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Escuela "José A. Balseiro" 2014
Modelado en Neurociencias
Mecanismos iónicos del potencial de membrana
Funcion y propiedades de canales iónicos
Marcela Nadal
Octubre 2014
Señales eléctricas en células excitables
= cambios en el potencial de membrana
Cambios en el potencial de membrana de neuronas
cambios en el potencial de membrana
• gradiente electroquímico
• membrana semipermeable
• permeabilidad selectiva a ciertos iones: Na+,
K+, Cl-, Ca2+
en el equilibrio, el movimiento neto de iones es cero:
INTRACELULAR
K+
155
Na+
12
Cl-
A-
4.2
123
_ +
+ _
_ +
potencial de
equilibrio
EXTRACELULAR
4
- 98 mV
145
+67 mV
123
- 90 mV
0
El potencial de equilibrio o de “reposo” de membrana (EM) depende de la
permeabilidad de la membrana a cada ion y se calcula con la ecuación de
Goldman-Hodgkin-Katz (1943-49) para K+, Na+ and Cl-
EM= -90mV
en el equilibrio, la membrana es más permeable a potasio (y cloro) y muy poco a sodio
Mecanismos iónicos de los cambios en el
potencial de membrana
conductancias responsables por el disparo del potencial
de acción en el axón gigante de calamar
Hodgkin and Huxley, 1952
firing of an action potential: voltage and time-dependent changes in gNa y gK
Hodgkin and Huxley, 1952
Cambios en el potencial de membrana II: potenciales de accion
Bean, 2007
Diversidad de patrones de disparo en neuronas
Izhikevich 2007
Izhikevich 2007
Primera clasificación de patrones de disparo en
neuronas
Cortical pyramidal neuron
Anisodoris (CS)
Brainstem mesV
Axon squid (HH)
MNTB
Superior olive
Izhikevich 2007
Clasificacion de Hodgkin
Class 3 neural excitability. A single action potential is generated in response to a
pulse of current. Repetitive (tonic) spiking can be generated only for extremely
strong injected currents or not at all.
Izhikevich 2007
En las neuronas tipo I hay una relación directa entre
“threshold” y excitabilidad
PLASTICIDAD
Primer código neuronal identificado: frecuencia de disparo
After ED Adrian, 1926
Códigos neuronales:
de frecuencia, temporal, latencia y por sincronía
schematic depictions of different
neural coding schemes en response to two stimuli:
circuit properties
homosynaptic interactions
heterosynaptic interactions
Golisch, 2008; Kullman, 2007
inhibitory interneurons provide functional balance
and computational complexity
axons
dendrites
Huang, 2007
señales químicas: neurotransmisores
y neuromoduladores
neuronas individuales
señales eléctricas: cambios
en el potencial de
membrana
•
•
•
Potenciales graduados o de receptor
Oscilaciones subumbral
Potenciales de acción (spikes)
input sensorial
arquitectura del circuito:
diversidad de tipos de neuronas
y de conexiones
output motor
cerebro de gato, adaptado de Ramon y Cajal, 1911
Multicolor Labeling of Cortical Neurons with
Lipophilic Dye–Coated Particles
Gan et al., 2000
diversity of neurons in the neocortex
from Kawaguchi & Kubota 1997
firing patterns in the neocortex
regular-spiking fast-rhythmic bursting
regular-spiking
fast-spiking
fast-rhythmic bursting
intrinsically bursting
fast-spiking
Steriade, 2004
Mecanismos iónicos de los cambios en el
potencial de membrana
CANALOMA
de los canales
sensibles a voltaje
y estruturalmente
relacionados
Canales HH
- canales de cloro / - receptores ionotrópicos
Yu and Catterall 2004
voltage-clamp: K+ and Na+ currents
current-voltage relations
IK delayed rectifier
INa transient
Cole & Curtis, 1939, Hodgkin & Huxley, 1952, Cole & Moore, 1960, Huguenard and McCormick
Patrón y frecuencia de disparo en el axon de calamar
Guttman, R.
la corriente de potasio tipo “A”
Connor and Stevens, 1971
Los canales de potasio tipo A se activan a potenciales
por debajo del umbral de disparo del potencial de accion
Sub-threshold
A-type K+ channels
Función de la corriente de potasio tipo A en
el intervalo inter-espiga y en la frecuencia de disparo
EI
membrane potential trajectory
theory
20
0
100ms
-20
EL
-40
EK
EA
underlying ionic currents
1.0
IA (nA)
0.5
IK
IA
IA
0
-0.5
-1.0
II
II
From Connor and Stevens, 1971; Hille, 1992
y sus propiedades
Las corrientes definen que tipo de sistema
dinámico es una neurona
Anisodoris:
Nav
Kv
A-type Kv
leak
Squid axon:
Nav
Kv
leak
Alteraciones
del sistema
dopaminérgico
en areas
específicas
producen
distintas
patologías
nigrostriatal
mesocortical and mesolimbic
tuberoinfundibular
Dopamine pathways
ADHD, attention-deficit–hyperactivity disorder; HT, hypothalamus; nAcb, nucleus accumbens; SN,
substantia nigra; VTA, ventral tegmental area.
Bozzi and Borrelli TINS 29, 167-174
Las neuronas dopaminérgicas tienen distintas
frecuencias de disparo
dopamina
Liss et al., 2001
Las corrientes tipo A regulan la frecuencia de disparo
en neuronas dopaminérgicas
Liss et al., 2001
“A” currents affect the back propagating action potentials
in dendrites of CA1 hippocampal neurons
LTP
Na+
Ca2+
Ih
K+ sust.
ISA
soma
dendrite
action
potentials
Hoffman et al., 1997; Magee & Johnston, 1997; Migliore et al. 1999; Jonhston et al., 2000
pyramidal neurons in the neocortex
Huang, 2007
CANALOMA
de los canales
sensibles a voltaje
y estruturalmente
relacionados
- canales de cloro / - receptores ionotrópicos
Yu and Catterall 2004
Canales Iónicos
diagrama de membrana excitable en 1967
Bertil Hille’s thesis
Pietzsch, Nature, 2004
aminoacidos
estructura de un canal de potasio Kv de vertebrados
Each subunit is composed of
six membrane spanning
hydrophobic α-helical sequences
Tetrámero
Bezanilla 2008
Como se crecen cristales de proteínas?
Crystals of insulin grown in space
(microgravity)
method used to investigate molecular structures:
X-ray crystallography (or X-ray diffraction)
From the angles and intensities of the
diffracted beams, a three-dimensional picture
of the density of electrons within the crystal is
produced.
Large, ordered
collection of
identical molecules
X-ray diffraction image of DNA taken
by Rosalind Franklin in 1952
In X-ray crystallography, resolution is the highest resolvable peak in the diffraction pattern
Resolution:
4Å
8Å
16 Å
32 Å
Estructura de un canal de potasio por cristalografia de rayos X
Overhead view of a voltagedependent potassium ion
channel shows four red-tipped
"paddles" that open and close
in response to positive and
negative charges. This structure
showed for the first time the
mechanism by which potassium
ions are allowed in and out of
living cells during a muscle or
nerve impulse.
http://www.bnl.gov/bnlweb/history/nobel/nobel_03.asp
http://www.jic.ac.uk/staff/david-lawson/xtallog/summary.htm
Extracellular view of the tetrameric Kv1.2/2.1 paddle chimaera (Kvchim)
Tetrámero
estructura de un canal de potasio Kv en la membrana
McKinnon 2007
Propiedades de canales iónicos
• Selectividad
• Conductancia
• “Gating”: mecanismo de apertura y cierre
• Inactivación (N-type, C-type)
Propiedades de canales iónicos
• Selectividad
• Conductancia
• “Gating”: mecanismo de apertura y cierre
• Inactivación (N-type, C-type)
KcsA: propiedades físicas de la superficie interna
• Blue: high positive charge
• White: neutral
• Red: negative charge
• Yellow: hydrophobic (or partly so) side
chains in the inner vestibule ( Thr75, Ile100,
Phe103, Thr107, Ala108, Ala111, Val115)
• Green CPK spheres: K+ ion positions in the
conduction pathway
Doyle et al., 1998
The carbonyl oxygen atoms provide a
formidable negative electrostatic potential
Filtro de selectividiad del canal de K+
Los átomos de oxígeno de los carbonilos se alinean hacia el centro para
reproducir la interacción del agua con el K+
Doyle at al., 1998; Long et al., 2007
Correlación entre conformacion del filtro de
selectividad, ocupancia de iones de K+ y apertura
del canal
106 iones
por segundo!
Åqvist & Luzhkov, 2000
Selectividad de canales de K+ para iones de K+
Selectividad K+ sobre Na+ es de ~100:1
Armstrong, 2007
Estructura del canal de sodio Nav
Filtro de selectividad del canal de Na+
Catterall, 2010; Sato et al., 2001; Yamagishi et al., 2009
Membrane access to the central cavity in Nav
Filtro de selectividad de canales de sodio
0.93
1
0.94
0.49
0.086
permeabilidad relativa pX/PNA
Hille, 2001
Comparison of Selective Ion Transport in Channels
Phe 348
Ile356
Glu148
Tyr 445
Gouaux and MacKinnon, 2005
Ser107
La estructura del tipo “pore-loop” esta
conservada en la evolución
Kcsa
bacteria
Kv1
vertebrado
Anderson & Greenberg, 2001
Cambios en aminoacidos puntuales definen la selectividad del poro
(1000:1)
(3:1)
Canal de Sodio
Canal de Calcio
Hille, 2001; Yu and Catterall 2004
Pore-blocking toxins inhibit voltage-dependent
K+ channels by plugging the ion-conduction pathway
scorpion peptide toxin
charybdotoxin (CTX)
Barnajee et al., 2013
Propiedades de canales iónicos
• Selectividad
• Conductancia
• “Gating”: mecanismo de apertura y cierre
• Inactivación (N-type, C-type)
The patch clamp technique
Patch clamp: registros de canal único
Erwin Neher and Bert Sakmann, premio nobel 1991
Registro de 3 canales en un patch
gating transitions are stochastic
Los eventos de canal único tienen un
comportamiento probabilístico al azar
sodium channel
potassium channel
La conductancia de canal único es característica de cada tipo de
canal y puede ser modificada por la presencia de
proteínas auxiliares
Kaulin et al., 2009, Amarillo
Propiedades de canales iónicos
• Selectividad
• Conductancia
• “Gating”: mecanismo de apertura y cierre
• Inactivación (N-type, C-type)
Mecanismos de “gating”
Voltaje: canales de sodio, potasio y calcio dependientes de voltaje
Calcio: calcium-activated potassium channels
Ligando: receptores ionotrópicos (nicotinic Acetylcholine receptor, ionotropic
glutamate-gated receptors and ATP-gated P2X receptors, and the anion-permeable γaminobutyric acid-gated GABAA receptor); cyclic nucleotide-gated (HCN) channels
Segundos mensajeros (intracellular ATP, PIP2, cAMP or cGMP and G-protein βγ
subunits): Inward-rectifier potassium channels, calcium-activated potassium channels,
Two-pore-domain potassium channels
Luz: Channelrhodopsin
Presion, estiramiento, desplazamiento: Canales iónicos mecanosensibles
Temperatura: Transient Receptor Potential ion channel superfamily, such as TRPV1 or
TRPM8 are opened either by hot or cold temperatures.
Modelo de la compuerta (Hodgkin y Huxley)
Hille, 2001
Canal de potasio
bacteria
vertebrado
Gating mechanism: the opening of the gate occurs by
bending the inner TM2/S6 helix in response to changes in voltage
In the bacterial channels MthK
and KvAP, the TM2 bundle opens
at a glycine hinge (red ).
In the eukaryotic Kv1.2, the hinge in S6
corresponds to the PVP motif (between
positions 473 and 475 in Shaker) (red ).
Kv
bacteria
Each voltage-sensing module interacts most closely with the
pore-forming module of the adjacent subunit
in the clockwise direction as viewed from the extracellular side
McKinnon 2007
Positively charged residues
negatively charged clusters
K+
In the Kv1.2 crystal structure,
part of the high-impact
positions in S5 and the pore
helix turn out to face the VSD,
whereas high impact
positions in S4 turn out to face
S5.
highly conserved phenylalanine 233
Ledwell & Aldrich 1999, Pathak et al. 2005
Schematic illustration of how the channel closes and opens
McKinnon 2007
Voltage gating of the Na+ channel Nav
Noda et al., Nature. 1984
Propiedades de canales iónicos
• Selectividad
• Conductancia
• “Gating”: mecanismo de apertura y cierre
• Inactivación (N-type, C-type)
firing of an action potential: voltage and time-dependent changes in gNa y gK
IK delayed rectifier
INa transient
CANALOMA
de los canales
sensibles a voltaje
y estruturalmente
relacionados
- canales de cloro / - receptores ionotrópicos
Yu and Catterall 2004
Corrientes de sodio en diferentes preparaciones
Hille, 2001
N-type inactivation: ‘‘ball and chain’’
Armstrong et al., 1973
Ellisman et al., 1983
The primary structure of the subunits of the voltage-gated sodium channels
cADN del gen que codifica para la subunidad del canal
preparar cARN
inyectar ovocitos
separar ovocitos
y remover
la capa folicular
registrar corrientes de membrane con
voltage clamp de dos electrodos
Xenopus laevis
Estudio del mecanismo de inactivación de canales de sodio en ovocitos
Patton et al., 1992; Kellenberger et al., 1997
Inactivación C-type
Cambios conformacionales en el canal:
dilatación del anillo que forma el filtro de
selectividad, destruyendo su abilidad para unir K+
con alta afinidad
Propiedades de canales iónicos
• Selectividad
• Conductancia
• “Gating”: mecanismo de apertura y cierre
• Inactivación (N-type, C-type)
CANALOMA
de los canales
sensibles a voltaje
y estruturalmente
relacionados
- canales de cloro / - receptores ionotrópicos
Yu and Catterall 2004
Modulación de la actividad de
canales iónicos
Plasticidad Neuronal Intrínseca
Kv Channel Complex
Señales eléctricas en neuronas
= cambios en el potencial de membrana
• Potenciales graduados o de receptor
• Oscilaciones subumbral
• Potenciales de acción (spikes)
el código por sincronía de poblaciones de neuronas
da lugar a ritmos
Klausberger y Somogy, 2008
Oscillaciones y el código temporal
how neuronal excitability reflecting saliency can be converted to a
temporal phase code by alpha oscillations
Jensen et al., 2012
Model of Force Transmission in Kv Channels
Lee et al., 2009