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1. FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS DE
INMUNOHISTOQUÍMICA
Es una técnica que permite localizar moléculas en los tejidos mediante el
empleo de anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). La técnica, por
la gran especi¿cidad \ alta a¿nidad que tienen los anticuerpos para reconocer
moléculas \ unirse a ellas, permite detectar cantidades ín¿mas de moléculas
presentes en el tejido. La inmensa mayoría de técnicas de inmunohistoquímica
pueden aplicarse a tejido ¿jado e incluido en para¿na con buenos resultados,
siempre que la ¿jaciyn tisular, su procesado e inclusiyn se realicen adecuadamente
ya que la utilización de métodos o reactivos inapropiados en el tratamiento tisular
previo puede producir pérdidas de antigenicidad que limitarán o impedirán la
obtención de resultados ¿ables.
A continuación se expondrán los conceptos básicos que permitirán la
compresión de la técnica.
ƒAntígenos: Son aquellas sustancias capaces de producir una reacción
inmune. Sus propiedades inmunológicas son: inmunogenicidad
(capacidad de producir una respuesta especí¿ca bien humoral yo
celular), antigenicidad (capacidad de combinarse con anticuerpos yo
con receptores de células), alergenicidad (capacidad de producir reacción
alérgica). La inmunogenicidad viene dada por una serie de factores, es
decir, dependerá o bien de la molécula atacada (por ejemplo las proteínas
son las más inmunogénicas) o bien del sistema en conjunto (el hombre en
este caso; problemas de respuesta inmune).
ƒEpítopos: Son cada uno de los sitios discretos de una macromolécula
reconocidos individualmente por un anticuerpo especí¿co o por un 7&5
(receptor de linfocitos 7) especí¿co. Son regiones inmunológicamente
activas.
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Fundamentos biológicos de inmunohistoquímica
ƒAnticuerpos: La capacidad de reconocimiento especí¿co de cualquier
tipo de molécula o partícula extraña por parte del sistema inmune, es
posible gracias a que cuenta con las inmunoglobulinas (Ig) y con los
receptores de los linfocitos 7 (7&5), los cuales poseen las cualidades de
diversidad, heterogenicidad y procedencia a partir de reordenaciones de
genes.
Los tipos de Ig que encontramos el suero son las cinco siguientes ordenadas
de mayor a menor concentración en sangre:
1. La IgG atraviesa la vía placentaria. El feto adquiere las primeras
inmunoglobulinas de la madre. No forma anticuerpos a menos que se
produzca una infección, por lo que sintetizaría IgM. La IgG activa la cascada
del complemento por la vía clásica.
2. La IgA se encuentra en la mayor parte de las secreciones corporales, y
produce la activación de la cascada del complemento por la vía alternativa.
3. La IgM se encuentra circulante y se encarga de la activación de la cascada
del complemento por la vía clásica.
4. La IgD se encuentra como molécula de membrana en los linfocitos B.
5. La IgE aparece en alergias e infecciones por parásitos, siendo indetectable
en situaciones normales.
Las inmunoglobulinas se pueden encontrar solubles en sangre o como parte
especí¿ca del complejo de las células B. Están constituidas en su estructura
común por dos tipos de cadenas proteicas: pesadas y ligeras, diferenciándose
por sus características ¿sicoquímicas, ¿siológicas e inmunológicas.
Las Ig que se encuentran en las membranas de las células B van reconocer al
antígeno, es decir anticuerpos secretados por las células plasmáticas procedentes
de activación, proliferación y diferenciación de células B. Estos anticuerpos se
encuentran en el suero, en los líquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo
ciertos epitelios internos. Estas Ig circulantes son los efectores de la rama
humoral del sistema inmune especí¿co, ya que la sola unión antígenoanticuerpo
no es su¿ciente en todos los casos para terminar con él.
En el caso de los receptores de células 7 aparecen sólo como moléculas
de membrana de los linfocitos 7. 5econocen al antígeno restringido por el
complejo mayor de histocompatibilidad o CMH de la célula diana o de la célula
presentadora. El CMH son un conjunto de genes presentes en el cromosoma 6
implicados en la presentación de antígenos a las células 7. Suministran la base de
la inmunidad celular especí¿ca (en el caso de los linfocitos 7C) y del mecanismo
de los linfocitos 7 colaboradores (7H).
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
x &oPpOeMo antígenoanticuerpo AgAc: De¿ne la unión especí¿ca entre
ambos con el ¿n de inhibir o ralentizar la toxicidad del primero. Se realiza gracias
a algunas fuerzas débiles como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van Der Waals,
interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La reacción se caracteriza por su
especi¿cidad, rapidez, espontaneidad y reversibilidad.
x Antisuero: 7ambién llamado suero inPunoOygico, es el suero sanguíneo
que contiene anticuerpos policlonales derivados de diferentes líneas de células B.
3ara producir un anticuerpo es necesario puri¿car el antígeno (provocando esta
reacción). Lo ideal sería separar una célula que fabricase un tipo determinado
de anticuerpo y obtener clones o progenies en medios de cultivo. Esto no es
posible debido a la incapacidad de supervivencia de la célula productora de
anticuerpos en medio de cultivo. Cada linfocito genera una población celular
o clon, genéticamente idénticas (mismo anticuerpo). Sin embargo, en un
suero sanguíneo no encontramos un solo tipo de anticuerpos, sino una mezcla
heterogénea denominada antisuero o anticuerpos policlonales. Esto es debido a
tres razones principalmente:
1. La continua exposición a antígenos hacen que haya siempre un nivel
basal de respuesta inmunológica.
2. Los antígenos suelen ir acompañados de impurezas que también
producen respuesta inmunológica dando lugar a otros anticuerpos.
3. El sistema inmune reconoce al mismo tiempo todos los epítopos que
posee un antígeno, dando lugar a distintos anticuerpos para un mismo
antígeno.
Antígeno atacado por anticuerpos policlonales
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Fundamentos biológicos de inmunohistoquímica
El problema que se presenta con los Ac policlonales son los inconvenientes
que existen en su uso:
9
La falta de reproductibilidad de resultados, ya que la respuesta inmune
varía de unos individuos a otros dentro de una misma especie, e incluso en
un mismo individuo en función del momento en que se haga la extracción
del suero.
9Obtención de cantidades limitadas, que dependen de los lotes de
animales inmunizados.
9
3uri¿cación laboriosa, cuyo objetivo es eliminar los Ac que reaccionan
de forma cruzada no especí¿ca.
9Incapacidad para discriminar determinantes antigénicos diferentes
dentro de una misma molécula o célula, ya que no pueden diferenciar
entre Ag en la membrana de una misma célula.
Para la técnica de inmunohistoquímica, serán necesarios los anticuerpos
monoclonales (puros) que sólo podrán obtenerse a través de técnicas in vitro de
una célula híbrida llamada KibridoPa. El hibridoma es la fusión de linfocitos B
productores de anticuerpos y una línea celular de mieloma (células B cancerígenas)
que no producen inmunoglobulinas propias y tienen una expectativa de vida
in¿nita. La primera fase en la producción de anticuerpos monoclonales (o
mononucleados) consiste en la selección del antígeno (mediante fusión celular),
éstos son puri¿cados parcialmente, vgr por disgregación subcelular, lavado
con un disolvente apropiado (elución) de bandas proteínicas a partir de geles
de acrilamida o enriquecimiento cromotográ¿co. Posteriormente, se inyecta
al animal experimental con los antígenos seleccionados, esperando que cada
linfocito produzca un anticuerpo especí¿co. Los linfocitos se extraerán del bazo
o del torrente sanguíneo, y tendrán un carácter Portal que, al fusionarlo con un
mieloma asumen un carácter inPortal. La célula resultante con una nueva carga
genómica, guarda su especi¿cidad en la producción de anticuerpos homogéneos
(y únicos, de allí su denominación de anticuerpos monoclonales) al originar un
clon de nuevas células, con la rapidez del mieloma.
Los Ac monoclonales poseen las siguientes ventajas frente a los policlonales:
9
Homogeneidad en el proceso de obtención, consiguiéndose siempre Ac
idénticos.
9
No requiere usar Ag puri¿cados.
9
Los cultivos pueden proporcionar el Ac de forma ilimitada.
20
MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
21
UNIDAD FORMATIVA 2:
ASPECTOS TÉCNICOS DE LA
INMUNOHISTOQUÍMICA
2. 1. Marcaje inmunohistoquímico
2. 2. Procesamiento en inmunohistoquímica
2. 3. Aplicaciones de la histoquímica
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2. ASPECTOS TÉCNICOS
INMUNOHISTOQUÍMICA
DE
LA
La inmunohistoquímica permite el estudio de tejidos procedentes de biopsias,
autopsias y material citológico.
Existen diversos tipos de técnicas cuya indicación va a depender de:
ƒAnticuerpo a utilizar: Mono o policlonal.
ƒMaterial disponible: )resco, congelado o ¿jado en formalina.
ƒAntígenos a estudiar: De super¿cie o membrana citoplasmáticos o
nucleares.
La cuestión más importante va dirigida a la preservación del tejido y de los
antígenos.
En general, el proceso histológico siguiendo una serie de pautas para dicha
preservación: La ¿jación se suele hacer en formaldehído 4 tamponado a pH
.4 (no más de 244 horas) y la inclusión en para¿na (se recomiendan para¿nas
de bajo punto de fusión, ya que a altas temperaturas se pierde inmunoreacción).
La temperatura no debe superar la del ambiente y si se descalci¿ca la muestra se
realizará con ED7A.
Será conveniente aplicar alguna forma de ¿jación para proteger el tejido aún
cuando se manejen secciones en congelación.
Para ello se habrá de tener en cuenta que:
x Los ¿jadores que actúan por precipitación de proteínas dan mejores
resultados que los ¿jadores por reticulación o los que contienen oxidantes.
x 8n exceso de ¿jador reduce la inmunoreactividad del tejido.
25
Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
x El efecto de cada ¿jador sobre un antígeno puede ser diferente en función
de la localización histológica y anatómica de dicho antígeno.
x En muestras de gran volumen la ¿jación por inmersión no convence ya que
proporciona resultados variables en cuanto a positividad inmunohistoquímica
dándose una mayor tinción en las zonas mejor ¿jadas.
x Hay ciertos antígenos de super¿cie o receptores nucleares que no deben
¿jarse ya que puede alterar la muestra. Por ello se debe recurrir a la congelación
o ¿jación breve en acetona, cloroformo o una mezcla de ellos.
x La ¿jación debe ser rápida para evitar la autolisis, si esto no fuera posible
se puede frenarse el proceso a exponiendo el tejido temperaturas de 4 ºC o en
soluciones conservantes.
x Para acortar el tiempo de ¿jación puede utilizarse la ¿jación por microondas.
La capacidad inmunoreactiva se conserva bien tras la aplicación de algunos
procedimientos rutinarios de decalci¿cación (eliminación de las sales de calcio tras
la ¿jación).
Los criterios más importantes para la decalci¿caciyn son:
1) Eliminación completa de las sales de calcio.
2) Ausencia de defectos deletéreos de células, tejido conectivo y sustancia
fundamental.
3) 4ue no se inhiban procesos como los de ¿jación y tinción (Walington
1976).
Se suelen utilizar ácidos fuertes como el ácido nítrico pero aplicado a la
inmunohistoquímica, acabaría con la inmunoreacción en pocas horas. Por eso se
recomienda la utilización de ED7A a una concentración de ,5 M, ácido acético
acuoso a una concentración al 1 o ácido fórmico al 5.
Respecto al corte, si el procedimiento de inmunotinción se realiza sobre tejido
congelado se harán con el criostato (cortes de 4 - 6 micrómetros), que se secan al aire
a temperatura ambiente durante 2 horas.
A continuación se ¿jan en acetona absoluta a 4º C durante 5 minutos y se vuelven
a secar al aire durante 30 minutos.
Si la técnica se va a retrasar en el tiempo, hay que guardar las secciones envueltas
en papel de aluminio y con un desecante a ”20º C. Después se temperan las secciones
a temperatura ambiente sin desechar el envoltorio de papel de aluminio. Cuando esto
se consigue se vuelve a repetir el proceso durante aproximadamente 60 minutos
y a continuación se realiza una re¿nación con cloroformo durante 20-30 minutos
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
pasándolo por un baño de solución tamponada por último. Los cortes de para¿na
se obtienen de un grosor de 3 - 5 micrómetros y se dejan secar toda la noche en la
estufa a 37º C.
El siguiente paso es despara¿nar cuidadosamente en xileno, para llevar la muestra
hasta alcohol absoluto e hidratarla.
Debido a los numerosos lavados que es preciso efectuar, es frecuente que se
desprendan algunos cortes. Por ello se recomienda emplear un adhesivo que ¿je las
secciones al portaobjetos, con adhesivos como albúmina de huevo, gelatina o poli
L-lisina. La precaución con el adhesivo debe estar presente ya que un exceso de
adhesivo puede ser causa del aumento de tinción inespecí¿ca de fondo.
En la actualidad existen en el mercado portaobjetos que presentan una o varias
super¿cies ligeramente deprimidas donde pueden adherirse los tejidos para realizar
la incubación sin que ocurran fenómenos de difusión de los reactivos.
2.1 MARCAJE INMUNOHISTOQUÍMICO
Para visualizar el lugar donde se produce la unión antígeno-anticuerpo es necesario
emplear un trazador o marcador. El marcaje inmunohistoquímico se puede realizar
con Àuorocromos (técnicas de inmunoÀuorescencia), técnicas inmunoenzimáticas,
iones metálicos en forma coloidal (técnica de inmuno-oro) o isótopos radioactivos.
La Àuorescencia es una forma de luminiscencia entendiéndose ésta última como
la emisión de la luz que se produce a partir de una fuente de energía no térmica y bajo
el efecto de una excitación.
La Àuorescencia priParia o autoÀuorescencia es la propiedad que presentan
determinadas sustancias de forma espontánea sin necesidad de ser modi¿cadas
(la lámina elástica de las arterias muestra autoÀuorescencia en determinadas
condiciones).
En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir la Àuorescencia,
llamándola Àuorescencia secundaria, esto se puede hacer mediante tinción
histoquímica con sustancias Àuorescentes llamadas ÀuorocroPos o uniendo
Àuorocromos a antígenos dirigidos a anticuerpos tisulares.
Los Àuorocromos son moléculas químicas que absorben la luz a una determinada
longitud de onda emitiendo otra diferente. Se caracterizan por sus espectros de
excitación y emisión que varían según el tipo de Àuorocromo. Su capacidad de
absorber fotones de alta energía procedente de la radiación ultravioleta o del espectro
visible provoca una redistribución de los electrones de las moléculas Àuorescentes,
puesta de mani¿esto por la emisión de una radiación luminosa de longitud de onda
distinta aunque dentro del espectro visible.
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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
Si al iluminar una sustancia con luz visible ocurre un fenómeno similar al descrito
y la liberación de energía se produce de forma gradual, prolongándose la emisión de
luz después de cesar la iluminación del objeto, estaremos ante un fenómeno llamado
fosforescencia. Hay Àuorocromos que producen el llamado fenyPeno de 4uengcKin
(se produce por la colisión entre moléculas, ambas con capacidad de Àuorescencia,
disminuyéndose así la intensidad de la Àuorescencia emitida).
Los Àuorocromos más utilizados en las técnicas de inPunoÀuorescencia son:
x Fluoresceína: Absorbe luz azul y emite Àuorescencia verde manzana.
x 5odaPina: Absorbe luz verde y emite Àuorescencia roja anaranjada.
La nueva generación de Àuorocromos como el alexa Àúor o los dylight Àúor
son generalmente más fotoestables, brillantes y menos sensibles al pH que otros
de excitación y emisión comparable.
Estas sustancias pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar
la unión de éstos a sus correspondientes antígenos, por ello esta capacidad es
muy útil para visualizar los lugares donde reproduce la reacción Ag-Ac.
La técnica inPunoenziPática se describe como una técnica de inmunoensayo
en el que un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a
una enzima capaz de generar un producto detectable. 7ambién se le conoce como
técnica E/I6A.
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
El antígeno o anticuerpo estará marcado con una enzima e insolubilizado sobre
un soporte (inmunoabsorbente). Así la reacción Ag-Ac quedará inmovilizada
y más fácilmente detectada, añadiendo al ¿nal un sustrato más una sustancia
denominada cromógeno, de tal manera que el producto de la reacción actúa sobre
el cromógeno dando lugar a un precipitado insoluble, coloreado y cuanti¿cable
mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Dentro de estas técnicas diferenciamos varios reactivos participantes: Ac
primario, que es el que se une especí¿camente al Ag problema del tejido, y Ac
secundario o Ac puente, que es el que actúa uniendo el Ac primario con la enzima
que actuará como marcador. Estos Ac puente se unen a otros Ac debido a los
determinantes antigénicos que presenta actuando a modo de Ag frente a otros Ac,
pudiendo de este modo formarse cadenas casi ilimitadas de Ag y Ac.
Hay diferentes tipos de E/I6A:
‡ Anticuerpos Parcados:
E/I6A directo.
9
9
E/I6A indirecto: Es el más utilizado en la detección de anticuerpos. .
9
E/I6A sandZicK:
ƒ
Heterólogo (HADAS)
ƒ
Doble (DAS)
‡ Antígeno Parcado
9
E/I6A coPpetitivo: Se parte de un anticuerpo poli o monoclonal, frente
a un antígeno conocido, que previamente ha sido ¿jado en la placa. Se le
denomina de competición porque el suero problema es incubado previamente
con el antígeno, antes de incubarlo con el antisuero ¿jado en la placa, y por
tanto compite con él. Los pasos siguientes serán los de adición e incubación
del conjugado, lavado y ¿nalización con el sustrato y lectura.
7odos los tipos de ELISAs citados se pueden resumir en dos grandes grupos:
9 E/I6As para detectar antígenos: E/I6As sándZicK.
Las fases se describen en este orden: un anticuerpo poli o monoclonal
antiantígeno suele estar ya ¿jado a la placa. A continuación se incuba con
la muestra problema, se añade el conjugado y por último el sustrato. 7odos
los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.
E/I6As para detectar anticuerpos: E/I6As indirectos. Las fases se
9
describen en este orden: El antígeno se pega a la placa (inmovilización del
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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
antígeno) y se procede a la adición del suero problema, incubación y lavado,
adición del conjugado, incubación y lavado, ¿nalizando con la adición del
sustrato, el frenado de la reacción y la lectura.
3asos generales de un E/I6A
1. 7apizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. 8nión del antígeno o anticuerpo especí¿co al anticuerpo o antígeno
tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no
unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color
Encontramos diferencias entre ambas técnicas ELISAs directas e indirecta
estimables de mención, en cuanto a:
ƒFacilidad de realizaciyn de la técnica: La indirecta es más fácil ya que
en la técnica directa es necesario el uso de un Ac primario especí¿co para
reaccionar con el Ag especí¿co.
ƒRapidez: La directa es más rápida porque se utiliza sólo un Ac primario;
en la indirecta al entrar en juego el Ac secundario con una etapa adicional de
incubación, se alarga el procedimiento de ensayo.
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
ƒ6ensibilidad: La directa es menos sensible porque el Ac primario se
etiqueta y esta intervención reduce la inmunoreactividad, algo que no ocurre
en la indirecta.
7ambién en el método indirecto al utilizar Ac secundarios, el número de
epítopos para unirse el Ag es mayor y así se ampli¿ca la señal y se mejora la
sensibilidad.
Esto último puede ser una desventaja en los casos en los que se produce
una reacción cruzada del antígeno y el anticuerpo, llevando a error a los
resultados. En el método directo este fenómeno no tiene lugar de producirse
ya que el uso de un solo Ac no da la opción de reacción cruzada.
La enzima más utilizada es la peroxidasa (se obtiene del rábano), así como la
segunda más frecuente es la fosfatasa alcalina.
La perioxidasa se puede emplear tanto unida al Ac primario, lo que sería la
técnica directa, como en unos inmunocomplejos llamados PAP (peridoxidasa
+ Ac anti-peroxidasa) que se unirán a un Ac puente (secundario), en técnica
indirecta.
Amiloide del tipo AA marcado con anticuerpo monoclonal anti-AA. Se trata de una reacción
positiva de la peroxidasa (colorante unido al anticuerpo anti-AA).
Estos complejos PAP van a actuar como trazadores de la reacción Ag-Ac. Para
obtener los Ac especí¿cos frente a la peridoxidasa, se le inocula previamente
al animal, y luego se extraen del suero para someterlos a técnicas in vitro con
la peroxidasa. Así se formarán, a través de una reacción de precipitación, los
complejos Ac-Ag peroxidasa-antiperoxidasa o complejos PAP.
A continuación se procede al revelado del marcador añadiendo el agua
oxigenada (peróxido de hidrógeno), siendo en este caso el sustrato, junto al
cromógeno adecuado para esta enzima. La reacción que tiene lugar es al unirse la
31
Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
enzima al sustrato, este libera oxígeno provocando la oxidación del cromógeno y
originando un producto insoluble y de color pardo.
En caso de que los tejidos sean muy ricos en peroxidasa endógena se utiliza
como trazador la fosfatasa alcalina, para cuyo revelado se utilizan otras sustancias.
Recientemente se han introducido otros métodos de mayor sensibilidad basados
en la a¿nidad que tienen la biotina y la actina, capaces de generar un enlace no
inmune, y que se practican sobre tejidos previamente incluidos en para¿na. En
estos métodos los Ag a demostrar tienen que haber sido desnaturalizados en gran
medida durante el procesamiento histológico.
La avidina es una glicoproteína de alto peso molecular contenida en la clara
del huevo y en la bacteria Streptomyces Avidinii. La molécula posee cuatro
regiones hidrofóbicas de unión con la biotina.
Por otro lado la biotina, es una vitamina de bajo peso molecular que se encuentra
en la yema del huevo y se conjuga fácilmente con Ac y enzimas marcadoras por
ligarse de forma covalente a cadenas laterales amino o carbonilo. Pueden unirse
hasta 150 moléculas de biotina por una sola molécula de Ac.
Aunque ambas moléculas pueden unirse fácilmente a Ac y enzimas, la biotina
es la que se conjuga antes debido a su pequeño tamaño. Con biotina se puede
realizar el marcaje del Ac primario (técnica directa) o del Ac secundario (técnica
indirecta).
Bazo. Representa una inmunorreacción para vPRRS (virus del síndrome respiratorio y
reproductivo en cerdos) en los macrófagos de la pulpa esplénica. Complejo ABC, contrateñido
con hematoxilina. 200X.
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
La fase no inmunológica implica aplicar un complejo de avidina formado por
la avidina y un trazador enzimático con lugares de unión a ella. De este modo se
puede producir la ¿jación sobre el Ac secundario biotinilado. 7odo este conjunto
de sustancias se conoce como Pétodo del coPplejo avidinabiotinaA%&. En
resumen, podemos a¿rmar que un gran número de moléculas de biotina pueden
unirse a un Ac dando lugar a una relación trazadorAc muy alta, lo que hace que
la sensibilidad de este método sea muy elevada.
Puesto que el producto de la inmunotinción con el ABC y PAP es similar y de
similar sensibilidad, algunos autores recomiendan en procedimientos con dobles
tinciones o intensi¿caciones utilizar el PAP y el ABC de elección.
En relación a la técnica inPunooro (ión metálico en forma coloidal), podemos
decir como técnica de marcaje, que hace esta función gracias a la propiedad de
las partículas de oro para formar, en soluciones salinas, complejos estables con
moléculas proteicas. Para conseguir partículas de oro de diferentes tamaños (5
a 20 nm), se manipula el pH de la solución que lo contiene, aunque ya en el
mercado existen tamaños predeterminados de partículas de oro coloidal si se
mantiene a una temperatura de 4ºC.
En cuanto a la metodología del oro coloidal, hay que tener en cuenta su baja
capacidad de penetración en los tejidos y por tanto pueden enmascarar anticuerpos
al unirse a ¿jadores como glutaraldehído o tetróxido de osmio. Su aplicación
ideal es en tejidos poco ¿jados y cortados con crioultramicrotomos. 7ambién da
buen resultado en tejidos frescos o ¿jados y cortados con vibratomo empleando
7ritón x-100 o 7Zin 20 en las soluciones de lavado. Actualmente los problemas
que sufre la muestra por ¿jadores, detergentes y sometimiento a temperaturas
más altas, se están disminuyendo con el uso de resinas sintéticas hidrofílicas que
además de polimerizar a bajas temperaturas, no requieren oxidantes ni uso de
osmio (provocando menor pérdida de antígenos).
En el caso de bajas concentraciones de antígenos, se puede utilizar la plata
que, mediante técnicas de precipitación permiten visualizar las partículas de oro.
7ambién otra técnica ampliamente utilizada, es la asociación de proteínas a las
partículas de oro coloidal. Algunas de estas proteínas son: proteína A, proteína
G, IgG o streptavidinaavidina.
El Parcaje con isytopos radiactivos RIA está basado en una competencia
establecida entre la sustancia a cuanti¿car y las cantidades conocidas de la misma
sustancia marcada con un isótopo, para unirse a anticuerpos especí¿cos. Al
establecerse esta pugna resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuanti¿car,
menor será la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa.
33
Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada
que va unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre. Esto se hace mediante
un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solución y la
hormona unida al anticuerpo forma agregados que precipitan fácilmente. Una vez
medida la radiactividad se representa una curva con las cantidades de hormona
sin marcar y marcada.
En el RIA directo, a la fase sólida se añade una cantidad conocida de
anticuerpo. Diferentes concentraciones conocidas de Ag marcado se incuban
con una concentración constante de la muestra de la que se desea conocer la
concentración del antígeno en cuestión. El RIA de inhibición también sería una
técnica competitiva de análisis, pero se diferencia en que lo que se une a la fase
sólida es una cantidad ¿ja de antígeno (no de anticuerpo). Para este proceso
(inhibición), se incuba una concentración ¿ja de anticuerpo marcado frente a una
serie de diluciones de la muestra que contiene el antígeno.
Existe una técnica no competitiva denominada sandZicK, en la cual se une un
Ac en cantidades constantes a la fase sólida. 7ras realizar el bloqueo, se añade el
antígeno en concentraciones variables. Después se añadirá un segundo anticuerpo
contra el antígeno, pero esta vez marcado.
En la actualidad, cada vez es más frecuente el empleo de inmunoglobulinas
marcadas con isótopos radiactivos con la ¿nalidad de aplicarlo en campos
como trazador en determinaciones in vitro de antígenos especí¿cos, técnicas
inmunoradiohistológicas y técnicas de análisis no competitivo. Estas se tomarán
como alternativa al RIA en aquellos casos en los que algunas moléculas no pueden
ser marcadas directamente con radioyodo, en la detección de tumores primarios
o metastásicos (inPunoescintografía) e incluso la posibilidad de irradiación local
de células neoplásicas (inPunorradioterapia).
En estos casos citados, se entiende que el anticuerpo podrá ser marcado sin
que merme su capacidad inmunoreactiva. El marcaje de proteínas o péptidos con
yodo radiactivo (I125 ó I132) puede realizarse por diferentes métodos.
2.2 PROCESAMIENTO EN INMUNOHISTOQUÍMICA
En el siguiente esquema se puede ver un resumen de todo el proceso, que a
continuación se desarrollará:
7odas las muestras vendrán acompañadas de una hoja identi¿cativa
y explicatoria del contenido de partida, historia y necesidades así como
observaciones si las hubiera. 7ambién deberán incluirse controles positivos para
el anticuerpo solicitado.
34
MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
*ri¿ca resumen de la técnica
ƒ3reparaciyn de la Puestra: En apartados anteriores está tratado este
punto ya que se habló de cómo preparar la muestra para alterar lo menos
posible la inmunoreactividad. Es por ello que se citarán los pasos dentro
del proceso sin mucho detalle:
ƒFijaciyn: Cada antígeno, dependiendo de su localización histológica y
anatómica, podrá ¿jar un producto de forma distinta.
ƒDescalci¿caciyn: Se decía que, habitualmente se utilizaban productos
fuertes con ácido nítrico, que hacen poco resistentes a los antígenos.
Por tanto, un procedimiento de elección para conservar mejor la
35
Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
inmunorreactividad tisular es la utilización de ED7A. El ED7A, también
llamado ácido etilendiaminotetraacético, es una sustancia utilizada como
agente quelante o antagonista de metales pesados, que signi¿ca que puede
crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación
octaédrica. Coordina metales pesados de forma reversible por cuatro
posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando
hexadentado, y en el más importante de los ligandos quelatos pues cuanto
más ligandos posea, más estable es.
ƒInclusiyn: El cambio del etanol por acetona y del tolueno o del xileno por
cloroformo o benzoato de metilo mejora notablemente la inmunotinción,
ya que aumenta la tinción especí¿ca y disminuye la de fondo.
ƒCortes y adhesivos: Sobre tejido congelado se obtendrán cortes de 4 a 6
micras que se secan al aire a temperatura ambiente durante 2 horas, se ¿jan
en acetona absoluta a 4ºC durante 5 minutos, y se vuelven a secar al aire
otros 30 minutos; mientras que para cortes en para¿na las secciones serán
menos gruesas, entre 2 y 4 micras, y se introducirán en una estufa durante
un mínimo de 20 minutos para que el corte de adhiera al portaobjetos.
Se hablaba de la facilidad de algunos tejidos que se desprenden por los
múltiples lavados que hay que hacer. Cuando se ha realizado digestión
con proteasas o mediante calor aún esto se acentúa más, por lo que es
aconsejable utilizar adhesivos que ¿jen las láminas seccionadas (ya
existen portaobjetos especiales que incluyen la película de adhesivo). Con
el ¿n de evitar la difusión de los anticuerpos, se puede utilizar un lápiz con
diamante o rotulador especial para cercar la sección de tejido.
ƒ3revio a la inPunotinciyn.
ƒInPunotexidores autoPáticos: Gracias a las nuevas tecnologías, se
dispone de máquinas que llevan a cabo la inmunotinción de manera
automática. Esta modalidad, permite introducir los portaobjetos con las
secciones de tejido, previamente etiquetados y con códigos de barras para
su identi¿cación a través de un lector, que permitirá aplicar sobre cada
muestra el reactivo correcto. El proceso de la tinción automática es muy
laboriosa por la exactitud del trabajo sobre cada una de las muestras y el
complejo mecanismo electrónico controlado por ordenador que incluye
una fuente térmica propia para el desenmascaramiento antigénico y que
supone un gran avance por la reducción de errores durante la realización de
la técnica (no se acortan ni se exceden tiempos, temperaturas, cantidades
de reactivos, etc.). El siguiente paso tras la ¿nalización de la tinción
automática es la deshidratación de las muestras y proceder al montaje de
los portaobjetos.
ƒ.its universales de inPunohistoTuíPica: Se denomina al conjunto de
reactivos utilizados en el proceso de inmunotinción. Hay kits para revelar
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Ac mono o policlonales y se utilizan de forma distinta en función al
procedimiento que vaya a utilizarse. Hay muchos laboratorios que están
utilizando el multilink (kit universal) cuya aplicación es indistinta a los Ac
empleados.
El 5 de los kits empleados son los de estreptavidina-biotina-peroxidasa
o fosfatasa alcalina. Los kits PAP se están usando menos por la baja
intensidad de la tinción y se están sustituyendo por los FAAFA (fosfatasaantifosfatasa-alcalina) que no cuenta con este hándicap, siendo además
muy útil para la tinción de Ag de lábil expresión.
La gama de cromógenos para el revelado en inmunotinción es muy amplia.
ƒ3enetraciyn de los reactivos. Detergentes: Los detergentes se utilizan
para aumentar la permeabilidad de las membranas y que así los Ac
puedan penetrar y así alcancen a los Ag a detectar. Estas sustancias son
particularmente rentables cuando se trabaja con células intactas de frotis,
improntas y monocapas de cultivos celulares o con cortes gruesos en
congelación o incluidos en para¿na. Se habrá de tener muy en cuenta de qué
forma pueden incidir estos productos en el tejido a nivel inmunoreactivo.
ƒ%loTueo de la tinciyn de fondo: La tinción de fondo se trata de uno
de los principales problemas de la técnica inmunohistoquímica. Se de¿ne
como toda tinción que aparece allí donde no debería haberla. Existen dos
tipos de tinción de fondo:
Especí¿cas: Se pueden deber: 1) A la presencia del Ag bajo estudio,
en lugares distintos a donde se quiere detectar; 2) por la existencia
en el antisuero primario de Ac frente a Ag distintos al que se quiere
determinar (problema prácticamente inexistente cuando se utilizan Ac
policlonales de buena calidad o Ac monoclonales). 3) 7ambién por
atrapamiento pasivo del Ag o difusión del mismo hacia lugares donde
habitualmente no se encuentra. Estos errores ocurren normalmente
por problemas con la ¿jación (se retrasa o es inadecuada), o cuando
existen áreas extensas de necrosis e in¿ltrado inÀamatorio.
Inespecí¿cas: La forma de tinción de fondo inespecí¿ca más común
es la uniyn no inPunolygica del Ac con ciertos componentes de los
tejidos debido a fuerzas hidrofóbicas y electroestáticas. Habitualmente
es el Ac primario el que proporciona los niveles más altos de tinción
de fondo inespecí¿ca.
El bloqueo de tinción de fondo se realiza incubando los cortes con un
anticuerpo que no inter¿era con el Ac primario o usando el Ac primario a
altas diluciones lo más altas posibles y añadiendo bloqueantes proteicos
de la tinción a utilizar. 7odo ello con el objetivo de inhibir la unión no
inmune a moléculas que poseen los Ac.
37
Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
ƒ%loTueo de la actividad enziPática endygena: Se trata de un método por
el que se consigue inhibir la actividad enzimática de la enzima que se va a
utilizar como marcador con el ¿n de que no reaccione con el sustrato por
a¿nidad (muchas de ellas se encuentran de forma endógena en los tejidos).
Si no se bloquea esta actividad, se induciría a error por la obtención de
falsos positivos.
El método más usado para este bloqueo es la incubación de las secciones
antes del proceso inmunológico, aplicando algún agente bloqueante
especí¿co en cada caso.
ƒDesenPascaraPiento antigénico o recuperaciyn antigénica: Los
tejidos llegan casi todos al laboratorio ¿jados en formalina e incluidos
en para¿na. Las estructuras tridimensionales de las proteínas tisulares
se alteran en grado variable durante este proceso. Algunos antígenos
tisulares (epítopes) son resistentes a la ¿jación con formol e inclusión en
para¿na y son reconocidos por anticuerpos especí¿cos. Otros epítopes
pierden su reactividad antigénica después de estos procesos de rutina.
La continua práctica con anticuerpos nuevos ha mejorado el proceso
inmunohistoquímico y el uso de pretratamientos proteolíticos (que suelen
dejar un fondo de tinción mayor y favorecen el desprendimiento del tejido)
consiguiendo una mejor conservación de la capacidad inmunoreactiva.
Aún así, el éxito mayor de resultados se ha obtenido con métodos de
pretratamiento con calentamiento de los cortes histológicos (incubación
en torno a los 100ºC) que desenmascaran los epítopes, mejorando
ostensiblemente los resultados del proceso. Como se ha mencionado,
la ¿jación en soluciones que contengan formaldehído pueden causar
reacciones cruzadas en las proteínas y la inclusión en para¿na alterar
la forma de las proteínas. Es por ello que en el proceso de recuperación
antigénica se revierten algunos de estos problemas, rompiendo las uniones
cruzadas, restaurando la conformación de epítopeantígeno y removiendo
los iones clásicos con citrato.
Los buffer (o tampones) para la recuperación antigénica, por su composición
y pH son utilizados en los métodos de recuperación antigénica junto con
métodos de calor siendo cruciales para obtener buenos resultados (buffer
citrato 0.01 molL con pH 6.0 y buffer trisED7A, pH 9.0).
A continuación se describirán los Pétodos de recuperaciyn antigénica:
- Digestiyn enziPática: El pretratamiento de los cortes histológicos
¿jados en formalina e incluidos en para¿na con distintas enzimas
proteolíticas refuerza o mejora la reactividad inmunohistoquímica de
ciertos antígenos. Los procesos varían de acuerdo a los laboratorios, la
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
¿jación de los tejidos, el tipo de anticuerpo y los antígenos estudiados.
Algunos de los pretratamientos enzimáticos más utilizados son el
de tripsina, pronasa, y pepsina. En estos procedimientos las láminas
tendrán que estar pretratadas con adhesivos y los cortes despara¿nados y
rehidratados.
Método de pretratamiento con tripsina
‡ Cubrir los cortes con solución de trabajo de tripsina.
‡ Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados
C por 20-40 minutos. La incubación óptima depende del tiempo de la
¿jación en formol y el antígeno en estudio. Recomendamos tripsina al
0.1 durante 30-40 minutos a temperatura ambiente.
‡ Detener la reacción lavando con agua destilada.
‡ Bloquear peroxidasa endógena y colocar los cortes en agua destilada
‡ Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.
Método de pretratamiento con pronasa
‡ Cubrir los cortes con solución de trabajo de pronasa.
‡ Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados
C por 5-10 minutos. La incubación óptima depende del tiempo de la
¿jación en formol y el antígeno en estudio.
‡ Recomendamos pronasa, 0.01 durante 5-10 minutos a temperatura
ambiente.
‡ Detener la reacción lavando con agua destilada.
‡ Bloquear peroxidasa endógena y colocar los cortes en agua destilada
‡ Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.
- +orno de Picroondas: Se utiliza un horno de microondas doméstico de
750-00 Zatios con plato giratorio. Hay que utilizar coplins o gradillas
de cristal o plástico para microondas así como láminas pre-tratadas con
adhesivo. Antes de comenzar hay que despara¿nar y rehidratar los cortes.
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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
Método de pretratamiento con pepsina
‡ Cubrir los cortes con solución de trabajo de pepsina precalentada
a 37ºC
‡ Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados
C por 10-30 minutos. La incubación óptima depende del tiempo de la
¿jación en formol y el antígeno en estudio.
‡ Detener la reacción lavando con agua destilada.
‡ Bloquear peroxidasa endógena y colocar los cortes en agua destilada
‡ Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.
Método de horno de microondas
‡ Coloque las láminas en la gradilla y rellene los espacios vacíos con
láminas en blanco.
‡ Llene el recipiente contenedor con 200 mL de buffer de recuperación
antigénica e introduzca la gradilla con las láminas. Cubra el contenedor
para minimizar la evaporación.
‡ Coloque el contenedor en el centro del horno. Caliente los cortes
a 2x7 minutos. Rellene el contenedor con 50 mL de agua destilada
entre los dos tratamientos. Los cortes no se pueden secar durante el
proceder.
‡ Después del segundo tratamiento retire el contenedor del horno y
mantenga los cortes en el buffer a temperatura ambiente durante 1520 minutos para su enfriamiento.
‡ Lavar en agua destilada.
‡ Bloquee la peroxidasa endógena y coloque las láminas en agua
destilada.
‡ Enjuagar en 7BS o PBS.
‡ Continúe con la técnica de inmunohistoquímica.
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Método de calentamiento con vapor
‡ Llene el depósito de la base con agua destilada a temperatura
ambiente.
‡ Coloque la rejilla de la base
‡ Coloque la cámara vaporizadora sobre la rejilla
‡ Llene el contenedor de incubación con 200 mL del buffer de
recuperación antigénica
‡ Coloque la tapa de la cámara de vaporizar.
‡ Ponga el timer por 75 minutos. El equilibrio entre el baño y la
cámara de incubación a 95ºC toma unos 45 minutos
‡ Remueva la tapa de la cámara y coloque las láminas en el buffer ya
precalentado. Vuelva a cubrir la cámara
‡ Incube durante 20-40 minutos
‡ Retire de la cámara vaporizadora el contenedor del buffer y las
laminas
‡ Enfriar las laminas por 20 minutos a temperatura ambiente
‡ Enjuague en agua destilada
‡ Bloquear peroxidasa endógena y colocar las laminas en agua
destilada
‡ Enjuagar en 7BS o PBS
‡ Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.
- 2lla a presiyn: Se requiere un vaporizador (steamer) doméstico y las
láminas han de estar pre-tratadas con silano u otro adhesivo.
ƒ/a inPunotinciyn propiaPente dicha
ƒDiluciones de los anticuerpos lavados e incubaciones: Cuando se
diluye por primera vez un Ac o, aunque sea conocido, si se usa por primera
vez sobre un tejido problema, hay que hacer pruebas de ensayo para evitar
errores posteriores como falsos negativos o tinción de fondo.
Por eso hay que elegir la dilución correcta a ¿n de obtener una tinción
óptima. El objetivo irá encaminado a evitar que el diluyente no se evapore
durante el proceso de incubación y que el anticuerpo no unido al antígeno
se elimine por completo antes de la incubación siguiente. Respecto a la
41
Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
evaporación de diluyente, se evita incubando el tejido en un ambiente
húmedo (cámaras de incubación). La aplicación de calor también va
a inÀuir en la unión Ac-Ag, así que si la incubación es corta se hace a
temperatura ambiente y si es larga se hace a temperaturas constantes de
unos 4ºC.
Para eliminar el antisuero no unido, se utilizan soluciones tamponadas
(usualmente el 7BS). Primero se lavan las secciones de tejido para extraer
el exceso de antisuero y después se cubre con el tampón elegido para
enjuagarlas.
ƒColoraciones de contraste: A ¿n de reconocer mejor los tejidos se
emplean coloraciones (cromógenos) para diferir las áreas tisulares
inmunoteñidas de las que no lo han sido. En el apartado de tinciones
generales están descritas.
ƒControles: Los controles se realizan para asegurarse que no hayan
falsos negativos o positivos.
Una tinción inmunohistoquímica especí¿ca se de¿ne con los siguientes
paráPetros:
1. No hay tinción si se excluye el Ac primario.
2. Se inhibe la tinción si se absorbe el anticuerpo primario con el
antígeno frente al cual se ha obtenido, pero no con otros.
Es por todo esto que para la obtención de un buen desarrollo de la técnica hay
que realizar controles distintos que se explican a continuación:
- Los negativos incluyen una omisión del Ac primario o la sustitución
del mismo por suero no inmune o solución isotípica. Estas sustancias
alternativas (no inmunes) no van a reconocer al Ag a estudiar, pero sí
serán reconocidas por el Ac secundario o puente. Se utiliza el mismo
tejido que para el control positivo y si el resultado es positivo será debido
a una ¿jación inespecí¿ca.
- Los controles positivos, se llevan a cabo utilizando una sección de tejido
que incluya el Ag a demostrar de forma que si el resultado es negativo la
causa es un defecto de ¿jación o un error en el procedimiento. Es el de uso
más extendido y se utiliza en todas las preparaciones.
- El control de absorciyn consiste en demostrar que desaparece la
inmunorreactividad una vez el Ac primario con el Ag se hallan unido. Se
utiliza para valorar nuevos Ac. No es una técnica de control que se haga
muy rutinariamente.
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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Por último la técnica de bloTueo consiste en inhibir la unión de los distintos
elementos utilizados según si la técnica es directa (Ac primario con Ac conjugado)
o indirecta (Ac puente con el complejo PAP por ejemplo). El bloqueo se consigue
realizando una incubación extra con Ac del mismo tipo de los marcados.
Volviendo al objetivo principal de los controles para detectar falsos negativos
o positivos, las causas de los falsos negativos pueden ser:
- Enmascaramiento de los antígenos.
- Desnaturalización de los antígenos por el calor, haciendo que sean
irreconocibles por los Ac.
- Errores en el procedimiento técnico.
Y las de los de falsos positivos:
- Presencia de peroxidasa endógena, por una mala inhibición de la misma
(incorrecto desbloqueo enzimático).
- Reacciones cruzadas inespecí¿cas entre Ag y Ac, de forma que algunos
Ac pueden reaccionar con Ag parecidos a los que se estudian y, sobre
todo, la posibilidad de una ¿jación química no inmune entre los Ac y la
colágena del tejido conectivo.
2.3 APLICACIONES DE LA HISTOQUÍMICA
No cabe duda que la posibilidad que ofrece esta técnica de localizar componentes
tisulares in situ, contribuye a un importante avance en el conocimiento
¿siopatológico siendo especialmente útil en el campo de la oncología (para la
clasi¿cación de algunas neoplasias con alto grado de anaplasia o de metástasis
de origen incierto). 7ambién se utiliza para el estudio del rechazo de trasplantes
de órganos, enfermedades autoinmunes y alérgicas.
El espectro de anticuerpos utilizados hoy día (comercializados), van en
crecimiento. Aquí podemos ver algunos:
Anticuerpo
CD1a
CD4
CD8
CD30
CD45
Ejemplos de marcadoresinm nohistoquímicos
Células/antígenos detectados
Célula de Langerhans
Linfocito 7 de auxilio
Linfocito 7 citotóxico
Célula de Reed-Sternberg
Leucocitos
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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica
CD68
S100
HMB-45
AE1
AE3
DESMINA
GFAP
CEA
AFP
REN
VIM
44
Macrófagos
Células de SchZann
Melanocitos
Citoqueratinas de bajo peso molecular
Citoqueratinas de alto peso molecular
Células musculares
Glía
Antígeno carcino-embrionario
Alfa-fetoproteína
Receptores nucleares de estrógenos
Sarcomas