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TEMA 16. PROTEÍNAS HUMANAS
RECOMBINANTES
1. INTRODUCCIÓN
Una falta de proteínas terapéuticas humanas viene solucionado por la adición externa de la
proteína. El problema es que están disponibles en cantidades muy limitadas (orina, sangre y
otros tejidos humano y animales), el coste de producción es alto y el modo de acción no estaba
bien caracterizado, además el uso de proteinas animales puede provocar respuesta inmune.
Aparte, la sangre y los tejidos humanos pueden estar contaminados, antes, en las
transmisiones de sangre a los hemofílicos se les contagió de SIDA y hepatitis, y a las personas
con enanismo congénito con Creutzfeld-Jacob.
La solución es buscar el gen que codifica para la proteína y hacer que una célula que crezca
rápido la produzca en grandes cantidades. Una vez producida, habría que aislarla y purificarla,
obteniendo la misma proteína que se produce en el cuerpo humano.
2. PRODUCCIÓN DE INSULINA HUMANA
La insulina es una hormona, que al llegar a sus receptores en la célula activa a vesículas con
receptores de glucosa que se abren al exterior, haciendo que entre mucha más glucosa.
La insulina se extraía del páncreas del cerdo, pero existe un aminoácido de diferencia entre la
insulina porcina y la humana, esto hacía que en muchos casos se dieran reacciones alérgicas.
Además, el proceso de extracción y depuración era laborioso.
Unos investigadores en 1978 fueron capaces de producir grandes cantidades de insulina
humana en el laboratorio, dos años más tarde, el 15 de octubre de 1980, las acciones de la
empresa que realizó esta descubrimiento, Genentech, tuvo el aumento en valor de las acciones
mas elevado en la historia de la bolsa de Nueva York (35 a 89 $)
La insulina se sintetiza como preproinsulina, de ahi se corta un
trozo y pasa a ser proinsulina, ambas inactivas; y al final se
obtiene la insulina que es activa y que esta formada por el
péptido a y el péptido b, unidos por 2 puentes disulfuro.
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Lo que hiceron fue, por ingeniería genética, construir los genes que codificaban para las dos
cadenas de la insulina, estos dos genes los insertaron en dos células distintas de E.coli para que
cada una sintetizara el péptido correspondiente en grandes cantidades.
En estos genes tenemos la región codificante y un gen que codifica para una β-galactosidasa,
una proteina que tambien tiene E.coli, así se engaña a la célula y se obtiene una proteina híbrida
entre β-galactosidasa y cada una de las cadenas, que es estable en las condiciones de
crecimiento de la bacteria y no es degradada.
Una vez que la bacteria ha producido la proteína híbrida hay que separar las correspondientes
cadenas de la β-galactosidasa; para ello se incluye un codón que codificaba para el aminoácido
metionina porque ni en la cadena a ni en la b hay metionina, por lo tanto este aminoácido unía a
la β-galactosidasa con las cadenas, por lo que solo hay que cortar por ahi. Por último se unen
las dos cadenas por métodos químicos mediante puentes disulfuro, y obtenemos la insulina
humana.
3. PRODUCCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES
NUEVAS ESTRATEGIAS EN EL DESARROLLO DE VACUNAS
1. Se pueden eliminar los genes de virulencia de un agente infeccioso manteniendo la
hablidad de estimular una respuesta inune, con lo que eliminamos la posibilidad de una
reversión a la virulencia.
2. Se pueden crear sistemas vivos no patógenos que transporten determinantes antigénicos
de un agente patógeno con el que no estén relacionados.
3. Para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, los genes que
codifican para las proteínas que tienen determinantes antigénicos se pueden aislar, clonar y
exresar en un huésped alternativo que las producirá en grandes cantidades que serán
recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas de subunidades.
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HEPATITIS B
Es una enfermedad vírica producida por el VHB que origina insuficiencia hepática y cáncer
que mataba cada año a dos millones de personas. En 1976, en los laboratorios Merck
demostraron experimentalmente la viabilidad de una vacuna contra este virus, habían obtenido
un antígeno particulado purificado de plasma de enfermos de hepatitis y esto protegía a los
animales por infección por el virus; la vacuna era eficaz pero no podia producirse en grandes
cantidades por la limitación de donantes. La solución vino por la clonación del genoma del virus
y la expresión de las partículas del VHB en Saccharomyces cerevisiae, estas partículas están
glicosiladas (al contrario que la insulina), las bacterias no tienen sistemas de glicosilación y las
levaduras si aunque rudimentario.
El genoma del VHB consta de DNA de cadena doble parcial con unos 3200 pares de bases.
El virus contiene DNA polimerasa en el interior (P), además tiene una cápsida interna-HBc (C) y
una envuelta compleja (S), compuesta de dos envueltas, MHBs (preS2) y LHBs (preS1), que son
proteínas de distinto tamaño.
La estrategia que se siguió para clonar el antígeno de superficie fue insertar el gen en un
plásmido junto con el antigeno de la cápsula y por enzimas de restricción, queda solo el antígeno
de superficie; posteriormente se inserta en un plásmido pbr322 o pHBS-5, y se replica en E.coli,
como lo que se quiere es que se replique en S.cerevisiae hay que introducirle su origen de
replicación, se coge el antígeno de superficie y se introduce en un plásmido con el origen de
replicacion de S.cerevisiae, 2μ.
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VACUNA DEL VHB: La proteína de superficie expresada en
levaduras no se glicosilaba, ya que su sistema de glicosilación
es muy distinto al de las células humanas. Sin embargo, las
estructuras formadas se autoensamblaban de una forma que
asemejaba a la cubierta del virus y no se distinguía del virus,
era un pseudovirus que hacía que la respuesta inmune fuera
buena.
En 1986 se convirtió en la primera vacuna
recombinante apta para su uso en EEUU. Antes de 1986 se
necesitaban 40L de suero humano para producir una única
dosis de la vacuna VHB. Actualmente se obtienen cientos de
dosis de la vacuna recombinante a partir del mismo volumen
de cultivo de levaduras.
4. PERSPECTIVAS FUTURAS
Lo primero antes de desarrollar cualquier medicamento es hacer un estudio de mercado.
DESARROLLO DE UN NUEVO MEDICAMENTO
Se realiza en distintos pasos:
1. Descubrimiento (ensayos en laboratorios):
• RECOLECCIÓN/TAXONOMÍA: Primero hay que diseñar un método de selección del
medicamento que queremos, después analizar muestras y ver si hay algo con actividad
frente a la enfermedad. Una vez recolectada la muestra elegida y analizada, la
identificamos.
• ESPECTRO DE ACTIVIDAD: A continuación determinamos frente a qué es activo ese
medicamento a nivel de laboratorio.
• AISLAMIENTO/PURIFICACIÓN: Cuando vemos que es potencialmente útil realizamos el
aislamiento y purificación
• ELUCIDACIÓN QUÍMICA: Gracias al aislamiento y purificación podemos determinar su
composición y estructura química.
• PATENTES: Por último se patenta (ahora no se hace tanto, ya que es una forma de que
la competencia averigue en que se está trabajando)
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2. Preclínica: Suelen ser estudios biológicos en animales, para ver:
• grado de toxicidad
• farmacocinética
• formulación y estabilidad
3. Ensayos clínicos (lo mas caro), se dividen en tres fases:
• FASE I-SEGURIDAD Y DOSIFICACIÓN: Se hacen pruebas de toxicidad, farmacocinética,
máxima dosis tolerable, dosis aplicada y el esquema de aplicación (cuantas veces hay
que aplicarlo).
• FASE II-EFICACIA Y EFECTOS SECUNDARIOS: Se hace la selección de la indicación
terapéutica, principalmente por la FDA-agencia estatal del medicamento de EEUU, se ve
que no haya otro medicamento en el mercado que actúe contra lo mismo, y que si exste,
el nuevo medicamento sea mejor; y se busca la relacion eficacia-seguridad.
• FASE III-REACCIONES ADVERSAS EN USOS PROLONGADOS: Se compara con otras
terapias y se ve su eficacia a gran escala, esta fase dura bastantes años.
De 20000 muestras analizadas solo 1 es comercializada, y para esto se tardan unos 15 años,
costando 50 0millones de euros. Por ejemplo, la FDA aprobó en 1996 38 biomedicinas, este
número ha ido descendiendo, y en el año 2005 aprobó solo 3.
Actualmente la búsqueda de nuevas proteínas recombinantes humanas se centra en buscar
proteínas glicosiladas lo más parecidas a las humanas. En el dibujo se ve que lo más parecido a
las humanas son las proteínas glicosiladas de animales transgénicos, y vemos que las bacterias
no tienen patrones de glicosilación y que los de las levaduras son muy escasos.
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CÉLULAS IMPLICADAS EN LA PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE
FÁRMACOS
CÉLULAS
VENTAJAS
INCONVENIENTES
Escherichia coli (bacteria)
-Insulina
-hGH
-Tiempo de reproducción corto -Cuerpos de inclusión
-Fermentación rápida
-Sin modificaciónes
-Materia prima barata
Saccharomyces cerevisiae
(levadura)
-VHB
-Crecimiento rápido
-Glicosilaciones diferentes
-No hay cuerpos de inclusión
-Reacciones inmunitarias
-Modificaciones posttraducción
CHO (células de ovario de
hámster chino-mamífero)
-DNAasa
-tPA
-Posibilidad de cultivos en
suspensión
-Patrón de glicosilación muy
parecido al humano
-Cultivo laborioso y caro (por
ser en monocapa por la
inhibición del crecimiento de
las células de mamíferos,no
hay pared celular y se rompen
rápido )
-Rendimiento relativamente
bajo
La experimentación actual está centrada en obtener la proteína humana en un animal, y se
está dirigiendo la síntesis de ese producto a la leche, es decir, solo en las células de las
glándulas mamarias; esto se consigue con un promotor que activa la expresión del genOtra posibilidad que se está desarrollando es el uso de huevos.
El mejor método para obtener la proteína en la que es deficiente el paciente es la terapia
génica, es decir, introducir en el paciente los genes para la proteína correcta y que sustituya a la
defectuosa. El problema es que no hay un método selectivo para introducir el gen en su sitio
correcto, los vectores son virus y su genoma se va a integrar en el genoma humano y puede
integrarse cerca de un promotor que active la expresión descontrolada de determinados genes
para distintas proteínas que pueden inducir la producción de tumores.
TRATAMIENTOS FUTUROS DE LA DIABETES
Van encaminados a conseguir obtener una sustancia similar a la insulina, y que se pueda
administrar oralmente. En MSD (empresa farmacéutica) se buscaban solo sustancias parecidas
a la insulina y despues de 40000 ensayos encontaron que Pseudomassaria, un hongo del Zaire,
producía DAQ (dimetilasterriquinona) que tiene la misma acción que la insulina y que se puede
administrar oralmente.
También se está investigando con células madres, para convertir células madre del ratón en
células β (Universidad Miguel Hernández de Elche)
Se está intentando desarrollar la terapia génica, con ratones transgénicos, que expresan en el
páncreas el gen IGF-1, han logrado regenerar los islotes pancreáticos productores de la insulina
(Universidad Autónoma de Barcelona).
Se desarrolló un inhalador de insulina, pero cayó en desuso ya que resecaba mucho la
garganta a los diabéticos. Actualmente se investiga también el trasplante de islotes pancreáticos
de cerdo que se hubieran desarrollado en monos.
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