1. Espiritual

UNIVERSIDAD RICARDO
PALMA
Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, Nº1
Diciembre, 2014
Boletín
Científico
http://www.urp.edu.pe/biologia/index.php?urp=Laboratorios
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Boletín Científico
Decano
Dr. Tomás Agurto Saenz
Director
Blgo. Alcides Guerra Santa Cruz
Editor General
Santiago Justo Arévalo
Editor de Estilo
Paola Nunja Huamán
Editor Científico
Marlon Morales Moisela
Comité Editor
Tania Churasacari Vinces
Cindy Cajachagua Pucuhuaranga
Diego Santiago Bravo
Carla Saldaña Serrano
Luis Pabón Rodríguez
Miguel Gonzáles Olivos
Mario Aguayo Cerna
Pavel Pastrana Sumari
Miguel Morales Campos
Claudia Monge Pimentel
Miguel Montero Orozco
Roma Ballena Palomino
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Contenido
Editorial
Presentación…………………………………………………………………….03
Editorial……...…………………………………………….……………………04
Actividades del Laboratorio
Difusión y Exposición de Trabajos de Investigación
URP presente en el IV CONCIMAR ...…………………………….….…..05
Encuentro Científico de invierno internacional 2014 (ECI) ...……………..05
Curso-Taller de Redacción Científica ……......…….….……………………….....06
Ciclo de conferencias: Inmunidad y Cáncer.………………..…………….……....07
Proyección Social con alumnos del Colegio EUROAMERICANO….…..….....…08
Reunión de Integración con los Padres de Familia...…...…………...………….....09
Primera capacitación de Interciclo-2014 ...………………………………….…....10
Integrantes Demuestran lo Aprendido en Importantes Laboratorios.…………....11
Visita de estudios a Petramás: Empresa 100% Peruana….….…………….…..….12
Artículos de Divulgación
Virus contra Bacterias………………... ...………………………………….…....13
Proteínas Recombinantes…………….. ...………………………………….…....14
Artículos de Investigación
Actividad antimicrobiana del extracto acetona-agua de Macrocystis pyrifera (C.
Agardh 1820) en bacterias de importancia clínica ………………………...…….15
Determinación de Géneros Bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao - La Punta Callao …………………………………………………………………………...20
Efecto antibiótico de Piocianina de Pseudomonas aureginosa sobre Escherichia coli y
Staphylococcus aureus …………….……..………...…………………………….......24
MiniReview
Aspectos generales de la crianza de Cuy y su agente infeccioso: Salmonella……....28
Fundamentos básicos de PCR convencional y sus variantes..……………….…....34
Integración de la Biotecnología Bacteriana y la Ingeniería Genética de Plantas......43
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Editorial
Presentación
Les presentamos el segundo número del Boletín Científico del Laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo
Palma. En esta nueva edición tenemos el placer de informarles acerca de las
actividades realizadas en el presente año, donde se incluyen cursos,
capacitaciones, artículos de divulgación, trabajos de investigación y artículos de
revisión; todo esto realizado por integrantes del laboratorio con el único deseo
de hacer la mejor ciencia posible. Actualmente, la intedisciplinariedad de la
ciencia hace necesario que trabajemos en conjunto con otras áreas, es por esto
que el divulgar e informar sobre las actividades que se realicen en un
determinado lugar no solo sirve para dar a conocer las labores de un equipo,
sino pretende además ampliar horizontes a través de la formación de nuevos
nexos con otras instituciones y equipos para así mejorar e integrar los
conocimientos adquiridos, es decir si cada uno aporta de un punto de vista
diferente, los logros se hacen más completos y útiles. Les reiteramos nuestros
saludos y les deseamos mucho éxito en todas las áreas que se desempeñen y
trabajos que realicen, recuerden que todo esfuerzo tiene su recompensa.
Equipo de Trabajo del Laboratorio Microbiología e Inmunología
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Editorial
El Microbiólogo
Dr. Tomás Agurto Sáenz
Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas
Profesor Principal en la Cátedra de Microbiología
En un libro titulado “los cazadores de microbios” se
relata de los trabajos de científicos que querrán
saber y demostrar el porqué de las enfermedades del
humano, en animales y plantas. Robert Koch,
postulaba que una infección es producida por un
agente a quien hay que encontrarlo y este agente
debe reproducir el mismo mal al ser inoculado en un
animal, eso es lo que se hace ahora, se mira cara y
cara con la colonias crecidas en una placa Petri y
bajo el microscopio se puede definir su forma,
coloración; así como mediante pruebas bioquímicas
y moleculares se puede determinar su composición
química, sus reacciones y los componentes de su
ADN, logrando una mejor identificación de las
bacterias, hongos, y virus que pueblan el mundo, en
el suelo, agua, aire. Existen especies no patógenas,
en las que se explora sus actividades metabólicas
para transformar y elaborar una serie de productos
que se industrializan, los antibióticos que ocupan un
alto lugar en producción industrial; los alimentos,
cada vez más transformados, conservados, para que
sean idóneos e inocuos. En los ciclos biológicos
intervienen las bacterias y en la cadena alimenticia
son las iniciadoras de los procesos metabólicos, así,
se puede decir que los microrganismos son los
verdaderos responsables para que la vida exista y
este en desarrollo continuo y aquí en el laboratorio
de microbiología un grupo entusiasta, activo,
guardan por ser maestros en dar acción a los
microorganismo
con
sendos
trabajos
de
investigación ya al paso de crear el curso y la
especialización en genética bacteriana.
Jóvenes sigan adelante, el éxito depende de ustedes.
Dr. Tomás Agurto Sáenz
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Difusión y Exposición de
Trabajos de Investigación
Con la finalidad de difundir y discutir los resultados de las
últimas investigaciones relacionadas a los diversos aspectos de
las ciencias del Mar realizadas por investigadores y estudiantes
universitarios en nuestro país, se llevó cabo el IV Congreso de
Ciencias del Mar (IV CONCIMAR). Este importante evento,
realizado en el mes de Junio en la Universidad Peruana
Cayetano Heredia, estuvo dirigido a la comunidad académica,
científica y empresarial nacional e internacional, así como al
sector pesquero y a sus representantes.
El equipo de investigación del Laboratorio de Microbiología se
hizo presente con
el tema Determinación de Géneros
Bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao – La Punta –
Callao, el cual tuvo el principal objetivo de expandir y motivar
los trabajos en el área de microbiología marina para sus
aplicaciones ecológicas y biotecnológicas.
ENCUENTRO CIENTIFICO
DE INVIERNO
INTERNACIONAL 2014
(ECI)
URP presente en el IV
CONCIMAR
Santiago Justo Arevalo y Luis David
Pabon presentando el panel
“Determinación de géneros bacterianos
en el Mar de la Playa Canlao”
En este invierno 2014 la Facultad de Ciencias Biológicas
tuvo el honor de ser la sede de la sesión de Biología del ECI
2014. Esta se llevó a cabo en el auditorio Biotempo con la
dirección del Prof. Alcides Guerra. Nuestro laboratorio
manifestó su presencia a través de la presentación de 3
trabajos de investigación: “Determinación de Géneros
Bacterianos en el Mar de la Playa Cantolao – La Punta –
Callao”, “Extracción y Actividad Antimicrobiana del
Pigmento Piocianina de 8 cepas de Pseudomonas
aeruginosa” y “Actividad Antibacteriana del Extracto
Acetona-Agua de Macrocystis pyrifera (C. Agardh 1820) en
Bacterias de Importancia Clínica”
La jornada se realizó con éxito con la presencia de
estudiantes de varias universidades del país, además en toda
nuestra universidad se expusieron trabajos de investigación
relacionados a todas las áreas de ciencias.
Marlon Morales Moisela en su exposición del
tema: “Actividad antibacteriana del Extracto
Acetona-Agua de Macrocystis pyrifera (C. Agardh
1820) en Bacterias de Importancia Clínica”
En el año 2015 se realizará el ECI de Verano en las fechas 2
al 6 de Enero donde seguiremos participando con
investigaciones que venimos realizando gracias al esfuerzo de
todos los integrantes abocados a la ciencia en la Facultad de
Ciencias Biológicas.
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Curso-Taller de
Redacción Científica
El 30 de mayo, 6 y 13 de
Junio del presente año se
organizó el Curso-Taller de
Redacción Científica, el cual
contó con la participación de
ponentes de la Dirección
Científica Académica de
ONCOSALUD – AUNA:
Joseph Pinto, Claudio Flores
y
Priscila
Valdivieso,
quienes expusieron y dieron
importantes pautas sobre
cómo redactar de manera
ordenada y organizada un
artículo de investigación
científica, cómo presentarlo
a una revista para que evalúe
su publicación, además de
dar a conocer aspectos
generales para tomar en
cuenta en la edición de una
revista científica, el proceso
editorial para la evaluación
de trabajos y cómo mejorar
la calidad y contenidos de esta.
Este evento se realizó con el
fin de promover la publicación
de artículos científicos en
estudiantes y profesionales de
nuestra
facultad,
contribuyendo en gran medida
al desarrollo científico.
Cabe agregar que en el evento
no
sólo
participaron
estudiantes y profesionales de
nuestra casa de estudios, sino
también de otras universidades
como la Universidad Nacional
de Ingeniería, Universidad
Nacional Agraria, Universidad
Nacional Federico Villareal y
la
Universidad
Peruana
Cayetano Heredia.
Afiche de Presentación del Curso-taller
Cierre del curso Taller de Redacción
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Ciclo de Conferencias:
Inmunidad Cáncer
En los últimos años las
ciencias biológicas se han
desarrollado rápidamente, lo
que ha permitido el estudio
de mecanismos moleculares
de defensa de nuestro
sistema inmune frente a
señales de advertencia de un
mal funcionamiento celular.
El ciclo de conferencias
“Inmunidad y Cáncer” tuvo
como objetivos actualizar a
los asistentes en las últimas
investigaciones sobre la
inmunidad
del
cáncer,
promover
nuevas
investigaciones, además de
crear un foro de debate en
aspectos relacionados a los
avances en el tratamiento del
cáncer.
Dicho evento fue realizado
con éxito gracias a la acción
conjunta del Laboratorio de
Microbiología e Inmunología
– URP y la Dirección
Científico
Académica
de
ONCOSALUD – AUNA, el
día 21 de Junio del 2014 en el
Auditorio Ccori Wasi – URP,
el ciclo de conferencias conto
con la participación de
destacados ponentes en el área
tales como el Dr. Alfredo
Aguilar
Cartagena
y
representando a nuestra casa
de estudios el Blgo. Alcides
Guerra Santa Cruz.
Afiche de Presentación del Ciclo de
Conferencias
Cierre del Ciclo de Conferencias: Inmuidad y Cáncer
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Proyección Social con los alumnos de
Colegio EUROAMERICANO
El Colegio Euroamericano es una escuela situada
en el valle de Pachacámac, esta resaltante
institución maneja un programa poco común en
los centros educativos del país, el IB o
Bachillerato Internacional, lo que permite que sus
alumnos egresen con un Diploma adicional que
les permite postular universidades de alto
prestigio internacional una vez terminados sus
estudios secundarios. Para contribuir a la
formación de los alumnos de esta institución, la
Universidad Ricardo Palma a través del
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Biológicas y como parte de su programa
de Proyección Social, ha capacitado a alumnos
del último año del Bachillerato de Biología en
técnicas
experimentales
básicas
de
la
microbiología como Coloración Gram, ELISA y
electroforesis.
Además ha permitido que el alumno Rodrigo
Alcorta del Bachillerato de Biología investigue el
efecto antimicrobiano de plantas del Perú,
realizando su trabajo de graduación del IB
asesorado por el Prof. Jefe de Laboratorio, Alcides
Guerra y los ayudantes de laboratorio.
Es así como se integran partes fundamentales de
la educación y el progreso del país: Colegios y
Universidades.
Alumnos del Colegio
Euroamericano en la
capacitación de técnicas
experimentales Basicas
de microbiología
Alumna Tania Churasacari capacitando alumnos del
EUROAMERICANO
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Reunión de Integración con los Padres de
Familia
también de los proyectos que tenemos en curso; para
finalizar esta primera etapa de la reunión, tomó la
palabra el ayudante principal, Santiago Justo, quien
a nombre de los demás integrantes, emitió una muy
emotiva y sincera perorata, donde agradeció la
asistencia de todos los presentes. Seguidamente los
padres fueron guiados al laboratorio y vieron
directamente el lugar de trabajo de sus hijos,
La bienvenida fue en el Auditorio Biotempo y la dio entonces pudieron intercambiar impresiones.
el Dr. Agurto, con su siempre jovial prosa,
adentrándolos en el panorama de nuestra carrera y la No nos queda más que agradecer a nuestros padres,
microbiología en la actualidad; luego tomó la por haberse dado un momento para compartir con
palabra el Blgo. Alcides Guerra, Jefe de nuestro nosotros y siempre estar ahí, apoyándonos en cada
laboratorio, enterándolos de todas nuestras etapa de nuestras vidas, por ser nuestros guías,
actividades realizadas hasta el momento así como consejeros y amigos.
El Laboratorio de Microbiología, celebró en el
interciclo 2014 una reunión en la que el Dr. Tomás
Agurto Sáenz, Decano de la Facultad de Ciencias
Biológicas; el Blgo. Alcides Guerra, Jefe del
laboratorio e integrantes del mismo se reunieron con
los padres de familia, en una muy amena asamblea
donde los padres eran los invitados.
Visita de los padres a las
diferentes ambientes del
Laboratorio de
Microbiología
Palabras del Decano a los padres
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Primera Capacitación
De Interciclo-2014
El Laboratorio de Microbiología de la Universidad
Ricardo Palma conoce el entusiasmo y ganas de
aprender que tenemos los alumnos de la Facultad de
Biología, además del espíritu científico que nos
caracteriza, ante esta situación se realizó una
capacitación de un poco más de un mes dirigida a
todas las personas que deseen compartir
conocimientos con los ayudantes del laboratorio
Microbiología, esta incluía clases teóricas, prácticas
y discusión de papers en temas desde los básicos
hasta los más actuales: medios de cultivo, pruebas
bioquímicas, antibiograma, extracción de DNA
bacteriano, identificación molecular de una bacteria,
transformación bacteriana, purificación de proteínas
y electroforesis. La finalidad era que los asistentes
se sientan involucrados e identificados como
partícipes directos de cada tema desarrollado con la
intención de motivarlos en el campo de la
investigación, que conozcan que en cada laboratorio
“El aprendizaje es
experiencia, todo lo demás
es información”
Albert Einstein
“Dime y lo olvido,
enséñame y lo recuerdo,
involúcrame y lo aprendo”
Benjamin Franklin
de la facultad hay personas que les gusta la ciencia
tanto como a ellos. Pavel Pastrana, uno de los
participantes de la capacitación nos comenta que:
“Participar en el interciclo, del laboratorio de
microbiología, ha sido una muy buena experiencia
tanto para mi vida profesional como personal; ya
que aparte de haber adquirido nuevos conocimientos
en el área de la microbiología también me ayudó a
ser más meticuloso con las técnicas empleadas en un
laboratorio y ser más organizado en el día a día. Por
otro lado me siento muy contento de haber
participado, pues lo aprendido y el material
complementario, me ha ayudado bastante en los
cursos que estoy actualmente llevando. Me siento
muy agradecido y cómodo en este ambiente, y
agradezco a los muchachos del laboratorio por
permitirme llevar este curso con ellos y brindarme
su conocimiento y su confianza.”
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Integrantes Demuestran lo Aprendido en
Importantes Laboratorios
El laboratorio de Microbiología viene esforzándose
por ampliar las barreras del conocimiento. Es así que
dos más de nuestros integrantes han obtenido la
oportunidad de realizar prácticas en laboratorios de
prestigio a nivel nacional e internacional.
Uno de ellos es Marlon Morales, quien terminó
exitosamente su ciclo de prácticas en el Laboratorio
Mixto Internacional (LMI) del Institut de Recherche
pour le développement (IRD), un instituto de
investigación francés que se encuentra asociado a la
Universidad Peruana Cayetano Heredia que viene
dedicándose a la investigación del aislamiento y
fraccionamiento de productos naturales de planta
nativas del Perú con el fin de probar la capacidad de
estas contra bacterias, enfermedades como
Leishmania y Malaria, y hasta contra el mismo
cáncer. Marlon expresó que su formación en el
laboratorio de Microbiología le sirvió de base, pues
le permitió aportar con ideas claras sobre técnicas
empleadas en pruebas de sensibilidad bacteriana y el
mecanismo de acción de los antibióticos conocidos,
además de formarse con un concepto de
interdisciplinariedad en la ciencia, ya que el LMI
trabaja en conjunto con químicos y fármaceúticos en
busca de nuevas opciones para generar antibióticos.
Por su parte, Santiago Justo, integrante veterano del
Laboratorio de Microbiología, ha conseguido la
oportunidad de practicar en el Instituto de Química
de la Universidad de Sao Paulo, en el área de
Bioquímica. Durante seis meses, Santiago podrá
acompañar al equipo de investigación que se
encuentra liderado por el Dr. Shaker Chuck Farah,
además tendrá la oportunidad de afianzar sus
conocimientos en técnicas moleculares como
clonación, secuenciamiento de ADN, expresión y
purificación de proteínas recombinantes; y técnicas
espectroscópicas como cristalografías, dicroísmo
circular y microscopias. Santiago opina que estar
encargado del laboratorio de Microbiologia, le ha
dado la capacidad de desenvolverse de manera
activa y constante en el área y en las investigaciones
científicas
De esta manera, el Laboratorio de Microbiología
abre la puerta a sus integrantes en diferentes
instituciones de prestigio a nivel nacional e
internacional.
Santiago Justo
exponiendo en
Auditorio
Biotempo
Marlon Morales
trabajando con
extractos de
Pseudomonas
aeruginosa
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Actividades
Visita de Estudios a Petramás:
Empresa 100% Peruana
El día 14 de Julio del 2014, los integrantes del
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Biológicas realizamos una visita a la
primera empresa 100% peruana, productora de
energía eléctrica a partir de residuos. La visita fue al
Relleno Sanitario Huaycoloro, siendo esta una de
las tres plantas procesadoras de residuos sólidos de
la empresa Petramás ubicada en el distrito de San
Antonio, provincia de Huarochirí. Durante el
recorrido se observó grandes extensiones de terreno,
las cuales están destinadas a diferentes procesos en
el tratamiento de residuos, ya sea residuos sólidos
orgánicos hasta residuos de alta peligrosidad. La
planta trabaja con el modelo de Desarrollo Limpio
de Residuos que consiste en la captura y combustión
del biogás generado en el relleno, la captura del gas
se dan en grandes pozos que están conectados a un
gaseoducto que llevan el biogás a la Central
Térmica, la cual es una moderna estación
automatizada de succión y quemado del gas
conectada a una moderna central generadora de
electricidad que finalmente se interconecta a redes
que abastecerán de energía eléctrica a diferentes
lugares de Lima.
La gran importancia que tiene esta planta
generadora de energía eléctrica a partir de desechos,
es que reduce la cantidad de emisiones de gases
contaminantes al medio ambiente. Petramás
gestiona uno de los mecanismos más limpios en el
tratamiento de residuos sólidos contribuyendo a
mitigar los efectos que el calentamiento global causa
al Perú y a todo el mundo.
Alumnos en Planta procesadora de Petramás
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Divulgación
Por Claudia Monge.
Virus contra Bacterias
En 1917 el microbiólogo Félix d’Herelle descubrió
que existían virus que eran capaces de parasitar
bacterias a los que llamo “bacteriófagos”. Los
siguientes años realizo los primeros estudios de
empleo de fagos para tratar la disentería. No obstante
recién en 1921 se estandarizaron tratamientos por
Richard Bruyboghe, al usar fagos para tratar
infecciones de estafilococos en la piel. Durante esa
época los bacteriófagos o también llamados fagos
fueron comercializados
para combatir diversas
infecciones. Especialmente durante la primera guerra
mundial, donde la fagoterapia fue utilizada para
combatir la disentería.
Con el paso de los años debido a la aparición de los
antibióticos las investigaciones en tratamientos de
fagoterapia fueron dejadas de lado. Sin embargo, la
aparición de cepas bacterianas resistentes a un elevado
número de antibióticos obligaron a los científicos a
encontrar nuevas formas de combatir las bacterias.
La especificidad del ataque de los bacteriófagos
constituye por un lado una ventaja para la fagoterapia
frente a los antibióticos, ya que los fagos atacan
directamente a una determinada cepa de bacterias,
mientras que los antibióticos arrasan con todas las
bacterias: las patógenas
que causan alguna
infección pero también con las beneficiosas como
las de la flora bacteriana natural del cuerpo.
Además dicha especificidad de los fagos es a su
vez una desventaja frente a los antibióticos puesto
que para combatir una infección de bacterias se
necesita conocer la cepa específica mientras que
con los antibióticos no es necesario este
conocimiento por su amplio rango de ataque contra
bacterias.
Otra ventaja frente a los antibióticos es la
capacidad de los bacteriófagos de tener mayor
alcance en los tejidos (puede incluso atravesar la
barrera hematocefalica, a la cual los antibióticos
no tienen alcance)
Por último una gran desventaja de la fagoterapia es
que algunos fagos pueden ser portadores de genes
de resistencia a antibióticos o de genes que
codifican toxinas y por lo tanto, pueden introducir
estos
genes a las bacterias otorgándoles
características no deseadas.
El laboratorio de microbiología está en proceso de
estandarización de metodologías para el
aislamiento de
bacteriófagos con miras a
posteriores investigaciones en fagoterapia.
Figura 1. Representación gráfica de
posicionamiento de un fago sobre la
superficie bacteriana
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Divulgación
Por Miguel Morales
Proteínas Recombinantes
Durante el siglo xx se lograron importantes avances,
uno de ellos fue determinar la estructura de doble
hélice del ADN. Esto les valió a Watson J y Crick F
el premio nobel en 1962, luego permitió conocer
como el ADN se transmite de una generación a otra.
Además se reconoció que un organismo desde el
más simple al más complejo tenía el mismo código
génetico. Esto quiere decir que el ADN puede ser
interpretado y traducido por cualquier otro
organismo del planeta. También se descubrió que
esta información se traduce a proteínas, moléculas
imprescindibles para todo organismo. Como dijo el
químico holandés Mulder: “sin proteínas no hay
vida posible en nuestro planeta”
las bases complementarias (en este caso el gen de
interés) y por último se ligaran con ayuda de la
enzima, ADN ligasa, en el vector, obteniendo ADN
recombinante.
Para la producción de proteínas recombinantes se
siembra
bacterias
conteniendo
el
ADN
recombinante, luego se separa la proteína
recombinante de las otras proteínas bacterianas en
un proceso de purificación (normalmente
cromatografías), en algunos casos es necesario tratar
a la proteína para conseguir una forma estable que
pueda cumplir su función de manera óptima.
La bacteria más utilizada para esto es la Escherichia
coli, por su fácil manejo, elevado rendimiento y
En el año 1975 Nathans D y Smith H descubrieron porque se reproducen rápidamente duplicando su
un tipo de enzimas (proteínas que aceleran número cada 20 minutos, obteniendo así varias
reacciones químicas) de virus y bacterias, las cuales copias del gen de interés insertado en el vector.
actualmente son de gran utilidad para el desarrollo
de las proteínas recombinantes, dando origen a la En el laboratorio de microbiología se viene
trabajando en el diseño y construcción de plásmidos,
ingeniería genética.
con el objetivo de producir proteínas de interés
Una proteína recombinante se genera al colocar un biotecnológico.
fragmento de ADN en un organismo distinto al
original, ese fragmento se denomina ADN
recombinante y las proteínas producidas a partir de
ese ADN: proteínas recombinantes.
De manera básica la metodología de producción de
proteínas recombinantes es la siguiente: primero se
aísla el ARNm que codifica la proteína de interés,
por acción de las transcriptasas inversas que
sintetizan ADN a partir de ARN (normalmente la
transferencia de información, es de ADN a ARN y
luego, a una proteína), el ADN obtenido se inserta
en un vector (transporte del gen de interés)
“cortado” por unas enzimas de restricción
denominadas endonucleasas (“tijeras moleculares”,
cortan los enlaces fosfato de la cadena de ADN sin
dañar la secuencia de nucleótidos); así quedaran
bases sin aparear que estarán disponibles para
aparearse con el fragmento de ADN que contenga
Figura 1. Metodología general de generación de proteínas
recombinantes.
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
Actividad antimicrobiana del extracto
acetona-agua de Macrocystis pyrifera (C.
Agardh 1820) en bacterias de importancia
clínica
Marlon Morales, Paola Nunja, Lina Burga, Santiago Justo, José Ávila, Alcides Guerra
Laboratorio de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma.
Laboratorio de Biología Marina y Continental, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo
Palma.
INFORMACIÓN DEL
ARTÍCULO
Palabras claves:
Macrocystis pyrifera, Discos
de Difusión. Gentamicina-
R E S U M E N
Se evaluó la actividad antibacteriana del extracto acetona-aguade
Macrocystis pyrifera. Se seleccionaron cuatro cepas de importancia clínica:
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y
Salmonella enterica del Laboratorio de Microbiología. Los extractos fueron
obtenidos de los filoides, esporófilos y del alga entera de una muestra seca
de la especie; y, a su vez, de una muestra fresca. La prueba de sensibilidad
se realizó mediante discos de difusión cargados con 30 µl de cada extracto;
se utilizaron discos con 10 mg de Gentamicina como control. Ningún
extracto presentó actividad antibacteriana en ninguna de las cepas
evaluadas; por otro lado, todas las cepas se mostraron sensibles ante la
acción de la Gentamicina. Se concluye que Macrocystis pyrifera no posee
una actividad antimicrobiana ante las cepas de importancia clínica
evaluadas.
1. Introducción
Las bacterias se han adaptado a un sinfín de hábitats
con diferentes mecanismos de sobrevivencia.
Actualmente la resistencia bacteriana a antibióticos
es un problema de gran importancia en el área
clínica. A raíz de este fenómeno es que cada cierto
tiempo se necesita sintetizar nuevos antibióticos para
combatir a estos microorganismos.
Las algas marinas son consideradas una parte
importante en los ambientes acuáticos, ya que
cumplen un nicho ecológico fundamental
equilibrando los niveles de oxígeno en el agua, por
medio de fotosíntesis; participando en las redes
tróficas; y produciendo metabolitos secundarios que
poseen diferentes propiedades, entre ellas, la
actividad antimicrobiana secundarios que poseen
diferentes propiedades, entre ellas, la actividad
antimicrobiana
Macrocystis pyrifera es una
macroalga de importancia económica a nivel
mundial. Pertenece a la división de las Phaeophytas,
conocidas como algas pardas, las cuales son
conocidas por producir sustancias como diterpenos,
florotaninos, fucoxantinas, acetogeninas, entre otros
metabolitos. De estos, los florotaninos son los que
han recibido mayor atención en los últimos 5 años
por las diversas propiedades de interés biomédico
que poseen. No obstante, los estudios relacionados a
la actividad antibacteriana de extractos de algas
pardas no abundan en la literatura científica, y
menos aún en Macrocystis pyrifera.
Partiendo del concepto que ciertas algas producen
sustancias bioactivas que impiden el crecimiento de
organismos patógenos en su hábitat natural resulta
interesante el uso de metabolitos obtenidos de dichos
organismos como antibióticos alternativos. En este
sentido, el presente trabajo busca evaluar la
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
actividad antibacteriana de dos extractos obtenidos
de diferentes partes anatómicas de Macrocystis
pyrifiera en bacterias patógenas de importancia
clínica
2. Materiales y Métodos
Se colectaron ejemplares juveniles flotantes de
Macrocystis pyrifera (DMR<20 cm) de la bahía de
Pucusana (12º28’38”LS 76º47’53”LO) en los meses
de enero y julio del 2014. Los ejemplares fueron
transportados en bolsas negras sin agua de mar al
Laboratorio de Biología Marina y Continental de la
Universidad Ricardo Palma, donde se limpiaron de
epífitos y sales con agua de caño. Previo a la
extracción, las muestras (filoides, esporófilos y toda
el alga) se secaron en una estufa a 60°C hasta
obtener un peso constante, 1g se maceró en
oscuridad por 1 hora en 10 ml de acetona: agua
(7:3) a temperatura ambiente con agitación cada 15
minutos. Se realizó un tratamiento más utilizando
10 g de alga fresca siguiendo el procedimiento antes
mencionado. El extracto se filtró en papel filtro
(Rundfilter 125 mm), luego se evaporó el solvente
en estufa, se resuspendió en agua destilada y,
finalmente, se filtró a 0.22 µm (Merck Millipore).
Para relacionar la actividad antibacteriana con el
contenido de polifenoles de los extractos, estos se
cuantificaron usando el método de Folin-Ciocalteu
usando como estándar floroglucinol. El contenido
de fenoles totales (CFT) fueron expresados en mg
equivalentes de floroglucinol/100 g de alga seca
(mg PGE/100 g).
La actividad antimicrobiana se evaluó empleando la
técnica del antibiograma por el método de discos de
difusión en agar (INS, 2002). Se usaron discos de
papel de filtro Whatman N° 42 y se cargaron
asépticamente con 30 µl del extracto algal. Se
cargaron discos con 10 mg de Gentamicina que se
usó como control y se dejó en absorción durante 2-3
horas.
Se usaron 4 cepas bacterianas aisladas de diferentes
hospitales de Lima: Staphylococcus aureus,
Escherichia
coli,
Salmonella
enterica
y
Pseudomonas aeruginosa. Cada cepa fue reactivada
en Caldo CASO; posteriormente, se procedió con la
preparación del estándar para el inóculo. El inóculo
se ajustó hasta una turbidez de 0.08 OD a 0.1 OD en
625 nm, usando cubetas esterilizadas con radiación
U.V. Luego del ajuste del estándar las cepas fueron
sembradas en placas con Agar Mueller-Hinton e
incubadas a 37°C por 24 horas.
Los halos de inhibición obtenidos fueron medidos
con vernier. La actividad antibacteriana se clasificó
como Resistente (R), Sensible (S) e Intermedia (I)
(Tabla 1). Este procedimiento se realizó con tres
repeticiones para cada uno de los extractos.
Tabla 1. Clasificación de la actividad antibacteriana
con Gentaminica.
Clasificación
Diámetro del halo de
inhibición formado por
Control
Resistente (R)
12mm ≥ DHI
Intermedia (I)
12mm ≤ DHI < 14mm
Sensible (S)
DHI ≥ 15mm
*d: diámetro menor del halo de inhibición. D: diámetro mayor
del halo de inhibicón. DHI: diámetro de inhibición de la
sustancia evaluar.
3. Resultados
El extracto realizado a partir de toda el alga fresca
(AF) tuvo el mayor CTF (contenido total de
fenoles), lo cual fue estadísticamente mayor en
comparación al resto de extractos (Tabla 2).
De los extractos evaluados, ninguno presentó una
actividad antimicrobiana. El control presentó un
diámetro de inhibición esperado lo que permite
validar la prueba, además según dicho diámetro, las
cepas fueron clasificadas como sensibles a
gentamicina (Tabla 3).
4. Discusión
La actividad antibacteriana de distintas algas
pertenecientes al grupo de las Phaeophytas se ha
evaluado constantemente en diferentes laboratorios
alrededor del mundo. Las sustancias bioactivas de
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16
Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
Tabla 2. Contenido Total de Fenoles (CTF) de los
diferentes extractos evaluados.
A: Extracto de alga entera seca. E: Extracto de los esporófilos
de una muestra seca. F: Extracto de Filoides de una muestra
seca. AF: Extracto de una alga fresca. Las letras indican
diferencias altamente significativas (p<0.01).
Tabla 3. Promedio del diámetro de los halos de
inhibición formados en el ensayo con los extractos
acetona-agua de Macrocystis pyrifera
*C: Control (Gentamicina). A: Extracto de alga entera seca.
E: Extracto de los esporófilos de una muestra seca. F:
Extracto de Filoides de una muestra seca. AF: Extracto de una
alga fresca.
estas algas les permiten defenderse en su medio
natural, contra organismos microbianos y epífitos;
entre estas sustancias se encuentran los florotaninos,
los cuales son los responsables de la alta actividad
antibacteriana de varias algas pardas, tal como lo
reportó Jeong Ha-Lee (2014) en su trabajo con
Eisenia byciclis. La mayoría de algas pardas a las
que se les atribuye actividad antibacteriana lo
realizan mediante los florotaninos. En nuestro
trabajo se usó Macrocystis pyrifera, la cual posee
aproximadamente 34,4 mg/g de taninos en épocas de
verano y 0.547 mg/g en épocas de invierno del total
de polifenoles que existen en el alga, lo cual influye
en su capacidad antibacteriana (Castro-Gonzáles
M.1993).
Por otro lado, la acción de los solventes en los
extractos de algas también influye de alguna manera
en los resultados que se obtienen. Es así que la
extracción acuosa de algas como Sargassum
wigthiiy Padina tetrastromatica presentaron
actividad antimicrobiana ante cepas patógenas tales
como Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa y en cepas patógenas de
peces como Vibrio fischeri, Vibrio alginolithycus.
(Johnsi G. 2011).
El método por discos de difusión es uno de los más
usuales cuando se realiza un antibiograma y se
encuentra actualmente estandarizado por el Instituto
Nacional de Salud del Perú (2002), en la cual se
recomienda el uso de antibióticos obligatorios según
las cepas que se evalúan. Entre estos, la gentamicina,
es uno de los antibióticos de uso oftálmico que se
usan para todas las cepas que se evaluaron en este
trabajo. Además se ha usado esta sustancia como
control en cultivos de Escherichia coli a una
concentración de 2 mg/ml, tal como se realiza en
nuestro trabajo (Cháves Torres L. 2008).
Los discos de difusión fueron cargados con 30 µl del
extracto algal y colocados en el medio de cultivo. En
otros estudios, se usaron 20 µl de extracto acuoso en
los discos, los cuales presentaron un resultado
positivo de actividad antimicrobiana ante cepas
clínicas (Johnsi G. 2011). Sin embargo, también
existe el método de pocillos de 6 mm en el medio de
cultivo, los cuales fueron cargados con 50 µl del
extracto algal, permitiendo también la obtención de
resultados positivos (Magallanes C. 2003). El uso de
ambos métodos permite la difusión de los extractos.
Finalmente, varias especies emparentadas con
Macrocystis pyrifera presentan una actividad
antibacteriana tratadas con diferentes métodos de
extracción y de antibiograma. No obstante, nuestra
especie no presentó ningún resultado positivo
durante la investigación, tal como un trabajo
realizado en nuestro país donde trabajaron con
extractos etanólicos de M. pyrifera evaluado
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
mediante el método de pocillos, sin encontrar
actividad antibacteriana en cepas clínicas y no
clínicas. Estos resultados los atribuyeron a que
posiblemente existe una concentración mínima de
sustancias bioactivas en estas algas las cuales son
solubilizadas en el ambiente acuático (Magallanes
C. 2003).
antimicrobiana por el método de discos de difusión.
Serie de Normas 30: 30 – 36.
Jeong L, Sung E, Eun L, Yeoun J, Hyo K, Mi J,
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5. Conclusiones
El extracto acetona-agua de los filoides, esporófilos,
y del alga entera seca y fresca de Macrocystis Jhonsi G, Lipton A, Aishwarya M, Sakira A,
pyrifera no posee actividad antibacteriana ante las Udayakumar A. 2011. Antibacterial activity of
cepas de importancia clínica evaluadas.
aqueous extract from selected macroalgae of
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6. Referencias Bibliográficas
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Methicillin-resistant Effect between Dieckol from Ecklonia stolonifera y
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Bioprocesses Engineering 13: 758-764.
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Laboratorio de Microbiología
Artículo de Investigación
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Volumen 1, n°2
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
Determinación de Géneros Bacterianos en
el Mar de la Playa Cantolao – La Punta –
Callao
Justo S, Churasacari T, Saldaña C, Cajachagua C, Pabón L, Gónzales M, Santiago D, Guerra A.
Laboratorio de Microbiología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.
INFORMACIÓN DEL
ARTÍCULO:
Justo S, Churasacari T,
Saldaña C, Cajachagua C,
Pabón L, Gonzáles M,
Santiago D, Guerra A.
Determinación de Géneros
Bacterianos en el Mar de la
Playa –La
Punta-Callao.
Boletín Científico. 2014.
1(2): 22-25
Palabras Claves: Bacterias
Marinas, Esquemas de Das
S et al (2007) y Oliver J
(1982), Pruebas bioquímicas
R E S U M E N
Los océanos albergan una gran diversidad biológica, hasta el momento
relativamente poco explorada por el humano. Con el objetivo de ampliar los
conocimientos en la biodiversidad bacteriana del mar peruano, se realizaron
muestreos aleatorios en el mar de Playa Cantolao-La Punta-Callao
(12º04´06´´ S 77º10´10´´O), en total se tomaron 5 muestras en frascos
estériles a una profundidad de 3m utilizando una vara de madera
acondicionada a una jeringa de 20ml. Para el aislamiento se utilizó el método
de dispersión en placa en Agar Marino, se trabajó con diluciones sucesivas
para obtener colonias aisladas. Para la identificación se realizaron pruebas
bioquímicas que incluían determinación de citocromo oxidasa, motilidad,
producción de H2S, producción de indol, metabolismo de glucosa, producción
de pigmento, luminiscencia, catalasa y desarrollo en anaerobiosis; además de
las coloraciones Gram y de espora. Los esquemas propuestos por Das S et al.
(2007), Oliver J (1982) y el Bergey´s Manual 2da y 7ma edición fueron
utilizados para la determinación de géneros. Se logró el aislamiento de 20
cepas bacterianas. Los géneros encontrados fueron: Moraxella, Bacillus,
Acinetobacter, Vibrio, Aeromonas, Photobacterium, Alteromonas,
Alcaligenes, Streptococcus y Chromobacterium.
1. Introducción
Los océanos comprenden aproximadamente el 70%
de la superficie terrestre; la diversidad de sus
ambientes permite que se desarrolle gran cantidad de
formas de vida; además tienen importancia como
regulador de la temperatura global y como sumidero
de carbono
De esta primera idea se desprenden dos principales:
la diversidad de especies y la importancia ecológica
de los ecosistemas marinos.
En primer lugar, la diversidad biológica marina
comprende todo tipo de organismos que habiten en
los mares, un grupo importante con poca
consideración en nuestro país son las bacterias;
estudios recientes en otras partes del mundo han
hallado bacterias marinas con propiedades que van
desde la producción de pigmentos utilizables (Yada
S, Wang Y, Zou Y, Nagasaki K, Hosokawa K,
Osaka I, Arakawa R, Enomoto K. 2007) hasta
bacterias que purifican nanopartículas de oro a partir
de otros compuestos (Shama N, Pinnaka A, Raje M,
Fnu A, Sharkar M, Roy A. 2012), además de
bacterias
ampliamente
estudiadas
como
Marinobacter hydrocarbonoclasticus capaz de
producir enzimas que degradan hidrocarburos
aromáticos, Vibrio fischeri que tiene en su genoma
el operon LUX (biolumniscencia) o Pseudomonas
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
pseudoalcaligenes productora de enzima que
degrada el cianuro.
En segundo lugar, el bacterioplancton tiene un papel
significativo como principal contribuyente en los
procesos biogeoquímicos de los ambientes marinos,
y representa un componente fundamental en las
redes alimentarias . En los últimos años, el concepto
de red trófica clásica ha cambiado a un modelo
alternativo más complejo denominado "bucle
microbiano", basado en la capacidad de las bacterias
heterótrofas de reciclar la materia orgánica disuelta y
de hacerla circular mediante diversas interacciones
ecológicas a través de los otros componentes del
plancton y, en forma indirecta, también a través de
los niveles tróficos superiores del ecosistema marino
(Schauer M, Balagué V, Pedros-Alio C, Massana R
2011).
En los océanos, los microorganismos son los
responsables del 98% de la producción primaria e
intervienen en todos los ciclos de la materia, con un
papel fundamental, a su vez, en el destino de los
contaminantes en zonas altamente antropizadas.
Además los organismos heterótrofos como las
bacterias consumen entre el 18% y 77% de carbono
orgánico disuelto en el mar (Azam F, Fenchel T,
Field J, Gray J, Meyer LA, Thingstad F. 1983).
transportadas al Laboratorio Microbiología de la
Universidad Ricardo Palma en un cooler refrigerado
a 4ºC.
Aislamiento de bacterias:
Se utilizó el método de dispersión en placa con
medio marino (fig. 1).Para esto se tomó 1ml de la
muestra y se colocó en un tubo con 9ml de agua de
mar esterilizada y filtrada obteniendo la dilución 101
, se repitió este procedimiento obteniendo 3
diluciones (hasta 10-3). Las placas fueron incubadas
a Tº ambiente (20-25°C) durante 48h. Al cabo de
este tiempo se seleccionaron las colonias aisladas y
fueron reaisladas en tubos con Agar Marino. Estas
fueron incubadas nuevamente a Tº ambiente hasta
observar crecimiento visible y luego fueron
almacenadas a 4ºC hasta el momento de la
caracterización bioquímica.
Por lo tanto el estudio de las bacterias en los
ambientes marinos de nuestro país nos permitirá
aumentar nuestros conocimientos en la ecología y
buscar nuevos recursos aprovechables. El presente Figura 1 Aislamiento por diluciones sucesivas en medio
estudio tiene como objetivo identificar los géneros Marino.
bacterianos presentes en el mar de Playa CantolaoCallao como base para futuros estudios ecológicos y
Determinación Bioquímica:
biotecnológicos.
Se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas:
2. Materiales y Métodos
coloración gram, citocromo oxidasa, motilidad,
Recolección de muestras: Se realizaron muestreos producción de H2S, producción de indol,
aleatorios en el mar de la playa Cantolao-La Punta- metabolismo de glucosa, producción de pigmento,
Callao (12º04´06´´ S 77º10´10´´O). Se tomaron 5 luminiscencia, catalasa, desarrollo en anaerobiosis,
muestras, a una profundidad de aproximadamente 3 coloración de esporas. (fig.2)
metros utilizando una vara de madera acondicionada Los esquemas propuestos por Das S et al. (2007),
con jeringas estériles de 20ml. Además se colectaron Oliver J (1982) y el Bergey´s Manual 2da y 7ma
3 litros de agua de mar para la preparación de los edición fueron utilizados para la determinación de
medios de cultivo. Las muestras de agua fueron géneros
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
A
B
E
D
C
F
Figura 2: A; Prueba de catalasa, B; Citocromo oxidasa,
C; SIM, D; Agar P (pigmentación), E; Agar Marino
(Anaerobiosis), F; HughLeifson
(metabolismo de
glucosa).
3. Resultados
En total se obtuvieron 20 cepas, de las cuales 17
lograron ser identificadas hasta la categoría de
género; 3 no tuvieron crecimiento suficiente para su
identificación.
Se encontraron 10 géneros. De los cuales, 8 fueron
bacilos gramnegativos y sólo 2 grampositivos, un
bacilo y un coco (tabla 1).
4. Discusiones
Pellón et al. 2001 en su trabajó con muestras de 2
moluscos bivalvos cultivados en Pucusana y el
Callao: Argopecten purpuratus “concha de abanico”
y Crassostrea gigas “ostra” logran identificar 6
géneros bacterianos: Vibrio (40%), Aeromonas
(15%), Flavobacterium (10%), Pseudomonas (5%),
Moraxella (5%), Flexibacter (5%) y no identificados
(20%), León et al. 2010 por su parte en su trabajó
con muestras de 5 invertebrados intermareales
recolectados en la Bahía de Ancón: Phymactis
clematis “anémona”, Tetrapygus niger “erizo de
mar”, Heliaster helianthus “estrella de mar”, peje
sapo y Tegula atra “caracol” logra identificar 4
géneros: Vibrio (50%), Pseudomonas (10%),
Flavobacterium (20%) y Actinomycete (20%), el
presente trabajo reporta la presencia en el ambiente
marino de 10 géneros bacterianos entre ellos
Aeromonas, Moraxella y Vibrio sin embargo no se
encontró cepas de Flavobacterium, Flexibacter ni
Actynomicetes lo que sugiere que estos géneros
podrián estar más relacionados a organismos que
géneros como Bacillus, Photobacterium y
Alteromonas que no fueron encontrados en los
trabajos mencionados anteriormente pero sí en este.
Tabla 1. Resultados de las Pruebas Bioquímicas realizadas a las cepas aisladas
CAT=Catalasa; OXID=Oxidación; MOT=Motilidad; PIG= Pigmentación; ANAEROB=Anaerobiosis; H.F= HughLeifson;
Ab=Aerobio, Cer=Anaerobio; NP=. No hay presencia de espora; N= No se realizó la prueba.
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
Pellón et al. 2001 y León et al. 2010 determinan
que la cepa más abundante es la correspondiente a
Vibrio sin embargo en este trabajo la cepa más
abundante fue la de Moraxella, esto puede ser a
causa de que hay mayor asociación de Vibrio con
invertebrados que el género Moraxella. Además en
un estudio realizado en Argentina, en la zona
costanera de Comodoro se reporta en muestras de
sedimentos y agua marina 6 de los géneros hallados
en este trabajo (Acinetobacter, Aeromonas, Vibrio,
Moraxella,
Bacillus,
Photobacterium),
adicionalmente determinan que la mayor cantidad
de cepas halladas fueron grampositivas a diferencia
del presente trabajo que encuentra que el 80% de
los géneros y el 90% de las cepas aisladas fueron
gramnegativas, esto sugiere y afirma que las
grampositivas están mayormente asociados a los
suelos y que las gramnegativas más bien habitan
asociadas a la columna de agua.
5. Conclusiones
Se determinó la presencia de 10 géneros
bacterianos, estos fueron: Moraxella (23,5%),
Bacillus (5,88%), Acinetobacter (5,88%), Vibrio
(11,76%), Aeromonas (11,76%), Photobacterium
(5,88%), Alteromonas (11,76%), Alcaligenes
(5,88%),
Streptococcus
(5,88%)
y
Chromobacterium (11,76%).
6. Referencias Bilbiográficas
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Página
23
Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
Efecto antibiótico de Piocianina de
Pseudomonas aureginosa sobre
Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Santiago Justo, Tania Churasacari, Carlos Elías.
Laboratorio de Microbiología. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma
INFORMACIÓN DEL
ARTÍCULO:
Justo S, Churasacari T,
Elias C. Efecto Antibiótico
de
Piocianina
de
Pseudomonas aeruginosa
sobre Escherichia coli y
Staphylococcus
aureus.
Boletín Científico. 2014.
1(2): 26-29.
Palabras
Claves:
Pseudomonas aeruginosa,
Piocianina, antibiótico
R E S U M E N
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa, patógeno oportunista
de importancia clínica pues causa gran cantidad de enfermedades
intrahospitalarias. Además este es un organismo ubicuo debido
principalmente a su alta capacidad para metabolizar variedad de sustratos.
Esta bacteria tiene la capacidad de producir varios pigmentos extracelulares,
uno de ellos, la piocianina es una exotoxina perteneciente al grupo de las
fenazinas que cuenta con la capacidad de inhibir el desarrollo de organismos
competidores. Se utilizaron 8 cepas de Pseudomonas aeruginosa, 2
ambientales, 5 nosocomiales y 1 cepa de referencia (ATCC 27853). Para
estimular la producción de piocianina las cepas fueron incubadas por 7 días a
37ºC en caldo P. La extracción de Piocianina se realizó por el método
propuesto por Knight (1978) que constó de una extracción clorofórmica,
seguida de una extracción con HCl. No se observó diferencias en el efecto de
la piocianina de cepas nosocomiales y ambientales frente a Staphylococcus
aureus, sin embargo sólo la piocianina de la cepa de muestra respiratorio
mostró un leve efecto sobre Escherichia coli.
1. Introducción
Psedudomonas sp. es un género cosmopolita, este
grupo es capaz de utilizar y metabolizar un amplio
rango de sustratos, ya sean orgánicos o inorgánicos,
por ello puede vivir bajo muy diversas condiciones,
poseen también gran plasticidad génica (Ruiz L,
2007); encontrándose en suelos y aguas, tanto
continentales como marinas (Baumann L, Baumann
P, Mandel M, Allen R; 1971), Pseudomonas
aureginosa es el patógeno más importante de este
género, debido a que es un patógeno oportunista
(Francis K y Brown P; 2012) siendo el más
importante en humanos debido al número, tipo de
infecciones y mortalidad asociadas (Ruiz L, 2007),
así mismo es también conocido por su capacidad de
sintetizar diferentes pigmentos hidrosolubles
extracelulares entre los que se destaca un pigmento
verde fluorescente, pioverdina (Merino L, 2007) que
actúa como sideróforo en condiciones mínimas de
Fe (III) y actúan como inhibidores del crecimiento
de microorganismos patógenos en plantas (Bello D,
Santo Tomás J, Díaz M, Bell A; 2006) y un
pigmento azul, piocianina (Young G, 1947),
perteneciente a las fenazinas, soluble en cloroformo.
Se ha demostrado que este pigmento posee actividad
antibacteriana (Merino L, 2007), y que su
producción es activada principalmente bajo efecto
de quorum sensing (Williams P, 2009).
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
El objetivo del presente trabajo es determinar la
actividad antibacteriana del pigmento piocianina
sobre una cepa de Escherichia coli y una cepa de
Staphylococcus aureus.
2. Materiales y Métodos
Obtención de Cepas de Pseudomonas
Se trabajó con 8 cepas de Pseudomonas aeruginosa
(Tabla 1); 5 fueron aislamientos nosocomiales, 1
aislada a partir de eyecciones de paloma, 1 de un
manantial ubicado en la costa verde, además de la
cepa ATCC 27853 de Pseudomonas aeruginosa.
Para la confirmación de las cepas se utilizaron
pruebas bioquímicas que consistían en metabolismo
de glucosa, degradación de citrato, motilidad,
producción de Indol y producción de pigmentos.
Obtención de Pigmentos
Las ocho cepas aisladas fueron sembradas en 5ml de
caldo CASO por 18 horas a 37 º C, luego se ajustó la
turbidez del caldo hasta una OD de entre 0.10 y 0.08
a 625nm; por último se tomó una alícuota de 1ml y
se sembró en 50 ml de caldo P lo cuales fueron
incubados por 7 días a 37ºC, agitándose
manualmente dos veces al día para favorecer la
oxigenación del medio.
Extracción de Piocianina
Transcurridos los 7 días se tomaron muestras de 10
ml de Caldo P, se centrifugaron a 3000 rpm por 10
minutos y se transfirió el sobrenadante a un tubo
limpio; se realizó una primera extracción con
cloroformo seguido de una extracción con HCl
0.2N. La fase ácida fue neutralizada con NaOH 0.2N
hasta observar el cambio de coloración. Una vez más
se realizó la extracción clorofórmica y a partir de
esta se cargaron discos de 6 mm de papel filtro
Whatman Nº 42 con 10ul del extracto.
Prueba de Sensibilidad
Para esta prueba se utilizó una cepa de Escherichia
coli ATCC 25922 y una cepa de Staphylococcus
aureus ATCC 25923. Se ajustó la turbidez del caldo
CASO, donde fueron previamente inoculadas, entre
0.10 y 0.08 de OD a 625nm. Cada extracto fue
probado por triplicado en placas con agar Muller
Hinton, como control positivo se utilizó discos de
gentamicina.
Análisis estadísticos
Se realizó la prueba de ANOVA para determinar
diferencias significativas entre los efectos
inhibitorios de los extractos de piocianina de las
diferentes cepas utilizadas.
3. Resultados
No se observó diferencias significativas entre los
halos de inhibición del extracto de piocianina frente
a la cepa de Staphylococcus aureus (Tabla 2).
Sólo la piocianina de la cepa aislada de muestra
respiratorio (Tabla 1) mostró un leve efecto
inhibitoria sobre Escherichia coli.
Tabla 1. Cepas de Pseudomonas aeruginosa
utilizadas.
Código
Origen
Descripción
A
A
B
A
C
N
D
N
Aislamiento de
eyecciones de
palomas
Manantial de la Costa
Verde en Playa La
Estrella
Aislamiento del
Hospital Grau
Heridas epiteliales
aislada en el HNGAI
E
N
Heridas epiteliales
aislada en el HNGAI
F
N
Heridas epiteliales
aislada en el HNGAI
G
N
Muestra respiratoria
aislada en el HNGAI
ATCC
27853
-----
Donación del aisladas
en el HNGAI
N= Nosocomial, A=Ambiental. HNGAI= Hospital Nacional
Guillermo Almenara Irigoyen
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25
Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Artículo de Investigación
Tabla 2. Mediciones de Halos de Inhibición de mayores concentraciones para inhibir el crecimiento
Piocianina
frente
a
Escherichia
coli
y de bacterias gramnegativas.
Esto se confirma con el trabajo de Knight et al.
Staphylococcus aureus
(1978) que utilizando el método de pocillos en agar,
Código
Escherichia
Staphylococcus
una metodología conocida por ser más directa que
los discos de difusión, reportan efecto inhibitorio de
coli
aureus
la piocianina sobre Proteus morganii sugiriendo que
15.79
A
altas concentraciones del pigmento no permiten el
16.02
B
desarrollo bacteriano.
18.00
C
Por último, de manera muy interesante ninguno de
.1513
D
los trabajos mencionados anteriormente reportaron
14.37
E
16.00
F
un efecto inhibitorio de la piocianina sobre cepas de
8.61
16,70
G
Pseudomonas sugiriendo la existencia de un
14.07
ATCC 27853
mecanismo que contrarreste la acción de la
21.30
21.30
Gentamicina
piocianina.
*Los resultados mostrados son la media de tres ensayos expresados
en mm.
4. Discusión
Stephen et al (1981) realizan un ensayo similar
con piocianina donde una cantidad de 2.5 ug por
disco resulta en un halo de inhibición de 17 mm
para Staphylococcus aureus. Un resultado similar
se evidencia en la cepa G la cual también mostró
halo de inhibición frente a Staphylococcus aureus
esto sugiere que las concentraciones obtenidas
pueden haber sido inferiores en los otros casos a
los 2.5ug por disco.
Baron y Rowe (1981) encuentran que la actividad
antibacteriana de Pseudomonasa eruginosa no se
manifiesta frente a cepas como Proteus vulgaris,
Enterobacter aerogenes otras Pseudomonas ni
frente a Escehrichia coli; sin embargo otros
autores como Young G (1947) y Nowroozi et al
(2012) han determinado que la Piocianina sí tiene
efecto contra Escherichia coli e incluso Nowroozi
et al (2011) menciona que las nanopartículas de
plata tienen un efecto sinérgico inhibitorio tanto
en Escherichia coli como en Staphylococcus
aureus. En este trabajo se utilizan discos cargados
con 2 ug, nuestro trabajo también reportó efecto
inhibitorio sobre E. coli, esto demuestra que al
parecer el efecto de antibacteriano de la piocinana
es dependiente de la concentración y se necesita
5. Conclusiones
La cepa de Staphylococcus auereus se mostró
sensible frente al extracto de piocianina de todas las
cepas obtenidas de Pseudomonas aureginosa, por el
contrario Escherichia coli se mostró sensible solo
frente al extracto de piocianina producido por la
muestra G, aislada de HNGAI.
Estudios bibliográficos no muestran efecto
inhibitorio de la Piocianina sobre Pseudomonas
aeruginosa lo que sugiere un mecanismo de
protección frente al efecto de este pigmento.
6. Referencias Bibliográficas
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Mini-Review
Aspectos generales de la crianza del Cuy y
su agente infeccioso: Salmonella
Justo, S.
Laboratorio de Microbiología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.
R E S U M E N
INFORMACIÓN DEL
ARTÍCULO:
Justo S. Aspectos Generales
de la Crianza del Cuy y Su
Agente
Infeccioso:
Salmonella.
Boletín
científico. 2014. 1(2): 3035.
Palabras
Claves:
Cuy,
Salmonella, Producción.
Actualmente la demanda de cuy para consumo, tanto al interior como al
exterior del país, viene en aumento. La distribución y crianza de esta especie
con fines de comercio está restringido a 4 países Sudamericanos: Ecuador,
Colombia, Bolivia y Perú; siendo Perú el país con la mayor población. Los
sistemas de crianza del cuy se clasifican según su finalidad y la cantidad de
individuos criados. Debido principalmente a deficiencias en la técnicas de
crianza por falta de investigación, la producción del cuy atraviesa graves
problemas por enfermedades infecciosas las cuales diezman a gran parte de la
población en los criaderos. La Salmonella se ha identificado como el agente
infeccioso bacteriano más importante por ocasionar altos índices de
mortalidad y morbilidad; los sistemas de control empleados actualmente no
han sido suficientes para atenuar este mal. A nivel mundial se han desarrollado
vacunas contra Salmonella pero estas están diseñadas para su principal uso en
aves de corral; los estudios existentes en vacunas contra Salmonella para
cuyes son escasos y muy pocos enfocados realmente a proteger al cuy de la
Salmonella. En conclusión, se necesita de mayor cantidad y rigurosa
investigación científica tanto en el agente infeccioso como en el cuy y los
sistemas de crianza para mejorar la producción de cuy en el país.
Introducción
Cavia porcellus denominado comúnmente como
cuy, cobayo, curi, conejillo de indias y en inglés
Guinea pig es un mamífero roedor originario de la
región andina, se ha estimado que su domesticación
en el Perú se inició hace 2500 a 3600 años por restos
de abundantes excretas de cuy encontrados en el
templo
del Cerro Sechín (Departamento de
Ancash); en el período de Paracas Cavernas entre
700 a 500 a.C se han encontrado indicios de
alimentación con carne de cuy en los pobladores,
además en el Período de Paracas Necrópolis casi
todas las casas tenían un espacio de crianza de cuyes
(500 a.C – 200 d.C.)(Moreno A 1989). El cuy ha
constituido desde esas épocas una importante fuente
proteica, se ha estimado que en Lima Metropolitana
se consume anualmente 0.1 kg de carne de cuy por
persona anualmente y en la Sierra del Perú 1.8 kg
(INEI 2009), alcanzando las 116500 toneladas
consumidas anualmente en todo el Perú (Chauca L
1995). Actualmente viene aumentando la demanda
del cuy para la exportación es así que en el año 2000
se exportaron solo 145,00Kg de carne de Cuy pero
para el año 2006 las cifras se habían incrementado
hasta 7762,73Kg con un valor total de 56794,66
dólares americanos siendo el principal país de
destino Estados Unidos (MINAG 2014).
Aunque la distribución del cuy no está restringida al
Perú, este presenta la mayor población de cuyes
alcanzando los 23 240 846 animales, estando el 92%
de la población en la sierra y solo el 6% en la costa
(MINAG 2003). Tanto en Perú como en Ecuador la
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28
Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Mini-Review
distribución del cuy es amplia, encontrándose casi
en la totalidad del territorio, a diferencia de otros
países como Colombia y Bolivia donde la
distribución
está
restringida
a
algunos
departamentos y por lo tanto presentan poblaciones
menores. (Chauca L 1997).
En la crianza del cuy se han reportado diversas
enfermedades infecciosas ocasionados por bacterias
como Bortedella bronchiseptica, Diplococcus
pneumoniae,
Yersinia
pseudotuberculosis,
Streptococcus
pyogenes,
Pasteurella
spp.,
Escherichia coli, Clostridium sp., Klebsiella
pneumoniae,
Diplococcus
pneumoniae,
Corynebacterium
pyogenes,
Shigella
sp.,
Producción del cuy según los sistemas de crianza
Tabla 1. Lugares de Crianza y Número de Cuyes
Criados según el Tipo de Sistema.
La producción del cuy se puede clasificar en tres
niveles de acuerdo al sistema de crianza (Chauca L
1997): el sistema familiar, el familiar-comercial y el
comercial. El sistema familiar se caracteriza por
desarrollarse fundamentalmente como sustento para
la alimentación de la familia, los cuyes son criados
por los miembros de la familia y los alimentan con
malezas, residuos de cosecha y residuos de cocina,
se crían entre 20 a 50 cuyes por lugar de crianza
(Zaldivar M et al. 1990); este sistema se encuentra
en departamentos como Cajamarca, Junín y Lima
(Perú), Nariño (Colombia), La Paz y Cochabamba
(Bolivia) y el 90% de la crianza en Ecuador (Chauca
L 1997, Caycedo 1981, Chauca L 1991, INIA 1999,
Moncayo R 2000). El sistema familiar-comercial
nace siempre de los sistemas familiares en áreas
rurales cercanas a la ciudad, donde el criador pueda
fácilmente comercializar su producto; los
productores invierten recursos monetarios para
infraestructura, tierra para la siembra de forrajes y
mano de obra para el manejo de la crianza (Chauca
L 1995), en este sistema se mantienen entre 50 y
1000 cuyes, y se encuentra en departamentos como
Cajamarca, Junín y Lima (INIA 1999). Por último el
sistema comercial se presenta mayormente en
empresas agropecuarias, se mantienen áreas de
cultivo para la siembra del forraje, se utiliza además
alimento balanceado; este sistema mantiene por lo
menos 1000 cuyes, Lima es el principal
departamento con este sistema, además de Cuzco y
Arequipa (Peña S 2007).
Salmonella en cuyes
Sistema de Lugares
Número de
Crianza
donde
se cuyes
encuentra
criados
Familiar
Cajamarca,
De 20 a 30
Junín, Lima
(Perú),
Nariño
(Colombia),
La
Paz,
Cochabamba
(Bolivia),
Ecuador.
Familiar
– Cajamarca,
De 50 a
Comercial
Lima, Junín, 1000
Ancash
(Perú)
Comercial
Cuzco,
Arequipa,
Lima (Perú)
De 1000 a
más
Streptococcus zooepidermicus, y especialmente el
género Salmonella (Morales S 2012, Correa R
2000).
Salmonella es un género de bacterias gramnegativas
perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, este
género está dividido en dos especies Salmonella
entérica
y Salmonella bongori, S. entérica
comprende más de 2500 serotipos que están
ordenados en 7 grupos: I, II, IIIa, IIIb, IV, VI y VII.
Existe una gran diversidad en este género.
Actualmente los serotipos de Salmonella pueden
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Laboratorio de Microbiología
Volumen 1, n°2
Mini-Review
infectar un amplio rango de hospederos, desde posteriores; aunque en muchos casos los animales
reptiles y aves hasta mamíferos incluyendo humanos mueren sin mostrar síntoma alguno (Layme 2010).
(Gamazo C e Irache J 2007)
En los casos crónicos se presenta un
Salmonella es el principal agente infeccioso en los adelgazamiento paulatino, pelaje deslucido y
cuyes, durante largo tiempo se ha observado una aumento del volumen abdominal (Evans A 2005).
gran susceptibilidad a la salmonelosis en los cuyes,
sin embargo aún son escasos los reportes con datos Control de Salmonella en cuyes
exactos que permitan tener una idea clara de la
Actualmente, la mayoría de criaderos realiza el
realidad de la salmonelosis en cuyes, algunos de
control de la Salmonelosis utilizando antibióticos
estos reportes son el de Leguía P 1993 que señala
como
Sulfatrimetoprim,
enrofloxacina,
que hasta el 95% de muertes de la morbilidad
estreptomicina,
amoxicilina,
cloranfenicol,
general es generada por este agente causal variando
fosfomicina. Matsuura A et al. en el 2010
los efectos según el estado de desarrollo del cuy
determinaron que de 40 cepas de Salmonella
(52.70% en adultos y 19.83% en lactantes), Morales
aisladas a partir de cuyes el 100% fueron sensibles
S et al 2007 quien menciona que Salmonella
los 4 primeros antibióticos mencionados, el 97,5% a
provoca brotes de mortalidad y abortos de hasta el
gentamicina y cloranfenicol, y el 92,5% a
65%, Matsuura A et al 2010 quién reporta en un
fosfomicina. Estos antibióticos son administrados
criadero de Ancash una prevalencia de 61.5% y
por vía oral a través del alimento balanceado.
Ramírez A 1972 una prevalencia de 65.5%.
Además como ya se comentó líneas arriba, las
Aunque no existe referencias exactas de cuál es el buenas prácticas de manejo como: el control de
serotipo causante de la Salmonelosis en los cuyes, se roedores y aves, el ingreso controlado del personal,
ha reportado mayormente presencia de S. enteritidis el aislamiento de cuyes enfermos, el control de
(Correa R 2000, Matsuura A et al 2010) y S. sanidad de los alimentos, la limpieza constante del
thiphymurium (Correa R 2000, Guamán M 2014), criadero, entre otros permitirán prevenir hasta cierto
además de S. typhi (Dima V et al 1989) y S. dublin punto el brote de enfermedades. Sin embargo se
(Wagner J y Manning P. 1976)
sigue requiriendo de métodos de prevención más
La principal vía de infección es la oral a través de efectivos que permitan desarrollar un sistema de
alimentos contaminados, esto ocasionado en gran crianza con menores índices de morbilidad y
medida por las malas prácticas de manejo, deficiente mortalidad.
nivel de bioseguridad que ocasionan presencia de Una forma bastante estudiada para el control de la
roedores y aves contaminados, ingreso no Salmonella son las vacunas, sin embargo la mayoría
controlado de personal, estrés en los cuyes (Figueroa de vacunas producidas actualmente están destinadas
I y Verdugo A 2005). Además se ha determinado a la industria de aves de corral (Desin T et al. 2013)
que las variaciones de temperatura y humedad y hasta la fecha son pocos los estudios realizados en
predisponen a la aparición de infecciones (Ramírez
cuyes, además resulta interesante recalcar que gran
A 1972).
parte de la información acerca de vacunas contra
La salmonelosis en cuyes se puede manifestar de salmonella probadas en cuyes se ha realizado con el
dos formas: crónica o aguda, siendo esta última la objetivo de utilizarlas en otros animales y no en el
que mayor mortalidad causa presentándose como un cuy (el cuy es utilizado como animal modelo). Esto,
cuadro septicémico agudo que genera muertes en 24 sin embargo no ha permitido que se desarrollen
a 48 horas, los signos más frecuentes son trabajos continuos enfocados a desarrollar una
decaimiento, postración, anorexia, adelgazamiento, vacuna ideal para cuyes, en cambio se han probado
pelos ásperos y erizados, y parálisis de los miembros
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30
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Volumen 1, n°2
Mini-Review
Tabla 2. Reportes de Vacunas Probadas en Cuyes.
Serovar
S. Abortusequi
S. Abortusequi
Comentario
htrA- mutante, permite 80-100% de
protección.
aroA-htrA- 100% de protección hasta
luego de 11 meses.
Vía de
Administración
Oral,
Intravaginal y
parental.
Oral,
intravaginal,
subcutánea.
S. Dublin
Cepa avirulenta HB 1/17, 46% de
protección con S. Dublin y 26% contra
S. Tyhphimurium.
--------------------
S. Typhi
Probado en cuyes recién nacidos, se
comprobó producción de anticuerpos.
Oral
S. Typhimurium
Cepa atenuada con 0.5% de formalina,
se comprobó producción de
anticuerpos.
Subcutánea
S. Typhimurium
Bacterina Cuadruple Inactivada, en
venta.
Intramuscular
vacunas contra cepas y serotipos de Salmonella de
poca importancia para la crianza de cuyes como S.
Typhi (Dima V et al. 1989), S. Dublin (Cameron C y
Fuls W. 1975, Smith W y Halls S. 1966), S.
Abortusequi (Singh B et al. 2005), aunque en
algunos casos llegando a una efectividad del 100%.
La información se resume en la tabla 2.
Referencia
Singh B et al.
2005.
Singh B. 2005.
Cameron C y
Fuls W. 1975.
Dima V et al.
1989.
Barakat A et al.
1984.
Laboratorios
Llaguno.
tomarse en caso de un brote y por sobretodo no
existen medidas preventivas bien definidas que nos
permitan evitar el desarrollo de la enfermedad. En
pocas palabras se requiere de rigurosa
investigación científica para poder tener la
posibilidad de mejorar la producción del cuy en el
país.
Conclusiones
Actualmente la demanda del cuy viene en aumento
tanto al interior del país como en el exterior, sin
embargo se atraviesan serios problemas y pérdidas
por causa de enfermedades infecciosas, siendo una
de las más importantes la salmonelosis. A pesar de
existir investigaciones que muestren a los serovars
Typhi y Enteritidis como los agentes causales de esta
enfermedad; aún no hay evidencia científica
suficiente para poder determinar cuáles son los
procesos de la Salmonelosis en el cuy, cuáles deben
ser las principales medidas de sanidad que deben
tomarse, cuales son las formas de control que deben
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Fundamentos básicos de PCR
convencional y sus variantes
Médico, A .
Laboratorio de Microbiología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma .
INFORMACIÓN DEL
ARTÍCULO:
Medico A. Fundamentos
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Palabras Claves:
PCR,
Cebadores, Fundamentos y
aplicaciones
R E S U M E N
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología
molecular, desarrollada por Kary Mullis en 1986, utilizada para amplificar a
partir de una o unas pocas copias una secuencia de ADN, generando miles a
millones de copias de esa secuencia de ADN. Esta técnica involucra tres pasos
principales: desnaturalización, hibridación y extensión, los cuales se repiten en
ciclos para lograr la amplificación; es necesario dar énfasis al diseño de
cebadores y sus consideraciones básicas, ya que esto aporta la especificidad a
la técnica. Por último, en la actualidad el PCR es una técnica común e
indispensable en los laboratorios de investigación biológica debido a su gran
variedad de aplicaciones; la diversidad de aplicaciones que existen han
permitido que se generen variantes de la técnica clásica: Nested PCR, Real
Time PCR, RT-PCR, Inverse PCR. Este artículo es un corto repaso de los
fundamentos básicos de un PCR convencional y algunas de sus variantes.
Introducción
Es indiscutible la importancia de la replicación del
ADN desde niveles tan simples como el celular
hasta niveles ecológicos, ya que con ella la célula es
capaz de continuar su división celular. Por este
mismo motivo es importante en el estudio del
cáncer, que ocasiona casi 15 millones de muertes al
año en todo el mundo, de las cuales solo en el Perú
se presentan aproximadamente 31 mil nuevos casos
por cada año (Ramos WC et al 2013).
En 1957 los biólogos estadounidenses Matthew
Meselson y Franklin Stahl utilizando cultivos
bacterianos de Escherichia coli, demostraron que el
ADN celular se replica
de la forma,
semiconservativa, propuesta por Watson y Crick
(Watson JD, Crick FHC 1953). Estos
investigadores utilizaron el elemento nitrógeno (N)
presente en la molécula de ADN, como el 14N
natural y la incorporación del isótopo de 15N
radiactivo, pudieron demostrar que cuando el ADN
se replica, una de sus cadenas pasa a las células
hijas sin cambiar (14N) y es la que actúa como de
molde o patrón, para así formar una segunda hebra
complementaria (15N) y completar las dos cadenas
del ADN (Watson JD et al 2006) (Ochman et al
1988). La replicación del ADN consta de tres
etapas: iniciación, elongación y terminación. Otras
características de la replicación son la
secuencialidad y bidireccionalidad desde un punto
fijo llamado origen de replicación. Este proceso se
desarrolla formando horquillas. In vivo necesita
varias proteínas y enzimas tales como la helicasa,
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topoisomerasa, proteínas SSB, ADN polimerasa I y
III, ARN primasa y ADN ligasa (Karp G 2011). Para esto debemos analizar la estructura del ADN
Con la técnica de la reacción en cadena de la (Fig. 1). El primer objetivo del PCR es
polimerasa (PCR) todas estas enzimas, a excepción desnaturalizar las cadenas sin que se afecte la
secuencia de nucleótidos. Esto es posible ya que los
enlaces puente de hidrógeno son enlaces débiles, por
Tabla 1. Lista de reactivos necesarios para
lo tanto se rompen cuando se le aplica calor;
realizar cada proceso. Se aprecia que la
mientras que los enlaces fosfodiéster no se ven tan
variación de temperatura reemplaza a varias
enzimas necesarias in vivo.
afectados por este ya que son enlaces covalentes
fuertes. En la década de los 80, un problema que se
tuvo fue conseguir una ADN polimerasa que no
fuera termolábil, porque la ADN polimerasa común
se desnaturalizaba a altas temperaturas, entonces
después de cada ciclo del PCR se debía agregar
nuevamente, haciendo de este proceso muy lento y
costoso (Erlich HA et al 1991). El uso de una ADN
polimerasa termoestable, obtenida de Thermus
aquaticus (Fig. 2), significó un mayor rendimiento
en el proceso (Erlich HA et al 1991) (Saiki RK et al
1988).
de las ADN polimerasa I y III, son reemplazadas
por variaciones de temperatura (Tabla 1).
PCR: ¿Por qué temperatura?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
una técnica que fue desarrollada en 1986 por Kary
Mullis. Por el desarrollo de esta técnica Mullis
recibió el Premio Nobel de Química en 1993
(Bartlett JMS, Stirling D 2003). Sin embargo,
Gobind Khorana en 1971 ya había descrito el
principio básico de la replicación de una cadena de
ADN utilizando dos cebadores complementarios a
los extremos de la secuencia a amplificar.
Figura 1. Esquema general de tipos de enlaces en el ADN.
Lamentablemente el progreso se vio limitado por la
(Tomada de: http://genemol.org/biomolespa/la-molecula-desíntesis de cebadores y la purificación de la
adn/molecula-03.jpg y modificada por el autor del artículo).
polimerasa
(Kleppe
K
et
al
1971).;;
Para desarrollar un óptimo PCR se necesitan
…………………………..
excelentes cebadores ya que estos les dan
El objetivo del PCR es amplificar ADN hasta especificidad al proceso. Pero debemos saber
obtener un gran número de copias de una secuencia primero dos cosas: ¿qué son? (Apartado 1) y ¿con
molde. Pero, ¿cuál es el factor que determina que la qué criterio se diseñan? (Apartado 2).
temperatura sea una gran herramienta en la
Fue muy difícil en los primeros experimentos
amplificación de secuencias?
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Apartado 1. Cebadores.
Los cebadores son cadenas cortas de ADN artificiales
de no más de cincuenta nucleótidos (mayormente de
18 a 25 pares de bases) que son complementarios al
principio y al final del fragmento de ADN blanco
(Rahman M et al 2013). Luego de hibridarse es
donde la ADN polimerasa actúa y comienza la
síntesis de la nueva cadena en dirección 5’ a 3’ (Fig.
3). El fragmento de ADN a ser amplificado se
delimita por los cebadores utilizados.
Figura 2. Micrografía de Thermus aquaticus, bacteria
Gram-negativa identificada por Thomas Brock (Tomada de
http://www.museeafrappier.qc.ca/images/site/large/thermus-aquaticusdianemontpetitagc.jpg y modificada por el autor).
determinar las temperaturas idóneas para la
desnaturalización, hibridación y elongación; es más,
los primeros experimentos de PCR se hicieron a
baño María. Hoy en día se realiza este proceso en un
equipo denominado termociclador de
manera
controlada y programada. En este se pueden realizar
las variaciones secuenciales repetitivas de
temperatura llamadas ciclos con la confianza de que
la temperatura del ADN y el tiempo en cada paso sea
el correcto.
Pasos de un ciclo de PCR
Cada ciclo consta de tres pasos (Fig. 4); todos estos
ciclos son precedidos de un ‘inicio’ donde el ADN es
desnaturalizado por un tiempo de, aproximadamente,
5 minutos a 94°-96° C para asegurarse de que tanto
el ADN molde y los cebadores estén separados
completamente; este proceso es necesario para ADN
polimerasas que necesitan activación por calor.
Y a su vez todos los ciclo son seguidos de un paso de
‘elongación final’, generalmente de 10 minutos a una
temperatura de entre 70° y 74° C, con esto se asegura
que cualquier ADN de cadena simple restante sea
totalmente ampliado (Haras D, Amoros JP 1994).
1. Desnaturalización (1-4 minutos): El ADN molde
de doble cadena debe ser calentado hasta los 94-96°
C, dependiendo de la cantidad de G/C que tenga, con
el fin de separar las hebras. El calor rompe los
Figura 3. Representación de cebadores forward y
reverse y su complementariedad de bases con la
cadena molde. (De
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Primers_RevComp.s
vg y modificada por el autor del artículo de revisión)
enlaces puente de hidrógeno que une a las bases
nitrogenadas.
2. Hibridación (30’’-2 minutos): Después de
separar las hebras de ADN, la temperatura se
reduce de modo que los cebadores pueden
adherirse a las hebras individuales de ADN. La
temperatura de esta etapa depende del Tm,
tamaño de los cebadores y del contenido de G/C
de cada uno de ellos y es de 50°- 60° C
generalmente. La temperatura incorrecta durante
la etapa de hibridación puede resultar en
cebadores que no se unen al ADN molde en lo
absoluto, o la unión inespecífica.
3. Extensión (30’’-2 minutos): La ADN
polimerasa se adhiere a la cadena tomando como
punto de referencia al cebador;
añade los
desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs) mientras
se abre camino a lo largo de la cadena de ADN. El
tiempo y la temperatura dependen tanto de la
fidelidad y rendimiento de la ADN polimerasa
como de la longitud del fragmento de ADN
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rompen los enlaces puente de hidrógeno
manteniendo la regla de que la velocidad de
migración es inversamente proporcional al tamaño
(Karp G 2011).
El tamaño del producto de PCR se puede
Figura 4. Cambios de temperatura (C°) y tiempo (minutos)
controlados en la desnaturalización, hibridación y extensión
en
un
ciclo
PCR.
(Tomado
de
http://cs412725.vk.me/v412725833/76db/hsbC98fWTs4.jpg)
blanco.
,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
Figura 5. Resultados de una corrida de electroforesis con la
escalera de ADN a la izquierda. (Tomado de
http://www.cepazahar.org/recursos/file.php/46/Proyectos/Bi
otecnologia/resultado_electroforesis_adn.jpg).
Después de todo el proceso se puede colocar la
muestra a temperaturas de 4° a 15° si es que se
desea conservar a corto plazo (expuesto a acción de
nucleasas pero no a formación de cristales de hielo);
a -20°, si se desea a mediano plazo y a -70° o -80° si determinar mediante la comparación con un
se quiere a largo plazo (expuesto a formación de marcador de ADN, que contiene fragmentos de
cristales pero no a acción de nucleasas). ADN de tamaño conocido. Hay dos formas de
hacer electroforesis, puede ser de forma vertical u
horizontal. El gel por lo general es de
Análisis de resultados
El método más común y sencillo consiste en la poliacrilamida (+ resolución) o de agarosa para
tinción del producto de ADN amplificado con un ADN/ARN y proteínas (Fig. 5).
colorante químico, como por ejemplo el bromuro
de etidio (compuesto aromático altamente tóxico y Gráfica de amplificación del PCR
cancerígeno), que se intercala entre las dos hebras Puede ser dividida en tres fases (Fig. 6):
del ADN (Garibyan L, Avashia N 2013). 1. Fase exponencial: Esta fase se caracteriza
Previamente se realiza una electroforesis. porque la polimerasa está en su máxima actividad y
la cantidad de reactivos restantes es alta; además
La electroforesis en gel es un procedimiento que en cada ciclo, la cantidad de producto se duplica
consiste en inyectar ADN en gel y luego aplicarle (suponiendo 100% de eficiencia) (Arnheim N,
una corriente eléctrica continua. Como resultado da Erlich H 1992). La reacción es muy sensible, sólo
una migración del ADN a través del gel del polo cantidades pequeñas de ADN tienen que estar
negativo al polo positivo (esto porque el ADN tiene presentes.
carga negativa por los grupos fosfato que son 2. Fase lineal: La reacción se ralentiza así como la
atraídos al polo positivo), así las cadenas más ADN polimerasa va perdiendo actividad y los
pequeñas de ADN doble se mueven más rápido que reactivos que se consumen, como cebadores y
las cadenas más grandes por su menor masa. En el dNTPs,
se
hacen
limitados.
caso de ADN simple y ARN, para evitar que se 3. Fase Plateau: No se acumula más producto
plieguen de manera indeseada se le agregan debido al agotamiento de reactivos y enzima. En
sustancias como la betamida y la formamida que
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Apartado 2. Diseño de Cebadores.
¿Por qué son importantes los cebadores? La principal razón es porque los cebadores le dan la especificidad al PCR.
Por lo que un buen diseño de ellos llevará a un óptimo desempeño del PCR. En este apartado se verán las
consideraciones básicas para el diseño de estos, el diseño de un cebador depende de la variante de PCR.
Ubicación del cebador: Definir la ubicación antes de ser diseñados teniendo en cuenta un posible rango de variación.
Y esta ubicación debe ser flexible para no perder valiosos nucleótidos de la secuencia de interés.
Tamaño del cebador: Influye en el tiempo y temperatura necesarios para la hibridación y en la especificidad (A
mayor tamaño más especificidad ya que eso disminuye el número de lugares posibles de unión).
Temperatura de fusión (Tm): Es una medida de la estabilidad de las secuencias de doble cadena. Es definida como
la temperatura en la cual 50% de los complejos cebador-molde encuentran formados y 50% aún permanecen
disociados o sin formarse. Un alto contenido de G/C incrementa la temperatura de fusión ya que la unión entre estas
bases complementarias tiene 3 puentes de hidrógeno, a diferencia de A/T que solo tiene 2.
Temperatura de hibridación (Th): Es la temperatura utilizada para que los cebadores se hibriden, generalmente es
4° C menos que la temperatura de fusión y varía directamente proporcional a esta. Ambos cebadores deben tener Th
similares porque si no el cebador con Th más alto hibridará inespecíficamente a bajas temperatura mientras que el de
Th más baja puede que no hibride a temperaturas altas.
Evitar homodímeros: Es importante que un cebador no tenga complementariedad entre más de 3 de los nucleótidos
que lo conforman. Ya que las regiones de auto-homología pueden formar estructuras parcialmente de dos cadenas que
puedan interferir con la hibridación al molde. También se recomienda que la energía libre de Gibbs sea mayor de -8.0
kcal/mol de preferencia positivo; de esto depende la cantidad de G/C y A/T (A mayor complementariedad de G/C se
tiene menor energía libre de Gibbs) (Fig. 7).
Evitar heterodímeros: Un heterodímero es la homología entre los dos cebadores. Una homología parcial en las regiones
medias de los cebadores puede que interfiera con la hibridación, en caso la homología ocurra en los extremos 3’ de cada
cebador se dará la formación de dímeros que impedirán la formación del producto por competición.
Contenido en G/C: La composición de bases del cebador en guanina y citosina debe ser de entre el 50% y 60% y se
debe evitar que el cebador contenga zonas poli-G o poli-C que puedan llevar a hibridación inespecífica. También se
debe evitar las zonas ricas en poli-A y poli-T ya que es por dónde puede des-hibridarse el complejo molde-cebador
(Somma M, Querci M 2007).
Secuencia 3’ terminal: La posición terminal 3’ confiere una unión firme entre el cebador y la secuencia molde. Se
debe considerar la existencia de dos residuos de G o C en las últimas bases a modo de grapa (por ejemplo GG, CC,
GCO CG) para que la polimerasa actúe ahí (Figura 6). Se conoce también que los cebadores con secuencias inestables
(Mucha concentración de A/T o ΔG mayor de -8 kcal/mol) suelen ser más específicos ya que la tasa de apareamiento
en lugares incorrectos es menor. (Fig. 8)
Estructuras secundarias del ADN molde: Puede que el cebador se vea obstaculizado si la secuencia blanco tiene
afinidad entre de bases. Se debe evitar que el cebador deba unirse a zonas con apareamiento de base del molde. Para eso
debemos saber que zonas del ADN molde tienen afinidad entre sí (Fig. 9).
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Figura 7. Esquema de complementariedad de
bases de un cebador de 20 nucleótidos con ΔG
de
0.22
kcal/mol.
(Tomado
de
http://mfold.rna.albany.edu/cgi-bin/displayimg2.cgi?FIRST=YES&TITLE=Homodimero&
FULL_NAME=19/14Nov02-19-38-32f82d35970d/14Nov02-19-3832f82d35970d_1&IMG_WID=936&OTYPE=j
pg&ANGLES=Natural&FLAT=Flat&ROT_DE
G=auto&SMOOTH_DEG=45&MAG_FAC=1
&CIRCULAR=linear&ANN=None&HILITE=
None&MODE=auto&LAB_FR=default
y
modificado por el autor del artículo de revisión).
Figura 8. Esquema simple de la unión de cebadores
a la secuencia molde, se puede apreciar que en los
extremos hay al menos una guanina a modo de grapa.
(Tomado
de
http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/neste
d/nested4.gif y modificado por el autor del artículo
de revisión).
Figura 9. Presencia de estructuras secundarias en
el
ADN
molde.
(Tomado
de
http://mfold.rna.albany.edu/cgi-bin/displayimg2.cgi?FIRST=YES&TITLE=14Nov02-2207-27ac20ce3d77&FULL_NAME=22/14Nov02-2207-27-ac20ce3d77/14Nov02-22-0727ac20ce3d77_1&IMG_WID
=936&OTYPE=jpg&ANGLES=Natural&FLAT
=default&ROT_DEG=auto&SMOOTH_DEG=4
5&MAG_FAC=1&CIRCULAR=linear&ANN=
None&HILITE=None&MODE=auto&LAB_FR
=default y modificada por el autor del artículo de
revisión).
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esta etapa del PCR es en donde se pueden analizar
los datos, por ejemplo mediante electroforesis.
Variantes del PCR
Nested PCR (PCR anidado): Es una técnica muy
sensible en donde dos conjuntos de cebadores se
utilizan en la ejecución de dos PCR consecutivos, el
segundo conjunto es destinado a amplificar un
objetivo secundario dentro del producto de la
primera ejecución (Severini GM et al 1993).
Multiplex PCR (PCR múltiple): Técnica de PCR
que permite la detección simultánea de más de una
secuencia en una sola reacción. Mediante el empleo
de dos o más parejas de cebadores para producir
amplicones de tamaños distintos que son
específicos para diferentes secuencias de ADN
diferentes (Markoulatos P et al 2002).
Real Time PCR (PCR a tiempo real): Es una
técnica que se basa en el mismo principio que el
PCR convencional, solo que a este se le añade
fluoróforos y además se utiliza un termociclador
con
sensores
de
fluorescencia.
Gracias al fluoróforo se miden los productos a
medida que se producen, en simultáneo; durante la
amplificación este fluoróforo se une a las moléculas
del ADN y los valores de fluorescencia se reportan
en cada ciclo (Hirakawa Y et al 2010).
RT-PCR (PCR transcriptasa inversa): Es una
variante de la PCR en la se usa ARN como emplea
una enzima transcriptasa inversa para realizar la
síntesis de un ADN complementario al ARN
(ADNc). Para luego aplicar un PCR convencional
sobre este. Es frecuentemente utilizado en los
perfiles de expresión, para determinar la expresión
de un gen o para identificar la secuencia de un
transcrito de ARN, incluyendo el inicio de la
transcripción y los sitios de terminación. (Doak SH,
Zaïr ZM 2012)
Inverse PCR (PCR inverso): Una limitación de la
PCR convencional es que requiere cebadores
complementarios a ambos extremos de la secuencia
blanco, pero este método permite amplificar e
identificar una secuencia conociendo solo una
región interna de la secuencia objetivo es
ampliamente usado en genética (Ochman et al 1988).
Usos y aplicaciones del PCR
Huella digital genética: Esta técnica forense
permite identificar a una persona comparando su
Figura 6. Gráfica de amplificación del PCR según el
número de ciclos empleados a) gel de agarosa donde
se realizó la optimización de la cantidad de ADN (en
donde 1: escalera, 2: producto específico, 3: producto
inespecífico); b) gráfica de concentración de ADN
respecto del número de ciclos empleados c) logaritmo
de la concentración de ADN respecto del número de
ciclos
empleados
(Tomada
de
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7
e/Cycle_range_end-point_PCR.jpg y modificada por
el autor del artículo de revisión).
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ADN con otra muestra obtenida, por ejemplo, de la
escena
de
un
crimen.
Determinando si pertenecen al mismo individuo o
no, o si existe parentesco entre ellas. Como la
muestra suele ser muy escasa, el PCR puede
aumentar la cantidad de ADN amplificando ciertos
segmentos polimórficos (variantes en la
población), para luego ser separados por
electroforesis lo que se conoce como ADN
fingerprint
o
huella
digital.
Test de paternidad: En esta técnica se amplifica
por PCR fragmentos polimórficos de ADN de la
madre, del niño y de él o los presuntos padres y,
separándolos mediante electroforesis, se puede
visualizar una serie de fragmentos que tiene el
niño, los cuales deben compartir con la madre y
padre biológicos.
Detección de enfermedades Cada gen en estudio
puede ser amplificado por PCR, con los cebadores
adecuados, y luego ser secuenciados; para así
determinar si un individuo porta alguna mutación
que explique la presencia de una enfermedad o su
aparición en el futuro, la que puede ser heredada a
sus progenitores y así se maneje su tratamiento.
Secuenciación y clonación de genes: La PCR es
habitualmente usada para amplificar un
determinado gen o un ARNm (representado por un
ADNc), que puede introducirse en un vector y
luego en un organismo, que al duplicarse también
duplicará el gen que nos interesa. Así podemos
tener una cantidad suficiente de un gen o ADNc,
por ejemplo, para secuenciarlo o incluso para
producir a gran escala la proteína que este gen
codifica.
;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;
Análisis de ADN antiguo: Con el PCR se puede
analizar ADN que tiene miles de años de
antigüedad (siempre y cuando esté en buen estado),
lo que ha permitido estudiar muestras obtenidas
desde momias hasta animales y vegetales ahora
extintos
Conclusiones
El conocimiento de los diversos mecanismos
moleculares implicados en la replicación ha
permitido desarrollar la técnica del PCR y
reemplazar el uso de enzimas por variables
controladas como la temperatura en aparatos
automatizados. Además el PCR es altamente
específico y debe esto principalmente a los
cebadores y su diseño, haciendo del PCR una
técnica ampliamente usada en el mundo. A partir de
un PCR convencional, que consta de tres pasos por
ciclo (desnaturalización, hibridación y extensión), se
han desarrollado distintas variantes de acuerdo al
campo y/o finalidad de su uso. Por lo que el uso del
PCR se ha extendido a campos desde la biología
evolutiva hasta la medicina.
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Volumen 1, n°2
Mini-Review
Integración de la Biotecnología Bacteriana
y la Ingeniería Genética de Plantas
Morales, M.
Laboratorio de Microbiología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Ricardo Palma.
INFORMACIÓN DEL
ARTÍCULO:
Morales M. Integración de
la Biotecnología Bacteriana
y la Ingeniería Genética de
Plantas. Boletín Científico.
2014. 1(2): 42-51.
Palabras
Claves:
Agrobacterium tumefaciens,
TDNA, operón vir
R E S U M E N
Los estudios en biotecnología han demostrado que se puede utilizar el
mecanismo de infección de microorganismos fitopatógenos para que las
plantas expresen moléculas cuya producción actual es ineficiente y de alto
costo. Uno de estos organismos utilizados en la ingeniería genética de plantas
es Agrobacterium tumefaciens que tiene la capacidad de transferir una
secuencia del plásmido Ti al genoma vegetal. Esta secuencia se denomina
TDNA y el proceso es regulado, principalmente, por el operón vir del pTi, el
cual está conformado por ocho genes vir (A-H). La transferencia comienza
con la activación de la proteína receptora virA, por interacción con
compuestos fenólicos secretados por la planta; a partir de ello, se fosforila la
proteína VirG, y actúa como factor de transcripción para las demás proteínas
Vir. Las proteínas que se encargan de transportar el TDNA y mantener su
integridad son VirD1 y VirD2, VirB, VirE y VirF. Esta propiedad, ha dado
paso a múltiples investigaciones en donde se reemplazan los genes de
virulencia del TDNA por un gen de interés y otro vector de A. tumefaciens
que no posee una región de TDNA pero sí el operón vir lo que permite la
transferencia, a este sistema se le denomina vector binario. En la actualidad
mediante la aplicación de esta metodología se pueden obtener plantas
transgénicas lo cual permite mejorar la productividad de plantas de
importancia económica u obtener sustancias proteicas que son indispensables
en otras áreas de ciencia.
Las plantas, fuente de vida
Desde los inicios de la humanidad, las plantas han
sido los principales organismos pluricelulares que
se han usado como alimento, medicina, e inclusive
como ornamento. La distribución de muchas
especies puede llegar a ser global dependiendo del
uso al que esté destinado. Es así que, a medida que
se desarrollaban nuevas técnicas para cultivar y
conservar diferentes tipos de plantas, se adaptaban
otros organismos que, al igual que los humanos,
necesitaban de la planta para sobrevivir, causando
pérdidas en la productividad de cultivos, como el
virus de la papa que afecta al 90% de las plantas
cultivadas (Robles, L. et al 2010). Esto inició los
estudios guiados a la fitopatología, área que se ha
desarrollado desde 1729, cuando el botánico
Michelli observó hongos en plantas de melocotón,
dando paso a la determinación de hongos, bacterias
y virus, que producen enfermedades en las plantas
(Agrios, 2013).
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De las bacterias a las plantas
mejoramiento genético, o inclusive expresar
Una de estas enfermedades es la “Corona de moléculas difíciles de obtener en otros sistemas
Agallas”, denominada así por las agallas de aspecto (Valderrama et al 2005).
tumoroso que aparecen en la parte basal del eje
principal aéreo de la planta, generalmente en la Transferencia de ADN (T-DNA) en la célula
base del caule, y fue descrita por primera vez por vegetal
Fabre et al en 1853. Sin embargo, fue en 1997
cuando Chilton et al, reconocieron fragmentos de El desarrollo de la enfermedad está ligado a la
ADN en los tumores axénicos de plantas de tabaco, interacción entre el patógeno, el ambiente y el
procedentes de un bacilo gramnegativo: hospedero. El patógeno coloniza las heridas e infecta
Agrobacterium tumefaciens. Posteriormente, se la planta mediante mecanismos moleculares que
determinó que estos fragmentos de ADN contenían involucran una serie de interacciones genéticas que
contribuyen a que la bacteria sea capaz de adherirse
a la planta y causar la tumoración y transferencia de
ADN; estos procesos se pueden sintetizar en cuatro
pasos fundamentales: la colonización bacteriana; la
inducción del sistema de virulencia; la generación
del complejo de transferencia (T-DNA); y la
integración del T-DNA en el genoma de la planta.
En este proceso resalta la participación de un
plásmido denominado Ti (Tumoral inductor –
“inductor del tumor”) (Fig. 2). (de la Riva et al
1998).
Figura 1. “Corona de Agallas” causada por A.
tumefaciens (Escobar et al. 2003).
genes que inducían la formación de tumores en las
células vegetales, ya que eran introducidos
mediante un mecanismo de transferencia al genoma
de las plantas. Es así que la investigación causó
gran impacto en el área de la genética de plantas,
concibiendo la idea de que una planta puede
expresar un gen que no se encuentre normalmente
en su genoma. A partir de ello se comenzó a
investigar este mecanismo con el fin de realizar un
El proceso colonización bacteriana incluye la
adherencia del patógeno a la raíz o tallo de la planta;
esto se da debido a que Agrobacterium reconoce
células vegetales que se encuentran dañadas por
factores físicos, químicos o biológicos (cita); ya que
dichas células vegetales secretan sustancias fenólicas
de bajo peso molecular como acetosiringona e
hidroxiacetosiringona que son reconocidos por la
bacteria (cita); por otro lado, las células vegetales
dañadas tiene la característica de no presentar una
pared celular estable lo que conlleva a la alta
producción de lignina y flavonoides que permiten
dirigir a la bacteria hacia las células susceptibles
(cita); posteriormente, la bacteria se une a la célula
mediante la acción de una molécula en la pared
celular sensible a proteasas que es reconocida por la
bacteria; estas moléculas pueden ser dos proteínas de
adhesión en donde se encuentra la vitonectrina y la
ricoadhesina, sin embargo este proceso no ha sido
descrito genéticamente (Llop P 2003); no obstante,
se han identificado genes que son necesarios para
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esta acción como: chvA y chvB. En segundo lugar,
la inducción del sistema de virulencia se refiere a la
expresión del operón vir, el cual consta de 8 genes:
6 de ellos se han determinado como esenciales:
virA, virB, virC, virD, virE y virG; mientras que los
otros no se consideran relevantes en la
transferencias de ADN: virF y virH. El virA es un
receptor dimérico ubicada en el peptidoglicano y la
membrana interna, que se une a la proteína chvE la
cual reconoce los compuestos fenólicos secretados
por la planta y por acción de un sensor kinasa (1),
ubicado en la región del virA que se encuentra en el
citoplasma, que capta los grupos fosfatos del ATP y
fosforila al virG (2) ubicado en el citoplasma de la
bacteria, y que funciona como factor de
transcripción para la expresión de los demás genes
vir (3) (de la Riva et al 1998).
La generación del T-DNA se da mediante la
expresión del gen virD2, principalmente, el cual
funcionan como endonucleasa uniéndose a los
bordes (Right border y Left border) del plásmido en
el sentido 5’ – 3’, formando el complejo virTDNA
(4). La proteína virD2 es la más importante en este
proceso ya que guía al TDNA desde el citoplasma
bacteriano al genoma de la planta (Rodríguez, L
2012); además se añade la función de las proteínas
virE2 que ayuda en el transporte del TDNA y su
Figura 2: Mecanismo molecular de la transferencia del TDNA del pTi al genoma vegetal.
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integración (6) (Wroblewski, T et al 2005). Además
actúa la proteína virF cuya función no está
completamente determinada, pero se cree que actúa
inactivando las enzimas que puedan degradar el
TDNA mediante proteólisis (7) (Schrammeijer, B. et
al 2001). Este complejo ingresa en el citoplasma de
la célula hospedera mediante la acción de las
proteínas virB 1 -11 y virD4 los cuales unen la
membrana celular de la bacteria con el citoplasma
de la célula vegetal (5) formando un puente similar a
un proceso de conjugación (McCullenet al 2006)
(Fig. 2).
Finalmente, el complejo virTDNA es internalizado
en el núcleo de la célula vegetal por el la proteína
virD2 el cual contiene dominios de recombinación y
ligación (Bako, L. et al 2003); y con la participación
de histonas como la H2A (Tzfira, T. et al 2002);
además, existen proteínas de la planta, como VIP1,
que reconocen al virE2 para permitir la integración
del TDNA; por otro lado, también, es reconocido
por las chaperonas de la planta: RocA, Roc4 y
CypA (8) que mantienen la inserción del TDNA en
el genoma de la planta (Valderrama et al 2005).
La transformación: Base de la Ingeniería
Genética
A partir del mecanismo anterior. La ingeniería
genética ha encontrado un beneficio propio en la
obtención de plantas transgénicas. Es así que se
utiliza un sistema de vector binario, el plásmido Ti
se ha “domesticado” inhibiendo la síntesis de genes
de inducción de tumor y desarrollo de la
enfermedad y manteniendo los genes de
transferencia de ADN: el operón vir (Gutarra, B.
2004) (Fig. 3), este plásmido se utiliza con otro
vector que posee el gen de interés con el fin de
obtener varias copias del plásmido, y subclonado
en un plásmido de expresión que posee un
promotor, residuos que facilitan la purificación (Ej.
His-6) y un terminador (Shoji, Y. et al 2008).
Además, para facilitar la identificación de una
transferencia exitosa, el vector de expresión
presenta un gen que da resistencia a herbicidas, así
se puede tratar a las plantas con dichas sustancias y
si no resultan afectadas entonces la expresión del
gen es satisfactoria (Cubero, J. 2013). Existen,
actualmente, vectores comerciales con sitios
múltiples de clonación (MCS), como pT7-Blue y
pBluescriptII, en los que se ha insertado el gen del
Figura 3: Sistema de Vector Binario. (izq.) plásmido Ti “desarmado”. (der.) Vector con el gen de interés. *Extraído de:
http://concienciadeplantas.blogspot.com/2013/03/tecnicas-que-empleamos-parte-1.html
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IFNγ controlado por promotores de αAmy y
Ubiquitina, el cual fue subclonado en otro plámsido
comercial de A. tumefaciens: pCAMBIA1390, el
cual está diseñado con el marcador de resistencia a
higromicina; es decir que aquellas plantas que hayan
sido transformadas deberán ser resistente a este
antibiótico y expresar el IFNγ (Chen, T. et al 2004).
Aplicaciones de la Transformación de Plantas
mediado por Agrobacterium tumefaciens
La ingeniería genética en microbiología y en
botánica ha permitido la obtención de organismos
genéticamente modificados (OGM), los cuales
pueden expresar características deseables, tales
como colores, resistencia a factores abióticos como
temperatura, potencial hídrico, e inclusive
pesticidas; y bióticos, como plagas principalmente;
además se está evaluando la posibilidad de expresar
proteínas cuya producción es baja y poco efectiva y
que tienen una importancia en el área de salud,
generalmente, tales como las moléculas del sistema
inmunológico o antígenos para la producción de
proteínas recombinantes (NSTA, 2007). Sin
embargo, en la actualidad, Europa es el principal
continente donde se ha permitido el uso de algunos
transgénicos que poseen resistencia a herbicidas y
plagas, producción de colores, y longevidad y sus
usos
van
desde
cultivos,
alimentación,
procesamiento, ornamentación e importaciones
(Cuadro 1), además, es posible la venta de semillas
de esta plantas transgénicas (Sebiot, 2000).
En nuestro país, el uso de los transgénicos para las
actividades mencionadas anteriormente no está
permitido debido a la proclamación de la Ley N°
29811 que impide el ingreso, producción y
liberación de OGM en el territorio nacional por un
periodo de 10 años, y simultáneamente, se debe
equipar, adaptar y desarrollar una infraestructura
necesaria para la evaluación de estos organismos y
su aceptación en el país (MINAM, 2012). Para ello,
es necesaria la investigación en las áreas de la
biotecnología bacteriana y vegetal con el fin de
comprobar la viabilidad y uso de los organismos
genéticamente modificados y transformados por
acción de Agrobacterium tumefaciens.
Conclusiones
Es así que a partir de una patología que parecía
tener la capacidad de causar un grave impacto en la
economía de la agricultura y más aún en la
Tabla 1. Plantas Transgénicas permitidas en Europa.
Organismo
Característica
Usos
Maíz Bt-176
Resistente a Pyrausta nubilalis“Taladro”
Todos los usos
Maíz MON-810
Resistente a Pyrausta nubilalis“Taladro”
Todos los usos
Maíz T25
Resistente a glufosinato de amonio (herbicida)
Maíz Bt-11
Resistente al “taladro” y al glufosinato de amonio
Tabaco
Resistente a bromoxinil (herbicida)
Soya A-5403
Resistente al glifosato (herbicida)
Achicoria
Tolerante al glufosinato de amonio (herbicida)
Todos los usos
Importación y
procesamiento
Cultivo
Importación y
procesamiento
Cultivo
Claveles
Nuevos colores
Ornamentación
Claveles
Mayor Longevidad
Ornamentación
Extraído de : “Plantas Transgénicas: Preguntas y Respuestas (Sebiot, 2000)
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alimentación del hombre, resultó ser una
herramienta para el mejoramiento genético que
actualmente viene solucionando gran cantidad de
problemas de la humanidad. La interacción genética
del plásmido Ti, permite la adherencia de la bacteria
a la planta (chvA, chvB); la inducción del sistema de
virulencia a partir de los genes virAy virG; la
síntesis del complejo virTDNA mediante la
expresión de los genes virB, virC, virD, virE, virF,
virH; y la integración del TDNA en el genoma de la
planta, donde el principal protagonista es el gen
virD2, ya que posee dominios de ligamiento y
recombinación. Este proceso, es aprovechado para
la obtención de transgénicos lo cual permite mejorar
la productividad de plantas de importancia
económica u obtener sustancias proteicas que son
indispensables en otras áreas de ciencia.
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Contacto:
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