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CLART® ENTHERPEX
DETECCIÓN Y TIPADO DE
HERPES Y ENTEROVIRUS HUMANOS
MEDIANTE
IDENTIFICACIÓN GENÓMICA
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
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CLART® ENTHERPEX
CLART® ENTHERPEX está bajo la protección de la familia de patentes correspondiente a la solicitud
de Patente Internacional PCT WO2009122201. Esta familia comprende miembros que han entrado
en fase nacional y regional en distintos territorios, entre los cuales se incluyen patentes concedidas
en Europa, Méjico y Rusia, y solicitudes de patente en tramitación en Brasil y Canadá.
CLART®, CLART-Strip®, CAR®, SAICLART®, AUTOCLART® y ENTHERPEX® son Marcas Registradas por
GENOMICA.
EL ON0318 sólo ampara el diagnóstico in vitro de CMV.
GENOMICA, S.A.U.
Parque Empresarial Alvento, Edificio B
Calle Vía de los Poblados, 1 – 1ª planta
28033 Madrid, España
www.genomica.com
Versión 5
Julio 2015
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ÍNDICE:
1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
4.1. Reactivos de extracción-purificación
4.2. Reactivos de amplificación
4.3. Reactivos de visualización
4.4. Otros componentes
5. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO
5.1. Reactivos y material
5.2. Equipos
6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
6.1. Recomendaciones generales
6.2. Precauciones para la visualización
7. TOMA DE MUESTRAS
7.1. Torundas
7.2. Suero, plasma
7.3. Líquido cefalorraquídeo
7.3. Tejido fijado en formol o etanol e incluido en parafina
8. PROTOCOLO DE TRABAJO
8.1. Extracción manual del ADN/ARN a partir de diferentes muestras
8.1.1. Torundas
8.1.2. Suero, plasma
8.1.3. Líquido cefalorraquídeo
8.1.4. Tejido fijado en formol o etanol e incluido en parafina
8.2. Extracción automática
8.3. Reacción de amplificación
8.4. Visualización del producto amplificado en CLART-Strip® (CS)
8.4.1 Visualización Manual
8.4.2. Visualización en autoclart®
9. LECTURA DE RESULTADOS
10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
12. BIBLIOGRAFÍA
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1. GLOSARIO DE TÉRMINOS
Consúltense las instrucciones de uso
Fecha de caducidad
Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar a temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 2 ºC y 8 ºC
2ºC
-18ºC
Conservar entre –30 ºC y –18 ºC
- 30ºC
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2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO
CLART® ENTHERPEX detecta la presencia en muestras clínicas (torundas, suero, plasma, líquido
cefalorraquídeo y biopsias) de los 8 virus herpes humanos: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6,
HHV-7 y HHV-8; y de los tres virus más importantes desde el punto de vista clínico humano de la
familia de Enterovirus, pero sin diferenciarlos entre ellos: Poliovirus, Echovirus y Coxsackievirus.
La detección se lleva a cabo mediante la amplificación de un fragmento de entre 106-328 pb,
cuya secuencia aunque está altamente conservada es lo suficientemente específica como para
identificar cada tipo de virus. De esta manera, se asegura la especificidad de la detección.
La detección del producto amplificado por RT-PCR se lleva a cabo mediante una plataforma
tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART® (Clinical Arrays Technology). La
plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez muy cómodo y eficaz que
consiste en imprimir un microarray en el fondo de un pocillo de placa microtiter, lo que simplifica
todo el proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de microarrays clásicos. La
Figura 1 muestra un CLART-Strip® o CS de 8 pocillos.
Figura 1. Plataforma CLART-Strip®-CS en forma de tira de 8 pocillos.
Este tipo de tecnología permite la detección simultánea de múltiples marcadores moleculares de
utilidad diagnóstica y de los controles necesarios para asegurar la fiabilidad de los resultados
obtenidos.
El sistema de detección con CLART® ENTHERPEX se basa en la precipitación de un producto
insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la hibridación de los productos
amplificados con las sondas específicas. Durante la RT-PCR, los productos amplificados se marcan
con biotina. Después de la amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas sondas
específicas que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo que se
incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la
estreptavidina con la biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran
unidos a sus sondas específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto
insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en
las que ocurre la hibridación (Figura 2).
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Figura 2: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la superficie,
capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A través de la biotina, se
une el conjugado, en este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano, HorseRadish Peroxidase). El
sustrato o-Dianisidina por la acción de la HRP, produce un precipitado sobre la zona en la que se produce
la hibridación.
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La sensibilidad obtenida combinando la amplificación genómica y la visualización en el microarray
con el kit CLART® ENTHERPEX es tan alta, que no es necesario hacer dobles amplificaciones
(nested-PCR), evitando así el riesgo de contaminación que éstas conllevan.
Uno de los principales inconvenientes de la detección por amplificación genética son los falsos
negativos, debidos principalmente a la presencia de inhibidores de la mezcla de enzimas (RT y ADN
polimerasa) en las muestras en las que se quiere detectar el virus (hemoglobina, sales, etc).
Con el kit CLART® ENTHERPEX se han eliminado estos falsos negativos añadiendo a cada uno de
los tubos de amplificación un control interno de la eficiencia de la reacción de amplificación.
Si la extracción RNA/DNA se realiza de forma incorrecta la técnica dará lugar a un falso negativo,
por lo que se recomienda especial cuidado a la hora de realizar este proceso.
A su vez, se debe incluir un control negativo de extracción para comprobar que las muestras no
hayan sufrido contaminaciones durante los procesos de extracción, amplificación y visualización;
lo que daría lugar a un falso positivo.
3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT
El kit CLART® ENTHERPEX contiene suficientes reactivos para la extracción y análisis del ADN/ARN
de 16 ó 48 muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas,
dependiendo de la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en
las condiciones indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad del kit.
3.1. Reactivos de extracción
El kit de Extracción y Purificación CLART® ENTHERPEX se envía a -20º C y se debe conservar a esta
temperatura hasta su uso.
Sus componentes son:
• SEML (solución de extracción). Una vez descongelada se debe guardar a 4ºC y consumir
antes de 8 días.
• SD (solución de dilución). Conservar a -20ºC o a 4ºC.
• IP (Isopropanol). Conservar a -20ºC.
• DE (Etanol 70%). Conservar a -20ºC.
• DB (Solución de digestión 5X). Una vez descongelada guardar a 4ºC.
• PK (Proteinasa K 10X). Una vez descongelada se debe mantener en hielo y guardar a 4ºC.
No usar este reactivo si ha transcurrido más de un mes tras su descongelación.
3.2. Reactivos de amplificación
Se envían y conservan a -20º C.
•
Tubos de amplificación
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Se envían dos tipos de tubos de amplificación:
•
•
Tubo incoloro (multiplex PCR 1) para la amplificación de HSV-1, HSV-2 y VZV. Contienen
45 µl de mezcla de reacción. Mix1.
Tubo verde (multiplex-RT-PCR 2) para la amplificación de CMV, EBV, HHV-6, HHV-7,
HHV-8 y Enterovirus (Echovirus, Poliovirus y Coxsackivirus). Contienen 43 µl de mezcla
de reacción. Mix2
¡ADVERTENCIA!: Hay que añadir 2 µl de mezcla de enzima antes de introducir el material
genético extraído en los tubos de amplificación verdes. Los tubos incoloros ya llevan
incorporada la enzima.
•
Mezcla de Enzima: es una mezcla de las enzimas de RT (retrotranscriptasa) y DNA
Polimerasa. Lista para su uso. Conservar a -20ºC.
NOTA: En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura; la
aparición de un color rojizo en la ventana de visualización indica que en algún momento los
productos han sobrepasado la temperatura de conservación de –20oC y no deben utilizarse.
3.3. Reactivos de visualización
El kit de visualización se envía a 4 ºC.
¡ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, las tiras CLART-Strip® (CS) deben conservarse a
temperatura ambiente.
• Tiras CS (incluyendo las sondas específicas). Se suministran en un sobre termosellado.
Conservar siempre cerrado (máx. 25ºC), a temperatura ambiente y protegido de la luz.
• SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4 ºC.
• DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC.
• CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes de usar.
• RE (Solución de Revelado). Conservar a 4º C.
• TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4º C.
3.4. Otros componentes
Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesitan los siguientes componentes:
• Lector CAR® (CLINICAL ARRAY READER): permite la lectura e interpretación automática de
hasta 12 tiras de arrays CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras. Está fabricado y
distribuido por GENOMICA para su uso exclusivo con los kits de diagnóstico.
• SAICLART®: software desarrollado por GENOMICA para el procesamiento de imágenes.
• Software específico del kit CLART® ENTHERPEX diseñado y validado por GENOMICA.
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Figura 3. CAR® (CLINICAL ARRAY READER)
4. MATERIAL REQUERIDO, NO SUMINISTRADO
A continuación describimos todo el material requerido que no es suministrado con el kit.
4.1. Reactivos y material
-
Agua destilada.
Guantes desechables.
Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo.
Recipiente con hielo picado.
Tubos tipo eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
Gradillas para tubos de 1,5 ml.
Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
Suero salino (0.9% NaCl).
4.2. Equipos
• autoclart® (figura 3) Este equipo se necesita para la visualización automática El
autoclart® permite el procesado automático de la fase de visualización de hasta 12
tiras de arrays CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras.
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Figura 4. autoclart®
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Microcentrífuga.
Termociclador.
Cabina de flujo laminar para el laboratorio de extracción.
Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de
pre-PCR.
Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir el material genético a los tubos de
amplificación.
Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl , 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de
post-PCR.
Termobloque con agitación ajustable a 25°C, 30°C y 59 ºC. Compatible con placas de 96
pocillos.
Vórtex.
Sistema de vacío.
5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN
¡Muy importante para evitar contaminaciones! Leer detenidamente antes de comenzar la
técnica.
5.1. Recomendaciones generales
1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar la contaminación de
las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada una de las áreas debe tener su
propio material de trabajo identificado (pipetas, puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca
debe salir de cada una de ellas.
1. Área pre-PCR: En este área se hace la preparación de las muestras, la extracción del ADN
y la adición del material extraído a los tubos de amplificación. Dicha preparación de las
muestras para su extracción debe realizarse dentro de una cabina adecuada y con las
medidas de esterilización más amplias posibles para evitar contaminaciones.
2. Área post-PCR: En esta área se lleva a cabo la amplificación y la visualización del producto
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amplificado. El material de esta área nunca ha de entrar en contacto con el del área de
extracción. Evitar ir al área de pre-PCR después de haber estado trabajando en el área de
visualización.
2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con cierta
frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empieza a trabajar en las áreas antes descritas.
Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se añada el ADN a los tubos de amplificación.
3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas) en profundidad con lejía
diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras, y obligatoriamente después de
una contaminación. En el caso de termocicladores y termomixers, se recomienda limpiarlos antes
y después de su uso, en estas mismas condiciones.
4. Emplear siempre puntas con filtro y pipetas de desplazamiento positivo para evitar
contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de pipetas para cada
área.
5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado.
6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes, aunque sean del mismo lote.
7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para evitar contaminaciones.
8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo.
9. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se emplean otras
muestras distintas a las indicadas.
5.2. Precauciones para la extracción y la adición del material extraído al tubo de amplificación.
1. Utilizar guantes en todo momento.
2. Limpiar las superficies de trabajo de la cabina con lejía diluida al 10%.
3. Encender el flujo laminar y la luz UV al menos 20 minutos antes de comenzar la extracción.
Apagar la luz UV cuando se esté trabajando dentro de la cabina.
4. La preparación de las muestras antes de su extracción, debe hacerse dentro de la cabina.
5.3 Precauciones para la visualización
1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del pocillo, ya que podría
dañarse el microarray situado en el fondo/pocillo.
2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del pocillo CS, nunca directamente sobre el
fondo.
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3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los productos
desnaturalizados de PCR.
4. El array no debe quedar seco.
5. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el microarray para evitar que
queden restos de éste y que reaccionen con la solución RE, produciendo un precipitado
inespecífico que pueda dar lugar a interpretaciones erróneas del resultado.
6. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las distintas soluciones.
7. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de posición y que
no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso contrario, limpiar el fondo del
pocillo con un papel de celulosa impregnado de alcohol.
6. TOMA DE MUESTRAS
6.1. Torundas
Tomar la muestra con una torunda seca y estéril, de algodón o alginato, preferentemente del tipo
uretral (incluso para los frotis vaginales). No utilizar dispositivos que produzcan el sangrado de la
lesión. Volver a introducir la torunda en su tubo sin ningún tipo de medio. Conservar la muestra a
4º C si se va a procesar antes de 7 días o a -20º C si se va procesar después. Las torundas son de un
solo uso con lo que una vez procesadas deben desecharse. Es importante evitar congelaciones y
descongelaciones repetidas.
6.2. Suero o plasma
Las muestras de sangre de las que se desee extraer el plasma han de tomarse en tubos que
contengan citrato o EDTA como anticoagulante, nunca heparina.
Para extraer el suero hay que dejar coagular la muestra de sangre durante 30 min y centrifugar a
1500 g durante 20 min.
En algunos casos, tras la toma de este tipo de muestras es posible aislar la fracción celular y
proceder a la extracción del DNA/RNA a partir de ésta.
Si la muestra se va a procesar antes de 12 h se debe conservar a 4º C. Si el análisis se realiza con
posterioridad, la muestra se debe alicuotar y almacenar congelada a -70º C y descongelar justo en
el momento de su procesamiento. Es importante evitar congelaciones y descongelaciones
repetidas.
6.3. Líquido cefalorraquídeo
Si la muestra se va a procesar antes de 12 h se debe conservar a 4º C. Si el análisis se realiza con
posterioridad, la muestra se debe alicuotar y almacenar congelada a -70º C y descongelar justo en
el momento de su procesamiento. Es importante evitar congelaciones y descongelaciones
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repetidas.
6.4. Biopsias fijadas en formol o etanol e incluidas en parafina
Fijar las muestras en formol tamponado durante el menor tiempo posible (nunca más de 24h),
para evitar la degradación del DNA/RNA. El empleo de formol no tamponado o la fijación durante
más de 24h podría conducir a un resultado falso negativo.
Es importante limpiar cuidadosamente la cuchilla con xileno o usar cuchillas de un solo uso, antes
y después de cortar la muestra, para evitar arrastrar restos de otra muestra cortada
anteriormente. Hacer con el microtomo 2-3 cortes de 5 µm y ponerlos en un tubo estéril de 1,5
ml.
7. PROTOCOLO DE TRABAJO
7.1. Extracción manual del ADN/ARN a partir de diferentes muestras
Se recomienda que, para obtener unos óptimos resultados, el rendimiento de la extracción sea,
como mínimo de 5-10 ng/μl de ADN/ARN, independientemente de que la extracción se realice
de forma manual o automática.
Recomendaciones específicas antes de comenzar la extracción:
•
•
•
•
•
Trabajar en el área pre-PCR de extracción, siempre en campana y siguiendo las
recomendaciones del punto 6.1.
Antes de comenzar y al finalizar se debe limpiar cuidadosamente el área de la campana
con lejía diluida al 10%.
Limpiar las pipetas antes y después de cada uso con lejía diluida al 10%.
Mantener las muestras en hielo.
Utilizar tubos eppendorf de 1.5 ml estériles. Mantenerlos lo más separado posible en la
gradilla durante la extracción para evitar contaminaciones.
Extracción del ADN/ARN
7.1.1. Torundas
Al final de cada serie de muestras incluir un control negativo constituido por 1,5 ml de suero salino
y procesarlo igual que el resto de las muestras.
1. Añadir 1,5 ml de suero salino (cloruro sódico 0,9 %) al tubo que contiene la torunda y agitar en
el vortex durante 1 min.
2. Decantar el sobrenadante en un tubo Eppendorf de 1,5 ml autoclavado y centrifugarlo durante
10 minutos en microcentrífuga a la máxima velocidad.
3. Quitar el sobrenadante con la pipeta cuidando de no arrastrar el precipitado de células.
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4. Descongelar un tubo de DB 5X (Solución de Digestión 5X), un tubo de PK 10X (Proteinasa K 10X)
y un tubo de SD (Solución de Dilución). La Proteinasa K se debe mantener en hielo mientras se esté
usando y después se debe guardar a 4ºC. Nunca volver a congelarla una vez descongelada.
Preparar la mezcla de digestión, mezclando las siguientes cantidades por cada muestra a analizar:
70 x (nº tubos + 1) = __ µl de SD (Solución de Dilución).
20 x (nº tubos + 1) = __ µl de DB5X (Solución de Digestión 5X).
10 x (nº tubos + 1) = __ µl de PK 10X (Proteinasa K 10X).
5. Añadir 100 µl de mezcla de digestión a cada muestra. Resuspender suavemente el precipitado
de células con la ayuda de la micropipeta.
6. Incubar a 55-60ºC durante 2 h.
7. Hervir durante 10 min para inactivar la Proteinasa K. Si el cierre de los tubos no es lo
suficientemente fuerte, se recomienda perforar los tapones con una aguja para impedir que se
abran durante la incubación a 100 ºC. Procurar que el agua del baño no entre en el tubo por este
agujero. No cerrar la tapa del baño.
8. Centrifugar en microcentrífuga a máxima velocidad durante 10 min. Pasar inmediatamente el
sobrenadante a un tubo limpio y tomar una alícuota de 5 µl para hacer la reacción de
amplificación. Guardar el resto a -20 ºC.
7.1.2. Suero o plasma
Es necesario procesar una muestra formada por 100 µl de suero salino y que servirá como control
negativo de la reacción de amplificación y visualización.
1. Descongelar la muestra en hielo.
2. En un tubo Eppendof poner 100 µl de muestra clínica
3. Añadir 400 µl de SEML (solución de extracción de muestras líquidas). Esperar a que la solución
se descongele y se vuelva transparente antes de usarla. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces
e incubar durante 15 min a Tª ambiente.
4. Añadir 500 µl de Isopropanol (almacenado a -20º C), mantener el isopropanol en hielo hasta
su uso. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces y centrifugar, preferiblemente a 4º C, a 13000
rpm durante 20 min.
5. Aspirar el sobrenadante con micropipeta. Se puede utilizar la micropipeta de 1000 µl para
eliminar el sobrenadante, siempre y cuando se emplee al final una micropipeta de menor escala,
por ejemplo la de 20 µl, para los restos del fondo del tubo y evitar eliminar el precipitado por
equivocación.
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6. Añadir 500 µl de Etanol 70% (almacenado a -20º C), mantener en hielo hasta su uso. Agitar
ligeramente para limpiar el precipitado del fondo y centrifugar 15 min a 13000 rpm.
7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente como se indica en el paso 5. Secar perfectamente en
la campana durante 15 ó 20 min dejando los tubos abiertos. Antes de resuspender la muestra
comprobar que no queden restos de etanol que podrían inhibir la PCR.
8. Resuspender en 25 µl de Solución de dilución. El ADN/ARN extraído se puede utilizar
directamente para su análisis (se mantendrá en hielo hasta el momento de añadirlo al tubo de
amplificación) o se puede guardar a -20º C.
7.1.3. Líquido cefalorraquídeo
Es necesario procesar una muestra formada por 50 µl de suero salino y que servirá como control
negativo de la reacción de amplificación y visualización.
1. Descongelar las muestras en hielo.
2. En un tubo Eppendof poner 50 µl de muestra clínica
3. Añadir 200 µl de SEML (solución de extracción de muestras líquidas). Esperar a que la solución
se descongele y se vuelva transparente antes de usarla. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces
e incubar durante 15 min a Tª ambiente.
4. Añadir 250 µl de Isopropanol (almacenado a -20º C), mantener el isopropanol en hielo hasta su
uso. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces y centrifugar, preferiblemente a 4º C, a 13000 rpm
durante 20 min.
5. Aspirar el sobrenadante con micropipeta. Se puede utilizar la micropipeta de 1000 µl para
eliminar el sobrenadante, siempre y cuando se emplee al final una micropipeta de menor escala,
por ejemplo la de 20 µl, para los restos del fondo del tubo y evitar eliminar el precipitado por
equivocación.
6. Añadir 500 µl de Etanol 70% (almacenado a -20º C), mantener en hielo hasta su uso. Agitar
ligeramente para limpiar el precipitado del fondo y centrifugar 15 min a 13000 rpm.
7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente como se indica en el paso 5. Secar perfectamente en
la campana durante 15 ó 20 min hasta que no queden residuos de etanol. Antes de resuspender la
muestra comprobar que no queda etanol.
8. Resuspender en 25 µl de Solución de dilución. El ADN/ARN extraído se puede utilizar
directamente para su análisis (se mantendrá en hielo hasta el momento de añadirlo al tubo de
amplificación) o se puede guardar a -20º C.
7.1.4. Biopsias fijadas en formol o etanol e incluidas en parafina
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1.a. Incluidas en parafina: Hacer con el microtomo 2 cortes de 5 µm y ponerlos en un tubo
Eppendorf de 1,5 ml autoclavado. Es importante limpiar cuidadosamente la cuchilla con xileno,
antes y después de cortar la muestra, para evitar arrastrar restos de otra muestra cortada
anteriormente.
1.b. Fijadas en formol o etanol: Cortar/Machacar un fragmento de muestra de unos 2-3ml con
una cuchilla estéril sobre un porta estéril e introducirlo en un tubo estéril de 1,5 ml. Machacar el
tejido con la punta de la pipeta, mezclar en el vortex para facilitar la lisis.
2. Descongelar a temperatura ambiente un tubo de DB 5X (Solución de Digestión 5X), un tubo de
PK 10X (Proteinasa K 10X) y un tubo de SD (Solución de Dilución). La Proteinasa K se debe
mantener en hielo mientras se esté usando y después se debe guardar a 4ºC, nunca volver a
congelarla una vez descongelada. Preparar la mezcla de digestión, mezclando las siguientes
cantidades por cada muestra a analizar:
70 x (nº tubos + 1) = __ µl de SD (Solución de Dilución).
20 x (nº tubos + 1) = __ µl de DB5X (Solución de Digestión 5X).
10 x (nº tubos + 1) = __ µl de PK 10X (Proteinasa K 10X).
Añadir 100 µl de mezcla de digestión a cada muestra. Empujar el corte con la punta de la
micropipeta para que quede completamente cubierto por la mezcla de digestión.
Añadir 100 µl de la mezcla a un tubo de 1,5 ml vacío, que se procesará como control negativo
de extracción y visualización.
3. Incubar a 56º C durante 3 h en un termobloque o en un baño.
4. Hervir durante 10 min para inactivar la Proteinasa K. Si el cierre de los tubos no es lo
suficientemente fuerte, se recomienda perforar los tapones con una aguja para impedir que se
abran durante la incubación.
5. Centrifugar inmediatamente en microcentrífuga durante 10 min. Recoger el sobrenadante en
un tubo de 1,5 ml limpio, atravesando con la micropipeta la capa superior de parafina solidificada.
El DNA extraído se puede utilizar directamente para su análisis o se puede guardar a -20º C.
7.2. Extracción automática
Seguir recomendaciones del fabricante.
7.3. Reacción de amplificación
7.3.1 Recomendaciones específicas para la amplificación:
• Trabajar en el área de Pre-PCR, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del
punto 6.1.
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• Tener especial cuidado a la hora de añadir la mezcla de enzimas a los tubos de
amplificación, ya que contiene un elevado porcentaje de glicerol, de forma que si se introduce
demasiado la punta de la pipeta, la mezcla se adhiere a las paredes provocando, por un lado,
que se añada más mezcla de lo necesario al tubo de reacción, y por otro lado, se produzca
una pérdida del producto, pudiendo darse el caso de no tener suficiente para el resto de
tubos de amplificación del kit.
• Añadir el ADN/ARN en el área de Pre-PCR, siempre en campana y siguiendo las
recomendaciones del punto 6.1. Durante el proceso mantener los tubos cerrados separados y
en hielo.
7.3.2 Protocolo de la Reacción de amplificación:
1. Descongelar por cada muestra que se vaya a analizar dos Tubos de amplificación (uno
incoloro y otro verde, correspondientes a las dos multiplex difierentes) y mantenerlos en
hielo. No usar temperaturas superiores a 37º C para la descongelación.
2. Centrifugar unos segundos en la microcentrífuga para que quede todo el líquido en el
fondo del tubo. Si no se dispone de adaptadores de microcentrífuga, se pueden utilizar en su
lugar tubos de un tamaño mayor a los que se les haya cortado la tapa.
3. Añadir 2 μl de la mezcla de enzima a los tubos de amplificación verdes (Mix 2). Mantener
la mezcla de enzimas en hielo durante su manipulación.
4. Añadir 5 µl del ARN/ADN con una concentración mínima de 3ng/µl extraído de las
muestras, a cada uno de los Tubos de Reacción y resuspender varias veces con la
micropipeta. Dejar los tubos en el hielo.
5. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas para ambos tipos de
multiplex:
1 ciclo
45ºC 45min
95ºC 15min
45 ciclos
95ºC 30 seg
56ºC 90 seg
72ºC 60 seg
1 ciclo
72ºC 10 min
4ºC continuo hasta la recogida de tubos (opcional)
6. Arrancar el programa y colocar los Tubos de Reacción en el termociclador. La duración de
la amplificación es de unas 5 horas, aunque puede variar ligeramente dependiendo del
equipo empleado.
- 17 -
7.4. Visualización del producto amplificado en CLART-Strip® (CS)
Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización:
1. Encender el CAR® (CLINICAL ARRAY READER) al comienzo del proceso. La autocalibración
del equipo tarda unos minutos y es necesario, si se desea, introducir el nombre de las
muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura. El aparato debe estar listo en
el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de
revelado.
2. PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO REUTILIZAR
SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON ANTERIORIDAD.
3. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner en marcha el
programa de desnaturalización. Colocar los tubos de amplificación separados en el
termociclador durante el proceso y nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización.
4. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro pero sí es necesario usar
una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se añada un nuevo
reactivo, aunque se trate de TL. Sí es necesario utilizar puntas con filtro durante la adición
de amplificados al pocillo CS.
5. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para aspirar las
soluciones, desechar los peines después de cada uso o descontaminarlos con una solución
de lejía diluida al 10% tras cada ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira correctamente
y aclarar la solución de lejía aspirando agua destilada.
6. Al aspirar las diferentes soluciones dentro de los pocillos de la tira NO se dejará volumen
residual.
7. Atemperar la SH a temperatura ambiente. Asegurarse de que no tiene cristales en el
momento de uso.
8. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de placas ha estado a
59ºC al menos durante 30 min o 1 hora.
9. Introducir la tira en el termomixer INMEDIATAMENTE después de añadir los productos
amplificados especialmente si se van a realizar muchas tiras.
10. En el caso de que se realicen un número alto de tiras a la vez, se recomienda añadir los
reactivos (salvo los amplificados) con pipetas multicanal y cubetas específicas, para esto se
debe seleccionar una cubeta para cada tipo de reactivo. Al final de cada ensayo se deben
lavar las cubetas con lejía al 10%, y después con agua destilada.
7.4.1. Visualización manual.
- 18 -
1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para
este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador, lo más separado posible, e
incubar a 95º C durante 10 minutos, NUNCA SOBREPASAR LOS 10 MINUTOS. Programar
en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los
amplificados sigan a 95º C. Sacar los tubos de la incubación a 95º C y colocarlos
inmediatamente en un recipiente con hielo.
2. Preparación de la Solución TL diluida:
Por cada CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado diluida, añadiendo 1
ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada.
3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los CS añadiendo 200
µl de Solución TL diluida a cada pocillo. Resuspender de 10 a15 veces con la pipeta
multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la superficie del array. Se
recomienda realizar este lavado mientras se están desnaturalizando los amplificados y
mantener la solución de lavado en la tira hasta que se vaya a proceder a la adición de los
mismos. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de
vacío.
El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco durante
mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente.
4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH, ésta debe estar a Tª ambiente y sin cristales.
Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de solución SH (evitar que se
forme espuma) a cada pocillo de los CS. A continuación, añadir 5 µl de producto de PCR
desnaturalizado. Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de
hibridación SH, con cuidado de no tocar el fondo del pocillo. Se recomienda cargar cada
tira de manera independiente y separada del resto para evitar contaminaciones. Al
concluir la adición de muestra en cada tira, debe ir inmediatamente al termomixer de
placas, para evitar que esté demasiado tiempo a temperatura de laboratorio y evitar las
posibles renaturalizaciones de los amplicones. Incubar la tira cubierta con la tapa de
plástico transparente en el termomixer de placa tapado durante 1 hora a 59º C, agitando a
550 rpm.
Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH de los CS con pipeta o bomba
de vacío: El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer
seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente. (Dejamos
programado el termomixer de placa a 30º C y en movimiento para su utilización posterior
en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura).
5. Doble Lavado: añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10
a15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o
preferiblemente con bomba de vacío multicanal sin dejar remanente. Repetir la
operación. Este paso se debe realizar con puntas diferentes para cada pocillo en ambos
lavados. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los
pocillos con esta solución hasta que el termomixer alcance la temperatura.
- 19 -
6. Bloqueo y conjugado: se recomienda centrifugar la solución CJ de alta afinidad durante 10
segundos antes de usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Por cada CS, se
añade 1 ml de solución DC y 7.5 µl de Solución CJ de alta afinidad.
Desechar la Solución TL diluida sin dejar restos de solución y añadir a cada pocillo del CS
100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el termomixer de
placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la
solución rápidamente con pipeta o bomba de vacío multicanal. (Dejar programado el
termomixer de placa a 25º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 8.
Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura).
7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS,
resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar completamente la
solución con la pipeta o vacío. Repetir la operación dos veces más.
Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la
Solución RE dando lugar a una señal inespecífica.
8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida completamente y añadir 100 µl de
solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a 25 º C en el termomixer de placa
sin agitación.
¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación
9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe quedar seco.
10. CAR® (CLINICAL ARRAY READER): Coloque la placa dentro del CAR®, éste analizará las
muestras automáticamente.
7.4.2. Visualización en autoclart®
1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para
este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar a 95ºC durante 10
minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10
minutos los amplificados sigan a 95ºC. Sacar los tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos
inmediatamente en un recipiente con hielo.
2. Encender el equipo autoclart® y seguir las instrucciones que aparecen en la pantalla:
1. Cerrar la puerta y pulsar el mando.
2. Seleccionar Run en el menú de inicio.
3. Seleccionar el tipo de ensayo a realizar: ENTHERPEX Test.
4. Seleccionar el pocillo de la tira en el que se desea comenzar: A1 o E1, en el caso de que
se reutilice un CS donde se han procesado previamente los 4 primeros arrays.
5. Seleccionar el número de muestras.
- 20 -
Con autoclart® se pueden procesar desde 4 a 96 muestras. El número de muestras debe
ser un múltiplo de 4.
6. Confirmar que el número de muestras y el pocillo de inicio (A1 o E1) es correcto.
7. Colocar el rack completo de puntas en su posición correspondiente.
8. Chequear que el contenedor de puntas y el contenedor de desecho de reactivos están
vacíos.
9. Llenar la botella de agua destilada con 250 ml de agua destilada.
10. Añadir los volúmenes de reactivos que autoclart® solicita en función del número de
muestras que se quieran procesar:
- TL (Tampón de lavado). El volumen que aparece en la pantalla, indica la cantidad de TL
diluido necesaria. Para preparar el TL diluido realizar una dilución 1:10 del TL en agua
destilada.
- SH (Solución de Hibridación). Añadir el volumen de solución de hibridación atemperada
que aparece en la pantalla.
- CJ (Conjugado). Se recomienda centrifugar el CJ durante 10 segundos antes de usarse.
Cada 1 ml de solución CJ diluida que indique la pantalla se prepara añadiendo 1 ml de DC
(Diluyente de conjugado) y 5 µl de Solución CJ. Se debe dar un vórtex a la solución una vez
diluida para homogenizar.
ADVERTENCIA: Debe de ponerse especial precaución a la hora de preparar la dilución del
conjugado: 5ul conjugado + 1000 ul diluyente de conjugado por tira, ya que un aumento
en la concentración del conjugado puede ocasionar falsos positivos.
- RE (Revelado). Añadir el volumen de revelado indicado en la pantalla.
11. Cerrar la puerta y pulsar el mando para comenzar.
El equipo realizará el pre-lavado de los CS y la adicción de la solución de hibridación, a
continuación emitirá un pitido para indicar que es el momento de la adicción de las
muestras, el pitido cesará cuándo el usuario abra la puerta del equipo.
12. Para añadir las muestras sacar los CS del autoclart® y adicionar al mismo pocillo de CS
5 µl producto de PCR desnaturalizado del tubo blanco y otros 5 µl del tubo verde,
resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación, con cuidado
de no tocar el fondo del pocillo. A continuación introducir de nuevo la placa en el
autoclart® y pulsar el mando para que continúe el proceso de visualización.
13. Cuando ha terminado el proceso de visualización, el autoclart® emite un pitido hasta
que el usuario abre la puerta del equipo para sacar los CS y proceder a la lectura en el
CAR®.
- 21 -
ADVERTENCIA: Una vez finalizada la visualización en autoclart® debe procederse de
forma inmediata a la lectura de los resultados en el CAR®, en caso contrario, podrían
aparecer falsos negativos por pérdida de la intensidad de las sondas.
14. CAR® (CLINICAL ARRAY READER): Coloque la placa dentro del CAR®, éste analizará las
muestras automáticamente.
9. LECTURA DE RESULTADOS
El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de forma
automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe en el que se indican los
resultados.
En la pantalla del equipo aparecerá una tabla con tres columnas, en la columna de la izquierda
aparecerán los virus que se caracterizan en el micro-array. En la columna del centro aparece el
resultado de positivo o negativo para cada virus, y en la columna de la derecha aparecerá la
conformidad del control de amplificación.
10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos negativos
debidos fundamentalmente a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las muestras en
las que se quiere analizar la presencia del virus (hemoglobina, restos de parafina, sales, etc). Con el
kit CLART® ENTHERPEX se han eliminado estos falsos negativos de amplificación gracias a la
introducción de un control interno en ambos tubos de reacción donde se analiza la muestra.
Cada tubo de amplificación contiene los siguientes oligos:
•
•
Oligos que amplifican un plásmido modificado incluido en el tubo de amplificación y que
se usa como control de amplificación de la reacción de RT-PCR/PCR.
Oligos específicos de Herpes virus y Enterovirus.
El tubo de RT-PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de los virus frente a la del control
de amplificación. De manera que, en ciertas condiciones (ej. cuando hay un elevado número
copias de un virus o cuando la muestra presenta coinfecciones con varios virus a la vez), puede
suceder que no se amplifique el control y aparezca una lectura de: CONFORME.
Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes interpretaciones de
los resultados de lectura:
- 22 -
1. Muestras positivas:
1.1. Con control de amplificación positivo
Virus
Especie
Resultado
Positivo
Control
Control Interno
Señal
> 0.150
Control
Conforme
Resultado
Conforme
CS
VIRUS
Marca de alineamiento
Control de amplificación
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO. Podemos decir que se trata de un verdadero resultado
positivo.
1.2. Con control de amplificación negativo
Virus
Especie
Control
Control Interno
Resultado
Positivo
Señal
< 0.150
Control
Conforme
Resultado
Sin señal
VIRUS
Marca de alineamiento
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO, aunque el control de amplificación se
muestre SIN SEÑAL. Esto se debe al efecto de la competencia con los virus. Podemos
- 23 -
decir que se trata de un verdadero resultado positivo.
2. Muestras negativas
Virus
Especie
Resultado
Negativo
Control
Control Interno
Señal
> 0.150
Control
Conforme
Resultado
Conforme
CS
Marca de alineamiento
Control de amplificación
Este se considera un RESULTADO VÁLIDO. En este caso podemos decir que se trata de un
verdadero resultado negativo.
2. Muestras inadecuadas, inhibidas
Virus
Especie
Resultado
Negativo
Control
Control Interno
Señal
< 0.150
CS
Marca de alineamiento
- 24 -
Control
PCR Inhibida
Resultado
Sin señal
Este se considera un RESULTADO NO VÁLIDO. Esto se debe a que algunas sustancias pueden
inhibir la reacción de PCR al perjudicar la actividad de la enzima ADN polimerasa.
La solución es verificar que en la muestra o el material genético extraído no hay presencia de
ninguna de estas sustancias. Se recomienda repetir la extracción o, si esto no es posible, pedir al
facultativo una nueva toma de muestra al paciente.
Existen dos posibilidades que dan lugar a un resultado de Virus No Concluyente:
•
En aquellos casos en que las réplicas de una sonda sean muy distintas entre sí.
•
En coinfecciones de más de 5 virus.
11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO
Control de interferencias conocidas:
Existen sustancias que pueden interferir en funcionamiento del kit CLART® ENTHERPEX.
Principalmente, son sustancias que inhiben la mezcla de enzimas y, por tanto, la reacción de
amplificación. Las interferencias más conocidas son:
1
Presencia de hemoglobina o parafina tras la extracción del DNA/RNA. Tanto el ADN extraído
a partir de muestras de sangre total o hemoderivados, como el obtenido a partir de muestras
de tejidos incluidos en parafina, puede contener restos de hemoglobina y parafina
respectivamente. Este problema se puede evitar purificando el DNA/RNA tras su extracción
2
Restos de Isopropanol en el ADN/ARN. En el proceso de extracción del ADN/ARN a partir de
muestras de suero, plasma y LCR, se tiene que precipitar este con Isopropanol. Si no se
procede a un secado correcto del precipitado, la presencia de Isopropanol en la muestra
puede producir una inhibición de la reacción de amplificación.
3
Utilización de muestras no adecuadas. El análisis de cualquier otro tipo de muestra clínica
distinta a las indicadas en el manual del kit CLART® ENTHERPEX, así como una toma incorrecta
de las muestras, puede conllevar que el resultado del análisis no sea concluyente o no
conforme por falta de amplificación por reacción inhibida. Por ejemplo, si la torunda ha sido
incluida en algún tipo de medio, la PCR puede resultar inhibida. Si el tiempo de fijación de un
tejido en formol es excesivo, el ADN puede degradarse.
4
Actividad residual de la Proteinasa K. En el proceso de extracción de ADN/ARN en muestras
de torundas y biopsias, se tiene que inactivar la Proteinasa K mediante incubación a 100 ºC
durante 10 minutos. Bajo estas condiciones, la inactivación se produce de forma completa. Si
este paso fuera omitido o las condiciones se suavizaran significativamente, podría ocurrir que
permaneciese una actividad residual de la Proteinasa K, lo que podría resultar en una
degradación de la ADN polimerasa y, por tanto, inhibición de la PCR.
5
La conservación inadecuada de las muestras puede influir en el resultado del análisis. Si las
muestras se someten a condiciones que puedan provocar una degradación del ADN/ARN que
- 25 -
contienen.
Especificaciones técnicas:
1. Parámetros Analíticos:
•
Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se determina mediante la amplificación de
diluciones seriadas de ADN de plásmidos recombinantes para cada uno de los virus
detectados en el kit. Cada uno de ellos lleva inserto el producto amplificado (incluyendo la
parte complementaria a las sondas específicas de detección). La visualización se realizó
tanto en CS dando lugar a los siguientes resultados:
VIRUS
Nº copias de plásmido
recombinante por
reacción de PCR
VZV
HHV-7
HSV-1
HSV-2
CMV
EBV
HHV-6
HHV-8
Coxsackivirus
Echovirus
Poliovirus
10
100
1000
Tabla 1. Relación del número de copias de plásmido recombinante necesarias para
obtener una sensibilidad del 100% en la detección de cada uno de los microorganismos.
•
Especificidad analítica. Se llevaron a cabo experimentos de especificidad con plásmidos
recombinantes visualizados en CS.
VIRUS
HSV-1
VZV
CMV
HHV-6
HHV-7
HHV-8
HSV-2
EBV
Enterovirus
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
100 %
99.4 %
92.2 %
Tabla 2: Especificidad analítica por tipo vírico
- 26 -
2. Parámetros de utilidad diagnóstica.
Para determinar los parámetros diagnósticos del kit, se han realizado estudios comparativos
de la técnica CLART® ENTHERPEX con extracción manual frente a las siguientes técnicas:
-
Herplex® : para los virus HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV y HHV-6
PCR cuantitiva: en algunos de los casos, para CMV y EBV
PCR tiempo real: para Enterovirus
PCR de desarrollo propio y detección en gel: para los virus HHV-7 y HHV-8
Inmunohistoquímica para HHV-8
Se ha validado el kit en los centros Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander),
Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa (Zaragoza) y Hospital Universitario La Paz (Madrid). El
total de muestras estudiadas ha sido 173, de las cuales 30 son torundas, 56 sueros/plasmas, 19
LCR y 68 son biopsias.
El análisis de los resultados de las muestras estudiadas se refleja en la siguiente tabla:
VIRUS
HSV-1
Torundas
Suero/Plasma
LCR
Biopsias
Total
HSV-2
Torundas
Suero/Plasma
LCR
Biopsias
Total
VZV
Torundas
Suero/Plasma
LCR
Biopsias
Total
CMV
Torundas
Suero/Plasma
LCR
Biopsias
Total
EBV
Torundas
Muestras
Positivas
Analizadas
Muestras
Negativas
Analizadas
Total
Sensibilidad (%)
Especificidad (%)
16
4
7
8
35
14
52
12
60
138
30
56
19
68
173
100
75
57.1
87.5
100
100
100
100
4
0
0
4
8
26
56
19
64
165
30
56
19
68
173
75
--100
100
--100
3
1
2
4
10
27
55
17
64
163
30
56
19
68
173
100
100
100
100
100
100
94.1
95.3
2
47
8
41
98
28
9
11
27
75
30
56
19
68
173
50
87.2
62.5
95.1
100
100
100
100
6
24
30
100
100
- 27 -
Suero/Plasma
2
54
56
100
LCR
2
17
19
100
Biopsias
38
30
68
94.7
Total
48
125
173
HHV-6
Suero/Plasma
9
47
56
77.8
Torundas
0
30
30
-LCR
3
16
19
33.3
Biopsias
23
45
68
91.3
Total
35
138
173
HHV-7
Torundas
3
27
30
100
Suero/Plasma
2
54
56
100
LCR
1
18
19
100
Biopsias
11
57
68
100
Total
17
156
173
HHV-8
Torundas
0
30
30
-LCR
0
19
19
-Suero/Plasma
3
53
56
100
Biopsias
2
66
68
100
Total
5
168
173
ENTEROVIRUS
Suero/Plasma
0
56
56
-Biopsias
0
68
68
-Torundas
0
30
30
-LCR
10
9
19
80
Total
10
163
173
Tabla 3: Parámetros diagnósticos de la Técnica CLART® ENTHERPEX
- 28 -
98.1
94.1
93.3
100
-100
100
100
100
100
100
--100
100
---100
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