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PRACTICA #10
TINCIONES PERMANENTES DE PARASITOS
II. Parte
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Que el alumno se familiarice con diferentes técnicas de tinción de parásitos para
poder distinguirlos al microscopio y utilizarlas en diagnóstico.
INTRODUCCION.
En la mayoría de los casos los protozoarios intestinales se pueden observar
bien con tinciones temporales, como es el caso de los exámenes directos con
lugol, solución salina o Sudán, como se vió en prácticas anteriores. En algunas
ocasiones es necesario teñir los parásitos en forma definitiva, para obtener
preparaciones permanentes; otras veces estas tinciones son necesarias porque
se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares, usando tinciones
especiales permanentes. Algunos parásitos requieren tinciones especiales, para
poder observarse.
MATERIALES Y METODOS
1. Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-resistente) Modificada:
Esta técnica es útil en la identificación de ooquistes de coccidios como
Cryptosporidium, Isospora, y Cyclospora, que son difíciles de detectar con
colorantes rutinarios. Esta tincion de Ziehl-Neelsen Modificada no require el
calentamiento de los reactivos al teñir.
Especimen:
Puede utilizarse el sedimento concentrado, de heces frescas o preservadas en
formalina.
Reactivos para la tinción:
Se efectúan cuatro pasos en el proceso, con diferentes reactivos:
Metanol Absoluto
Alcohol Acido: 10 ml de acido Sulfurico + 90 ml de etanol Absoluto. Almacene a
temperature ambiente.
Carbol fuchsina
Verde de Malaquita al 3% : disuelva 3 g de verde de malaquita en 100 ml de
agua destilada. Almacene a temperatura ambiente.
Procedimiento de la tinción :
Preparar un frote con 1 a 2 gotas del especimen fecal sobre un portaobjetos y
secar en una platina caliente a 60°C. Los frotes no deben quedar demasiado
gruesos.
Fijar con metanol absoluto durante 30 segundos.
Teñir con carbol Fuchsina por un minuto.
Lavar con agua destilada brevemente y escurrir.
Decolorar con alcohol- ácido durante 2 minutos. Enjuagar con agua destilada y
escurrir.
Teñir con el colorante de contraste verde de malaquita durante 2 minutos.
Lavar brevemente con agua destilada y escurra.
Secar el portaobjetos sobre una platina caliente a 60 °C durante 5 minutos.
Montar la preparación con un cobreobjetos usando un medio de montaje.
Examinar 200 a 300 campos usando el objetivo seco fuerte 40× .
Para confirmar la morfologia interna, use el objetivo de aceite de inmersión
100x.
2. Tinción de Fenol- Auramina
Este colorante puede ser usado como una alternativa a la tinción modificada de
Ziehl-Neelsen, para ooquistes de Cryptosporidium parvum.
Metodo
a. Haga frotes fecales como para Ziehl-Neelsen y fije con metanol por 1 min ,
escurra y deje secar.
b. Tiña con fenol-auramina (Lemperts) por 10-15 minutos.
b. Enjuague con agua de la llave
c. Decolore con alcohol-ácido (como en el Ziehl-Neelsen)
d. Enjuague con agua de la llave.
e. Cubra el frotis con el colorante de contraste, permanganato de potasio 0.1%
por 30 seg.
f. Enjuague con agua de la llave y deje secar al aire libre. No aplique papel para
secar.
g. Observe los frotes con luz azul en el microscopio de fluorescencia a 10 X y a
100 X . Los ooquistes de Cryptosporidium parvum aparecen de color Amarillo
brillante sobre un fondo oscuro.
3. Tinción Tricromo-modificada
Frotes fecales delgados, en la detección de Microsporidios intestinales.
Reactivos
Cromotropo 2R (Gurr) 6.0 g
Verde rapido
0.15 g
Acido Fosfotungstico 0.7 g
(use guantes al pesar)
Mezcle los componentes en 3 mL de acido acetico glacial y deje reposar por
30 minutos.
Añada 100 mL de agua destilada. Mezcle bien. El acido acético no disuelve
totalmente el colorante (es normal).
Método.
a. Suspenda las heces sin concentrar en formol de 10% (en proporcion 1:3)
b. Extienda una pequeña gota de suspensión fecal y extiéndala en las 2/3
partes de la superficie de un portaobjetos
c. Seque y fije en metanol durante 5 minutos.
a. Tina en Tricromo durante 90 minutos a temperatura ambiente o tina por
10 minutos a 50° C
b. Enjuague en alcohol acido (4.5 mL de acido acetico glacial en 95.5 mL de
etanol de 90% ) por 10 segundos
c. Enjuague en etanol de 95 % para lavar el exceso de colorante
d. Deshidrate en etanol de 95% por 5 minutos.
e. Deshidrate con etanol absoluto 100% por 5 minutos.
f. Aclare con xileno por 5-10 minutos.
g. Mount en DPX mientras este humedo usando un cubreobjetos de 22x40 y
examine a 100 X.
Las esporas de los microsporidios son muy pequeñas ( 1.0 x 0.5 µm), ovales y
con frecuencia exhiben una estructura central como banda, flankeada en el otro
lado con areas sin teñir. Las esporas se tiñen de rosa-rojo, contra un fondo
verde oscuro.
4. Fijación de Nematodos
La mayoría de los Nematodos puede fijarse en alcohol 70° caliente o en alcohol
acético (1 parte de ácido acético y 3 partes de alcohol 95°). Los Nematodos se
almacenan en alcohol 70°. Se agregan unas pocas gotas de glicerina a fin de
impedir la desecación en caso de evaporarse el alcohol durante ese tiempo. Los
adultos y larvas de 2–3 mm o menos se fijan mejor usando una solución de
ácido acético al 0,5%. Se utiliza una mezcla de 4% de formol y 1% o 0,5% de
ácido acético para la fijación y almacenamiento. Los Nematodos se pueden
aclarar en glicerina, alcoholfenol o en lactofenol. Luego, y antes de colocarlos
nuevamente en la solución de preservación se lavan en alcohol 70°.
Alcoholfenol:
80 partes de cristales de fenol fundido y
20 partes de alcohol absoluto
Lactofenol: 20 partes de agua destilada,
40 partes de glicerina,
20 partes de ácido láctico y
20 partes de cristales de fenol fundido.
5. Fijación de protozoarios
Para la fijación de protozoos se pueden utilizar varios métodos, entre ellos el de
líquido de Schaudinn:
Esparza la muestra donde están contenidos los parásitos en una capa fina
sobre el portaobjeto. Luego coloque el portaobjeto con el material hacia abajo en
una jarra con líquido de Schaudinn por un período de 15 a 20 minutos,
lavándolo entonces con etanol 70°. Luego transfiéralo a una solución de yodoetanol 70° (la solución deberá tener color té fuerte). El yodo remueve el cloruro
de mercurio. Manténgalo en dicha solución hasta que quede de color marrón.
Entonces lávelo con alcohol 70° hasta su completa decoloración y guárdelo en
un envase de portabojetos. Para prevenir que los portaobjetos se toquen entre
sí, se colocan aros de papel grueso entre ellos para separarlos. El diámetro
interior de estos aros deberá dejar libre el frotis. Finalmente, etiquete los
portaobjetos y tíñalos con hematoxilina de hierro.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
Describa sus observaciones y resultados.
Dibuje los organismos observados en su cuaderno de prácticas
Que beneficios observo en cada una de las tecnicas desarrolladas
Bibliografía
Taghi-Kilani,R. and L. Sekla. 1987. Purification of Cryptosporidium oocysts and
sporozoites by Cesium Chloride and Percoll discontinuos density gradient. J.
Tropical Med. Hyg., 36: 505.
DPDx – CDC. Diagnostic procedures for stool specimens. 2006.
http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/index.html
Diagnostic Automation , Inc.23961 Craftsman Road, Suite E/F
Calabasas, CA 91302. Tel: 818-591-3030 , Fax: 818-591-8383