1. No category

QUÍMICA BIOLÓGICA 2016
TP N° 3: METABOLISMO OXIDATIVO EN LEVADURAS
El trabajo práctico consiste en 2 sesiones de trabajo (Días 1 y 2), en los cuales se utilizará
como modelo de estudios la levadura Pichia pastoris, a fin de evaluar la velocidad de
consumo de glucosa de dicho microorganismo en presencia de distintos efectores (Día 1),
y las propiedades de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (Día 2).
INFORMACIÓN GENERAL
La mayoría de las levaduras utilizan azúcares como principal fuente de energía y
carbono para su metabolismo a través de la vía glucolítica; sin embargo, el destino del
piruvato depende de la especie de la levadura y de las condiciones de cultivo (Gancedo y
Serrano, 1989; Flores et al. 2000).
Los azúcares no pueden atravesar libremente las membranas lipídicas, por lo cual el
primer paso del catabolismo de estos carbohidratos tiene como objetivo el transporte de
tales compuestos a través de la membrana plasmática. Este transporte es catalizado por
sistemas específicos denominados permeasas. Algunos disacáridos no son transportados
al interior de la célula por permeasas, sino que son hidrolizados fuera de la membrana. La
capacidad de hidrolizar tales compuestos depende de la especie de la levadura y de la
naturaleza del azúcar.
Pichia pastoris es una levadura anaeróbica facultativa. El género Pichia pertenece a la
familia Saccharomycetaceae del reino Fungi (Kurtzman, 1984; Sreekrishna y Kropp, 1996).
Esta especie es considerada un fermentador débil, debido a que durante su crecimiento
aerobio una proporción menor al 30% de glucosa es fermentada, presentado una elevada
velocidad de respiración (entre 150-250 μmoles de O2·gcélulas-1.min-1) (Gancedo y
Serrano, 1989). Esta propiedad permite cultivar a estas levaduras a elevadas densidades
celulares, pues no hay formación significativa de subproductos del metabolismo
fermentativo, tales como el etanol, que podrían inhibir la proliferación celular; y hace que
sea un microorganismo muy utilizado en biotecnología, por ejemplo para la producción a
gran escala de proteínas recombinantes (Wu et al., 2014).
MATERIAL PROVISTO POR EL ALUMNO
Guardapolvo
Guantes
Marcador indeleble
ATENCIÓN:
Una vez finalizada cada sesión cada grupo deberá dejar su lugar de trabajo ordenado y
los tubos de vidrio utilizados lavados y desrotulados.
DÍA 1: IMPACTO DE EFECTORES METABÓLICOS SOBRE LA VELOCIDAD DE
CONSUMO DE GLUCOSA EN LAVADURAS.
OBJETIVOS:
Determinar la velocidad del consumo de glucosa de un cultivo de P. pastoris en
diferentes condiciones metabólicas, definidas por la ausencia de algún sustrato o la
presencia de un inhibidor de la ruta glucolítica.
REACTIVOS Y SOLUCIONES:
Glucosa 50 mM
Fosfato de Sodio 500 mM pH 5,5
Fluoruro de Sodio 100 mM
Buffer MES-NaOH 25 mM pH 5,5
Vaselina
Reactivo comercial para dosar glucosa (Wiener lab)
Cultivo de P. pastoris
MÉTODOS:
PREPARACIÓN DEL CULTIVO DE PICHIA PASTORIS
Las levaduras (mantenidas a -80 °C) fueron crecidas 16 horas a 30 °C y 180 rpm en 5 mL
de medio YPD (de las siglas en ingles: Yeast extract, Peptone, Dextrose, compuesto de: 10
g.L-1 extracto levadura, 2 g.L-1 peptona de caseína y 2 g.L-1 glucosa). A continuación, las
células fueron recuperadas por centrifugación y resuspendidas en un Erlenmeyer
conteniendo 250 mL de medio YPD. Luego de 24 h de crecimiento a 30 °C, se adicionaron
80 mL de glicerol 80 % v/v, y el cultivo fue fraccionado y almacenado a -80 °C hasta su uso.
DOSAJE DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA MEDIANTE EL MÉTODO DE LA GLUCOSA
OXIDASA
La glucosa oxidasa cataliza la oxidación de glucosa formando peróxido de hidrógeno, el
cual se cuantifica vía la reacción de la peroxidasa. El oxígeno se transfiere desde el
peróxido de hidrógeno a un aceptor produciendo un compuesto coloreado, el cual puede
ser detectado por medidas de absorbancia a 530 nm:
Glucosa + O2 + H2O
2 H2O2 + 4-AF + Fenol
+ 4 H2O
GOX: glucosa oxidasa
POD: peroxidasa
4-AF: 4-aminofenazona
GOX
POD
Ác. Glucónico + H2O2
4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona
Curva de Calibración del método de la glucosa oxidasa
El rango de linealidad del sistema es de 0,010 a 0,12 moles de glucosa.
Relación entre DO y peso seco (g.L-1)
PROCEDIMIENTO A REALIZAR:
1-LAVADO DEL CULTIVO DE LEVADURAS:
Para eliminar los contaminantes presentes en el medio de cultivo que podrían interferir
en el análisis (como glucosa residual y glicerol), el cultivo de levaduras será centrifugado
durante 2 min a 10000 rpm y las células resuspendidas en 2 mL de buffer MES pH 5,5.
Colocar el tubo en hielo.
2-MEDIOS DE REACCIÓN:
Se ensayará el consumo de glucosa por las levaduras bajo cuatro condiciones
diferentes (volumen final: 2,5 ml):
A
B
C
Glucosa (50 mM)
1 mM
1 mM
1 mM
Fosfato de sodio (500 mM)
-------10 mM
10 mM
Fluoruro de sodio (100 mM)
--------------40 mM
Vaselina*
---------------------Levaduras
0,48 ml
0,48 ml
0,48 ml
Buffer MES pH 5,5 (25 mM) Csp 2,5 ml Csp 2,5 ml Csp 2,5 ml
D
1 mM
10 mM
-------SI
0,48 ml
Csp 2,5 ml
*Luego de finalizar la preparación del tubo 4 agregar 0,5 ml de vaselina sobre la
superficie del líquido.
Se rotularán 4 tubos de khan (tubos A, B, C y D), y en cada tubo se colocarán las
soluciones descriptas en la tabla, agregando por último a las levaduras. Las reacciones se
comenzarán con el agregado de las levaduras. Los medios de reacción se incubarán en un
baño a 30°C. De cada uno de los tubos se toman alícuotas de 0,2 ml a los tiempos 0 (antes
de incubar los tubos en el baño), 15 y 30 minutos. Inmediatamente después de tomar las
alícuotas, estas se centrifugarán 1 minuto a máxima velocidad en centrífuga de Eppendorf
para bajar las levaduras de manera que éstas no interfieran en las medidas de absorbancia
posteriores. Se colocarán 0,1 ml de los sobrenadantes en tubos de khan rotulados, los
cuales se utilizarán para cuantificar el contenido de glucosa.
3- CUANTIFICACIÓM DE LA GLUCOSA PRESENTE EN EL MEDIO POR EL MÉTODO DE LA
GLUCOSA OXIDASA:
Para cuantificar la glucosa consumida en las muestras (tubos A-D) se preparará:
0,9 ml de agua + 0,1 ml de muestra + 0,5 ml de Reactivo de Glucosa
Los tubos se incubarán durante 5 minutos a 37°C y luego se leerá la absorbancia a 530
nm contra el blanco de reacción.
ANALISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS:
Cada grupo deberá incluir en su informe los siguientes puntos:
a)
Tabla con los siguientes datos obtenidos:
(Tener en cuenta que una dilución 1/50 del cultivo de levaduras utilizado durante el
práctico dio una DO de 0,237)
Abs
T0’
µmoles
glucosa T0’
Abs
T15’
µmoles
glucosa
T15’
Abs
T30’
µmoles
glucosa T30’
Velocidad de
consumo (µmoles
glucosa.gcélulas-1.min-1)
Tubo
A
Tubo
B
Tubo
C
Tubo
D
b)
Graficar µmoles de glucosa residuales en función del tiempo, y trazar en un mismo
grafico los puntos correspondientes a cada uno de los tubos (A-D).
RESPONDER:
1) De acuerdo a la teoría, en cuál de las 4 condiciones se esperaría observar la mayor
velocidad de consumo de glucosa? Fundamentar ¿Coincide con los resultados obtenidos?
2) Buscar en la bibliografía y explicar brevemente (5-6 renglones) las rutas metabólicas
que utiliza P. pastoris para consumir glucosa en ausencia de oxígeno. Citar la fuente
utilizada.
3) ¿Qué condición produjo la menor velocidad de consumo? ¿Cuál sería el fundamento
teórico del resultado obtenido?
4) ¿Esperarías encontrar diferencias en el consumo de glucosa entre los tubos A y B?
¿Porque? ¿Fue realmente observado lo que esperabas? ¿En caso negativo, a que podría
deberse?
5) En el protocolo de glucólisis se trabaja con una concentración de glucosa inicial de 1
mM. ¿Está este valor dentro del rango de linealidad del método? ¿Fueron las medidas
correctas? Explicar.
6) ¿Si quisieras determinar el contenido de glucosa en una muestra biológica, elegirías el
método de la Glucosa Oxidasa o el de Somogyi-Nelson? Justificar.
DIA 2: ESTUDIO DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES
MITOCONDRIAL.
Con el fin de estudiar el flujo de electrones a través de los complejos involucrados en la
cadena de transporte de electrones de la membrana interna mitocondrial, se utilizará un
aceptor artificial de electrones, el DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol). Este compuesto es
azul en su forma oxidada y es capaz de aceptar dos electrones de uno de los complejos del
sistema de transporte de electrones mitocondrial, tornándose incoloro al reducirse. El
DCPIP no impide el funcionamiento de la cadena de transporte de electrones, de modo
que durante los ensayos existe flujo de electrones hacia el aceptor artificial y hacia el
oxígeno simultáneamente.
DCPIP forma oxidada (azul)
DCPIP forma reducida (incoloro)
OBJETIVOS:
 Observar y describir los cambios que sufre el aceptor artificial de electrones en los
distintos ensayos propuestos.
 Formular una hipótesis acerca de la naturaleza del compuesto dador de electrones y
el complejo del cual acepta los electrones el DCPIP.
 Predecir los cambios que sufriría el aceptor artificial de electrones en los casos
propuestos en la tabla II.
REACTIVOS Y SOLUCIONES:
DCPIP: 1 mM (Forma oxidada: max: 600 nm.
600 nm: 22000 M-1 cm-1)
Dador X: 100 mM
Buffer de medida: fosfato de potasio 100 mM pH 7,4
DNF: 2 mM
Malonato: 500 mM
Antimicina 10 mM
KCN: 50 mM
Mitocondrias
METODOS:
PREPARACION DE MITOCONDRIAS:
Las mitocondrias se prepararon a partir de células de P. pastoris, según Diekert y col.
(2001). Las células fueron crecidas como se detalló previamente (Día 1) y recolectadas por
centrifugación a 3000xg durante 15 min a 8°C. Se realizaron dos lavados del pellet celular
con H2O destilada y finalmente se resuspendieron en la solución amortiguadora SHP fría
(0.6 M Manitol, 20 mM Tris:HCl pH 7,5, 1 mM PMSF). Se agregaron esferas de vidrio (0.40.5 mm de diámetro) a los tubos con las células y se realizó una ruptura mecánica de las
mismas por agitación vigorosa durante 1 minuto a máxima velocidad. Esto se repitió en
total 5 veces, incubando en hielo entre cada paso de ruptura. La suspensión resultante se
centrifugó a baja velocidad (600xg) durante 5 min. El sobrenadante que contiene
mitocondrias, membranas celulares y citosol, fue transferido a un tubo limpio y el pellet
(células enteras) fue sometido nuevamente a ruptura mecánica y centrifugación a baja
velocidad. El sobrenadante obtenido se colocó junto con el anterior. Seguidamente, se
centrifugó todo a 16100xg durante 30 minutos a 8°C. El pellet, que contiene mitocondrias,
fue lavado con solución amortiguadora SHP, centrifugado, resuspendido en un volumen
final de 1 ml de SHP y fraccionado en alícuotas de 60 µl, las cuales se conservaron a -80°C
hasta su utilización.
PROCEDIMIENTO A REALIZAR:
Las medidas de la reducción de DCPIP se realizarán en forma continua midiendo la
variación de la absorbancia a 600 nm debido a la desaparición de su forma oxidada en un
espectrofotómetro. Se prepararán 6 mezclas con los componentes detallados en la
siguiente tabla.
Preparar la mezcla en la cubeta de medida sin el dador de electrones ni las
mitocondrias y preincubar 2-3 minutos a 30 ºC. Posteriormente, agregar las mitocondrias
y el dador, homogenizar por inversión y comenzar inmediatamente la lectura de la
absorbancia durante 3 minutos.
Registrar en cada caso la variación de absorbancia por minuto y tomar la lectura más
estable y lineal. Previamente se realiza una línea de base en el espectrofotómetro
colocando 1 ml de buffer en la cubeta.
ATENCIÓN: homogenizar suavemente la suspensión de mitocondrias antes de pipetear.
Trabajar con guantes, algunas sustancias son tóxicas.
TUBO
1. CONTROL
2. NORMAL
3. DNF (80 M)
4.CIANURO (2 mM)
5.ANTIMICINA (0,4 mM)
6. MALONATO (100 mM)
BUFFER
(l)
DCPIP
(l)
MITOCONDRIAS
(l)
AGREGADO
(l)
900
890
850
850
850
850
50
50
50
50
50
50
10
10
10
10
10
40
40
40
40
DADOR DE
ELECTRONES X
(l)
50
50
50
50
50
50
PREDICCIONES EN BASE A LO OBSERVADO:
Teóricamente: ¿Cómo se vería afectada la velocidad de reducción del DCPIP en cada caso
contemplado en el siguiente cuadro? Referencias: + (igual al control); ++ (mayor al
control); - (velocidad=0)
Complejo dador Dador de electrones
al DCPIP
I
II
III
IV
NADH
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
Succinato- FADH2
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
Ascorbato + TMPD
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
DNF
Antimicina A
Malonato
KCN
ANALISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS:
1) Determinar el complejo del cual recibe electrones el DCPIP fundamentando su
respuesta.
2) Determinar el complejo al cual dona los electrones el dador X, indicando qué
compuesto puede ser X.
3) Calcular para los ensayos 2, 3 y 6 la velocidad de flujo de electrones (nmoles de
electrones/min) que fueron transferidos hacia el DCPIP en todo el volumen de ensayo.
4) ¿Las mitocondrias se encuentran en estado acoplado o desacoplado? ¿Por qué?
¿qué diferencias esperarías encontrar entre los tubos 1 y 2? ¿Por qué se incluye un control
sin mitocondrias?
LINKS INTERESANTES
En el siguiente link, pueden encontrar simulaciones de varios procesos biológicos. Es
posible en alguno de ellos cambiar variables y ver cómo se comporta el sistema. Aunque
está en inglés, vale la pena investigarlo. http://mw.concord.org/modeler/ Bajen a Selected
Curriculum Modules, entre los modelos está Chemical respiration, tendrán que descargar
un archivo a su PC, necesitarán tener Java.
En este link se encuentra la cadena modelizada con algunas animaciones:
http://brookscole.cengage.com/chemistry_d/templates/student_resources/shared_resou
rces/animations/oxidative/oxidativephosphorylation.html
BIBLIOGRAFÍA
Diekert K., Kroon A., Kispal G., Lill R. (2011). Isolation and Subfractionation of Mitochondrial
from the Yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology, vol. 65, Academic press.
Flores C.L., C. Rodriguez, T. Petit, et al. (2000). Carbohydrate and energy-yielding metabolism in
non-conventional yeasts. FEMS Microbiol. Rev., 24: 507-529.
Gancedo C., Serrano R. (1989) Energy yielding metabolism. In: A.H. Rose and J.S. Harrison, eds.
The Yeasts. Academic Press, London., pp. 205-259.
Kurtzman C.P. (1984). Synonymy of the Yeast Genera Hansenula and Pichia Demonstrated
Through Comparisons of Deoxyribonucleic Acis Relatedness. Antonie van Leeuwenhoek. J
Microbiol. 50: 209-17.
Sreekrishna K., Kropp K.E. (1996). Pichia pastoris, in Nonconventional Yeast in Biotechnology. A
Handbook., K Wolf, Editor. 1996, Springer Verlag: Berlin., pp.203-253.
Wu M., Liu W., Yang G., Yu D., Lin D., Sun H., Chen S. (2014). Engineering of a Pichia pastoris
expression system for high-level secretion of HSA/GH fusion protein. Appl. biochem. biotechnol.,
172(5): 2400-2411.