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••• ANALÍTICA
Eficacia de la ATPmetría como
método de verificación del tratamiento
de efluentes generados en una
Instalación de Contención Biológica
Debido a que el tratamiento de efluentes resulta un punto crítico que permite vehiculizar agentes biológicos patógenos fuera de un espacio biocontenido, resulta imprescindible verificar y
cuantificar de una forma rutinaria, y si es posible, proceso por proceso la ausencia o presencia
de suficiente carga biológica potencialmente contaminante antes de un vertido al exterior. El
siguiente artículo muestra un método de medición de ATP de aplicación en este proceso.
G .Pascual Álvarez1, D .Garrido
Velayos2. Mª Paz De Miguel
Casas3, E. Nancy Gómez-España3,
F .David García Domínguez3,
M. Angel Casado Cuadrado3,
L. Martinez Alonso3, Mª Paz
Mengibar Vallejo3.
1 Jefe del Servicio de Seguridad Biológica. Centro
de Investigación en Sanidad Animal, INIA.
2 Jefe de Equipo de Seguridad Biológica. VEOLIA
Servicios.
3 Técnicos de Seguridad Biológica. VEOLIA
Servicios.
Para determinar el estatus
biológico de los efluentes altamente biocontaminados generados en una instalación de
Contención Biológica, se ha
estudiado la viabilidad de uso
de un método de verificación
por medición de la bioluminiscencia del ATP (trifosfato
de adenosina) debido a su gran
rapidez, sensibilidad y sencillez de uso.
Para poder validar el método, los resultados obtenidos se
han comparado con los obtenidos en procesos coincidentes mediante el empleo de una
técnica conocida y aceptada
internacionalmente: uso de
bioindicador estándar específico para procesos de esterilización por calor: Geobacillus
stearotermophilus vinculando
la ausencia de crecimiento del
mismo a los niveles de ATP alcanzados en cada prueba.
Las pruebas se han realizado
en condiciones reales de trabajo en una Instalación de nivel
3 de contención biológica, dotada de boxes de experimen-
tación animal para grandes y
pequeños animales donde se
alcanzan altos valores de contaminación en los efluentes
generados.
Introducción
Uno de los grandes problemas
que se presentan en las Instalaciones de contención biológica
y en especial en aquellas donde
se desarrollan líneas de experimentación animal, procesos de
producción o actividades de
diagnóstico, es la posible presencia de sólidos conformados
o en suspensión altamente biocontaminados en los efluentes
generados.
A pesar de la posible existencia de un sistema previo
de separación de sólidos, una
Figura 1. El producto empleado para la toma de muestras se corresponde con el desarrollado por la empresa 3M para la determinación de ATP
total para Aguas (3M™ Clean-Trace™). Para la medición de dicho ATP se ha utilizado un Luminómetro NG 3M™ Clean-Trace™ nº serie: 0702-01091, calibrado el 28-09-2014. Dichos productos demuestran ser los más sensibles y con mayor garantía de repetitividad.*
78
MARZO/ABRIL16
parte de los mismos y en dependencia del tamaño de poro
presente en tamiz de filtración
(normalmente tamaños entre
0,2 mm y 0,9mm), serán arrastrados hacia los reactores destinados al tratamiento de los
efluentes generados.
La eficacia del sistema de
tratamiento de efluentes implantado, vendrá dada por la
capacidad de alcanzar un producto residual exento de carga
biológica viable o situada en
un nivel inferior al mínimo
necesario para determinar que
el vertido supone un escape
biológico capaz de generar infección.
Como
tratamiento
de
efluentes, el uso de los sistemas
químicos, térmicos o termoquímicos, resulta fundamental
y como tal es contemplado en
las diferentes legislaciones,
normativas y recomendaciones nacionales e internacionales establecidas en la materia,
como elemento imprescindible a implantar.
El método utilizado se ha
implantado y validado en el
Centro de Investigación en
Sanidad Animal (CISA), como
Instalación de Alta ContenFARMESPAÑA INDUSTRIAL
ANALÍTICA
Fecha toma de
muestras
1
2
3
4
5
6
4/30/2013
307
249
352
367
247
270
5/8/2013
433
492
716
786
598
751
5/9/2013
181
181
309
460
514
485
5/14/2013
480
438
533
696
486
745
5/29/2013
4148
1198
4908
4358
4195
3541
11/14/2013
245
277
107
95
105
90
12/3/2013
302
304
322
376
262
449
12/5/2013
244
171
318
184
178
242
12/17/2013
292
434
95
85
93
86
2/4/2014
453
504
293
447
433
674
3/25/2014
118
185
688
460
354
438
3/26/2014
1,608
1,523
677
577
394
446
3/27/2014
1,398
1,775
1,037
1,258
856
1,032
4/8/2014
1,931
1,004
2,032
2,071
1,673
1,470
4/9/2014
12,809
12,284
7,963
2,102
4,535
3,055
Tabla 1. Valores de ATP total en efluentes contaminados. Muestras: 1, 2, 3, 4, 5, 6 expresadas en URL: Unidades relativas de luz.
ción Biológica, donde los
efluentes generados representan riesgo de enfermedades
sanitarias humanas y animales
catalogadas como Grupo 3 de
Riesgo Biológico.
Objetivo
El objetivo del presente estudio es la utilización del método
de medida de ATP en líquidos,
como sistema de verificación
diaria de la eficacia de funcionamiento de reactores termoquímicos como sistema de
esterilización de los efluentes
altamente biocontaminados
generados en un Nivel 3 de
Contención Biológica (NCB3)
dotado de un área de experimentación animal.
Como sistema validador del
proceso, se simultanea el uso
de sistema tradicional de cultivo biológico de Geobacillus
stearotermophilus, que permite
demostrar microbiológicamente la eficacia de la esterilización.
Material y método
El estudio se ha desarrollado
en una planta de tratamiento
de efluentes de una Instalación
de nivel 3 de Alta Contención
Biológica (NCB3) que dispone
FARMESPAÑA INDUSTRIAL
El objetivo del presente estudio es la
utilización del método de medida de ATP
en líquidos, como sistema de verificación
diaria de la eficacia de funcionamiento
de reactores termoquímicos como
sistema de esterilización de los efluentes
altamente biocontaminados generados en
un Nivel 3 de Contención Biológica
de un reactor termoquímico
de 4.000 litros.
Mediante la medición de
ATP como molécula presente
tanto en la materia orgánica residual como en todas las
células animales, vegetales,
bacterias, levaduras y mohos,
se pretende determinar la presencia microbiana posterior
a los tratamientos térmicos o
químicos, y por lo tanto, determinar de forma rutinaria la
eficacia de la esterilización.
El sistema de monitorización, se basa en la cuantificación de la luz generada durante el proceso de reacción entre
la enzima luciferin/luciferasa y
el ATP, expresándose el resultado como Unidades Relativas
de Luz (URL) (figura 1).
El ATP para Aguas CleanTrace™ 3M™, consta de un hisopo (Hisopo Aqua-Trade AQT
100) que contiene un agente
catiónico: luciferina. Su función
es liberar el ATP tanto de células microbianas como del residuo orgánico. Al ser introducido en un tubo con el catalizador
(solución buffer de magnesio),
genera luz. La intensidad de la
luz es directamente proporcional a la cantidad de ATP que se
encuentra en la muestra.
Se puede medir tanto ATP
total (T) como ATP libre (F), la
diferencia entra ambas es que
el ATP T mide el ATP de las
células microbianas y del residuo orgánico y el ATP F mide
únicamente el ATP del residuo
orgánico. En este estudio se
toman medidas únicamente
del ATP total para abarcar más
amplio espectro.
El proceso desarrollado consiste en la toma de muestras
anterior y posterior a la esterilización de los efluentes por un
sistema termoquímico (adicción de peróxido de hidrógeno, y posteriormente subida de
temperatura a 135ºC, manteniéndola durante 20 minutos).
Terminado el proceso se procede a la toma de muestras de
efluente que se enfrenta al luminómetro para determinar un
valor en URL manteniendo en
cada muestra un patrón común
de tiempo de muestreo.
El trabajo de campo se realizó entre abril de 2013 y abril
de 2014.
La toma de muestras se divide en dos fases:
1. Toma de muestras del efluente contaminado: se toman
seis muestras, por separado
MARZO/ABRIL16
79
ANALÍTICA
Fecha toma de
muestras
1
2
3
4
5
6
4/30/2013
18
20
21
30
29
28
5/8/2013
31
21
9
16
7
14
5/9/2013
12
6
7
8
4
7
5/14/2013
13
11
15
13
6
6
5/29/2013
7
5
5
3
3
6
11/14/2013
3
3
1
2
6
9
12/3/2013
6
8
8
10
10
6
12/5/2013
153
126
5
7
192
155
12/17/2013
11
11
4
3
5
11
2/4/2014
4
23
8
19
10
6
3/25/2014
7
8
6
5
6
6
3/26/2014
5
4
9
3
4
14
17
3/27/2014
5
1
8
13
4
4/8/2014
2
3
3
5
5
4
4/9/2014
2
3
3
3
5
5
Tabla 2. Valores de ATP total en efluentes esterilizados. Muestras: 1, 2, 3, 4, 5,6 expresadas en URL: Unidades relativas de luz.
en frascos estériles y se realizan lecturas de ATP, de cada
muestra contaminada. Con el
fin de descartar un exceso de
depósito de malina en el depósito de vaciado en la toma
de muestras, se deja salir 500
ml de efluente antes de realizar la toma de muestras.
2. Toma de muestras del efluente
tratado: se toman seis muestras en tubos estériles, en cada
una de las cuales se realizan
una medición de ATP.
Se inicia el método desarrollado tomando muestras en
frascos estériles del efluente sin
tratar gracias a la existencia de
un punto de muestreo situado
en la virola del reactor.
Se realizan las lecturas en un
rango de tiempo entre los 2 y 5
minutos.
Se numeran y marcan como
muestras contaminadas.
Posteriormente, se introducen 12 tubos estériles numerados del 1 al 12 en posición
descendente en una barra
metálica diseñada para toma
de muestras, con el fin de cubrir toda la sección vertical
del reactor. Los tubos impares
se presentan vacíos con el fin
de llenarse de efluente para la
80
MARZO/ABRIL16
Se ha podido determinar que, aunque el
sistema de medición resulta ser ágil y
dinámico y que puede ser utilizado en
diversos campos de la industria ya que
es un indicativo rápido de la pureza de
los efluentes, no constituye un proceso
probatorio único
medida del ATP y a los pares
se les introduce una ampolla
con medio de cultivo y disco
de esporas con Geobacillus
stearotermophilus.
Durante el proceso de tratamiento del efluente y cuando
este se encuentra a una temperatura entre los 80 y 90ºC se
realiza una dosificación de 15
litros de peróxido de hidrógeno al 35%.
El proceso de esterilización
alcanza una temperatura de
135ºC y se mantiene durante
20 minutos.
Durante todo el proceso, simultáneamente se mantiene el
efluente en agitación de forma
que se garantice la mezcla eficaz y homogénea del producto.
Los controles biológicos se
ponen a cultivar junto con un
control positivo y los tubos
con efluente se trasportan a
una cabina de seguridad biológica clase IIA (TELSTAR) para
realizar la toma de muestra.
Resultados
La toma de muestras se ha realizado en un periodo de tiempo de un año.
Los resultados obtenidos
de la medida de ATP total en
efluentes contaminados se presentan en la Tabla 1. Los valores obtenidos de ATP total tras
la esterilización del efluente se
presentan en la Tabla 2.
En el efluente contaminado
el rango de resultados varía de
85 a 12809 URL. En el efluente
esterilizado el rango de resultados varía de 2 a 31 URL.
Los resultados obtenidos
en los cultivos biológicos (con
Geobacillus stearotermophilus)
tras la esterilización de los
efluentes, indican que el proceso de esterilización se realizó
correctamente exceptuando el
proceso del 05-12-2013 que
presentó 4 positivos por lo que
se abortó el ciclo.
En la Gráfica 1, se representa
una comparativa entre los valores medios de ATP total determinado en el efluente contaminado y una vez tratado.
Conclusiones
Los resultados obtenidos se
corresponden con una actividad del Centro entre el 50%
y el máximo de su capacidad,
por lo tanto se recogen resultados en las peores condiciones
posibles generadoras de materia contaminada en el efluente.
Para los resultados obtenidos de ATP total en el efluente
esterilizado, se obtienen valores por debajo de las 30 URL,
indicativos de reducción de la
contaminación. Se presenta una
excepción en la muestra tomaFARMESPAÑA INDUSTRIAL
ANALÍTICA
da el 05-12-2013. El resultado
obtenido fue descartado al ser
comparado con el registrado en
la misma prueba con el uso del
bioindicador y comprobar que
este dio positivo. En este caso, el
ciclo de esterilización del efluente se abortó. Fluctuaciones en la
línea de vapor permitieron variaciones significativas en la meseta de esterilización por lo que
el sistema abortó el ciclo impidiendo la liberación del efluente,
reiniciando el proceso.
Existe una diferencia entre
la toma de muestreas realizada
para los efluentes contaminados y los tratados. Mientras en
la primera se realiza gracias a
la presencia de un puerto de
toma de muestras situado en
la base del reactor, las muestras
obtenidas en los diferentes tratamientos se toman desde una
barra porta-indicadores situada a lo largo del reactor.
El punto de ataque en los reactores para la toma de muestras, se suele situar en la virola
del reactor o próximo a ella
resultando para un efluente estático la posición a priori más
comprometida. Esta posición
se presenta en la mayoría de
sistemas existentes en el mercado, debido a que permite tomar muestras independientemente del volumen de efluente
tratado de forma rápida, fácil y
cómoda.
En relación a esta circunstancia, el fabricante del método
llama la atención del usuario
para que tenga en consideración durante el muestreo, a la
cantidad de materia en suspensión que pueda aparecer en
la muestra a testar.
Efectivamente y como paso
previo al presente estudio, se
ha podido comprobar que
la presencia de materia en la
muestra va determinar la medición de la emisión de luz y
por lo tanto el resultado.
Un ensayo en el que se
permita una dilatación en el
tiempo con efluente estático
al finalizar el proceso, va a faFARMESPAÑA INDUSTRIAL
Gráfica 1. Comparativa de los valores medios de ATP T (total) en efluentes contaminados y tratados.
vorecer una mayor presencia
de sólidos decantados. Este
hecho resulta relevante ya que
esta situación va a interferir en
la lectura obteniéndose resultados de baja carga biológica
traducidos en valores bajos de
URL. La lectura va a favor del
éxito del proceso y en contra
del resultado real esperado.
La toma de muestras de la
barra porta-indicadores, permite determinar si existe homogeneidad en la carga biológica en el volumen del reactor
durante el proceso, es decir, si
en algún punto puede darse
estratificación y por lo tanto
distinta condición de esterilización que pueda dar lugar a
conclusiones de verificación
equivocadas.
Los resultados demuestran
que esta circunstancia no se
produce y el efluente se mantiene homogéneo, por lo que la
toma de muestras es independiente del resultado a obtener
si se realiza en cualquier punto
del reactor, ya que no se constata variación significativa en
los resultados.
En consecuencia, se ha podido determinar que la toma de
muestras debe realizarse siem-
pre con el efluente en recirculación o agitación, de forma
que se mantenga una mezcla
homogénea y no se permita
estratificación por decantación.
Otro parámetro que el fabricante recomienda prestar
atención en su método de
muestreo, es la temperatura del
efluente, que debería situarse
en la toma a unos 18-22 °C
para garantizar la optimización del proceso.
En el estudio realizado, este
parámetro no se ha tenido en
cuenta debido a que en la mayoría de las Instalaciones de
Biocontención, una paralización del ciclo completo incluyendo el proceso de vaciado o
liberación del efluente puede
condicionar el uso y funcionabilidad de toda la Instalación.
Los resultados comparativos entre el crecimiento de los
biocindicadores y resultados
de ATP total en URL en todos los ensayos, indican que la
temperatura no condiciona el
resultado.
Finalmente y como conclusión, según los resultados
obtenidos y en las condiciones
de muestreo establecidas, se
valora la idoneidad del méto-
do como una herramienta de
verificación diaria de los procesos de esterilización termoquímica de efluentes.
No obstante, se ha podido
determinar que, aunque el sistema de medición resulta ser
ágil y dinámico y que puede
ser utilizado en diversos campos de la industria ya que es un
indicativo rápido de la pureza
de los efluentes, no constituye
un proceso probatorio único,
sino que debe estar integrado
en la obtención de resultados
simultáneos adecuados de
tiempo y temperatura de esterilización por cada proceso
Bibliografía
WJ Simpson, JL Archibald & CJ Giles. Report
120906, 13 October 2006. “Protocol for assessing
the sensitivity of hygiene test systems for live microorganisms and food residues”. Cara Technology Limited, Leatherhead Enterprise Centre, Randalls Road, Leatherhead, Surrey, KT22 7RY, UK.
WJ Simpson, CJ Giles & HA Flockhart. Report
30606, 27 July 2006. “Repeatability of hygiene
test systems in measurement of low levels of
ATP”. Cara Technology Limited, Leatherhead
Enterprise Centre, Randalls Road, Leatherhead,
Surrey, KT22 7RY, UK.
*Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria (I) Publicado por Centro de
Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) el 31
enero, 2008 http://www.madrimasd.org/blogs/
alimentacion/2008/01/31/83638.
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