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SEMINARIO PRÁCTICAS
Colinesterasa del suero
un ejemplo de determinación de actividad
enzimática y cálculos cinéticos
Javier Sáez Valero
1. Colinesterasas: acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa
1.1. El Sistema colinérgico y el papel de acetilcolinesterasa (AChE)
1.2. Butirilcolinesterasa (BuChE), potencial papel fisiológico
2. Determinación de la actividad colinesterasa por el método de Ellman
2.1 El uso de inhibidores y sustratos específicos
3. La práctica
3.1. Los Objetivos
3.2. El Protocolo
3.3. Los cálculos enzimáticos
4. La seguridad en el laboratorio de investigación
Colinesterasas
Enzimas que hidrolizan preferentemente los ésteres de colina. Serin-esterasas
(y por ser inhibidos pro fisostigmina, eserina, 10-5M) Inh irreversible por organosfosforados
Acetilcolinesterasa: AChE
EC 3.1.1.7
(gen cromosoma 7)
Butirilcolinesterasa: BuChE
EC 3.1.1.8
(gen cromosoma 3)
Según la (IUBMB) Unión
internacional de Bioquímica
y Biología Molecular, los
estractos enzimáticos
pueden nombrarse por
un número de
identificación
consistente en las letras
EC seguidas de 4
digitos (separados por
puntos), que
corresponderían por
orden: el primero a la
clase (de las 6
existentes), el segundo
a la subclase, el tercero
a la sub-subclase y el
cuarto número
identificaría al enzima
concreto.
Clasificación y nomenclatura de enzimas
Normalmente se añade el sufijo -asa al nombre del sustrato o bien
a una palabra que describe la reacción
Glucosa-6-P
Isomerasa
ó
Hexosa-P
Isomerasa
Todas las enzima
nombres del E.C. y
además nombres
sencillos
Cada una de las 6 clases se subdivide en varias subclases y cada subclase en sub-subclase:
1. Óxido-reductasas
Reacciones de oxido-reducción
-Deshidrogenasas.
-Oxidasas.
-Reductasas.
-Peroxidasas
-Catalasas.
-Oxigenasas.
-Hidroxilasas.
2. Transferasas
Transferencia de grupos
funcionales
Transaldolasas, Transcetolasa.
Acil-, metil-, glucosil-, fosforiltransferasas.
Quinasas.
Fosfomutasas.
3. Hidrolasas
Reacciones de hidrólisis
(rotura de enlaces por
adición de H2O)
Esterasas.
Glucosidasas.
Peptidasas.
Fosfatasas.
Tiolasas.
Fosfolipasas.
Amidasas.
Desaminasas.
Ribonucleasas
4. Liasas
Adición de grupos a los dobles
enlaces o eliminación grupos para
formar dobles enlaces
5. Isomerasas
Reacciones de isomerización
(reordenamientos moleculares)
6. Ligasas
Formación de enlaces entre 2
sustratos, con aporte de ATP
Descarboxilasas.
Aldolasas.
Hidratasas.
Deshidratasas.
Sintasas.
Liasas.
Si una molécula se
reduce, tiene que haber
otra que se oxide
grupos aldehidos gupos
acilos grupos glucosilos
grupos fosfatos (kinasas)
Transforman polímeros en
monómeros.
Actuan sobre: enlace éster
enlace glucosídico enlace
peptídico enlace C-N
Entre C y C Entre C y O
Entre C y N
Racemasas.
Epimerasas.
Isomerasas.
Mutasas (no todas).
Sintetasas.
Carboxilasas
Entre C y O Entre C y S
Entre C y N Entre C y C
Ej: Acetilcolinesterasa (AChE)
EC 3 - Hidrolasa
EC 3.1 – Actúa sobre enlace ester
EC 3.1.1 – Hidrolasa de ester carboxílico
EC 3.1.1.7 – Acetilcholinesterasa
(Esterasa de acetilcolina)
Reacción:
acetilcolina + H2O = colina + acetato
Sistema colinérgico
EC 3.1.1.7
La función de la acetilcolinesterasa (AChE)
es la inactivación rápida del
neurotransmisor acetilcolina después de su
liberación en las sinápsis colinérgicas
Además se localiza en tejidos desprovistos de colina, por lo
que se le atribuyen otras funciones
La enzima
colinacetiltransferasa (ChAT)
acetila la colina (Ch)
utilizando acetil-coenzimaA
(Acetil-CoA) para formar el
neurotransmisor acetilcolina
(ACh).
La ACh, que se libera
mediante vesículas sinápticas
y la participación del
transportador vesicular de
ACh (VAChT).
La Sinápsis Colinérgica
ChAT
La ACh liberada al espacio
sináptico puede interactuar
con receptores colinérgicos
muscarínicos o nicotínicos.
Finalmente, ACh es
hidrolizada por
acetilcolinesterasa (AChE)
para producir acetato (A) y
Ch.
La Ch es recaptada por la
neurona presináptica por un
transportador de Ch de alta
afinidad (ChT).
AChE
AChE en PATOLOGÍA
La miastenia gravis (debilidad muscular)
Enfermedad neuromuscular autoinmune
(se generan anticuerpos contra receptores de ACh) y
Crónica: debilidad de los músculos esqueléticos
causada por un defecto en la transmisión de los impulsos nerviosos a los
músculos (tratamiento con Inhib AChE)
No confundir con miastenia congénita sináptica,
EAD (Endplate acetylcholinesterase deficiency)
o síndrome miasténico congénito de Engel: déficit de Col Q
(NUNCA administrar Inhib AChE!!!)
La Enfermedad de Alzheimer es una
enfermedad neurodegenerativa:
deterioro cognitivo y trastornos conductuales.
El sistema colinérgico es el más afectado por la
patología (papel de ACh en memoria)
EC 3.1.1.8
BuChE o colinesterasa del suero
La función fisiológica de la
Butirilcolinesterasa (BuChE) se
desconoce
Puede hidrolizar acetilcolina, aunque sin potencial
papel en la sinápsis colinérgica (condiciones normales)
Presente en casi todos los tejidos
Especialmente abundante en suero
BuChE en PATOLOGÍA
BuChE puede hidrolizar algunos ésteres de colina,
los cuales pueden ser drogas como
Procaína*, tetracaína*, aspirina, heroína y cocaína
También se ha propuesto que puede servir de “barrera” ante el
envenenamiento por organosfosforados
La actividad BuChE puede estar completamente ausente
en individuos con mutaciones genéticas: fenotipo silente
Individuos SIN patología pero NO pueden hidrolizar algunos
compuestos de uso en medicina (*):
anestésico suxametonium
BuChE es especialmente abundante en el suero siendo sintetizada
en el hígado por lo que la disfunción hepática cursa
con niveles bajos de actividad BuChE
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD COLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN
AChE
+
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -CO-CH 3
acetiltiocolina
Iso-OMPA
BuChE
X
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -CO -CH 2-CH 2-CH 3
butiriltiocolina
tiocolina
CH 3-CH 2-CH 2-C O O- + 2H +
butirato
BW
AChE
X
+ 2H +
+
+
BuChE
+
CH 3-CO O acetato
+
+
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S tiocolina

Basado en la oxidación de grupos tioles libres por un compuesto cromogénico
 un tioanálogo del sustrato preferente (ATCh/BuTCh)

La tiocolina reacciona rápidamente con el DTNB (5-tio-2-nitrobenzoato)
muestra un color amarillo intenso y un máximo de absorbancia a 412 nm
COO -
+
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S tiocolina
+ COO S
+
+
NO2
COOS
NO2
DTNB
NO2
(CH3)3N-CH2-CH2-S-S
conjugado
-S
-S
COO -COO
NO2
NO2
5-tio-2-nitrobenzoato
Cromóforo
412 nm
Análisis de actividad enzimática: espectrofotómetros
Un espectrofotómetro tiene la capacidad de
proyectar un haz de luz monocromática a
través de una muestra y medir la cantidad de
luz que es absorbida por dicha muestra.
Permite al operador realizar dos funciones:
1. Da información sobre la naturaleza de la
sustancia en la muestra (ej AN Abs 260 nm)
2. Indica indirectamente que cantidad de la
sustancia que nos interesa está presente en la
muestra
Lector de placa permite adaptar los métodos
y evaluar simultáneamente gran número de
muestras (placas de 96 pocillos)
La práctica…
Objetivos (El alumno habrá de ser capaz de):
Medir actividades enzimáticas por técnicas colorimétricas.
Representar gráficamente el curso temporal de la reacción y valorar la linealidad del
proceso.
Calcular actividades enzimáticas, expresando el resultado en unidades de actividad
enzimática.
Observar una cinética michaeliana y representar la curva de velocidad frente a
concentración de sustrato.
Determinar las constantes cinéticas por la representación de Lineweaver-Burk.
La práctica…
Ensayo de actividad enzimática
1) La formación de producto con el tiempo.
2) El efecto de la concentración de sustrato.
Procedimiento:
Preparar la tanda de 6 tubos (más un tubo para al ‘autocero’) según el protocolo
1º disolución de DTNB (breve incubación)
2º el volumen de sustrato (butiril-tiocolina) + el volumen de agua para completar.
Antes de la primera medida de actividad, preparar una cubeta sólo con 2 ml de agua y 1 ml de DTNB
(volumen total 3 ml), y usarla para hacer el ‘autocero’ del colorímetro
3º ‘Disparar’ la reacción con la enzima.
La práctica…
3º ‘Disparar’ la reacción con la enzima.
(tubo a tubo NO todos de golpe…)
Anotar cada 20 sg (durante 3 min)
el valor de absorbancia (a 410 nm)
* Es preferible iniciar la reacción añadiendo el sustrato, pero en esta práctica conviene dispararla con la enzima.
Ello nos lleva a ‘despreciar’ el valor de hidrólisis espontánea: los grupo tioles libres presentes en proteínas de la
muestra, los cuales al reaccionar también con el DTNB pueden alterar la medida enzimática. Se evita, en parte,
incubando las muestras con el DTNB, antes de añadir el sustrato.
*La adición de inhibidores es necesaria si la muestra puede contener AChE y BuChE; si sólo una de ellas está
presente, como es el caso, se pueden omitir.
Cinética Enzimática: Velocidad de transformación de reactivos en productos
Método de estudio del mecanismo de una reacción: estudio de la velocidad de la reacción
(y su variación en respuesta a cambios en los parámetros experimentales)
Las enzimas modifican las velocidades de las reacciones
La velocidad se expresa como cambio en [S] (o aparición de P, cambio en [P]) por unidad de t
Reacción: S
P
 d S  d P 
Velocidad  v 

dt
dt
Perfil de Velocidad o Curva de Progreso
vo
P
S
Curva de progreso:
Determina vo experimentalmente (para cada [S])
[S] ajustable por el investigador
S
vo
Tiempo
Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten
*
Cálculos
Para conocer la concentración de sustrato final en cada uno de los tubos, aplicar:
Vi × Si = Vf × Sf
Por ejemplo, para el tubo 1:
0.05ml ×6mM = 3ml × S1
(S1 = 0.1 mM)
CÁLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Unidad Internacional (U): Cantidad de enzima que transforma 1 micromol de sustrato por min.
1 UNIDAD = 1 U = 1 μmol / min
La relación absorbancia - concentración sigue la Ley de Lambert-Beer:
Absorbancia = ε C L
C = Abs / ε L(espesor)
siendo
ε= coeficiente de extinción molar del cromóforo (1,36×104 litro/ mol cm).
C = concentración molar de producto formado (moles / litro).
L = longitud del paso óptico de la cubeta (1 cm).
En la práctica (para nuestra reacción colorimétrica): C = Abs /1,36×104 (moles / litro)
Cálculos
Promediar Incremento absorbancia (∆Abs) frente a tiempo (min), ∆Abs /min,
comprobando linealidad gráficamente,
Dividiendo este valor por ε y por L nos dará el valor de ∆C/min (∆C es el incremento de producto).
A continuación, calculad la actividad enzimática, sabiendo el coeficiente de extinción del cromóforo,
empleando la expresión:
Actividad en U/ml (µmol.min-1.ml-1) = [(∆Abs/min)×103×Vt] / [1.36×104 × Vm]
Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima).
103 es una factor de conversión.
Para simplificar los cálculos, conviene calcular un factor “f” tal que:
Actividad en U/ml (µmol.min-1.ml-1) = (∆Abs/min)×f
Calcular dicho factor f para nuestros ensayos
Resultados
Representar gráficamente la absorbancia frente al tiempo para cada uno de
los tubos y obtener la recta que mejor se ajusta a los puntos:
calcular el ∆Abs/min
Calcular la actividad enzimática en U/ml suero (μmol/min /ml suero)
- Valores ∆Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S]
- Gráfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S.
- Valor obtenido de KM y Vmáx .
Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten
*
En la práctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturación, es poco preciso
A partir de 6-8 puntos experimentales, puede considerarse fiable la
determinación gráfica de KM y Vmax por este método
La KM y la Vmax son únicas para cada actividad enzimática en unas condiciones de pH y Tª determinadas
-Es un proceso bifásico:
KM: da información sobre la fase de fijación del sustrato E+SES.
Vmax: da información sobre la fase catalítica (cinética de paso de SP).
Velocidad inicial v0
Gráfica Michaelis-Menten
V max
Vmax
2
Km
-Significado de KM :
su valor es próximo a la [S] que suelen darse en
condiciones fisiológicas. Esto permite la regulación de la
actividad del enzima en respuesta a pequeñas variaciones
de pH, Tª, fuerza iónica, ….
-Sería la [S] a la cual el enzima trabaja a la mitad de su
velocidad máxima. Tiene unidades de concentración (M)
S
k 1  k 2
KM 
k1
Si k2<<k-1:
k 1
1

KM 
k1 K a
La KM puede ser un indicador de la afinidad de unión del enzima por el sustrato
-Significado de vmax :
La vmax revela el número de recambio de la enzima
-(La Constante catalítica ó) El Número de recambio (turnover):
Número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y por
cada molécula de enzima, en condiciones de saturación
(U/mol de enzima ó mol de Sustrato X min.-1 X mol de enzima-1)
Si hay S >>>> E, todo E está como ES y la kcat ~ k2
Cuestionario - Informe
1.- ¿Por qué es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la
actividad de butirilcolinesterasa?
¿Y por qué butiriltiocolina y no butirilcolina?
¿Por qué prescindimos de inhibidores de colinesterasas?
2.- ¿La enzima ensayada da una respuesta lineal de formación de producto
con el tiempo?
¿La enzima ensayada, cumple la ecuación de Michaelis - Menten?
3.- En hojas aparte deberá presentar un informe, que contenga los cálculos
ya comentados:
- La tabla de Resultados.
- Gráfica de absorbancia frente a tiempo.
- Tabla con valores de Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S]
- Gráfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S.
- Valor obtenido de KM y Vmáx .
Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2
Protección personal
En el laboratorio SIEMPRE ATENTOS!!
Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2
Procedimientos
1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. No se colocará ningún material en la boca ni se pasará la lengua por las etiquetas.
3. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la
formación de aerosoles y gotículas.
4. Se limitará el uso de jeringuillas y agujas hipodérmicas, que no se utilizarán en lugar de dispositivos
de pipeteo ni con ningún fin distinto de las inyecciones por vía parenteral o la aspiración de líquidos de
los animales de laboratorio.
5. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos
se comunicarán al supervisor del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos accidentes
e incidentes.
6. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
7. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de
eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de
efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando.
8. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegerán de la contaminación
mientras se encuentren en éste.
Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2
Procedimientos
Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2
Zonas de trabajo del laboratorio
1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados
con el trabajo.
2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material
potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo.
3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados
antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.
4. El embalaje y el transporte de material deberán seguir la reglamentación nacional o
internacional aplicable.
5. Las ventanas que puedan abrirse estarán equipadas con rejillas que impidan el paso de
artrópodos.
Seamos
Profesionales!!
(=responsables)
Los cuadernillos de practicas deben entregarse al profesor
responsable de la práctica al concluir la misma, con
el nombre del alumnos,
así del compañero