1. No category

Cinética Enzimática
La cinética enzimática como método para comprender el mecanismo
Normalmente se utilizan muchos métodos para estudiar el mecanismo de acción
de enzimas purificadas. El conocimiento de la estructura tridimensional de la
proteína proporciona información importante.
El valor de la información estructural aumenta en gran manera con la química de
proteínas clásica y con los modernos métodos de la mutagénesis dirigida (el
cambio de la secuencia de aminoácidos de una proteína mediante ingeniería
genética, que permiten a los enzimólogos examinar el papel de aminoácidos
concretos en la estructura y en la acción de la enzima.
No obstante, el enfoque central para estudiar el mecanismo de una reacción
catalizada por una enzima consiste en medir la velocidad de la reacción y la forma
en que se modifica como respuesta a cambios en los parámetros experimentales,
disciplina que se conoce como cinética enzimática.
Es éste el método más antiguo para conocer el mecanismo enzimático y uno de
los que continúan siendo más importantes en la actualidad.
A continuación se expone una introducción básica a la cinética de las reacciones
catalizadas por enzimas.
La concentración del sustrato afecta a la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas
Uno de los factores clave que afecta a la velocidad de una reacción catalizada
por una enzima purificada in vitro es la concentración de sustrato presente, [S].
Pero el estudio de los efectos de la concentración de sustrato es complicado
porque la [S] cambia en el transcurso de una reacción a medida que el sustrato
se convierte en producto.
Una aproximación simple es medir la velocidad inicial, designada Vo cuando
[S] es generalmente mucho mayor que la concentración de enzima, [E].
En este caso, si el tiempo es lo bastante corto después del inicio de la reacción,
los cambios en [S] son despreciables, por lo que se puede considerar constante.
En la (Fig 1) se muestra el efecto de la variación de [S] sobre Vo cuando se
mantiene constante la concentración de enzima.
Fig 1
A concentraciones de sustrato relativamente bajas, Vo aumenta casi linealmente
con el incremento de [S].
A mayores concentraciones de sustrato, Vo aumenta incrementos cada vez
menores en respuesta a incrementos de [S].
Finalmente se alcanza un punto más allá del cual se dan incrementos
pequeñísimos de Vo con el incremento de [S].
Esta meseta en el valor de Vo se denomina velocidad máxima, V
max.
El complejo ES constituye la clave para entender el comportamiento cinético del
mismo modo que representó un punto de partida para la discusión de la
catálisis.
El patrón cinético que muestra la figura que Victor Henri, siguiendo la
sugerencia de Wurtz, propusiese en 1903 que una enzima se combina con su
molécula de sustrato formando el complejo ES como paso necesario en la
catálisis enzimática.
Esta idea fue ampliada a una teoría general de la acción enzimática,
especialmente por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913. Postularon que la
enzima se combina en primer lugar de forma reversible con su sustrato
formando un complejo enzima-sustrato en un paso reversible relativamente
rápido:
k1
E+S
ES
(1)
k-1
El complejo ES se descompone seguidamente en un segundo paso más lento
dando la enzima libre y el producto de la reacción P:
k2
ES
E + P
(2)
k-2
En este modelo la segunda reacción es más lenta y limita, por tanto, la velocidad
de la reacción global.
De ahí que la velocidad global de la reacción catalizada enzimáticamente ha de
ser proporcional a la concentración de la especie que reacciona en el segundo
paso, es decir, ES.
En cualquier momento en una reacción catalizada por una enzima, la enzima
existe en dos formas, la forma libre o sin combinar E y la forma combinada ES.
A baja [S], la mayor parte de la enzima estará en la forma sin combinar E.
Aquí la velocidad será proporcional a [S] porque el equilibrio de la (Ecuación 1)
se desplaza hacia la formación de más ES a medida que [S] aumenta.
La máxima velocidad inicial de la reacción catalizada (V max) se observará cuando
todo la enzima esté prácticamente en forma de complejo ES y la concentración de
E sea extremadamente pequeña.
En estas condiciones, la enzima está "saturada" con su sustrato de modo que el
aumento adicional de [S] no tendrá efecto sobre la velocidad.
Esta condición se producirá cuando [S] sea suficientemente alta de modo que
prácticamente todo la enzima libre se haya convertido en la forma ES.
Cuando el complejo ES se descompone dando el producto P, la enzima queda libre
para catalizar la reacción de otra molécula de sustrato.
El efecto de saturación es una característica distintiva de la catálisis enzimática y
es el responsable de la meseta observada en la (Fig. 1).
Cuando la enzima se mezcla con un gran exceso de sustrato, existe un período
inicial denominado estado preestacionario, durante el cual aumenta la
concentración del complejo ES.
Normalmente este período es demasiado corto para que sea fácilmente
observado. La reacción alcanza rápidamente un estado estacionario en el que
[ES] (y la concentración de otros intermediarios) permanece aproximadamente
constante con el tiempo.
El concepto de estado estacionario fue presentado por G.E. Briggs y Haldane en
1925.
La Vo medida refleja generalmente el estado estacionario aun cuando Vo se limite
a los primeros instantes de la reacción, y el análisis de las velocidades iniciales se
conoce como cinética del estado estacionario.
La relación entre concentración de sustrato y velocidad de reacción
enzimática se puede expresar de manera cuantitativa
La (Fig. 1) representa la relación entre [S] y V0 en una reacción enzimática.
La curva que expresa esta relación tiene la misma forma general para muchas
enzimas (se acerca a una hipérbola rectangular).
La forma hiperbólica de esta curva se puede expresar algebraicamente mediante
la ecuación de Michaelis-Menten, deducida por estos investigadores partiendo de
su hipótesis básica de que el paso limitante de velocidad en las reacciones
enzimáticas es la descomposición del complejo ES para formar el producto y el
enzima libre. La ecuación es:
(9)
Los términos importantes son [S], V0, Vmax y la constante de MichaelisMenten ó Km. Todos ellos se pueden medir fácilmente de manera
experimental.
Aquí desarrollaremos la lógica básica y los pasos algebraicos en una
deducción moderna de la ecuación de Michaelis-Menten, la cual incluye la
suposición de estado estacionario introducida por Briggs y Haldane.
La deducción se inicia con las dos reacciones básicas que intervienen en la
formación y descomposición de ES (Ec 1 y 2).
En los primeros momentos de la reacción, la concentración del producto [P]
es despreciable y se hace la suposición simplie de que puede ignorarse k
describe la reacción inversa de P a S). La reacción global se reduce a
-2(que
(11)
V0 se determina por la descomposición de ES para dar producto y viene fijada
por [ES]:
V0 = k2 [ES]
(3)
Dado que [ES] de la Ec. 3 no se puede medir experimentalmente con facilidad,
hemos de empezar por encontrar una expresión alternativa para [ES].
En primer lugar introduciremos el término [Et] que representa la concentración
total de enzima (la suma de enzima libre y enzima unida al sustrato).
La enzima libre, o no fijada, se puede representar, por tanto, como [Et] - [ES].
Además, debido a que [S] es ordinariamente mucho mayor que [Et], la cantidad
de sustrato fijado por la enzima en cualquier momento de la reacción es
despreciable comparada con la [S] total.
Con estas consideraciones, los pasos siguientes nos conducirán a una expresión
de V0 en función de parámetros que se miden fácilmente.
Paso 1. Las velocidades de formación y descomposición de ES vienen
determinadas por los pasos gobernados por las constantes de velocidad k1
(formación) y k_1 + k2 (descomposición), según las expresiones:
(4)
(5)
Paso 2. Una suposición importante es que la velocidad inicial de reacción refleja
un estado estacionario en el que [ES] es constante, es decir, la velocidad de
formación de ES es igual a la velocidad de descomposición.
A esto se le denomina suposición de estado estacionario. Las expresiones de las
Ecuaciones 8-12 y 8-13 pueden igualarse en el estado estacionario dando:
(6)
Paso 3. Se resuelve la (Ec. 6) en función de [ES]. Primero se resuelve el factor
común en el miembro de la izquierda y se simplifica el segundo miembro dando:
Sumando el término k 1[ES][S] a ambos lados de la ecuación y simplificando
da:
Sumando el término k1 [ES] [S] a ambos lados de la ecuación y simplificando
da:
Despejando [ES] se obtiene:
Esta expresión se puede simplificar aún más, de forma que se combinan todas
las constantes de velocidad en una expresión:
El término (k2 + k-1) / k1 se define como constante de Michaelis Menten, Km.
Sustituyendo en la (ec .3) la expresión se simplifica a:
(7)
Paso 4. Se puede expresar ahora Vo en función de [ES]. La Ecuación 8-19 se
utiliza para sustituir [ES] en la (ec. 7), dando:
(8)
Esta ecuación aún se puede simplificar más. Dado que la velocidad máxima se
obtendrá cuando la enzima está saturada y [ES] = [Et], Vmax se puede definir
como k2[Et].
Sustituyendo esto en la (ec. 8) se obtiene la (ec. 9 ):
Ésta es la ecuación de Michaelis-Menten, la ecuación de velocidad de una
reacción con un sustrato catalizada enzimáticamente.
Es una definición de la relación cuantitativa entre la velocidad inicial Vo, la
velocidad inicial máxima Vmax y la concentración inicial de sustrato [S], todos
ellos relacionados a través de la constante de Michaelis-Menten Km.
Obsérvese que Km tiene unidades de concentración. ¿Se ajusta esta ecuación a
los hechos experimentales? Sí; podemos confirmar esto considerando las
situaciones límite en donde [S] es muy alta o muy baja, tal como muestra la
figura siguiente:
Fig. 2
De la ecuación de Michaelis-Menten emerge una relación numérica importante en
el caso especial en que Vo es exactamente la mitad de Vmax. Así pues:
Dividiendo por Vmax se obtiene:
Despejando Km obtenemos:
cuando
ó
(10)
Esto representa una definición práctica muy útil de Km: Km es equivalente a la
concentración de sustrato a la cual Vo es la mitad de Vmax.
La ecuación de Michaelis-Menten (Ec. 9) puede transformarse algebraicamente en
formas que son útiles para la determinación práctica de Km y V max.
Iransformaciones de la ecuación de Michaelis-Menten: gráfica de los
dobles recíprocos
La ecuación de Michaelis Menten
Se puede transformar algebraicamente en formas más útiles para representar
los datos experimentales. Una transformación común se deduce simplemente
tomando los inversos en ambos miembros de la ecuación de Michaelis Menten,
obteniéndose:
Separando los componentes del numerador en el segundo miembro de la
ecuación se obtiene:
que se simplifica a:
Esta forma de la ecuación de Michaelis-Menten se denomina ecuación de
Lineweaver-Burk.
Para las enzimas que obedecen la relación de Michaelis-Menten la gráfica de
1/V0 frente a 1/[S] (el "doble recíproco" de la gráfica V0 frente a [S] que hemos
utilizado hasta este momento) da una línea recta.
Esta línea tiene igual a Km/V max, la intersección sobre el eje 1 / V0 es 1 / Vmax y
la intersección sobre el eje 1/[S] es – 1 / Km. La representación doble recíproca,
también denominada de Lineweaver - Burk, tiene la gran ventaja de permitir una
determinación mucho más precisa de Vmax, la cual sólo puede ser obtenida
aproximadamente a partir de una gráfica simple de V0 frente a [S].
Se han deducido y utilizado otras transformaciones de la ecuación de Michaelis Menten. Cada una de ellas tiene alguna ventaja al analizar los datos cinéticos
enzimáticos.
La gráfica de los dobles recíprocos de las velocidades de reacción enzimáticas es
muy útil para distinguir entre ciertos tipos de mecanismos de reacción
enzimáticos y para analizar la inhibición enzimática.
Para comparar las actividades enzimáticas se utilizan parámetros
cinéticos
Es importante distinguir entre la ecuación de Michaelis-Menten y el mecanismo
cinético específico sobre el que se basó originalmente. La ecuación describe el
comportamiento cinético de muchas enzimas, diciéndose de todas las enzimas
que muestran una dependencia hiperbólica de V0 frente a [S] que siguen
cinética de Michaelis Menten.
La regla práctica de que Km = [S] cuando Vo =1 / 2 V
enzimas que siguen la cinética de Michaelis-Menten.
max
es válida para todas las
Sin embargo, esta ecuación no depende del mecanismo relativamente sencillo de
dos pasos propuesto por Michaelis y Menten.
Muchas enzimas que siguen la cinética de Michaelis-Menten tienen mecanismos
de reacción totalmente diferentes y enzimas que catalizan reacciones con 6 ú 8
pasos identificables muestran, a menudo, el mismo comportamiento cinético en
el estado estacionario.
Aunque la Ecuación 10 es válida para muchas enzimas, tanto la magnitud como
el significado real de Vmax y de Km pueden cambiar de una enzima a otra.
Es ésta una limitación bastante importante de la aproximación del estado
estacionario a la cinética enzimática.
Vmax y Km son parámetros que se pueden obtener experimentalmente para
cualquier enzima pero que por sí mismos proporcionan poca información acerca
del número, velocidades o naturaleza química de pasos discretos en la reacción.
La cinética del estado estacionario representa, no obstante, el lenguaje estándar
mediante el cual se caracterizan y comparan las eficacias catalíticas de las
enzimas.
En la (Fig. 2) se muestra un método gráfico sencillo para obtener un valor
aproximado de Km.
La Km puede variar considerablemente de enzima a enzima, e incluso para
diferentes sustratos de la misma enzima.
A veces el término se utiliza (a menudo inadecuadamente) como una indicación de
la afinidad de un enzima por su sustrato.
El significado real de Km depende de aspectos específicos del mecanismo de
reacción tales como el número y velocidades relativas de los pasos individuales de
la reacción. Para reacciones con dos pasos,
cuando k2 es limitante de velocidad, k2 << k-l por lo que Km se simplifica a k-1 /
k1 que se define como constante de disociación, Kd, del complejo ES.
Cuando se dan estas condiciones, Km representa una medida de la afinidad de la
enzima por el sustrato en el complejo ES.
Sin embargo, esta situación no es válida para la mayoría de enzimas.
A veces, k2 >> k-1 por lo que Km = k2 / k1.
En otros casos, k2 y k_1 son comparables por lo que Km es una función más
compleja de las tres constantes de velocidad.
La ecuación de Michaelis-Menten y el comportamiento de saturación
característico de la enzima continúan siendo válidos, pero Km no se puede
considerar como una medida sencilla de la afinidad por el sustrato.
Aún son más comunes los casos en los que la reacción transcurre a través de
múltiples pasos después de la formación del complejo ES; en estas condiciones
Km es una función muy compleja de muchas constantes de velocidad. Vmax
también varía considerablemente de una enzima a otra.
Si una enzima reacciona según el mecanismo de Michaelis-Menten de dos pasos,
V max es equivalente a k2 [Et] en donde k2 es el paso limitante de velocidad.
No obstante, el número de pasos en la reacción y la identidad del paso (o pasos)
limitante de velocidad pueden variar de una enzima a otra.
Por ejemplo, consideremos la situación, bastante frecuente, en la que la liberación
del producto, EP
E + P, es limitante de la velocidad.
Al inicio de la reacción (cuando la [P] es baja) se puede describir la reacción
completa mediante el esquema:
(12)
En este caso, en condiciones de saturación la mayor parte de la enzima se
encuentra en la forma EP con lo que Vmax = k3[Et].
Es útil definir una constante de velocidad más general, kcat para describir la
velocidad limitante de cualquier reacción enzimática a saturación.
Si hay varios pasos en la reacción y uno de ellos es claramente limitante, kcat es
equivalente a la constante de velocidad del paso limitante.
Para la reacción simple de la (ec. 11) , kcat = k2.
Para la reacción de la (ec. 12), kcat = k3.
Cuando hay varios pasos que son parcialmente limitantes de velocidad, kcat es
una función compleja de varias constantes de velocidad que definen cada paso
individual de la reacción.
En la ecuación de Michaelis-Menten, kcat = Vmax / [Et], con lo que la (ec. 9) se
transforma en:
(13)
La constante kcat es una constante de velocidad de primer orden con unidades de
tiempos inversos, denominándose también número de recambio.
Es equivalente al número de moléculas de sustrato convertidas en producto en
una unidad de tiempo dada por una sola molécula de enzima cuando la enzima
está saturada con el sustrato.
En la Tabla siguiente se indican los números de recambio de varios enzimas.
Los parámetros cinéticos kcat Y Km son útiles generalmente para el estudio y
comparación de diversas enzimas tanto si sus mecanismos de reacción son
sencillos como complejos.
Cada enzima tiene valores óptimos de kcat y de Km que reflejan el ambiente
celular, la concentración de sustrato encontrada normalmente in vivo por la
enzima y la química de la reacción catalizada.
Los parámetros kcat y Km nos permiten también evaluar la eficiencia cinética de
las enzimas, pero para este fin no es suficente cada uno de los parámetros
aislados.
Dos enzimas que catalizan reacciones diferentes pueden tener la misma kcat
(número de recambio) y, no obstante, las velocidades de las reacciones sin
catalizar pueden ser diferentes, con lo que los incrementos de velocidad
producidos por los enzimas pueden variar mucho.
Experimentalmente, la Km para una enzima tiende a ser igual a la concentración
celular de su sustrato.
Una enzima que actúa sobre un sustrato presente en muy baja concentración en
la célula tenderá a tener una Km inferior que una enzima que actúa sobre un
sustrato normalmente abundante.
La comparación de la relación kcat /Km para dos reacciones es la mejor manera de
comparar las eficiencias catáliticas de diferentes enzimas o el recambio de
diferentes sustratos por la mismo enzima.
Este parámetro, a veces conocido como constante de especificidad, es la
constante de velocidad para la conversión de E + S en E + P.
Cuando [S] < < Km , la (ec. 13) se simplifica a:
En este caso Va depende de la concentración de dos reactivos, [Et] y [S]; por
tanto, ésta es una constante de velocidad de segundo orden siendo la constante
kcat / Km la constante de velocidad de segundo orden con unidades M-1 s -l.
Existe un límite superior de kcat / Km impuesto por la velocidad a la que E y S
pueden difundir conjuntamente en una solución acuosa.
Este límite controlado por difusión es 108 a 109 M-1 s-1.
Los enzimas están sometidos a inhibición
Los inhibidores enzimáticos son agentes moleculares que interfieren en la
catálisis, haciendo más lentas o deteniendo las reacciones. Las enzimas catalizan,
prácticamente, todos los procesos celulares por lo que no es sorprendente que los
inhibidores enzimáticos se encuentren entre los agentes farmacéuticos más
importantes.
Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer
paso de la síntesis de prostaglandinas, compuestos que íntervienen en muchos
procesos, algunos de los cuales producen dolor.
El estudio de los inhibidores enzimáticos también ha proporcionado información
valiosa sobre los mecanismos enzimáticos y ha ayudado a definir algunas rutas
metabólicas. Hay dos amplias clases de inhibidores enzimáticos: reversibles e
irreversibles.
La inhibición reversible puede ser competitiva, acompetitiva o mixta
Un tipo de inhibición reversible común es la que se denomína competitiva.
Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo de la
enzima. Mientras el inhibidor (I) ocupa el sitio activo impide la fijación del
sustrato.
Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen
al sustrato y que se combínan con la enzima formando el complejo EI, pero sín
llevado a la catálisis.
Incluso combinaciones transitorias de este tipo afectarán negativamente a la
eficiencia de la enzima. Teniendo en consideración la geometría molecular de los
inhibidores que se parecen al sustrato, a menudo llegamos a conclusiones sobre
qué regiones de un sustrato normal interaccionan con el enzima.
La inhíbición competitiva se puede analizar cuantitativamente mediante cinética
del estado estacionario. En presencia de un inhibidor competitivo, la ecuación de
Michaelis - Menten pasa a:
(14)
donde
y
La (ec. 14) describe las características importantes de la inhibición competitiva.
El término α Km determinado experimentalmente, la Km observada en presencia
de inhibidor, a menudo se denomina Km "aparente".
Debido a que el inhibidor se une de manera reversible a la enzima, se puede
cambiar el sentido de la competición en favor del sustrato simplemente añadiendo
más sustrato.
Cuando [S] excede sobradamente a [I] se minímiza la probabilidad de que se fije
una molécula de inhibidor por lo que la reacción muestra una Vmax normal.
No obstante, la [S] a la cual Vo = 1/2 V
presencia del inhibidor en un factor α .
max
la Km aparente, aumentará en
Este efecto sobre la Km aparente y la ausencia de efecto sobre la Vmax es
diagnóstico de inhibición competitiva y se pone de manifiesto fácilmente en una
gráfica de dobles recíprocos .
La constante de equilibrio para la fijación del inhibidor, KI, puede obtenerse a
partir de la misma gráfica.
La inhibición competitiva se utiliza en terapéutica para tratar a pacientes que han
ingerido metanol, disolvente que se utiliza como anticongelante. El metanol se
convierte en formaldehído por acción del enzima del hígado alcohol
deshidrogenasa.
El formaldehído lesiona muchos tejidos siendo la ceguera un resultado frecuente
debido a que los ojos son especialmente sensibles al mismo.
El etanol compite de manera efectiva con el metanol como sustrato alternativo de
la alcohol deshídrogenasa.
El efecto del etanol es muy parecido al de un inhibidor competitivo, con la
diferencia de que el etanol también es un sustrato y su concentración dismínuirá
en el tiempo a medida que la enzima lo convierta en acetaldehído.
La terapia para el envenenamiento por metanol es la infusión intravenosa gradual
de etanol a una velocidad que mantiene una concentración controlada en el
torrente sanguíneo durante varias horas.
Esto disminuye la formación de formaldehído, reduciendo el peligro mientras los
riñones filtran el metanol que se excretará por orina.
Hay otros dos tipos de inhibición reversible, acompetitiva y mixta, que se aplican a
enzimas con un solo sustrato, pero en la práctica afectan a enzimas que actúan
sobre dos ó más sustratos.
Un inhibidor acompetitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el
sustrato en el centro activo y, a diferencia del inhibidor competitivo, sólo se une al
complejo ES.
En presencia de un inhibidor acompetitivo, la ecuación de Michaelis-Menten pasa
a diferencia del inhibidor competitivo, sólo se une al complejo ES.
En presencia de un inhibidor acompetitivo, la ec de Michalis Menten pasa a:
(15)
donde
y
Como se describe en la (ec. 15) a elevadas concentraciones de sus trato, Vo se
aproxima a Vmax / α'.
Así, un inhibidor acompetitivo disminuye la Vmax medida.
La Km aparente también disminuye, debido a que la [S] necesaria para alcanzar
la mitad de la Vmax disminuye en un factor α'.
Un inhibidor mixto también se fija a un sitio distinto al del sustrato, pero se
fijará tanto a E como a ES. La ecuación de velocidad que describe la inhibición
mixta es:
donde α y α ' se definen igual que anteriormente.
Por regla general, un inhibidor mixto afecta tanto a Km como a Vmax.
El caso especial α = α ', encontrado en raras ocasiones en la práctica, se define
clásicamente como inhibición no competitiva.
En la práctica, las inhibiciónes mixta y acompetitiva sólo se observan en enzimas
con dos o más sustratos (p. ej., S1 y S2) y son muy importantes en el análisis
experimental de estas enzimas.
Si un inhibidor se fija en un sitio normalmente ocupado por S1 , en los
experimentos en los cuales la [S1] varía puede actuar como un inhibidor
competitivo.
Si un inhibidor se fija en un sitio normalmente ocupado por S2, puede actuar
como un inhibidor de S1 mixto o acompetitivo.
Los patrones reales de inhibición observados dependen de si los acontecimientos
de fijación de S1 y S2 son ordenados o al azar, y por consiguiente se puede
determinar el orden en que se fijan los sustratos y se liberan los productos del
centro activo.
A menudo el uso de uno de los productos de la reacción como inhibidor puede
ser muy informativo. Si sólo está presente uno de los dos productos de reacción,
no se puede dar la reacción inversa.
Sin embargo, un producto se fijará generalmente en alguna parte del centro
activo y así funcionará como un inhibidor.
Los estudios de inhibición son a menudo detallados y pueden aportar una
información precisa sobre el mecanismo de las reacciones bisustrato.
Pruebas cinéticas para determinar los mecanismos de inhibición
La gráfica de los dobles recíprocos ofrece una forma fácil de determinar si un
inhibidor enzimático es competitivo, acompetitivo o mixto.
Se llevan a cabo dos grupos de experimentos de velocidad en los que la
concentración de enzima se mantiene constante. En el primer grupo [S] también
se mantiene constante, lo que permite medir el efecto del incremento de la
concentración de inhibidor [I] sobre la velocidad inicial V0.
En el segundo grupo [1] se mantiene constante y se varía [S]. En la gráfica de los
dobles recíprocos se representa l/V0 frente a l/[S].
El incremento de la [I] da lugar a una familia de líneas con una intersección
común en el eje l/V0 pero con pendientes diferentes.
Debido a que la intersección sobre el eje l/V0 es igual a l/V
Vmax no cambia en presencia de un inhibidor competitivo.
max
, podemos ver que
Esto es, independientemente de la concentración de un inhibidor competitivo, una
concentración de sustrato suficientemente elevada desplazará siempre al inhibidor
del sitio activo de la enzima.
Se puede calcular el valor de a a partir del cambio de pendiente para cualquier
valor de [I]. Conociendo [I] y α , se puede calcular KI a partir de la expresión:
α = 1 + [I] / KI
En la inhibición acompetitiva y mixta, se obtienen que representaciones similares
de los datos de velocidad dan familias de líneas.
Cambios en la intersección sobre los ejes señalan cambios en Vmax y Km.
Inhibición acompetitiva
Inhibición mixta
Inhibición competitiva
La inhibición irreversible es una herramienta importante en la
investigación enzimática y en la farmacología
Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con un grupo de la
enzima que es esencial para su actividad o lo destruyen, o forman una
asociación covalente muy estable.
Es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible
y una enzima. Los inhibidores irreversibles son otra herramienta útil para
estudiar los mecanismos de reacción.
Los aminoácidos con funciones catalíticas clave en el sitio activo pueden ser
identificados, en ocasiones, determinando qué
aminoácido se ha unido covalentemente a un inhibidor después de la
inactivación de la enzima.
Una clase especial de inhibidores irreversibles son los inhibidores suicidas.
Estos compuestos son relativamente poco reactivos hasta que se unen al sitio
activo de una enzima específica.
El diseño de un inhibidor suicida se hace de tal manera que pueda llevar a cabo
los primeros pasos químicos de la reacción enzimática normal.
No obstante, en lugar de ser transformado en el producto normal, el inhibidor
se convierte en un compuesto muy reactivo que se combina irreversiblemente
con la enzima.
A estos compuestos también se los llama inactivadores basados en el mecanismo,
ya que utilizan el mecanismo de reacción enzimático normal para inactivar la
enzima.
Los inhibidores suicidas juegan un papel central en el diseño racional de fármacos,
un método moderno en el que se sintetizan nuevos sustratos basándose en el
conocimiento de sustratos conocidos y mecanismos de reacción.
Debido a que el inhibidor suicida se ha diseñado para una enzima específica y no es
reactivo hasta que se halla en el sitio activo de la enzima, los fármacos basados en
este método ofrecen la ventaja de tener pocos efectos secundarios.
El pH afecta a la actividad enzimática
Las enzimas tienen un pH óptimo o un intervalo de pH en el que su actividad es
máxima.
Estas curvas se construyen a partir de medidas de velocidades iniciales, cuando
la reacción se lleva a cabo en tampones de pH diferentes.
Como el pH es una escala logarítmica que refleja variaciones de 10 veces en
[H+], las variaciones en V0 también se representan en escala logarítmica.
a valores superiores o inferiores de pH la actividad disminuye. Esto no es
sorprendente dado que algunas cadenas laterales de aminoácidos pueden
actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio
activo de la enzima, que dependen de su mantenimiento en un cierto estado de
ionización.
Por otra parte las cadenas laterales ionizadas de la proteína pueden jugar un
papel esencial en las interacciones que mantiene la estructura de la proteína.
La eliminación de un protón de un resto de His fuera del sitio activo podría, por
ejemplo, eliminar una interacción iónica esencial para la estabilización de la
conformación activa de la enzima.
Menos frecuentes son los casos en los que la sensibilidad al pH se debe a que el
grupo valorado se halla en el sustrato.
En el ambiente compacto de una proteína, el pKa de las cadenas laterales de los
aminoácidos puede cambiar significativamente.
Así, una carga positiva próxima puede disminuir el pKa de un residuo de Lys
mientras que la proximidad de una carga negativa puede aumentarlo.
Estos efectos dan lugar, a veces, a valores de pKa modificados en 2 o más
unidades de pH del valor normal (aminoácido libre).
Hay un residuo de Lys en la enzima acetoacetato descarboxilasa con un pKa de
6,6 (el normal es 10,5) debido a efectos electrostáticos de cargas positivas
cercanas.
Bibliografía
• Nelson David L, Cox Michael M. “ Lehninger Principios de Bioquímica”.
Ediciones Omega. 2001