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INMUNOCITOQUIMICA
Ultraestructural
Técnicas basadas en la reacción
Antígeno- anticuerpo
Fundamento:
Se basa en la alta afinidad y especificidad de la unión
antígeno-anticuerpo, y aprovecha que muchas moléculas
pueden actuar como antígeno.
Molécula
Humana
(antígeno)
POLICLONAL
Anticuerpo
MONOCLONAL
Esquema de la reacción indirecta
ORO COLOIDAL
2- anticuerpo secundario de
cabra
anti -Fc de Ig G de conejo
1- anticuerpo primario
obtenido en conejo contra el ag.
▲
Antígeno en sección de tejido
Ventajas del ORO COLOIDAL

Alta electrodensidad que facilita su perfecta visualización.

Se une al anticuerpo por interacciones de carga.

Se lo obtiene con diferentes tamaños para doble localización

Se puede cuantificar.

Se lo puede amplificar con intensificación con plata.

Se lo liga a distintas proteínas (proteína A, anticuerpos, porción
Fab, etc)
Preparación de Proteína A-Oro coloidal

Preparación del coloide a partir de tetracloroáurico
al 1% que se reduce con citrato de Sodio.

Se determina la menor cantidad de proteína A
(solución de 1mg/ml) necesario para estabilizar el
complejo de oro

Se adsorbe el oro mezclándolo con la concentración
determinada.

Ultracentrifugar a 75000 rpm y resuspender el
sedimento en PBS con polietilenglicol
Esquema general de la reacción
ORO COLOIDAL
3- incorporación
de una molécula
marcadora.
2- anticuerpo secundario de
cabra
anti -Fc de Ig G de conejo
1- anticuerpo primario
obtenido en conejo contra el ag.
▲
Antígeno en sección de tejido
Forma de exponer los antígenos
intracelulares

POSTEMBEDDING
. Se obtienen secciones finas del tejido en grillas de níquel
. Se va incubando las grillas en cada reactivo

PREEMBEDDING
¿Qué afecta la preservación de los
antígenos?
 El
alto grado de entrecruzamiento que hace el
glutaraldehído.
 La
oxidación del tetróxido del osmio.
 Las
 La
deshidrataciones extremas (Acetona 100º)
temperatura de polimerización (60º)
 Resinas
muy hidrofóbicas para interactuar con
soluciones acuosas
¿Qué afecta la preservación de los
antígenos?

Los entrecruzamientos que hace el glutaraldehído.
Reducir concentración de glutaraldehído

La oxidación del tetróxido del osmio.
Omitir esta postfijación

Las deshidrataciones extremas (Acetona 100º)

La temperatura de polimerización (60º)

Resinas muy hidrofóbicas para interactuar con soluciones acuosas
Usar resinas hidrofílicas
Resinas Hidrofílicas

LOWICRYL K4M
Resina acrílica hidrofílica.
polimeriza a -35ºC con UV ó químicamente a 60ºC.
Dificultades para cortar fino.
Produce dermatitis

LR- WHITE
Resina acrílica polar
Se polimeriza con calor
Las secciones son hidrofílicas
Da escaso fondo
Por su baja viscosidad es adecuada para incluir diente y
hueso
Resinas Hidrofílicas

UNICRYL
Excelente polimerización
Largely hydro-philic
Escaso o nulo background
Excelente preservación de los antígenos
Polimeriza con calor (50-60ºC) o con UV a-10 o -20ºC
Técnica de Postinclusión
Bloqueo aldehídos
Libres con glicina 0,05M
Ac Primario
de conejo
1h 37º C ó
la noche 4ºC
BSA 2% -SN Cabra 2%
Ac Secundario
cabra anti-conejo
unido a oro de 15 nm
30 min a 37ºC
Alta concentración de antígenos
Anti-Prolactina - HIPÓFISIS
CG
RER
Fijación: 3% formaldehído-3% glutaraldehído
Inclusión: Lowicryl
Antígenos citoplasmáticos
Anti-Galectina 1 – RETINA DE POLLO
MC
MC
Nu
Fijación: 2% glutaraldehído
Inclusión: LR-White
Antígenos virales
Anti-proteína de la envoltura del Virus del Tumor Mamario
Fijación: 2% glutaraldehído
Inclusión: LR-White
Osmicado vs Sin Osmicar
LR-White, sin osmio
Araldita-osmicado
Etching con H2O2
Localización de ANP
Anti-ANP - Atrio de rata
Fijación: 2% glutaraldehído + Osmio por 1h
Inclusión: LR-White
Etching: meta periodato de sodio
Localización de TLR4
RER en célula epitelial prostática
Doble inmunomarcación
HIPÓFISIS
Lado A
Solución de
Bloqueo
1º Incubación
Anti-prolactina
Oro de 6 nm
Lado B
Solución de
Bloqueo
2º Incubación
Anti-GH
Oro de 15 nm
Crioultramicrotomía

Porqué la Crioultramicrotomía es una mejora la
preservación de antígenos?
 Fijación


muy suave
No requiere deshidratación ni inclusión
Sólo requiere congelar el tejido con
crioprotección.
PROTOCOLO

Fijación aldehídica: formaldehído 2% y glutaraldehído
0,2% por dos horas

Crioprotección y congelamiento
2.3 M sucrose (Geuze and Slot 1980)
mezcla de 15% de polyvinylpyrrolidone (PVR mol.wt 10 000) y
sucrosa 1.7 M (Tokuyasu 1989).


Obtención de secciones en ultracriomicrótomo
Recolectar los cortes en grillas: con gotas de sucroca
2,3M y trasladadas a grillas cubiertas con formvar

Imunomarcación
Ultracriomicrótomo
Estudio de la función de proteínas SNARE de Golgi
vinculadas al transporte entre sus compartimientos.
Células que sobre expresan las
proteínas SNARE permiten ver
su localización en la zona de tran
Golgi
Aplicaciones del oro coloidal
a nivel óptico
Intensificación con plata
ó silver enhancement
Oro coloidal-IgG anti conejo
Oro-plata
Nivel óptico y electrónico
Anti CC16 en Célula bronquiolar de Clara
Aplicación del oro a nivel óptico
Anti-Prolactina - HIPÓFISIS
Oro-Plata
Fijación: 3% formaldehído-3%
glutaraldehído
Inclusión: LR-White
Aplicación del oro a nivel óptico
Anti- Galectina 1 en Célula de Müller en retina
Oro-Plata
Fijación: 2% glutaraldehído
Inclusión: LR-White
Soluciones de Bloqueo
- Suero normal de la especie del secundario (SN) (1-5%)
- Albúmina sérica bovina (BSA) (1-5%)
- Gelatina de pescado de agua fría al 0,1%
Todo en Buffer PBS, 15-30 minutos a TA.
- Lavar bien
Específico vs Inespecífico

Causas de marcas inespecífica
Background : causadas por unión no específica de
uno o dos componentes esenciales usados durante la
incubación.
 Crossreacciones: son debidas a interacciones
específicas que ocurren cuando el anticuerpo
reconoce áreas que se asemejan a los epitopes de las
moléculas contra las cuales está dirigido el
anticuerpo.

Específico vs Inespecífico

Cómo evidenciar si hubo inespecificidad?

Control de unión inespecífico del Ac primario
Reemplazando el anticuerpo primario por
suero
preinmune o suero normal de la misma especie.

Control de unión inespecífica del Ac secundario
Se elimina el anticuerpo primario; después de la Solución de
bloqueo se incuba con el secundario.

Control de reacciones por cross-reactividad
El anticuerpo primario se adsorbe con el antígeno
contra el que está dirigido
Post-inclusión
PROTOCOLO DE INCLUSIÓN

Fijación: 1,5% (v/v) de glutaraldehído y 4% de formaldehido
(v/v) en buffer fosfato o cacodilato a pH 7,4, 4 hs

Lavar bien el fijador y omitir fijación con osmio

Deshidratar con concentraciones crecientes de etanol ( 50%,
70% and 90%) por 15 minutos cada uno.

Comenzar a infiltrar la resina con una mezcla de etanol 90%
etanol y LR-White en partes iguales, por 2 h.

Remover y agregar LR-White puro y dejar toda la noche a 4ºC

Incluir en cápsulas de gelatina con LR-White nuevo. Tapar
bien y polimerizar a 50ºC por 24-48h.
INMUNOCITOQUIMICA
Ultraestructural
2º Bloque
Forma de exponer los antígenos
intracelulares

POSTEMBEDDING
. Se incluye en resinas hidrofílicas (LR-White, Lowycril,
Unicryl)
. Se obtienen secciones finas del tejido en grillas de níquel
. Se va incubando las grillas en cada reactivo

PREEMBEDDING:
. Se obtienen secciones de Vibrátomo
. Las secciones se van pasando por los reactivos
. Se incluye en Araldita en forma convencional
Preembeding: Vibrátomo
Preembedding
Fijación:
Formaldehído 4%
Glutaraldehído 0,05-0,1%
Bloqueo de Aldehídos con
0.1% sodium borohydride
Permeabilizar con Tritón X-100 0,05% 30 min
Solución de bloqueo
Suero primario
Cultivos celulares
Secciones de tejido
Suero secundario-oro coloidal
ultra-small
Fijación con glutaraldehído 1-2%
Intensificación con Plata
ANTÍGENOS
INTRACELULARES
Inclusión en Araldita
Preembedding
Sin Fijación:
Solución de bloqueo
Suero primario
Cultivos celulares
Suero secundario-oro coloidal 1/20-1/50
Fijar con glutaraldehído 1-2%
Scrapear las células
ANTÍGENOS DE
SUPERFICIE
Inclusión en Araldita
Preembedding en cultivos celulares
Antígenos de superficie
Receptor de estrógeno alfa
Antígenos de envoltura vir
Preembedding en
cultivos celulares
Antígenos intracelulares
SUPERFICIAL ANTIGENS
INTRACELLULAR ANTIGENS
Pre-embedding
Pre-embedding
CULTURED CELLS
CULTURED CELLS
No fixation is required
4% formaldehyde
0.05% glutaraldehyde
Post-embedding
TISSUES
4% formaldehyde
0.05-0.1% glutaraldehyde
CELL SUSPENSIONS
OR TISSUES
4% formaldehyde
1.5% glutaraldehyde
Inclusion in LR White acrylic
resin, and mounting of thin
sections on nickel grids
No required
Permeabilization is not
required
0,1% NaBH4 in PBS
for 10 min to inactivate
residual aldehyde
Permeabilization with 0.05%
Triton -X-100 in PBS for 30
min
0,1% NaBH4 in PBS
for 10 min to inactivate residual
aldehyde
Permeabilization of
vibratome slices with 0.05%
Triton -X-100 in PBS for 30
min
Blocking solution
Blocking solution
Blocking solution
Incubation with
primary antibody
Incubation with
primary antibody
Incubation with
primary antibody
Incubation with
gold complex of
5, 10 or 15 nm particles
Incubation with
Ultra small gold complex
Incubation with
Ultrasmall gold complex
Fixation with
1,5% glutaraldehyde in
cacodylate buffer
No required
Inclusion in epoxy resins.
Mounting of thin sections on
copper grids
Counterstaining with
alcoholic uranyl acetate and
lead citrate.
Fixation with
2% glutaraldehyde in
cacodylate buffer
Silver enhancement
Inclusion in epoxy resins.
Mounting of thin sections
on copper grids
Counterstaining with
alcoholic uranyl acetate and
lead citrate (optional)
Fixation with2%
glutaraldehyde in cacodylate
buffer
Silver enhancement
Inclusion in epoxy resins.
Mounting of thin sections
on coper grids
I
Counterstaining with a
lcoholic uranyl acetate and lead
citrate (optional)
Grid incubation with 0,05M
glycine in PBS buffer for 1020 min to inactivate residual
aldehyde
Permeabilization is not
required
Blocking solution
Incubation with
primary antibody
Gold complex of 16 nm
particles, or combination of 5
and 15 nm particles for double
labeling.
Fixation with
2% glutaraldehyde in
cacodylate buffer
Silver enhancement if
small or ultra small gold
particles were applied.
Counterstaining with aqueous
uranyl and lead citrate
(optional)
http://www.emsdiasum.com/
Electron Microscopy Science
http://www.tedpella.com/
Ted Pela