1. Ciencia

CARACTERIZACIÓN MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES SSR DE LÍNEAS DE
MAÍZ PISINGALLO
Sartor, M.1; Negri, M. E.2; Delucchi, C.2; Toledo, M.2; Decker, V.2; López Miró, D.2; Lorea, R.D.1 2;
Díaz Paleo, A.1 2
1
Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires. Monteagudo 2772, Pergamino, Bs As.
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Ruta 32 Km 4.5, Pergamino, Bs. As.
[email protected]
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Abstract
Molecular markers are powerful tools for the description of DNA variations in crop improvement
due to their high polymorphism, wide genome coverage and lack of environmental effects in their
determination. Are suitable for genetic variability evaluation in addition to any morphological
characterization. A set of 495 microsatellite (SSR) markers uniformly distributed over the maize
genome, were analyzed to estimate the degree of genetic relationship among 8 inbred popcorn
lines of the Breeding Program at INTA. The molecular results were organized in a binary matrix of
presence/absence from which three coefficients of similarity were estimated: Jaccard, Simple
Matching and Dice. These estimations performed on the 8 popcorn lines and B73 (control) were
used for cluster analysis according to UPGMA method. Clusters of the germplasm evaluated were
visualized in a dendrogram and the cophenetic coefficients were computed. The polymorphic
information content (PIC) of the inbred lines ranged from 0 to 0.76 with an average of 0.3. Five
clusters with the eight popcorn inbred lines and B73 were identified and this was consistent with
the three similarity indices used. Cophenetic coefficient in the three distances analyzed was greater
than 0.995, expressing a high agreement between the dendrogram and similarity matrix. The
clusters obtained were in accordance with the origins of germplasm. The genetic distances found
among the inbred lines evaluated allow to outline different heterotic groups for use in the breeding
program.
Palabras Clave: maíz pisingallo, marcadores moleculares, índices de similitud, coeficiente
cofenético.
Key word: popcorn, molecular markers, similarity index, cophenetic coefficient.
Introducción
Los programas de mejoramiento de maíz pisingallo (Zea mays L. var. everta) se
enfrentan a dos objetivos relevantes: el incremento del rendimiento en granos y la
mejora de la calidad comercial (fundamentalmente volumen de expansión, tamaño de
granos y porcentaje de explosión). En el primero de los casos, el aprovechamiento de la
existencia de grupos heteróticos, asociados a mayor divergencia genética entre
progenitores, permite utilizar la heterosis presente para la conformación de híbridos.
En cuanto a los parámetros de calidad comercial, la existencia de variabilidad y el estudio
de los componentes genéticos determinantes de la misma, permiten facilitar el proceso
de mejora.
Una herramienta relevante en el mejoramiento de cultivos es la utilización de
Marcadores Moleculares los cuales permiten detectar variaciones a nivel del ADN y son
complementarios a la caracterización agro-morfológica ya que presentan un alto
polimorfismo, están ampliamente distribuidos en el genoma y no son influidos por el
ambiente. Los microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeat) son ideales para la
discriminación del germoplasma del maíz (Smith et al., 1997) ya que presentan un alto
poder discriminatorio, son marcadores codominantes, de expresión multialélica, ubicación
cromosómica conocida, fácil automatización, buena repetibilidad y reproducibilidad.
Con el objetivo de identificar la variabilidad existente en un grupo de 8 líneas de maíz
pisingallo y estimar el grado de relación genética se analizaron 495 microsatélites (SSR)
distribuidos uniformemente sobre el genoma de maíz.
Materiales y métodos
Se caracterizaron 8 líneas experimentales de maíz pisingallo de orígenes diversos y
pertenecientes al programa de Mejoramiento de Maíz de la EEA Pergamino de INTA
(Tabla 1) y la línea B73, utilizando entre 483 y 509 (495 en promedio) microsatélites
distribuidos uniformemente sobre el genoma de maíz (Tabla 2). Las secuencias de los loci
se obtuvieron de la base de datos Maize Gene Data Bank (http://www.maizegdb.org).
Tabla 1. Líneas experimentales de maíz pisingallo caracterizadas.
PEDIGREE
ORIGEN
L3140
GRUPO
Derivada del híbrido comercial VYP211
A
Derivadas del híbrido comercial BS5625
B
Derivadas del híbrido comercial BS5620
C
Derivadas de una sintética de INTA proveniente de germoplasma
reventador de diversos orígenes con alta capacidad de expansión
D
L3145
L3148
L3159
L3175
L3180
L3186
L3197-3
Tabla 2. Ubicación de los 495 SSR evaluados.
Cromosoma Cant. SSR
Tamaño Cr (Mpb)
1
116
300
2
52
240
3
52
240
4
55
250
5
60
220
6
54
116
7
18
175
8
36
174
9
17
155
10
35
150
La extracción de ADN se realizó a partir de tejido foliar de un bulk de 5 plántulas de
cada línea de 7 a 10 días de edad (Kleinhofs et al., 1993). Las muestras se amplificaron
en placas de 96 posillos en un volumen de reacción de 13µl, compuesto por 200µM de
cada dNTP, 1,5mM Mg++, 200nM de cada oligonucleótido (cebador), 0.5U Taq-Polimerasa
y 30ng de ADN molde. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo utilizando un
perfil de PCR tipo “touchdown”. Los productos de amplificación se separaron mediante
electroforesis vertical en cubas de secuenciación en geles desnaturalizantes de
poliacrilamida al 6% y se visualizaron mediante tinción con nitrato de plata.
La identificación de la banda correspondiente a cada microsatélite se realizó utilizando
como criterio de referencia el dibujo o forma y tamaño de la banda presente en la línea
B73. Los distintos tamaños de bandas de cada microsatélite fueron interpretados como
diferentes formas alélicas de un locus.
Se estimaron las relaciones entre las nueve líneas (8 de pisingallo y B73) a partir de
una matriz binaria de presencia/ausencia, expresadas cuantitativamente a través de
diferentes índices de similitud: Coeficiente de Similitud de Jaccard, Coeficiente Simple
Matching y el Coeficiente de Dice. La matriz de distancia resultante se utilizó para el
análisis de clúster o conglomerados de acuerdo con el método UPGMA (de
encadenamiento promedio).
Los agrupamientos del germoplasma evaluado fueron visualizados en un
dendograma, y se estimó el Coeficiente Cofenético que mide la correlación entre las
interdistancias en el dendograma y las interdistancias en la matriz sobre la que se aplicó
el procedimiento de cálculo. El Coeficiente Cofenético es una medida de la distorsión
interna de la técnica e indica el ajuste del gráfico respecto a los coeficientes de
asociación originales. El software estadístico utilizado en todos los análisis fue el Info-gen
(Balzarini y Di Renzo, 2013).
Resultados y discusión
La variabilidad alélica encontrada para los 495 microsatélites evaluados en el
germoplasma en estudio fue elevada. El Contenido de Información polimórfica (PIC) de
las líneas varió entre 0 (monomorfico) y 0,76 con un promedio de 0,3.
Se lograron conformar 5 agrupamientos con las 8 líneas de pisingallo evaluados y la
línea B73, los cuales fueron consistentes con los tres índices de similitud utilizados
(Grafico 1).
Gráfico 1. Dendogramas de agrupamiento de las 8 líneas experimentales de pisingallo y la línea
B73 con un promedio de 495 marcadores microsatélites.
Promedio (Average linkage)
Distancia: (Simple Matching (1-S))
B73
L3175
L3180
L3186-3
L3197
L3159
L3148
L3145
L3140
0,00
0,15
0,31
0,46
0,62
Promedio (Average linkage)
Distancia: (Dice (1-S))
B73
L3175
L3180
L3186-3
L3197
L3159
L3148
L3145
L3140
0,00
0,18
0,35
0,53
0,70
Promedio (Average linkage)
Distancia: (Jaccard (1-S))
B73
L3175
L3180
L3186-3
L3197
L3159
L3148
L3145
L3140
0,00
0,21
0,42
0,63
0,84
Los diferentes índices de similitud utilizados coincidieron en los agrupamientos
obtenidos. De acuerdo a Legesse B. W. et al., 2007, para el Coeficiente Cofenético
valores superiores a 0,75 se encuentran en un rango aceptable, por lo que se consideró
muy buena la representación gráfica asegurando fiabilidad y consistencia al dendograma
con la matriz de similitud, ya que los valores obtenidos para las tres distancias fueron
superiores a 0,995.
Dichos agrupamientos coincidieron con los orígenes del germoplasma y las distancias
encontradas expresan divergencia genética entre las líneas evaluadas que permitirían
conformar diferentes grupos heteróticos a ser utilizados en el programa de
mejoramiento.
Conclusiones
Los resultados obtenidos indican que los SSR son muy útiles en la identificación/
diferenciación de germoplasma de maíz ya que permitieron una adecuada y precisa
caracterización de las 8 líneas analizadas. Los marcadores fueron lo suficientemente
polimórficos como para establecer patrones únicos que permitieron determinar de
manera eficaz en grado de relación entre las 8 líneas. Todos los agrupamientos coinciden
con la información del pedigree de las líneas.
El análisis mediante SSR proporciona suficiente precisión para estimar la variabilidad
genética lo cual muestra su utilidad en la caracterización y estimación de la base genética
como base para estrategias de mejoramiento exitosas.
Los resultados de este trabajo muestran la utilidad de los SSR para profundizar en el
conocimiento y asignación de grupos heteróticos y revelar relaciones de parentesco. Así
mismo, aporta evidencia adicional a favor de la caracterización molecular permitiendo la
estimación de la variabilidad genética la cual combinada con caracteres fenotípicos de
interés puede convertirse en una herramienta útil que asista al mejoramiento
convencional.
Citas bibliográficas
Balzarini M. G., Di Rienzo J.A. InfoGen versión 2013. FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. URL
http://www.info-gen.com.ar.
Legesse B. W., Myburg A.A., Pixley K. V., Botha A.M. 2007. Genetic diversity of African maize inbred lines
revealed by SSR markers. Hereditas 144: 10-17.
Smith J. S. C.; Chin, E. C. L.; Shu H.; Smith O. S.; Wall S. J.; Senior M.L; Mitchell E.; Kresovitch S. y Ziegle J.
1997 An evaluation of utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zea mays L.): Comparisons with data
from RFLPs and pedigree. Thoretical and Applied Genetics 95, 163-173.