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INVESTIGACIÓN PRECLÍNICA EN EL
DESARROLLO DE NUEVOS FÁRMACOS:
Experiencia personal en Ecuador
Dra ELISABET VILA CALSINA
Investigadora Prometeo
Universidad de Cuenca
Ecuador
Catedrático de Farmacología
Facultad de Medicina
Universidad Autónoma de Barcelona,
España
¿POR QUÉ EMPIEZA UN PROGRAMA PARA DESCUBRIR UN
FÁRMACO NUEVO?
Porque existe una necesidad médica insatisfecha
• No exista un fármaco para una determinada enfermedad
• Enfermedad nueva
• Los fármacos existentes produzcan muchos efectos adversos
¿ POR QUÉ FRACASA EN CLÍNICA UN FÁRMACO NUEVO?
•
•
No funciona
No es seguro
FASES DEL DESARROLLO DE UN NUEVO FÁRMACO
> 1 billón de Euros
1. DESCUBRIMIENTO
LEAD
10000 compuestos
2 – 5 años
2. PRECLÍNICA
FDA / EMA
< 250 compuestos
1.5 años
3. CLÍNICA
FDA / EMA
< 5 compuestos
5 - 7 años
4. Aprobación y registro
1 compuesto
1 -2 años
Adaptado de: Rang et al. Pharmacology. 6ª edición.
FASE DE INVESTIGACION PRECLÍNICA
El OBJETIVO principal del ensayo pre-clínico es probar que el
potencial fármaco es eficaz (farmacología) y seguro (toxicología)
para la etapa clínica y conocer su perfil farmacocinético
EFICACIA
IN VIVO
SEGURIDAD
IN VITRO
IN SILICO
FARMACOCINÉTICA
ESTUDIOS PRECLÍNICOS
FARMACODINAMIA
FARMACOCINÉTICA
TOXICOLOGÍA
Evaluación de la Eficacia
¿funciona?
Perfil FC: Como llega al lugar de acción y
las transformaciones que el organismo
ejerce sobre el F
Seguridad
FACTORES QUE PROVOCAN LA INTERRUPCIÓN DEL DESARROLLO DE UN FÁRMACO
Fuente: Predictive ADME and Toxicology Strategies. Dr. Nelesh Patel. 2006.
ESTUDIOS DE FARMACODINAMIA
IN VITRO
Caracterización de receptores
Bioquímicos
/ cultivos
celulares
Fijación con radioligandos
Actividad enzimática
Electrofisiología
Análisis de 2º mensajeros
Tejidos y órganos aislados
Corazón, vasos sanguíneos, intestino
Slices cerebrales
ESTUDIOS DE FARMACODINAMIA
IN VIVO
Animal entero
Comportamientos /efectos
“normales”
Anestésicos
contracepción
Modelos de enfermedades
hipertensión;
diabetes;
epilepsia
RRR
REEMPLAZO: técnicas alternativas
REDUCCIÓN: disminuir el número de animales (uso
adecuado de la estadística)
REFINAMIENTO: reducir el sufrimiento (anestesia,
analgesia, jaulas adecuadas…)
ESTUDIOS DE FARMACOCINÉTICA
Absorción
Células Caco-2
PAMPA
Células MDCK
Transporte PGP
Perfil farmacocinético "in vivo"
Distribución
Unión a proteínas plasmáticas "in vitro“ “in silico”
Distribución en tejidos "in vivo"
Metabolismo
Estabilidad metabólica (microsomas, fracciones
subcelulares, hepatocitos)
Estudios de inhibición de P450 (microsomas)
Estudios de inducción de P450 (chips de ADN, dosis
múltiple)
Eliminación
Cuantificación del compuesto y sus metabolitos en
fluidos biológicos
Fuente: Guía de desarrollo preclínico. GENOMA ESPAÑA. 2012
ESTUDIOS DE TOXICOLOGIA
Estudio de los efectos adversos de agentes biológicos, físicos o químicos
en las personas, animales o en el ambiente
PARACELSO en el siglo XV : “Dosis sola facit venenum”. Lo único que
determina que una sustancia sea o no tóxica es la dosis
OBJETIVO de la T. PRECLÍNICA
Probar la seguridad de un
compuesto antes de su uso en
los estudios clínicos
Mas baratos y rápidos que los estudios in vivo, aunque son menos predictivos
• Citotoxicidad
• Fijación a proteínas
• Inducción/ inhibición de enzimas
• Permeabilidad de membranas
• Inmunotoxicidad
• Metabolismo y cinética
2 especies animales Roedor y No-Roedor
• Dosis única
• Múltiples dosis: 14 días/ 3 meses /12-24 meses
• Estudios toxicocinéticos/FC
• Tx Crónica: Genotoxicidad
• Farmacología de seguridad : CV, respiratorio, SNC
• Tx de la reproducción y del desarrollo: teratogénesis
FUENTES POTENCIALES DE FÁRMACOS
• ORIGEN NATURAL (medicina tradicional o no)
Plantas – marino, agua dulce, terrestres
Animales: marino, terrestre
Microorganismos
Minerales
• LIBRERIAS ya existentes de compuestos sintéticos
• Síntesis combinatoria
• Diseño por ordenador
• Fármacos ya existentes
• Serendipity
• Ingeniería genética
VLIR DE PLANTAS MEDICINALES - UNIVERSIDAD DE CUENCA
CULTIVO DE ALGAS
PLANTAS VASCULARES
EXTRACTOS
• Solventes
• Fluidos supercríticos
ESTUDIOS DE ACTIVIDAD FARMACÓLOGICA
In vitro
Ensayos bioquímicos
Cultivo celular
In vivo
Danio rerio
Mus musculus
Rattus norvegicus
ELUCIDACION ESTRUCTURAL PARCIAL
• Separación de componentes en base a cromatografía (capa
fina, columna, Cromatografía de Gases y HPLC)
• Detección de componentes en base a arreglo de diodos (UV)
• Espectrometría de masas
ALGUNAS CONSIDERACIONES PARA LA INVESTIGACIÓN
PRECLÍNICA
• Necesidad de una REGULACIÓN NACIONAL para el estudio
con animales / células
• Necesidad de creación de Comités Éticos de Experimentación
Animal que sigan normas internacionales
• Bioterios normalizados según legislación internacional
• Agilización del sistema de importación para investigación
CARACTERIZACIÓN DE LA
CAPACIDAD ANTIINFLAMATORIA de
Jungia rugosa LESS en roedores
Jungia rugosa Less (Asteraceae)
Zona andina de Ecuador y se la conoce como “Carne humana” or “Fompo”
Sinónimos:
Cineraria stipulacea Willd ex Less
Jungia bullata Turcz
Jungia jelskii Hieron
Jungia malvifolia Muschl
TRADICIONALMENTE se usa para el tratamiento de:
• contusiones
• magulladuras
• heridas
• cortes
• otros procesos inflamatorios externos
ANÁLISIS FITOQUÍMICO DEL EXTRACTO METANÓLICO
Metabolites
Alkaloids
Anthracene
derivatives
Spray reagent
Chemical standard
Presence
Dragendorff; Ninhydrine
Berberine chloride
Negative
10% KOH in ethanol
Rhein
Negative
Bitter principles
Anysaldehyde-sulphuric acid; Vanillinsulphuric acid,
___
Positive
Cardiac
glycosides
Kedde reagent; Antimony III-chloride
reagent
___
Negative
Coumarins
10% KOH in ethanol; PEG natural Scopoletin; Umbelliferon
products reagent
Negative
Flavonoids
10% KOH in ethanol; PEG natural Quercetin; Quercetin
products reagent
3-gluconoride;
Isorhamnetin;
Apigenin
Anysaldehyde-sulphuric acid; Vanillin- Geraniol; Eugenol; Sclareol
sulphuric acid; Liebermann-Burchard
reagent
Positive
Vanillin-sulphuric acid
Positive
Terpenoids
Saponins
Escin
Positive
PRUEBAS DE SOLUBILIDAD DEL EXTRACTO
AGUA
DMSO : tóxico
CMC (1%): suspensión
Tween 20 (2% - 1%) máxima dosis soluble 75 mg/ml
TOXICIDAD AGUDA
Grupos de 8 animales: 125, 250, 500 y 750 mg/kg; i.p.
• Cambios de comportamiento (24 h)
• Mortalidad (14 días)
• Registro de peso corporal (14 días)
• Índice peso órganos/peso corporal (el día 14)
TOXICIDAD AGUDA: peso corporal
FASES INFLAMACIÓN AGUDA
1. Aumento de la permeabilidad vascular
Exudación de fluidos de la sangre
al líquido intersticial
Edema de oreja y Edema plantar
2. Infiltración de leucocitos de la sangre a los tejidos
Actividad de la MPO en tejido
3. Formación de granuloma y reparación tisular (fase proliferativa)
Cotton granuloma
EDEMA EN OREJA
Vehiculo
(Control)
Indometacina
(10 mg/kg)
EMJR
30 min
OD: Aceite de croto
OI: 2.5% acetona
4h
SACRIFICIO
(bajo
anestesia)
OD/OI
EDEMA de OREJA (ratón)
EDEMA DE OREJA
50
**
***
***
20
0,3
OD/tissue
Ear oedema (mg)
*
Tween 20 (1%)
JRLE (125 mg/kg)
JRLE (250 mg/kg)
JRLE (500 mg/kg)
Indomethacin (10 mg/kg)
0,4
Tween 20 (1%)
J rugosa (125 mg/kg)
J rugosa (250 mg/kg)
J rugosa (500 mg/kg)
Indomethacin (10 mg/kg)
40
30
MIELOPEROXIDASA
0,2
**
**
**
***
0,1
10
0
0,0
El EMJR disminuye el edema de oreja y la formación de MPO,
inducido por aceite de crotón en ratón
EDEMA PLANTAR EN RATA
Vehiculo
(Control)
Indometacina
(10 mg/kg)
EMJR
30 min
100 µl
Carragenina 1%
pata derecha (sc)
0 -6 h
V desplazado de la
pata inflamada
EDEMA PLANTAR (rata)
5000
1000
4000
800
600
AUC
Volume increase (ul)
Tween 20 (1%)
JRLE (125 mg/kg)
JRLE (250 mg/kg)
JRLE (500 mg/kg)
Indomethacin (10 mg/kg)
3000
*
*
2000
400
Tween 20 (1 %)
JRLE (125 mg/kg)
JRLE (250 mg/kg)
JRLE (500 mg/kg)
Indomethacin (10 mg/kg)
200
0
1000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Time (h)
El EMJR (500 mg/Kg) disminuyen tanto la 1ª como la 2ª fase y las dosis
menores solo la 2ª fase del edema plantar inducido por carragenina
COTTON PELLET GRANULOMA
1.
2.
3.
4.
Anestesiar, afeitar la espalda, limpiar con etanol
Hacer una incisión en la parte dorsal, abrir
Implantar por via sc el “pellet” de algodón esterilizado
Coser o grapar la incisión
G1 – G4: ≠ concentraciones de extracto
G4: Vehículo (Tween 20; 1%)
G5: Indometacina (10 mg/kg)
Implantación
Sacrificio
pellet
TRATAMIENTO
0
1
2
3
i) Sacrificar al ratón
ii) Extraer el pellet de algodón
iii) Pesar (peso total, Pi)
iv) Secar (24h, 60ºC o 48 h, 37ºC)
v) Pesar (peso seco, Ps)
4
5
6
7
DIAS
i.p.
COTTON PELLET GRANULOMA (ratón)
Tween 20 (1%)
JRLE (125 mg/kg)
JRLE (250 mg/kg)
JRLE (500 mg/kg)
Indomethacin (10 mg/kg)
18
16
Dry weight (mg)
14
12
10
**
**
8
6
4
2
0
El EMJR disminuye la formación de granuloma
ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
AGUDA
CRÓNICA
EDEMA DE OREJA
MPO
COTTON PELLET GRANULOMA
EDEMA PLANTAR
CONCLUSIÓN
EJRL posee potencial anti-inflamatorio compatible con su uso popular
Journal of Ethnopharmacology, 2015 (en prensa)
Inflamación por LPS: Estudios in vitro
Cultivo de macrófagos (Raw 264,7)
Viabilidad celular: MTT
Estimulacion con LPS
Nitritos
Citoquinas
PCR
Inflamación por LPS: Estudios in vivo
Extracto
30 min
LPS (20
mg/kg), ip)
24h
Anestesiar
(PB 50
mg/kg)
Extraer sangre por puncion
cardiaca, obtener plasma,
alicuotar, congelar a -80ºC
VHC
Determinación de Nitritos (Griess), TNF-α, IL-1 β, IL6, IL-10 (ELISA kits)
Sacrificar el animal;
recoger tejidos y
congelar con N2 y
guardar a -20ºC
VLIR DE PLANTAS MEDICINALES, UNIVERSIDAD DE CUENCA
GRACIAS