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 PALÍNDROMOS DE ADN Y ENZIMAS DE RESTRICCIÓN En el genoma existen secuencias especiales denominadas palindrómicas o simplemente palíndromos. Podrían considerarse como un tipo especial de secuencias “capicúas”. Para expresar correctamente lo que queremos decir, pongamos, como ejemplo de lo que sería un palíndromo, varias formas de construir esas especiales secuencias. Construcción de una secuencia palindrómica: 1.-­‐ FORMA A. 1.-­‐ Construir una tabla de 2 filas y un número par de columnas (6, 8, 10,..) 2.-­‐ Indicamos las direcciones”antiparalelas” de las dos cadenas de ADN. Denominamos la cadena inferior como principal y a la superior como cadena complementaria. 3’
5’
5’
3’
3.-­‐ Introducimos la secuencia de nucleótidos que queramos en la cadena principal uno por uno hasta llegar justo a la mitad. Simultáneamente hacemos lo mismo, con la misma secuencia introducida en la complementaria, y en la dirección correcta (5´-­‐3´), hasta la mitad de la secuencia .
3’
G
5’
5’
G
3’
3’
5’
3’
5’
G
G
5’
3’
C
G
5’
3’
C
A
G
C
C
A
1
4.-­‐ Rellenamos las posiciones de los nucleótidos complementarios de las dos cadenas y nos queda construída la secuencia palindrómica o palíndromo. 3’
5’
C
G
G
C
T
A
A
T
C
G
G
C
5’
3’
Lo propio y característico de un palindromo es que la secuencia es idéntica en una y otra cadena; ambas, al ser leídas en la misma dirección (de 5’ a 3’ o de 3´a 5´). Los palíndromos son lugares especiales del genoma ya que constituyen secuencias “diana” de determinados enzimas de restricción (endonucleasas) y señalan puntos de referencia en el genoma para otras funciones. Esta forma de construir secuencias palindrómicas, nos ayuda a calcular el número posible de secuencias palíndromo de un tamaño dado y, por tanto, la probabilidad de que una secuencia de ese tamaño, elegida al azar, sea o no una secuencia de ese tipo. En el ejemplo anterior: Una secuencia de 6 pb (palíndromo), la construimos con cualquier combinación de 3 (hasta la mitad = 43 posibilidades) siempre que, posteriormente, cumplamos con lo indicado anteriormente en el punto 4 (1 sola secuencia restante posible). Por tanto, en una de 6 habrá 43 x1 = 43 posibles secuencias que se pueden convertir en secuencias palíndromo. 43 palíndromos de 46 secuencias posibles. Si dividimos los casos posibles (43) entre totalidad de casos (46), tenemos la probabilidad de 4-­‐3. Por tanto la probabilidad de que una secuencia de 6 pb, al azar, sea un palíndromo es de 4-­‐3 = 1/43: 1 de cada 256. Generalizando para secuencias de “ n “ pb (siendo “ n “, un nº par), habrá 4n/2 secuencias que sean palíndromos. Dado que el ADN de un organismo vivo es larguíiiiisimo, estará, por simple probabilidad lleno de esas secuencias y cuanto más cortas sean, habrá más. 2.-­‐ FORMA B. Otra forma de construir un palíndromo es la siguiente: 1.-­‐ Construyamos una secuencia de ADN aleatoria con un número par de pares de bases 3’ ATGC 5’
5’ TACG 3’
2.-­‐ Hagamos de esta doble secuencia una sola secuencia, empezando por cualquiera de los extremos, y siempre en el mismo sentido de la 1ª anterior al pasar a la otra cadena. Por ejemplo: cojamos el 5´de la secuencia inferior, escribimos esa secuencia y continuamos por el 5´de la superior. 5’ TACG-CGTA 3’
2
3.-­‐ Construyamos la secuencia complementaria de ésta secuencia para completar una secuencia doble. 3’ ATGCGCAT 5’
5’ TACGCGTA 3’
Y al hacerlo, tenemos elaborada la secuencia palíndromo. Fíjate también que con esta forma de construir una secuencia palíndrómica, se pueden elaborar 4 diferentes: la segunda, además de la indicada, la haríamos empezando por el extremo 5´de la hebra superior, continuando por el 5´de la inferior. La tercera: empezando por el extremo 3´de la inferior, continuando por el 3´de la superior y la cuarta: empezando por el extremo 3´de la superior y continuando por el 3´de la inferior. Esta segunda forma de construcción de una secuencia palindrómica nos hace intuir una propiedad peculiar que tienen estas secuencias (quizás por ello hayan sido seleccionadas como dianas de los enzimas de restricción y de otras funciones en el ADN): Ej: …..AATGCATGCGCATAGCTA….
….TTACGTACGCGTATCGAT…
El palíndromo en color rojo
CG
GC
TA
…………AATGCATAGCTA……..
…………TTACGTATCGAT……...
AT
CG
GC
El palíndromo puede, por
hibridación entre sí mismo,
formar un doble bucle de
apareamiento.
PALINDROMOS DISCONTINUOS Hasta ahora sólo hemos hablado de palíndromos continuos, pero también existen otro tipo de secuencias palíndromo denominados discontinuos, porque el palíndromo queda interrumpido por una secuencia no palindrómica, quedando la secuencia que sí lo es dividida en dos y, en medio, la secuencia que no lo es. Por ejemplo: Ej: …..AATGCATGCAATGGCATAGCTA….
….TTACGTACG TTACCGTATCGAT…
La secuencia palíndromo
en color rojo
3
A T
A G
CG
GC
Puede también formar, por
TA
auto-hibridación, un doble
…………AATGCATAGCTA……..
bucle de apareamiento; pero, a
…………TTACGTATCGAT……...
diferencia de los palindromos
AT
continuos, queda en cada
CG
extremo de ambos bucles, una
GC
burbuja de nucleótidos sin
T C
aparear.
TA
Los palindromos también se dan en polinucleotidos de una sola cadena como en el ARN y, en estos casos, son de gran trascendencia para la estructura global de la molécula. Por ejemplo en los ARNt. Asímismo, los ARNm transcritos del ADN que contenga alguna de esas secuencias, podrán, asimismo autohibridarse formando bucles de apareamiento. Ese es el caso del ARNmic (micro ARN) transcrito que, una vez procesado en el citoplasma formará los ARNi. (Ver artículo: ADN basura (II)) Cuestiones: 1.-­‐ ¿Es posible la existencia de una secuencia palindrómica con un número impar de pares de nuceótidos? 2.-­‐ Busca en internet o en cualquier libro de texto de biología un dibujo que represente la estructura de los ARN de transferencia. Observa la cantidad de regiones palindrómicas interrumpidas que caracterizan su estructura. 3.-­‐ Los ARNi (ARN de interferencia). Elementos reguladores de la expresión de los genes también tienen que ver con ese tipo de secuencias. Infórmate y resume su origen y mecanismo de acción. 4
LOS PALINDROMOS Y LOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Las bacterias poseen un arma defensiva frente al ataque de los virus bacteriófagos que frecuentemente las invaden. Elaboran unos enzimas capaces de reconocer secuencias cortas y concretas, generalmente palindrómicas, del genoma del organismo invasor y cortárselo. De este modo inactivan su ataque. Previamente protegen sus propias secuencias palindrómicas que también podrían ser diana de sus propios enzimas. Lo hacen normalmente por metilación de bases en sus propias secuencias. Organismo del que se obtiene Ejemplos de Enzimas de Secuencia en que corta y (Bacterias) restricción punto de corte (Tijeras) (= Endonucleasas) G /AATTC
Escherichia coli Eco R1 / CCTGG
Escherichia coli Eco R2 GG/CC
Haemophilus aegyptius Hae III A/AGCTT
Haemophilus influenzae Hind II GTT/AAC
Haenophilus parainfluenzae Hpa I C/CGG
Haemophilus parainfluenzae Hpa II La mayoría de esas secuencias que reconocen y cortan son palíndromos. Cada bacteria posee un arsenal de ellas. Poco a poco se van descubriendo cada vez más en cada especie de bacteria. Se denominan Eco R1, Eco R2, Eco R3 ( procede de Escherichia coli; 1ª, 2ª, 3ª descubierta) Hind I (Haemophilus influenzae..), etc. Cada enzima de restricción reconoce una secuencia concreta y corta esa secuencia también de una forma específica. De tal modo que es posible que 2 enzimas de restricción distintos reconozcan la misma secuencia pero que la corten de modos diferentes. -­‐En algunos casos la cortan exactamente por la mitad de tal modo que dejan “romos” los extremos por donde se cortó. Por ejemplo: 3’… CGTACG… 5’
5’… GCATGC… 3’
Resultando: 3’… CGT 5’
5’… GCA 3’
3’ACG… 5’
5’TGC… 3’
5
-­‐En otros casos (en una de las posibilidades) 3’… CGTACG… 5’
5’… GCATGC… 3’
Resultando: 3’… CG 5’
5’… GCAT 3’
3’ TAGC… 5’
5’
CG… 3’
Esta segunda forma de cortar deja salientes simétricos en cada trozo y, además, complementarios por lo que podrían acoplarse de nuevo los tramos separados, por lo que se denominan extremos cohesivos o “pegajosos” a las puntas resultantes del corte. Este tipo de “tijeras”, permite corte y empalme: 2 fragmentos de ADN distintos cortados con la misma tijera luego podrían acoplarse intercambiados. Este es el mecanismo básico de la tecnología del ADN recombinante que permite la transgénesis y la obtención de un tipo de de organismos modificados genéticamente (OMGs), los organismos transgénicos. En los genomas de todos los seres vivos están presentes estas secuencias palindrómicas en mayor o menor número a lo largo de su genoma. Los enzima de restricción se han extraído inicialmente de las bacterias (cada vez son más numerosos) y, en la actualidad constituyen un instrumento básico en biotecnología genómica. Cuestiones: 1.-­‐ Si una secuencia palindrómica continua tuviera 10 pb. ¿Cuántas secuencias diferentes podrían ser objeto de corte por parte de esas “tijeras”? ¿Cuántos enzimas de restricción posibles y diferentes en teoría podrían existir para cortar esa secuencia? Yo he calculado, a bote pronto, 1024 secuencias diferentes y 6.144 enzimas de restricción distintos. ¿Estás de acuerdo? 2.-­‐ La facilidad de los genomas víricos para insertarse en los genomas de sus específicas células huésped, ¿podría tener algo que ver con esas secuencias y enzimas?. Describe cómo utilizarían ese mecanismo. 6