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GRACIELA NATALIA PUCCI
Trabajo Práctico N 2. Bacteriología- Microscopía y
Tinciones
Objetivo
Que el estudiante conozca las técnicas de coloración de Gram y
Ziel Neelsen
Que el estudiante utilice el microscopio para la observación de
preparados
Mapa conceptual
Diagnóstico clínico
Paciente
Tratamiento
Diagnóstico microbiológico
Directo
Indirecto
Muestra
Muestra
Observación Microscópica
En fresco
Microscópica
Cultivo
Por coloración
Macroscópica
Gram
Investigación molecular
inmunológica
Investigación
molecular
Investigación microorganismo
Identificación
Genómica
PSA
x técnicas
variadas
Inmunológica
A
g
x técnicas
variadas
PCR
LIA
Western plot
etc.
Aglutinación
ELISA
IFI
etc.
Ac
x técnicas
variadas
Aglutinación
ELISA
IFI
etc.
Introducción
Las tinciones son técnicas muy importantes para poder observar a los
microorganismos que por su tamaño no se pueden observar a simple vista o es
dificultoso verlas en muestras frescas. Existen diferentes tinciones que se usan
para observar diferentes partes de las estructuras de las células procariotas dos
de las más utilizadas en microbiología clínica son la tinción de Gram en donde
se pone en manifiesto el tipo de pared celular, se divide a las bacterias en dos
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grandes grupos Gram positivas y las Gram negativas y la Tinción de Ziehl
Neelsen para la observación de bacilo acido alcohol resistentes.
Repaso de microscopia
En microbiología una de las herramientas más utilizadas es el microscopio. Por
eso les recordamos algunas cosas.
Existen diferentes microscocpios que posee diferente poder de resolución.
En el laboratorio de microbiología el microscopio más utilizado es del
campo claro con objetivos de 5x, 10x, 40x y el que más se utiliza en
microbiología 100x.
Objetivos de bajo poder (5 x, 10 x y 40 x):
Durante la observación microscópica de preparados frescos se usan
objetivos de bajo poder. En ellos no se utiliza el aceite de inmersión y el
preparado se encuentra entre un porta y un cubreobjetos.
Descender el condensador completamente (en objetivos 5 x o 10 x) o
hasta la mitad de la distancia que recorre (en objetivo 40 x).
Elevar la platina hasta que aparezca una imagen borrosa en el campo
microscópico.
Buscar el enfoque por medio del tornillo micrométrico.
Objetivo de inmersión en aceite (100 x):
Se deben utilizar preparaciones teñidas, completamente secas.
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Poner una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la porción que se
va a examinar.
Elevar el condensador hasta donde pueda llegar y abrir completamente al
diafragma.
Colocar sobre la preparación el objetivo adecuado (100 x).
Ascender la platina, que se mueve por medio del tornillo macrométrico,
hasta que el aceite se ponga en contacto con el objetivo, siempre
evitando que presione la preparación.
Observar a través del ocular y girar el tornillo micrométrico hasta que la
imagen se encuentre enfocada.
Mantenimiento y precauciones.
Si ud. no esta utilizando el microscopio, el mismo debe estar
desenchufado, cubierto con la funda plástica con el fin de evitar que se
ensucien y dañen los lentes.
No se deben tocar nunca las lentes con las manos. Ni utilizar maquillaje
en los ojos que ensucien los lentes, en caso de necesidad límpielas
suavemente con pañuelos especiales para óptica.
Nunca deje el preparado sobre la platina cuando no este utilizando el
microscopio.
Para cambiar de objetivo emplee siempre el revólver. Si no es así puede
dañar la parafocalidad del microscopio.
Después de utilizar el objetivo de inmersión , limpie el aceite que queda
en el objetivo con pañuelos para óptica humedecidos con xilol.
No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio
No cambien el objetivo mientras está observando a través del ocular.
Encienda la luz únicamente en el momento de hacer las observaciones.
Al momento de apagar definitivamente el microscopio: Coloque el
objetivo de menor aumento en posición de enfoque, retire la muestra,
limpie el objetivo de inmersión con papel especial, baje completamente
la platina, ubique en “cero” la perilla de intensidad de luz, apague el
interruptor de la fuente y desconecte del toma corriente. Deje enfriar el
bombillo dejando el microscopio en la mesa, para que el responsable del
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equipo lo revise y lo guarde en el sitio adecuado y nunca enrolle el cable
sobre el microscopio.
Cubra el microscopio con el forro protector
Preparación de un fresco
La observación microscópica constituye la primera etapa del estudio de
los microorganismos y también del diagnóstico microbiológico ya que
permite conocer algunas características de los microorganismos, como
ser: forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras
(cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc.
El estudio "en fresco" se desarrolló cuando todavía no se habían
inventado la fijación y la tinción. Actualmente se siguen utilizando, sobre
todo gracias al desarrollo de las técnicas de contraste de fases y contraste
interferencial.
Un estudio “en fresco" es aquel que no precisa un
tratamiento en el que se maten las células, como es la fijación o la
inclusión. No presenta dificultades añadidas a las de cualquier técnica
microscópica, pero sí que requiere la máxima limpieza. Las bacterias no
teñidas
muestran
pocos
detalles
morfológicos,
el
diagnóstico
bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades
tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin
embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la
determinación de la movilidad. Las preparaciones fijas y teñidas son de
uso casi universal, tanto a partir de especímenes recibidos como de
colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede
ser colocada directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con
una asa, recordando siempre tener una preparación delgada y
homogénea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una
suspensión tenue en una gota de solución salina, y luego extendiéndola
con una asa sobre un portaobjetos. Las películas secadas al aire son
fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a
través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que
puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el
portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la
mano.
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Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:
Preparación húmeda.
Preparación de un preparado fresco
Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre
un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente.
Cubreobjeto
Preparación
fijada.
Se
coloca
una
suspensión
homogénea
de
microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija
(mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante
diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y,
habitualmente, con objetivos de inmersión.
Preparación preparado fijo para tinciones:
La extensión del material sobre el portaobjetos se hará de diferentes
formas, en función de la procedencia del producto a examinar.
Si el producto es líquido, se depositará una pequeña cantidad de
material en el centro del porta, extendiéndolo con el asa hasta conseguir
una capa fina y homogénea.
Si la extensión debe hacerse a partir de un cultivo en medio sólido, la
colonia que vayamos a estudiar se mezclará con una gotita de agua
destilada estéril colocada en el centro del porta.
Secado:
Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la preparación,
cuando está seca la superficie pasa de ser brillante a mate; para acelerar
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el secado se puede calentar ligeramente la parte inferior del portaobjetos
(sin quemar).
Fijado:
La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como
objetivo no permitir que la muestra de estudio se pierda (o se barra) en el
proceso de tinción.
En frotis hematológicos no se requiere de fijación debido a que existe una
coagulación rápida de las albúminas citoplasmáticas; o si el material a
teñir posee abundante material celular, se recomienda fijar con alcohol
metílico después de secar la preparación.
Los frotis de origen microbiológicos se deben de fijar con calor suave,
pasando el portaobjetos sobre una llama, tras la fijación es muy
importante esperar que se enfríe antes de proceder a realizar cualquier
procedimiento de tinción.
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Fig. Preparación de un preparado para tinción 1 realización del extendido
2. Secado del extendido 3. Fijado a la llama.
Tinción de Gram
En portaobjeto perfectamente limpio y desengrasado preparar un
extendido fino y dejarlo secar al aire.
2.- Fijar el material pasando el portaobjeto 3 o 4 veces por la llama, para
evitar que sea arrastrado por agua de lavado.
3.- Colorear el portaobjeto sobre las varillas de la cubeta de coloración y
cubrir con solución de cristal violeta 1 minuto (según la calidad del
colorante se pueden acortar los tiempos).
4.- Lavar cuidadosamente con abundante agua.
5.- Cubrir con solución de iodo durante 1 minuto.
6.- Lavar con agua.
7.- Decolorar durante 20 segundos exactamente con solución de alcoholacetona.
8.- Lavar con agua.
9.- Cubrir con solución contracolorante de safranina durante 1 minuto.
10.- Lavar con agua. Colocar en posición vertical hasta que se seque
11.- Observar con objetivo de 100 X de inmersión.
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Tinción de Ziehl Neelsen
Todas las bacterias se tiñen con el colorante fucsina en presencia de
calor. Sin embargo, la mayoría de las bacterias se decoloran después del
tratamiento con etanol/HCl, excepto las micobacterias y géneros
relacionados que resisten al tratamiento decolorante y retienen al
colorante. Esta ácido alcohol resistencia se debe al alto contenido de
sustancias hidrofóbicas (ácidos micólicos) en la pared celular.
Técnica de Coloración:
1.
Efectuar
un
extendido
fino
sobre
un
portaobjeto
limpio
y
perfectamente desengrasado.
2. Cubrir con colorante carbofucsina y calentar con hisopo hasta
desprendimiento de vapores. Efectuar este calentamiento tres veces en el
término de 10-12 minutos, cuidando que no entre en ebullición.
3. Esperar que se enfríe, volcar el colorante, lavar con agua e inclinarlo
haciendo escurrir un poco de Solución decolorante, cubrir con la misma
Solución de 1 a 2 minutos, lavar.
4. Lavar y contracolorear con azul de metileno de 30 a 60 segundos.
De esta técnica se verán preparados de esputos positivos en donde se
deberá observar los bacilos ácidos alcohol resistentes.
Otras tinciones
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Tinciones y métodos microscópicos para la detección rápida de microorganismos
en muestras y materiales infectados
Tinción y método
Aplicación
Wright-Giemsa
LBA, preparaciones
de Tzanck, muestras
con fondo celular
complejo
Gránulos
metacromáticos de
corinebacterias
Permite hacer
diagnóstico
presuntivo, sobre
todo, en neumonía y
meningitis bacteriana
Azul de metileno
Gram
Ziehl-Neelsen,
Kinyoun
Microscopía de
campo oscuro
Tinta china
Tinciones de
muestras (esputos,
LBA, LCR, orina,
etc.) para identificar
bacterias ácidoalcohol resistentes
(AAR) y para
diferenciación de
Micobacterias y
algunos
actinomicetales
aerobios (AAR
parcial)
Examen directo de
lesiones con sospecha
de sífilis primaria
Examen directo de la
Resultados
esperados
Morfología general
de las estructuras
celulares
Morfología general y
seleccionada
Detección de
leucocitos,
reconocimiento de la
morfología de
bacterias comunes
Los microorganismos
AAR muestran un
color rojo granate,
contrastado sobre un
fondo azulado,
permite detectar
también parásitos
como
Cryptosporidum y
Cyclospora
Comentarios
Permite visualizar
bacterias, levadura,
parásitos y
inclusiones virales
Corynebacterium
diphteriae
Requiere experiencia
para valoración
adecuada no incluye
otros agentes
infecciosos pero
puede diferenciar
levaduras
Las Micobacterias
son bacilos rectos,
cortos o largos y las
nocardias, bacilos
arboriformes y
ramificados
Se ven espiroquetas
móviles
Requiere experiencia
Los criptococos
Tinción inversa, la
10
KOH 10%
Naranja de acridina
Blanco calcofluor
extensión de LCR,
sangre y orina para
Cryptococcus
poseen una cápsula de
polisacáridos que
aparece como un halo
sobre un fondo oscuro
Examen directo de las
extensiones de piel,
pelos y uñas para ver
dermatofitos
Es eficaz para
diferenciar
verdaderos
microorganismos de
artefactos,
especialmente en
hemocultivos
Visualiza elementos
fúngicos
Examen directo de
LCR, LBA y otros
líquidos corporales
para detectar
estructuras fúngicas y
algunos quistes
parasitarios
Tinción de
fluorocromo fijada a
los núcleos de las
bacterias, que
muestran
fluorescencia naranja
sobre un fondo
oscuro, fluorescen
tanto bacterias viables
como no viables
Las levaduras y
mohos muestran una
fluorescencia
blanquecina suave
cápsula no se tiñe;
requiere experiencia
para diferenciar
leucocitos de
levaduras
Digiere las proteínas
de las muestras y
facilita la
visualización.
Requiere el uso de
microscopia de
fluorescencia
Tnción fluorescente
que se fija a la pared
celular de hongos y
levaduras, pero no a
bacterias o células
inflamatorias, se
prefiere a la tinta
china y a
preparaciones de
KOH
Requiere el uso de
microscopio de
fluoroescencia
Recordar que:
Los colorantes son para los portaobjetos.
NO SON PARA LAS MANOS.
NO SE DESPERDICIAN, NO SE TIRAN.
Hay que trabajar pensando en que se esta haciendo.
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