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Í?t'v.
Med.
Univ.
Navarra
XIII:
.n9,
19.'JIJ
UNIVERSIDAD DE NAVARRA. FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA Y MEDICINA INTERNA
Neoantígenos en fracciones subcelulares del cáncer gástrico:
detención por inmunoelectroforesis y radioisótopos
M. Ortiz de Landázuri y A. Chordi
RESUMEN
Se realiza un análisis comparativo mediante inmunoelectroforesis del estómago normal y del cfocer gástrico humano. Las diferencias encontradas
han sido:
a) En el cáncer gástrico desaparecen los antígenos G 133, G 113 y G 90,
así como se encuentran muy disminuidos los antígenos G 53, G 46a.
G 46b y G 46c, todos ellos constituyentes órgano-específicos del estómago ht:mano normal.
b) En el cáncer gástrico aparecen los neoantígenos N 28. N 46a, N 46b
y N 80, ausentes del estómago humano normal.
c) Dos de estos neoantígenos N 80 y N 46b, mostraron ser constituyentes
de la superficie externa de la célula cancerosa. El N 46b, mostró características embrionarias. Mediante radioinmunoabsorción se comprobó
que la captación del inmunosuero anti-neoantígenos por el cáncer gástrico y el tejido embrionario era respectivamente 8,5 y7. 9 veces mayor
que la del estómago normal.
Se discuten estos resultados. los cuales inducen a pensar que el estómago
normal como resultado de la cancerización sufre un fenómeno de retrodiferenciación celular.
El proceso tumoral para su desarrollo requiere ineludiblemente la presencia por
un lado de la neoplasia y por otra parte
del individuo portador de la misma. Por
ello el fenómeno biológico de la cancerización puede ser clínicamente observado desde una doble perspectiva. Por un
lado los fenómenos biológicos que el
desarrollo de tal neoplasia producen en
su portador y q u~ generalmente conllevan
a la muerte del mismo. De otra parte
pueden también estudiarse los mecanismos defensivos que pone en marcha el
huésped ante el de~arrollo de la neopla-
33()
ORTl7
DF T ANDA7llRI Y
sia. En otras palabras, pueden ser estudiados los mecanismos invasivos del tumor
o bien los mecanismos defensivos del
huésped.
El sistema inmunitario, es en definitiva el más amplio mecanismo defensivo
que posee el organismo. Sabemos que
la puesta en marcha del sistema inmunitario reside en distinguir lo que es "propio" de lo que es "extraño" al organismo. Unicamente en el caso de que la
dotación antigénica sea diferente a la
del indivíduo -es decir extraña- el sistema inmunitario iniciará su mecanismo
defensivo.
Por ello cabe preguntarse cuál será la
actitud del sistema inmunitario ante el
desarrollo de una neoplasia. Cómo considera el organismo al tumor, como un
fenómeno podríamos llamar "propio" o
más bien como un fenómeno "extraño".
En otras palabras si es activa o pasiva, la
actitud del sistema inmunitario.
De aquí radica el interés de conocer la
composición antigénica de los tumores,
ya que ello podrá dar luz sobre el comportamiento del sistema inmunitario.
En lo concerniente a la compasión antigénica de los tumores, la investigaci::Sn
inmunológica se ha desarrollado con el
fin de averiguar las diferencias antigénicas entre tejido tumoral y tejido homólogo normal. Estas diferencias se han buscado en un doble sentido: tanto en la
desaparición de antígenos normalmente
presentes (delección antigénica), como en
la aparición de nuevos antígenos, no
presentes en el tejido normal (antígenos
t un:iorales ).
Weiler so fue el primero en demostrar la
gradual eliminación de una proteína órgano-espefífica en el curso de una cancerización hepática. Este hecho fue luego
confirmado por numerosos autores 1. 15 ·
' 2 · H. :rn
Estudios posteriores realizados
con métodos más finos de detección tales como la Inmunoelectroforesis (l. E. F.)
OWRm
Vol. X!ll
han permitido demostrar a Baldwin 7 la
pérdida de al menos 8 antígenos órganoespecíficos en la cancerización hepática.
Esta pérdida antigénica no sólo ha sido
demostrada en tumores experimentales
10. u. 1 L n ..il sino también en los tumores
expontáneos humanos 2 · 3 · 4. l9, 2ll, 3o. 39. Por
ello, hoy en día es casi universalmente
admitido "la ausencia o disminución en
el tejido canceroso de antígenos normalmente presentes". Este hecho denominado "simplificación antigénica", "delección antigénica" o "reducción antigénica",
fue el que sirvió a Green 17 · 21 para emitir su teoría inmunológica del cáncer.
Por otra parte, se ha estudiado la presencia de antígenos tumorales tanto en
los tumores experimentales 1. 6 · 13 · 31 como
en los tumores expontáneos s. 9. ~s. 36. 37. <12.
tb. 52 . En resumen podemos decir que la
mayoría de los autores han detectado la
presencia de antígenos tumorales. Sin embargo se ha puesto en duda la especificidad de tales antígenos. Es decir, que no
se trataría de antígenos tumorales -antígenos sólo presentes en el tumor y ausentes del tejido normal- sino que debido a errores de técnica o de interpretación, se darían por tales, antígenos normalmente presentes.
En lo que respecta al cáncer gástrico,
también han sido estudiados tanto la delección antigénica como la presencia de
antígenos tumorales. Ya Nairn 3B. 39 demostró que en 45 de 54 carcinomas gastrointestinales, un antígeno órgano-específico, estaba totalmente ausente. Posteriormente Rapp 43 demuestra que tres antígenos específicos de la mucosa gástrica
normal se encontraban ausentes o grandemente disminuidos en los extractos tumorales gástricos. Son muy pocos como
veremos los estudios sobre delección antigénica en el cáncer gástrico y ello ha
sido debido a que muy pocos autores han
realizado trabajos sobre la composición
antigénica del estómago normal, condición imprescindible para deducir los posibles antígenos perdidos. En cuanto a
Diciembre 1969
NLOANI!ULNUS DEL CANCER UASTRICO
la presencia de antígenos tumorales en
el cáncer gástrico ha sido la escuela rusa
dirigida por Zilber quienes mayor atención le han prestado. Así Zilber 5 ' encuentra uno. posteriormente A venirova s
encuentra dos y finalmente Tsvetkov 'rn
encuentra cuatro neoantígenos en diferentes tipos de neoplasia gástica. Sin embargo los trabajos más importante son los
de Gold y Freedman 16 · 18 los cuales encuentran un neoantígeno cuya particularidad reside en encontrarse también presente en el tejido embrionario. Por ello
le denominaron "carcino-embrionario".
El objeto de nuestro trabajo ha sido el
estudio de la composición antigénica del
estómago normal y del cáncer gástrico
humano. Dada la problemática planteada
por los antígenos tumorales, estudiar con
especial énfasis su localización dentro de
las fracciones subcelulares. su esoecificidad. sus características embrionarias y su
caotación mediante radioinmunoensayo.
Finalmente estudiar si alguno de los antfoenos tumorales se hallaba en la superficie de la célula gástrica cancerosa, ya
que únicamente los cambios antigénicos
acontecidos en la superficie celular oueden ser apercibidos por el sistema inmunocompetente.
MATERIAL Y MÉTODOS
a)
Organos utilizados.
Se utilizaron 15 estómagos normales humanos procedentes de intervenciones quirúrgicas en enfermos con úlcus duodenal.
Los estómagos cancerosos se obtuvieron
de intervenciones quirúrgicas en enfermos
que se realizaba la gastrectomía por neoplasia gástrica. De esta forma se obtuvieron l O neoplasias gástricas, cuyo diagnóstico histológico fue en 7 de adenocarcinoma y en 3 de escirro.
El tejido embrionario humano se obtuvo
de fetos indiferenciados, con un período
Je gestación de cuatro meses.
b)
331
Preparación de antígenos.
Se prepararon diversos tipos de antígenos tanto de estómago normal como de
estómago canceroso. A cada órgano se
añadía un volumen de suero salino fisiológico estéril en la proporción (peso/volumen) de 1/3. Se trituraba la mezcla
primeramente en un aparato Turmix y
luego mediante Ultraturrax con el que
se 1012raba la trituración y rotura celular
con liberación de los componentes celulares. Durante el proceso de trituración
se enfriaba la mezcla para que la temperatura no ascendiera por encima de
37" C. El homogeneizado obtenido ~e
dejaba 48 horas a 4° C. para conseguir
la extracción de los antígenos hidrosolubles. Pasado este tiempo se centrifugaba
a 5.000 r. p.m. durante 10 minutos, desechando el sedimento. El supernadante
era un extracto acuoso a partir del cual
se realizaban las pruebas de inmunoelectroforesis.
El aislamiento de las fracciones subcelulares (mitocondrial, microsomal v citoplasma soluble) tanto del estómago normal como del estómago canceroso, ~e
realizaba con órganos recientementP- obtenidos. Se siguió la técnica de Ho12eboom ·13 . Después del lavado con sacaros,1. v trozeado del tejido gástrico n"ra
eliminar los restos sanguíneos, se añctrlían 7 volúmenes de sacarosa 0,25 M_
igual en mi. a su peso en gramos. La
mezcla se sometía a un homogeneizador
de vidrio Potter-Elvehiem, Este homoo-e_
neizado se centrifugó a 850 X g en una
c~ntrífmm M. S. E, Mistral 4L - durnnte
1O minutos a Oº C. El sobrante se sometió a una nueva centrifugación ::i 850 x o:
durante 10 minutos a Oº C. El sobrenadante se centrifugó a 13.000 X rr durnnte 1O minutos a 0° C. El sedimento se
susnendió en sacarosa 0.25M v se centrifugó a 13.000 X g durante 10 minutos.
ooeración que se realizó tres veces consecutivas con obieto de lavar la fracción.
Fl sedimento final constituyó la fracción mitocondriaL
332
M. 01Ul7 DC LANDA7URI Y A. CHORDI
El sobrenadante de la primera centrifugación a 13.000 X g se sometió a una nueva centrifugación de 100.000 X g. El
sobrenadante resultante estaba constituido por la fracción citoplasmática soluble.
El sedimento correspondía a la fracción
microsomal.
La obtención de células enteras del cfocer . gástrico, para el estudio de los antígenos de superficie, se realizaba con cánceres gástricos recientemente obtenidos.
El tumor era trozeado con tijeras y Jos
residuos eran eliminados mediante lavado . en solución Earle. El tejido trozeado
era tratado con tripsina al 0.25 % en solución Earle durante 90 minutos a 37° C.
en agitación continua. Finalmente se recogía el sedimento constituido por células
y se resuspendía en solución Earle.
d)
l nmunosueros.
Se obtuvieron inmunosueros frente a suero humano normal, tejido gástrico normal, cáncer gástrico humano y tiroices
hu'llano normal. Las inmunizaciones se
llevaron a cabo siguiendo la técnica de
Tormo 17 . La inoculación se efectuaba con
una mezcla de homogeneizado con coadvuvante de Freund en la proporción de
50 mg/ml.
Las absorciones con objeto de eliminar
los anticuerpos séricos. comunes con otros
órganos y propios del estómago normal,
se realizaban mediante la adición al inmunosuero total de los correspondientes
antígenos en Ja proporción anticuerpoantígeno de 1 : O, 1.
Con objeto de obtener un inmunosuero
específicamente dirigido contra los antígenos tumorales, se practicó la inmunosuero anti-cáncer gástrico una obsorción
con suero humano normal, tiroides humano normal, y estómago humano normal, con objeto de eliminar del antisuero
todos aquellos anticuerpos que no fueran
específicos del cáncer gástrico. A este
inmunosuero dadas sus características le
denominamos monoespecífico.
Técnicas in11111noelectroforéticas.
La inmunoelectroforesis se realizaba con
la técnica de Scheidegger +1 con las modificaciones posteriormente descritas 11. 12 •
La identificación de Jos componentes hallados por inmunoelectroforesis se hacía
por su movilidad electroforética relativa
a la albúmina sérica. Este valor se determinGba expresando en tanto PºL ciento
la movilidad de cada banda de precipitación con relación a la movilidad que en
b misma experiencia hubiese tenido la
albúmina del suero humano usado como
control. Las bandas de precipitación eran
designadas con una letra según fuera su
procedencia. S= séricos; GT= gastrotiroidea; G= gástrico; NG= neoantígenos.
e)
e)
Vul. Xlll
Radioinmunoabsorción.
Los tejidos eran h")mogeneizados manualmente en un Elvehiem-Potter con buffer
l-"1rato salino pH 8 y centrifugados a
59 X g para eliminar el sedimento. El
supernadante era de nuevo centrifugado
a 100 X g. El sedimento de ésta última
centrifugación era repetidamente lavado
por centrifugación a 4° C. hasta que mediante espectofotometría no se detectaban proteínas en el supernadante.
Del inmunosuero monoespecífico se obtenían las gamma-globulinas mediante
precipitación en sulfato sódico. Las gamma-globulinas eran marcadas con J1" 1
según el procedimiento de Talmage 45 • El
grado de marcage fue de 1 a 2 átomos
de iodo por molécula de gamma-globulina. El exceso libre de p 3 1 era eliminado
mediante una columna de Sephadex G-20.
Se usó para la elución fosfato buffer ·'ªlino pH 7,2. La técnica de la absorción
de radioanticuerpo fue llevada a cabo
mediante la incubación de 50 ¡J.g de radioglobulina en 100 mi de solución buffer con l 00 mgrs de partículas sedimenta bles en 200 mi de buffer salino durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación continua. Al final de
Diciembre l'Jó9
NEOAN1 lGENOS DEL CANCER GASTRICO
la incubación los tubos eran centrifugados a 1.500 x g. El supernadante se
recogía mediante pipeta y se tranfería al
tubo de contage. Los sedimentos eran
lavados 4 veces mediante centrifugación
a 1.500 x g en 0,1 ml de buffer. En el
quinto lavado ya toda Ja radioglobulina
no fijada al sedimento ha quedado eliminada y por tanto el sedimento se transfería al tubo final de contage.
RESULTADOS
A)
Composición antigénica del estónwgo humano normal.
Su composición antigénica se realizó tanto mediante el estudio del homogeneizado total como mediante las fracciones
subcelulares.
En la tabla I se expresan los resultados
obtenidos. Este estudio evidenció que
todos los antígenos encontrados en las
fracciones subcelulares pertenecían a 20
antígenos inmunológicamente diferentes.
De este grupo de 20 antígenos 7 eran
comunes con el suero, 2 eran comunes
con otros órganos (tiroides) y 11 eran
propios y específicos del tejido gástrico
normal.
B)
Composición antigénico del cáncer
gástrico humano.
De manera similar fue realizado el patrón antigénico del cáncer gástrico humano. Se encontraron 20 :mtígenos, de
los cuales 1O eran comunes con el suero. 2 eran comunes con otros órganos (tiroides) y 8 eran propios del tejido gástrico canceroso. En la tabla I se expresan los resultados obtenidos.
C)
Estudio comparativo de macromoléculas entre estómago normal y
cáncer de estómago.
Ya conseguidos los patrones antigénicos
333
de estómago normal y del cáncer gástrico, pasamos a estudiar las diferencias
antigénicas existentes entre ambos, lo
cual vamos a exponer en tres apartados:
l)
Modificaciones cuantitativas.
Las estudiamos mediante un doble
sistema:
·--Mediante el estudio comparativo
de ambos patrones. La simple
comparación de ambos patrones
antigénicos, como puede observarse en la tabla I, ya evidenciaba
parte de los cambios antigénicos
acontecidos.
--Mediante inmunoelectroforesis con
sistemas heterólogos.
Para ello enfrentábamos el inmunosuero anti-estómago normal al homogeneizado de cáncer de estómago
y por otra parte el inmunosuero anti-cáncer g3strico al homogeneizado
de estómago normal.
Mediante los sistemas heterólogos
estudiábamos tanto Ja desaparición
de antígenos en el cáncer gástrico
ausencia de banda de precipitación),
como Jos antígenos comunes a ambos patrones (presencia de banda de
precipitación). como resultado de este doble estudio se obtuvieron los siguientes resultados:
a)
Antígenos desaparecidos. Los antígenos G 133, G 113 y G 90
constituyentes órgano - específicos
del estómago normal humano,
desaparecían como resultado de
la cancerización. Su ausencia fue
demostrada en todos los tipos de
cánceres gástricos en los que fueron investigados.
b)
Antígenos disminuidos. Los antígenos G 46a, G 46b, G 46.c y
y G 53, se vio que aunque muy
w
t.w
.¡:..
TABLA l.
Antígenos inmunológicamente diferentes del estómago normal y del cáncer gástrico humano. En la primera columna se enumeran los diversos antígenos encontrados según su movilidad electroforética. Los antígenos van designados con un número
y una letra. El número hace referencia a su movilidad electroforética en relación con la de la albúmina humana. La letra
indica su procedencia: S = séricos; GT = comunes con el tiroides; G = propios del estómago normal; C = propios del
cáncer. Con un aspa se indica la presencia del respectivo antígeno en la fracción subcelufar corres¡fondiente.
ESTOMAGO HUMANO NORMAL
~----
Antígeno
~---------------~··----·---
Citoplasm. Soluble
Mitocondrial
CANCER GASTRICO HUMANO
-·~-
-- --
Microscmal
~---~---·------
Citoplasm. Soluble
-·----------
Mitocondrial
Microscmal
X
X
,::::
s
GT
s
(- 13)
(- 3)
(3)
GT (10)
( 12)
G
s (20)
e
G
s
s
s
G
G
G
e
e
G
s
s
e
s
G
G
G
s
G
s
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
(25)
(28)
(38)
(46)
(46)
(46)
(46)
(46)
(46)
(46)
(53)
(58)
(80)
(80)
(83)
(85)
(90)
(100)
(100)
(113)
(133)
X
X
X
X
X
X
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Diciembre /96í!
NEOANT!r<l'NO~
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C ANCER GASTRICO
débilmente estaban presentes en
algunos de los cánceres gástricos testados.
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-1
Antígenos comunes. Los antígenos G 12. G 28, G 85 y G 100,
estaban presentes tanto en el estómago normal como en el cáncer gástrico.
Antígenos aumentados. En el
dncer gástrico aumentaban los
antígenos séricos. Mientras en el
estómago normal existían 7 antígenos séricos, en el cáncer gástrico había un total de 1O antígenos séricos.
Neoantígenos tumorales.
Con ello pretendíamos averiguar la
existencia en el cáncer gistrico de
nuevos antígenos no presentes en el
estómago humano normal. Era interesante averiguar no sólo la presencia de neoantígenos en el homogeneizado total sino también cual era su
distribución dentro de las fracciones
subcelulares.
1 AHT!-[C(Abt SHN+THN+EN)
·~.
i
FCS ccric.r
1 AHHC(Abt
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i
ua:~...
F.Mit CÓl")CM
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SH~•THH•EH)
¡l5~~b
F.M~CÓnol'f'"
Fig. 1. Representación esquemática de la distribución de los neoantígenos. En todos los
canales va colocado el inmunosuero monoespecífico (inmunosuero anti-cáncer gástrico
absorbido con suero = SHN, tiroides = THN
y estómago humano normal = EHN), el cual
contiene únicamente anticuerpos frente a los
neoantígenos. En los respectivos pocillos van
colocadas las distintas fracciones subcelulares
(FCS = citoplasmática soluble, FMit =mitocondrial. FMicr = microsomal) así cerno el
homogeneizado total (H. E. Cancer) del cáncer gástrico.
El N 46a
cipitación
presencia
fracciones
tal.
Ello se realizó a partir del inmunosuero monoespecífico (inmunosuero
anti-cáncer gástrico absorbido con
suero, tiroides y estómago normal
humano) enfrentándolo a cada una
de las fracciones subcelular del cáncer gástrico.
formaba una banda de precercana al pocillo, cuya
fue detectada en todas las
y en el homogeneizado to
El N 46b formaba una banda c'c
precipitación enfrente del pocillo
central, pero muy separada del mismo. Era una banda muy n'tida y bastante larga que solamente fue observada en la fracción microsomal y en
la fracción citoplasmática soluble.
De esta forma se evidenció que, existen 4 neoantígenos en el cáncer gástrico cuya distribución en las fracciones subcelulares se expresa en la
figura l.
El N 80 formaba una banda de precipitación horizontal al canal y que
fue claramente detectada en el homogeneizado total.
Estos neoantígenos fueron designados
N 28, N 46a, N 46b y N 80.
El N 28 formaba una banda de precipitación casi horizontal, claramente
observable y de presencia bastante
constante en la fracción microsoma 1
y débil e inconstante en el homogeneizado total.
SH~•THH~
3)
Neoantígenos embrionarios.
Intentamos detectar si tales antígenos
estaban presentes en el tejido embrionario. Para ello enfrentamos el inmunosuero monoespecífico con tejido embrionario (homogeneizado to-
336
M. URTI/' DE LANDAZUIU Y A. CHORDI
tal de feto menor de cuatro meses)
nudiendo apreciar con gran nitidez
Ju aparición de una banda de precipit,tción con una movilidad electroforé':ca de 46. Por esto a este neoantígeno que identificamos como el 46b
lo denominamos carcinoem brionario
(fig. 2).
Fig. 2. Antígenos carcinoembrionarios.---En
los canales va colocado el inmu1~csuero monoespecífico (sólo contiene anticuerpos frente
a los neoantígenos). En el pocillo homogeneizado total de feto humano menor de cuatro
meses. El lado derecho de la fo:ografía correspoqse al rolo positivo y el izquierdo al
negati·. o.
D)
Estudio especial de los neoantígenos.
Una vez que habíamos detectado la presencia de neoantíg'.:nos en el cáncer gástrico, pasamos a reali~~1r un estudio especial de los mismos, para ahondar en
su conocimiento.
Primeramente, intrnt<1mos averiguar si
algunos de estos neoantígenos se encontraban en la superficie externa de la célula cancerosa, ya que las modificaciones
antigénicas para que puedan ser apercibidas por el sistema inmunocomp.etente
deben producirse en la superficie externa
de la célula, pues de lo contrario, estos
cambios no podrán ser detectados.
En segundo lu3ar, averiguar si los neoantígenos eran capaces de captar selectivamente el inmunosuero monoespecífico
marcado con un radionuclido. De esta
Vol. Xlfl
forma podríamos a la par que cuantificar
numéricamente dichOJ. captación, averiguar su selectividad.
1)
Neoantígenos de superficie.
El procedimiento seguido para su
detección consistía en la absorción
del inmunosuero monoespecífico con
células enteras cancerosas. Los antígenos que estuvieran en la superficie
de las células, eliminarían rns correspondientes anticu~rnos. Al realizar
de nuevo el análisis inmunoelectroforético, las bandas de precipitación
ausentes serían las corresoondiente a
los antígenos de superficie.
Con el inmunosuero así absorbido se
efectuaba una inmunoelectroforesis
frente al homor;eneizado de cáncer
de estómago, poniendo como control
el mismo inmunosuero pero sin absorber con células de cáncer (figura 3). La absorción con células cancerosas mostró eliminar los anticuerpos dirigidos contra los neoant'genos
NC 80 y NC 46b. Por tanto dos
neoantígenos se encontraban en la
superficie externa de la célula cancerosa.
Los neoantígenos NC 25 y NC 46a no
fueron absorbidos y por tanto eran
intracelulares.
[Aíifi-~
Fig. 3. lnmunoelectroforesis del cáncer de estó!llago (pocillo) desarrolladas con dos inmunosueros anti-cáncer monoespecíficos. La diferencia entre ambos inmunosueros radicaba
en que uno de ellos estaba absorbido con
células enteras (canal inferior) con el fin de
eliminar los anticuerpos dirigidos contra los
antígenos de superficie. Los antígenos desaparecidos por este procedimiento mostraban
ser neoantígenos de superficie.
Diciembre 1969
2)
NHJANT!ld'.NOS DIJ. CANlTH GASlRICU
Radioinmunoabsorción.
La puesta a punto de la técnica se
efectuó previo ensayo de la influencia
de cada uno de los factores que entraban a formar parte de la reacción.
La experiencia final se realizó en las
condiciones óptimas que habían evidenciado los anteriores experimentos.
Estas condiciones idóneas eran:
---Obtención de inmunoglobulinas del
inmunosuero monoespecífico mediante el método de Kendall por
dos veces consecutivas.
--Concentración de inmunoglobulinas para el marcaje. 10 mg en 0,5
ml.
337
La captación por el estómago canceroso y del tejido embrionario era muy
similar, siendo en ambos respectivamente 8,5 y 7,9 veces mayor que
la captación del estómago normal.
DISCUSIÓN
Nuestros hallazgos podemos resumirlos
(fig. 4) en los siguientes apartados:
a)
En el cáncer gástrico hemos encontrado una delección antigénica por
la cual tres antígenos órgano-específicos (G 133, G 113 y G 90) del tejí-
---Zona óptima de proporción de
50 ,ug de gamma-globu!ina por
1.000 p.g de partículas.
--Utilización de partículas sedimentables a 100 X g.
La tabla ll es una copia de los resultados obtenidos con uno de estos
experimentos finales donde puede
claramente observarse el curso del
mismo. Así puede apreciars-:: como
la radioglobulina colocada en cada
tubo (2." columna) va eliminándose
sucesivamente como consecuencia de
los lavados (tercera, cuarta columna).
Finalmente era medida la radioglobulina captada por el sedimento de las
partículas (séptima columna i que es
expresión de la fi iada al antígeno y
que por tanto no ha sido eliminada
rle los lavados. En la penúltima columna se exoresa el percento que corresponde al sedimento del total de
radioglobulina colocada en cada tubo. En la última columna con el término de cociente de absorción se indica el número de vec-::s Qué: la captación de partículas problema era
mayor que la del estómago normal.
Fig. 4. Representación esquemática de las
diferencias antigénicas entre estómago normal
y cáncer gástrico. En el círculo concéntrico
más externo, van colocados los diferentes
antígenos según su movilidad electroforética.
El número hace referencia a su movilidad
en relación con la de la albúmina humana.
La letra hace referencia a su procedencia:
S = sérico:
G = gástricos:
GT = gastrotiroidea; NC = neantígenos. En el segundo,
tercer y cuarto círculo concén'.rico, va indicado con un punto la presencia del respectivo
antígeno en la fracción subcelular correspondiente. En los tres anillos concéntricos más
internos, se expresan los antígenos perdidos,
los antígenos disminuidos y los neoantígenos.
Las dos flechas señalan los antígenos de superficie.
''-"
._.,
00
TABLA II.
Típico experimento final de radioinmunoabsorción. t\l)s0rción de
estómago y tejido embrionario.
y globulina
con J-131
(B) c. p.m.
Partículas
(A)
CANCER
ESTOMAGO
ESTOMAGO
NORMAL
\
(
\
I
460.828
Líquido
Superna d.
c. p.m.
Lavados
1, 2, 3
c. p.m.
Lavados
c. p. m.
4. 5
295.18 l
155.6,>7
2.168
radioglohulina antidncer gástrico,
Adherido
c. p. m.
tubo
1.790
Sedimento
c. p.m.
por cáncer gástrico,
Radioglobulina
o.
o
(O)
absorbida (Cl
6.002
Cociente de
Absorción
.,,
1.32
460.199
231.402
219.327
2.224
1.183
6.083
l.34
448.708
341.000
98.014
2.194
l.080
5.420
l.20
461.943
274.761
184.162
556
1.107
750
0,16
464.362
318.237
143.515
871
801
700
OJ 5
476.605
347.531
125.756
l.198
l.250
720
0.15
463.243
350.426
104.631
1.541
1.104
5.541
l,19
1,26
1.13
~
(
~
1.28
8,5
e
"'....~
o
"'r'
>
z
( 0,15
1,0
o
>
e"
:.::
-<
>
TEJIDO
EMBRIONARIO
450.720
440.281
339.020
103.161
1.501
1.326
5.722
328.921
l 03.435
1.805
1.120
5.000
~
(")
:i:
119
(A) -
Absorción de 50 µg de globulina anticáncer por 1.000 µg de partículas sedimentables entre 50 y 100 g.
(B) -
1 µC
(C)
~;,
(O)
Absorción de radioglobulina por las partículas problema Absorción por el control de partículas estómago normal.
7.9
o
"'g
4.37 x JO' c. p.m. 1-131 en contador de centelleo.
de la radioglobulina absorbida, calculada del total de inmunoglobulina marcada añadida a cada tubo.
"
2..
><
-........
Diciemhre /961)
NEO.\NTIGENOS DEL CANCER GASTRICO
do gástrico normal, desaparecen y
otros (G 53, G 46a, G 46b y G 46c)
se encuentran muy disminuidos.
b)
En el cáncer gástrico hemos detectado la aparición de cuatro neoantígenos, no presentes en el tejido gástrico normal.
c)
Dos de estos neoantígenos (N 80,
N 46b) se encontraban en la superficie de la célula cancerosa. Uno de
ellos (N 46b) presentaba características carcinoembrionarias. Este hecho fue demostrado mediante inmunoelectroforesis y radioinmunoabsorción.
Siguiendo este orden vamos a comparar
nuestros resultados con los obtenidos por
ocros autores.
a)
Delección antigénica.
Han sido muy pocos los autores que han
estudiado mediante inmunoelectroforesis
el análisis antigénico de la mucosa gástrica normal. Así Herzen 29 describe 5
antígenos órgano-específicos y Rapp :0
doce. Es obvio que para estudiar los antígenos perdidos en la cancerización, es
condición previa haber realizado con anterioridad un estudio de los antígenos
de la mucosa gástrica normal. Dado Jos
pocos estudios realizados sobre la mucosa gástrica normal, este hecho (delección
antigénica) ha sido únicamente constatado por Rapp 43 que ha sido juntamente
con nosotros el único autor que ha estudiado mediante inmunoeletroforesis ambos patrones antigénicos.
Nuestros resultados concuerdan en gran
parte con los de Rapp 4 ~ ya que los antígenos G 53, G 46a, G 46b y G 46c en
ambos estudios los encontramos disminuidos.
Sin embargo nuestros resultados discrepan en lo que respecta a los antígenos
G 133, G 113 y G 90 ya que nosotros
no los encontramos en el cáncer gástrico,
mientras Rapp dice aunque sin especifi-
339
car que los encuentra "disminuidos o incluso ausentes".
Creemos por ello que esta ligera discrepancia es meramente cuantitativa y únicamente depende del dintel o método seguido para distinguir lo ausente de lo
muy disminuido. Lo importante es el
hecho y en ello estamos de acuerdo, de
que en el proceso de cancerización g:is.
trica ocurre un fenómeno de delección
antigénica, por el cual se pierden la mayor parte de los antígenos órgano-específicos de la mucosa gástrica normal.
b)
Neoantígenos en el cáncer gástrico.
El problema más debatido y del cual
mayor número de investigadores se han
ocupado en lo que respecta a la composición antigénica de los tumores, ha sido
el de la presencia de neoantígenos en las
neoplasias y en nuestro caso concreto en
el carácter gástrico.
Nosotros hemos encontrado cuatro neoantígenos 25, 46a, 46b y 80. La mayoría de los autores confirman su presencia, pero se discrepa en el número de
ellos. Así Zilber .13 encuentra un neoantígeno, A venirova 5 encuentra dos y más
tarde Tsevetkov 18 encuentra cuatro. Más
recientemente Gold 16 mediante inmunoelectroforesis detecta un neoantígeno con
características embrionarias.
La discrepancia en el número de neoantígenos hallados en el cáncer gástrico
creemos que es debida a dos razones. En
primer lugar al método de detección. Así
la mayoría de los autores los han demostrado mediante inmunodifusión, que en
general conlleva una peor identificación
de las bandas de precipitación formadas.
Nosotros hemos usado la inmunoelectroforesis con la cual se delimitan mucho
mejor las bandas de precipitación y por
tanto pueden detectarse mayor número
de neoantígenos. En segundo lugar de la
potencia en anticuerpos del inmunosuero,
ya que de ello dependerá el número de
neoantígenos que pueden ser evidenciados.
340
M. mn1z [)F LANOAZURI y A. CHOiU)J
Ambas razones, método de detección y
potencia del inmunosuero, explican que
el número de neoantígenos hallados en
el cáncer gástrico no coincida de unos
autores a otros. Creemos que los cuatro
neoantígenos por nosotros hallados, se
deben a que obtuvimos un potente inmunosuero y a que usamos la inmunoelectroforesis como método de detección.
Sólo hemos encontrado un trabajo 43 en
la literatura que no detecta la presencia
de neoantígenos en el cáncer gástrico. Sin
embargo no los niega, ya que da una
serie de razones para explicar las divergencias de sus resultados con los obtenidos hasta la fecha por otros autores.
Tres han sido las mayores objeciones
que se han presentado a la existencia de
neoantígenos ·
En primer lugar que fueran producto
de absorciones incompletas. Esta objeción la eliminábamos comprobando siempre que el inmunosuero monoespecífico
no reaccionaba con el suero, tiroides y
estómago humano normal.
En segundo lugar que se tratara de isoantígenos, es decir, no de antígenos específicos de tumor sino de diferencias individuales antigénicas. Pudimos comprobar
que ello no era así. ya que en diferentes
grupos de cánceres gástricos los neoantígenos siempre eran los mismos y con
idénticas características electroforéticas.
.En tercer lugar que se tratara de antígenos normales considerablemente aumentados. En múltiples ocasiones testamos dicho inmunosuero monoespecífico frente
a tejido gástrico normal, comprobando
siempre la ausencia de dichos neoantígenos .en el tejido gástrico normal.
c)
Antígenos carcinoembrionarios.
La existencia de antígenos de superficie
en Jos tumores espontáneos humanos sólo
ha sido descrita en el linfoma de Burkit '1·' y en el cáncer gástrico '19 . Nosotros
hemos estudiado los antigenos de superficie, mediante la técnica de la inhibición
Vol. XIII
de la precipitación, habiendo dos neoantígenos (46 y 80), en la superficie de la
célula del cáncer gástrico. Unicamente
Viljin 19 ha estudiado los antígenos de
superficie del cáncer gástrico humano.
Usa un método cualitativo -el de los
anticuerpos fluorescentes- con el que
no puede determinar ni el número ni las
cciracterísticas de los mismos. Por tanto
constata su existencia. Nosotros su número y características.
Uno de estos neoantígenos dectectados
en la superficie celular, el N 46b, fue
hallado también en embriones humanos.
Este antígeno puede corresponder con
el antígeno carcinoembrionario de Gold "6
el cual detectó este antígeno en los cánceres primarios del sistema digestivo así
como en los órganos digestivos de embriones y fetos humanos. Su movilidad.
electroforéticá de 0,46 es similar a la del
detectado por Gold.
Para profundinu en el estudio de Jos
neoantígenos de superficie y en sus características embrionarias hemos usado el
marcado con Jrn de los anticuerpos antineoantígenos para de esta forma estudiar su captación específica por las partículas del cáncer gástrico. La mayor dificultad que presentan Jos estudios m>
diante radioinmunoabsorción radica en
la necesidad de utilizar células frescas y
en el caso ele los tumores humanos ello
exige una gran dependencia de las interverciones quirúrgicas. El método por nosotros descrito permite el uso de partículas conservadas a -20" C.
Los resultados obtenidos demuestran claramente que los anticuerpos anti-neoantígenos son absorbidos específicamente
por el sedimento de las células cancerosas con Ja misma intensidad que los sedimentos embrionarios en contraste con
Ja captación del estómago normal que
era sensiblemente menor. Por tanto los
resultados obtenidos mediante Ja captación de radioglobulina confirman los datos obtenidos mediante inmunoelectrofo-
Diciembre 1961)
NFOANTIGENOS DEL CANCER GASTRICO
resis. En la literatura no hemos encontrado ningún trabajo de estudio de estos
neoantígenos mediante radioinmunoabsorción.
Todos estos resultados nos llevan a concluir que en el estómago canc:roso ocurren dos hechos de suma importancia:
Por un lado un fenómeno de simplificación antigénica, por el que desaparecen
antígenos normalmente presentes en la
mucosa gástrica normal y por otro lado
la aparición de unos antígenos nuevos
denominados neoantígenos.
En este sentido podríamos decir que la
compos1c10n antigénica del t:stómago
canceroso se "primitiviza" ya que desaparecen casi todos los constituyentes específicos del tejido gástrico normal, viéndose estos reemplazados por la aparición c'e
unos antígenos nuevos o neoant g~nos.
341
Estos aspectos y el hecho de que estos
neoantígenos tengan características embrionarias nos apoyan la idea de que durante el proceso de cancerización gástrica ocurre un fenómeno de dediferenciación por el cual el estómago canceroso,
recorre el mismo camino pero en sentido
inverso al d ela diferenciación celular.
Nosotros creemos que en el proceso tumoral no se produce un fenómeno inmunitario de defensa y ello es debido a que
a pesar de aparecer antígenos nuevos,
tales antígenos, por el fenómeno de la
retrodiferenciación, ya han estado en contacto con el sistema de reconocimiento
inmunológico como lo demuestra el hecho de tener uno de ellos características
embrionarias. Ello condiciona que los
considere como "propios" y por tanto
que escapen del sistema inmunitario de
defensa.
SuMMARY
· Neoantigenes of gastric cancer detected by immunoelectrophoresis
and ( 1 31 labelled antibody technique
A co:11partive analysis by immunoelectrophorelic techniques of normal s:o:nach and human gas;ric canceris realized. The differences findins are described:
a) In the gas:ric cancer dissapear the G 133,
.G 113 and G 90 an higens. so is found ve:rydisíninish :d the G 53, G 46a, G 46b and
G 46c antigenes, specific-organs constituents
of normal human stomach.
b) In the gastric cancer appears the N 28,
N 46a, N 46b and N 80 neoantigens absents
m the normal human stomach.
e) Two of Jiis N tiO and N 46b neoantigens showed to be terminal surfac~ constiiuen:s of thc canc::rous cell. The N 46b anligen showed fmbryonal characterislics. From
rad:o:mmunoabsortion is comprobated that
cap'.ure of irr:munoserum an'i-neoantigens by
gas:ric and cmbrvobal tissue was 8,5 and 7.9,
r;:speciveles, greaéez the normal s'.omach.
ls disuss_d these results. wich sugget that
'lorm~I s.omach supports a celular re:rodifer~ntia;íon.
BIBLIOGRAFÍA
l.
2.
ABELEV, G. l. Prog. Exp. Tumor Res ..
7: 104, 1965.
ARONSON, S. R.. W. RAPP, L KusHNFR,
/111.
Arch. Al/erg\'. app/.
26: 327. 1965.
AVDEYEN. G. L. L S. RASHKAEV. R. E
P.
8URTIN.
Imm1111.,
),
Vol. XIII
M. ORTl7 DE LANDA7URI Y A. CHORDI
171.
28.
l.. l. S. BASHKAEV, B. E.
Bju//. eksp. Biol. Med., 55:
29.
GREENSPAN, l., E. R. BROWN, S. 0.
SeHWARTZ. Blood., 21: 717, 1963.
HERZEN, P. A. Bol. Exp. Biol. Med.,
30.
HILLEMANNS,
CHECHIK. Ac·a Un. int. Canccr., 19:
1963.
4.
AVDEYEV,
CHECHIK.
G.
77, 1963.
5.
AvENIROVA, Z. A.,
L.
7: 88, 1965.
Acta. Un. int. Cancer, 19: 163, 1963.
BALDWIN, R. W. Bril. J. Canc('I'., 19:
894, 1965.
7. BALDWIN, R. W. Bril. ]. Cancer., 18:
285, 1964.
8. CARPENTER, C. M.. Y. MATSUURA, L.
HYDE, R. A. LE CLAIR. Proc. Am. Ass.
Cancer. Res., 6: !O, 1965.
9. CARVALHO, S. Nature (Lond), 203: 1186.
1964.
10. CARRlJTHER, C.. A. BAUMLER, J. Na·11.
Cancer. Jnsl., 34: 191, 1965.
11. CHORDI, A .. l. G. KAGAN. J. Parasil., 51:
63, 1965.
12. CHORDI, A., l. G. KAGAN . .!. Jm11111nol.,
93: 439 1964.
13. DECKERS, CH. S1mcl11re anti¡;en:·que de
Tumeurs experimentales. Arscia. S. A.
Brussels. 1964.
14. FEL. v. J., T. TSIKARISHVILI. Ca11cer.
Res .. 24: 1675. 1964.
15. FISCHER, c.. E. WEILER. z. Krehsforch.,
64 : 441, 1962.
16. GoLD, P .• S. O. FREEDMAN. J. Exp. Med.,
121: 439, 1965.
17. GoLD, P .. S. O. FREEDMAN. J. Exp. Med.,
122: 467, 1965.
18. GoLo. P., M. Goto, S. O. FRFEDMAN.
Cancer Res., 28: 1331, 1968.
19. GoumE. R. B .. H. M. Me CALLUM.
Lance/., 1 : 348, 1962.
20. GoUDIE, R. B., H. M. Me CALLUM. Lance!., 2: 1035. 1963.
21. GREEN, H. N. Bril. Med. J., 2: 1374,
1954.
22. GREEN, H. N. A1111. N. Y. Acud. Sci ..
68: 268, 1957.
23. GREEN, H. N. lmm11110/or<ica/ Aspec1s of
wncer. 3." edición. R. W. Raven. Butterworth. London. 1957.
24. GREEN. H. N. J. ch ron. Dis., 8: 123,
1958.
25. GREEN, H. N. Carcino[{cnesis Mechanirnis
of Ac:ion. Ciha Symp. Editado por Wols-
31.
6.
ternho'.me
O'Connor. Churchill. London.
1958.
26.
27.
GREEN, H. N. Cancrn.. 14: 3. 1961.
GREEN, H. N., M. HONOR. Practici01:er ..
190: 705. 1963.
H.
G.
Z.
Naturf.,
l íb:
240, 1962.
A. LuooGOVSKAYA.
32.
HIRAI, H., H. TAGA, H. ISAKA, H. SATOH,
K. W ARABIOKA. Gann., 54: 177, 1963.
HIRAMOTO, R., J. BERNECKY, J. JURANDOWSKl, D. PESSMAN. Cancer Res., 21:
1372, 1961.
33.
34.
35.
36.
37.
HüGEBOON, G. H. Methods in EnzimoloRY· Academic Press. New York, 1965.
KALNIS, V. I., H. F. STICH. Nature (Lon-
don), 200: 189, 1963.
E. Jll · lnternational Symposi11m
of the biolor<ica/ charac:erization of tlu·
huam lumors. Madrid, 1969.
LEY!, M., l. MANDL. Fedn. Pwc. Am.
Socs. exp. Biol., 24: 177. 1965.
KLEIN,
LoISILLIER,
P. BuRTIN,
109:
38.
40.
41.
P.
BuFFE, K. B. TAl''lK,
GRABAR. lnst. Paste///'.,
1, 1965.
NAIR, R. C., H. G. RtcHMOND, M. G. Me
ENTEGART, J. E. FOTHERGILL. Bril. Med.
J., 2:
39.
F., D.
1335, 1960.
R. C., H. G. R1cHM:JND. Bri<
Med. J.. 1 : 1791, 1962.
NAIRN, R. C., J. E. FOTHERGILL. M. G.
Me ENTEGART, J. B. PORTEOUS. Bri 1 •
Med. J., l: 1788, 1962.
NAIRN.
NIRN, R. C.,
T.
GHOSE, A. TANNE:-:BERG.
Bril. Med. J., 20: 756, 1966.
42.
PÉREZ
CUADRADO,
S.,
S.
HUBERMAN,
G.
J. RACE. Cancer, 18: 73, 1965.
43. RAPP, W., S. B. ARONSON, J. KuSHl'ER,
P. BuRTIN, P. GRABAR. lmmunopathology IV lnternational Symposium.
44. ScHEIDDEGER, J. lnter. Arch. Al/erg., 7:
103, 1955.
45. TALMAGE, D. W., l. RADJ\VICH. Me'hods.
in Immunology. Academic Press. New
York, 1967.
46. TEE, D. E. H., M. WANG, J. WATKINGS.
Europ. J. Cancer., 1: 315, 1965.
47. TORMO, J. Tesis Doctora'. Madrid, 1966.
4c~.
TsVETKOV, V. S. Vopr. Onkol., JO: 16,
1964.
49. VILJIN, K., M. N. AvERKlEVA. Vopr.
Onkol., 14: 17, 1968.
50. WEILER, E. Z. Nat11rf., 78: 324, 1952.
51. WEILER, E. Brit. J. Cancer., 10: 553;
52. ZILBER, L. A. Adv. Cancer Res., 5;
291, 1958,
53. ZILBER, L. A., L. A. LUDOGOVSKAYA.
Folia Biol .. 13: 331, 1967.