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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TESIS
Qué para obtener el grado de:
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS
Presenta:
IBQ. Elier Ekberg Neri Torres
Ingeniero Bioquímico
Obtención de una cepa bacteriana degradadora de ácido tereftálico, modificada
genéticamente.
Dirigida por
Dr. Jésus Agustín Badillo Corona
Dr. Claudio Garibay Orijel
México, D.F. Marzo de 2012
i
ii
iii
RESUMEN.
La degradación ácido tereftálico (AT) ha ganado gran importancia, debido a que este es
un
compuesto
aromático
altamente
contaminante,
por
cada
tonelada
de
AT
manufacturada se generan 4 m3 de aguas residuales. Se han buscado diferentes
estrategias de degradación dentro de procesos físicos, químicos y biológicos, ya sea
como aerobios o anaerobios. Los procesos anaerobios requieren de un consorcio
microbiano y de un elevado tiempo de proceso logrando buenos resultados, pero los
procesos aerobios requiere de un menor tiempo de proceso y son realizados por cepas
puras como Ochrobactrum sp., sin embargo, generan una gran cantidad de biomasa, a lo
que posteriormente se le considera lodo de desecho, es bien sabido que mediante las
herramientas de la ingeniería genética se han logrado grandes avances en los proceso de
producción por lo que el objetivo de este trabajo fue la transformación genética mediante
un método el cual permita mejorar las capacidades de la cepa Ochrobactrum sp. para la
degradación de AT. Además de comparar las constantes especificas de crecimiento y
degradación de la cepa Ochrobactrum sp. transformada y sin transformar. Se aislaron
cuatro cepas degradadoras de AT, las cuales se identificaron mediante la secuenciación
del gen 16S rRNA, y resultaron ser encontradas dentro de los siguientes géneros
Arthrobacter sp., Brevundimonas sp., Agrobacterium sp. y Ochrobactrum sp. Por otra
parte, se logró transformar genéticamente la cepa de Ochrobactrum sp a la cual fue
insertado el plásmido pET 28b que confiere el gen de resistencia a kanamicina (km-R),
posteriormente se determinaron las constantes cinéticas de Ochrobactrum sp: la exp es
de 0.021 h-1, max es de 0.022 h-1, Ks 3.2, Yx/s es de 0.0004 gbiomasa/gsustrato y qs es de
36.9348 gsustrato/gbiomasa*h y Ochrobactrum transformada: exp es de 0.003 h-1, max es de
0.028 h-1, Ks 1.2, Yx/s es de 0.0001 gbiomasa/gsustrato y qs es de 30.1321 gsustrato/gbiomasa*h. Se
concluye que, el punto más importante de este desarrollo ha sido la respuesta a la
degradación de ácido tereftálico de las cepas aisladas y el método de transformación
utilizado, la cual no ha sido reportada en ninguna otra investigación, además de que en
este estudio se logró un 92% de degradación de AT.
iv
ABSTRACT.
The degradation of terephthalic acid (AT) has gained great importance, because this is a
highly polluting aromatic compound, per ton of AT manufactured this generate 4 m 3 of
wastewater. Different strategies have been sought for degradation in physical, chemical
and biological process, the biological process as either aerobic or anaerobic. Anaerobic
processes require an microbial consortium and a high processing time achieving good
results, but the aerobic processes requires less processing time and are made by inbred
strains as Ochrobactrum sp., However, generate a large quantity of biomass , to which
was later considered waste sludge. Is well known that using the tools of genetic
engineering have made great strides in the production process so that the objective of this
study was the genetic transformation by a method which to improve the capabilities of the
strain Ochrobactrum sp. for degradation of AT. In addition to comparing the constant
specific growth and degradation of the strain Ochrobactrum sp. processed and
unprocessed. Four strains were isolated to degrading AT, which were identified by 16S
rRNA gene sequencing, and were to be match genera Arthrobacter sp., Brevundimonas
sp., Agrobacterium sp. and Ochrobactrum sp. Moreover, it was possible to genetically
transform Ochrobactrum sp strain which was inserted to plasmid pET 28b, confers
kanamycin resistance gene (Km-R), subsequently determined the kinetic constants of
Ochrobactrum sp: the exp=0.021 h-1, max is 0,022 h-1, Ks 3.2, Yx / s= 0.0004 gbiomasa/gsustrato
and qs= 36.9348 gsust/gbio*h. For transformed Ochrobactrum: exp=0.003 h-1, max=0,028 h-1,
Ks=1.2, Yx / s=0.0001 gbiomasa/gsustrato and qs=30.1321 gsust/gbio*h. We conclude that the most
important point of this development has been the response to the degradation of
terephthalic acid and isolates the processing method used, which has not been reported in
any other investigation, in addition to this study achieved a 92% degradation of AT.
v
Agradecimientos.
Agradezco al Instituto Politécnico Nacional, al CONACyT y a todas las personas que
contribuyeron en el desarrollo de este trabajo.
Dedicatorias.
Dedicó este trabajo a mi familia y a la vida que me ha permitido llegar hasta aquí.
vi
Créditos.
El trabajo de esta tesis fue realizado en el laboratorio de Biotecnología Molecular y en el
laboratorio de Bioingeniería del Departamento de Bioprocesos de la Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnología de Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del
Dr. Jesús Agustín Badillo Corona y del Dr. Claudio Garibay Orijel, con la asesoría del Dr.
Edgar Salgado Manjarrez, la Dra. María del Carmen Oliver Salvador y el Dr. Noé Valentín
Duran Figueroa.
Durante el desarrollo de esta tesis se obtuvo el apoyo del CONACyT a través de la beca
de Maestría con número de registro 339071.
vii
Índice
1.
INTRODUCCIÓN. .................................................................................................................. 1
1.1.
2.
CARACTERÍSTICAS DEL ÁCIDO TEREFTÁLICO. ........................................................................ 1
ANTECEDENTES. ................................................................................................................. 2
2.1.
ESTRATEGIAS DE DEGRADACIÓN. FÍSICOS, QUÍMICOS, BIOLÓGICOS (ANAEROBIOS Y AEROBIOS) . 3
2.1.1.
Tratamientos físicos ................................................................................................ 3
2.1.2.
Tratamientos Químicos. .......................................................................................... 3
2.1.3.
Tratamientos Biológicos .......................................................................................... 4
2.1.
DEGRADACIÓN DE ÁCIDO TEREFTÁLICO................................................................................ 5
2.2.1.
Microorganismos probados para la degradación aerobia de ácido tereftálico. .......... 5
2.2.1.
Origen o fuente de los microorganismos degradadores de ácido tereftálico. ............ 8
2.2.
PROBLEMAS GENERADOS POR EL TRATAMIENTO AEROBIO DE ÁCIDO TEREFTÁLICO. ................ 10
2.3.1.
Lodos. ................................................................................................................... 10
2.3.2.
Disposición de los lodos. ....................................................................................... 11
2.3.
ÁREA DE OPORTUNIDAD. .................................................................................................. 13
2.4.1.
Ingeniería Genética y biotecnología....................................................................... 13
2.4.2.
Microorganismos genéticamente transformados que han sido exitosos en la
industria. 14
3.
JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................. 16
4.
HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 17
5.
OBJETIVOS......................................................................................................................... 17
5.1.
5.2.
6.
GENERALES. .................................................................................................................. 17
PARTICULARES. .............................................................................................................. 17
MATERIALES Y MÉTODOS. ............................................................................................... 18
6.1.
MATERIALES ................................................................................................................... 19
6.1.1.
Reactivos y soluciones. ......................................................................................... 19
6.1.2.
Equipo y Medios de cultivo. ................................................................................... 19
6.1.3.
Microorganismos. .................................................................................................. 20
6.1.4.
Plásmidos ............................................................................................................. 21
6.2.
MÉTODOS ...................................................................................................................... 22
6.2.1.
Métodos para la identificación de cepas CGO-01, CGO-02, J1 y J2. ..................... 22
6.2.2.
Métodos para la transformación genética de las cepas .......................................... 27
6.2.3.
Métodos para la cuantificación de ácido tereftálico. ............................................... 31
6.2.4.
Metodología para el cálculo de variables cinéticas................................................. 32
7.
RESULTADOS .................................................................................................................... 33
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
8.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS CGO-01, CGO-02, J1 Y J2. ......................... 33
RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS ........................................................................................... 36
TRANSFORMACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS. ................................................................. 37
CINÉTICAS DE CRECIMIENTO PARA CEPAS ORIGINALES Y DEGRADACIÓN DE ÁCIDO TEREFTÁLICO.
40
CINÉTICAS DE CRECIMIENTO Y DEGRADACIÓN PARA LA CEPA TRANSFORMADA. ....................... 43
DISCUSIÓN. ........................................................................................................................ 46
viii
8.1.
CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS IDENTIFICADOS MEDIANTE LA SECUENCIACIÓN
16S. ............................................................................................................................ 46
RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS ........................................................................................... 48
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA. .......................................................................................... 49
CINÉTICAS DE DEGRADACIÓN. .......................................................................................... 51
DEL GEN
8.2.
8.3.
8.4.
9.
CONCLUSIONES. ............................................................................................................... 52
10.
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 53
11.
ANEXO 1. ........................................................................................................................ 60
Índice de figuras.
Figura 1.1. Crecimiento en la producción en México de AT. (Energía, 2007) ..................... 2
Figura 2.1. Vías (orto)-para la degradación del (cloro) catecol. a) vía 3 clorocatecol de una
bacteria Gram negativa. b) Vía 3 clorocatecol de R. erythropolis 1CP. c) Vía 4 clorocatecol
de R. erythropolis 1CP. (Ferraroni et al., 2006) .................................................................. 6
Figura 2.2 Vías y pasos bioquímicos para el catabolismo de compuestos aromáticos en
Pseudomonas putida KT2440 (Jimenez et al., 2002). ........................................................ 9
Figura 6.1. Estrategia metodológica. ................................................................................ 18
Figura 7.1 Crecimiento en medio con AT sólido A) cepa CGO-01 donde se puede
observar el crecimiento de colonias circulares con diámetro de 1-2 mm brillante, B) cepa
CGO-02 donde se puede observar el crecimiento de cepas circulares de diámetro con
producción de pigmento, C) cepa J1, se observa el crecimiento de colonias puntiformes
blanco mate, y D) cepa J2, se observa el crecimiento de colonias puntiformes blanco
mate. ............................................................................................................................... 34
Figura 7.2 Imagen de electroforesis en gel de agarosa para la identificación de las
secuencia de 900 pb y la secuencia de 600 pb. Muestra los fragmentos de ADN de peso
de 900pb y 600pb. 1 marcador, 2 CGO-01 Bac1F-Bac910R (900nt), 3 CGO-02 Bac1FBac910R (900nt), 4 J1 Bac1F-Bac910R (900nt), 5 J2 Bac1F-Bac910R (900nt), 6 E. coli
Bac1F-Bac910R (900nt), 7 CGO-01 800F-1400R (600nt), 8 CGO-02 800F-1400R (600nt),
9 J1 800F-1400R (600nt), 10 J2 800F-1400R (600nt), 11 E. coli 800F-1400R (600nt) y 12
Control negativo. .............................................................................................................. 35
Figura 7.3 Crecimiento de la cepa Ochrobactrum sp. en medio selectivo de AT g/L) y la
adición de 100 g/L de kanamicina. Siembra mediante estría cruzada, donde se puede
observar el crecimiento de colonia puntiformes mate. ...................................................... 39
Figura 7.4 Electroforesis en gel de la extracción del plásmido pET 28b de un cultivo
líquido de Ochrobactrum sp 1-Marcador (1 Kb) y 2- Cepa Ochrobactrum sp.
Transformada. ................................................................................................................. 39
Figura 7.5 Curva de calibración para la densidad óptica y los sólidos suspendidos. Permite
determinar la cantidad de sólidos presentes en el cultivo................................................. 40
Figura 7.6 Fotografía de la curva de calibración para el HPLC. Mediante esta curva se
realiza la determinación de la degradación del AT. ......................................................... 41
ix
Figura 7.7 Cinética de crecimiento de microorganismos y degradación de AT para
Brevundimonas sp. Presentando una velocidad de crecimiento  de 0.020 h-1 a 30ºC (
Sólidos suspendidos,  Concentración de AT). ................................................................ 42
Figura 7.8 Cinética de crecimiento de Ochrobactrum sp. y degradación de AT. Durante
204 horas: velocidad de crecimiento  de 0.021 h-1 y una velocidad de degradación de
0.1129 g/L/h a 30ºC. ( Sólidos suspendidos,  Concentración de AT). ........................ 43
Figura 7.9 Cinética de crecimiento Ochrobactrum sp. Transformada genéticamente
mediante la inserción pET 28b y degradación de AT. Durante 204 horas: obteniendo una 
de 0.003 h-1 y Vd 0.1127 g/L/h a 30ºC. ( Sólidos solubles,  Concentración de AT). ..... 44
Figura 8.1 Electroforesis en gel del plásmido pET 28b de un cultivo liquido de
Ochrobactrum sp. 1-Marcador (1 Kb), 2- Control Negativo (EC), 3- Cepa Ochrobactrum
sp. Original, 4- Cepa Ochrobactrum sp. Transformada, 5 Agua, 6-Control positivo
(Plásmido pET 28b). ........................................................................................................ 50
Índice de Cuadros.
Cuadro 2-1 Ventajas y desventajas de los principales procesos de estabilización de los
lodos. ............................................................................................................................... 12
Cuadro 6-1 Reactivos usados para la reacción de PCR .................................................. 25
Cuadro 6-2 Condiciones necesarias para llevar a cavo la PCR. ...................................... 25
Cuadro 6-3 Determinación de la concentración mínima inhibitoria. .................................. 26
Cuadro 7-1 Tamaños y secuencias de nucleótidos características de los primers usados.
........................................................................................................................................ 33
Cuadro 7-2. Identificación de los microorganismos degradadores de ácido tereftálico. .... 35
Cuadro 7-3 Prueba de susceptibilidad de las cepas con los antibióticos más usado
comúnmente. ................................................................................................................... 36
Cuadro 7-4 Resultados obtenidos para los métodos de transformación........................... 38
Cuadro 7-5. Velocidades de crecimiento, rendimiento biomasa sustrato y rendimiento de
degradación de sustrato para las cepas Ochrobactrum sp. y Ochrobactrum sp.
transformada y velocidad de degradación de AT, a una temperatura de crecimiento de
30ºC................................................................................................................................. 44
Cuadro 7-6 Velocidad de degradación, porciento de degradación, concentración inicial y
final del AT en las cinéticas de degradación hechas para la cepas Ochrobactrum sp. y
Ochrobactrum sp. transformad, a una temperatura de crecimiento de 30ºC .................... 45
Cuadro 7-7 Velocidades de crecimiento especificas de cepas capaces de degradar ácido
tereftálico (AT), en comparación con cepas reportadas en la literatura. ........................... 46
x
1. Introducción.
1.1.
Características del ácido tereftálico.
En las últimas décadas se ha observado un incremento en la producción de los isómeros
del ácido ftálico (ácido orto-bencen di-carboxílico, ácido meta-bencen di-carboxílico y
ácido para-bencen di-carboxílico) para el uso en manufactura de resinas de poliésteres,
envases de plástico, fibras de poliésteres y otros productos basados en el petróleo. Estos
compuestos son liberados en las aguas de desecho, como consecuencia de los procesos
de producción de las industrias correspondientes (Kleerebezem et al., 1999b;
Kleerebezem et al., 2005b; Qiu et al., 2006; Zhang et al., 2006; Karthik et al., 2008).
Además estos compuestos están considerados mundialmente entre los 50 químicos más
producidos, y por lo tanto, son los contaminantes que se liberan con mayor frecuencia en
las aguas residuales y también son los que con mayor frecuencia podrán ser encontrados
en sitios contaminados. Por lo que también se ha observado el fenómeno del aumento en
la contaminación del terreno y de los cuerpos acuíferos debido a las aguas residuales que
contienen este tipo de compuestos. Por tal razón se ha dado gran importancia a los
tratamientos biológicos para la degradación de los principales contaminantes como
compuestos aromáticos, aromáticos clorados y alifáticos clorados (Macarie and Guyot,
1992). Entre los que destaca el Acido Tereftálico (AT) y sus derivados (Martínkova et al.,
2009).
En cuanto a los derivados de esté, los esteres ftalicos son componentes sintéticos usados
predominantemente como aditivos en plásticos para mejorar las propiedades mecánicas
de las resinas plásticas, particularmente la flexibilidad. A fin de proporcionar la flexibilidad
necesaria, los plastificantes de esteres ftálicos no se unen de forma covalente a las
resinas de plástico y son capaces de migrar en el medio ambiente (Hara et al., 2007).
Existe un gran número de focos rojos donde se liberan grandes cantidades de AT y sus
isómeros en el ambiente, la principal fuente de generación consiste en los residuos
generados durante la producción de estos compuestos los cuales se presentan en altas
concentraciones, también pueden ocurrir derrames accidentales alrededor de las
industrias químicas. Los principales compuestos en estas corrientes residuales son, en
orden decreciente de concentración: AT, ácido acético, ácido benzoico y ácido paratoluico (Macarie and Guyot, 1992; Kleerebezem et al., 2005a).
1
En recientes años la producción de AT mundial ha crecido rápidamente, se ha realizado la
evaluación y se tiene una producción mundial de 18.22 millones de toneladas en 1992 la
cual sufrió un aumento a 26.12 millones de toneladas (Kleerebezem et al., 2005a; Karthik
et al., 2008). En México, los isómeros ftálicos, considerados como plastificantes junto con
los adipatos y maleatos son utilizados en la industria para reducir la viscosidad, facilitan el
moldeo, aumentan la flexibilidad, añaden nuevas propiedades a la resina original y
combinan elasticidad, flexibilidad y dureza con resistencia mecánica. La Figura 1.1
muestra el aumento en los años recientes.
Figura 1.1. Crecimiento en la producción en México de AT. (Energía, 2007)
2. Antecedentes.
En diversos estudios ha sido posible calcular los parámetros de mayor importancia de
este proceso de degradación y se dice que por cada tonelada de AT manufacturada se
generan de 4–10 kgDQO/m3 con 5-20 gDQO/L, y 3-4 m3 de aguas residuales
(Kleerebezem et al., 2005a; Karthik et al., 2008).
El paso inicial tanto en la mineralización aerobia como en la anaerobia de los ácidos y
esteres ftálicos es la hidrólisis de las cadenas éster laterales, resultando en la formación
de monoalquil ftalato y ftalato. La vía de degradación más común del ftalato en procesos
2
aerobios es la vía del protocatecuato, seguida por la división del anillo y la completa
mineralización a dióxido de carbono y agua (Kleerebezem et al., 1999a). En varias
bacterias Gram negativas la degradación de estos compuestos ocurre por la vía cis-4, 5dihidroxiftalato a protocatecuato. Por otro lado, en las bacterias Gram positivas se
encontró que se degradaban mediante la vía 3, 4-dihidroxiftalato a protocatecuato
(Shigematsu et al., 2003; Choi et al., 2005; Hara et al., 2007).
2.1.
Estrategias de degradación. Físicos, químicos, biológicos
(anaerobios y aerobios)
Se han realizado diversos estudios con tratamientos físicos, químicos, biológicos como
tratamientos aerobios y anaerobios, con cepas puras o con consorcios microbianos con la
finalidad de biodegradar AT (Klebeerg et al., 1998; Abou et al., 2004; Choi et al., 2005).
Sin embargo, se consideran las siguientes estrategias de degradación como generales:
2.1.1. Tratamientos físicos
La sedimentación y la filtración son dos de los métodos físicos más usados para el lavado
de suelo y tratamiento de aguas residuales con contaminantes químicos y biológicos
(Bitton, 2005). En un trabajo posterior al desarrollado por Bitton (2005), se realizó la
extracción de contaminantes mediante coagulación floculación (Karthik et al., 2008) donde
se logró el aumento de la degradación en términos de velocidad DBO5/DQO, la cual se
incrementó de 0.45 a 0.67. El objetivo principal del trabajo de Karthik, fue evaluar la
conveniencia de los coagulantes para el pre-tratamiento de los efluentes, además de
mejorar la biodegradación de las aguas residuales que contiene ácido tereftálico usando
un proceso de coagulación floculación. Sin embargo, es importante mencionar que este
fue un pre-tratamiento por lo que en pasos posteriores fue necesaria la participación de
microorganismos para lograr la degradación.
2.1.2. Tratamientos Químicos.
Dentro de los métodos químicos podemos encontrar a la adsorción, absorción, la
precipitación con agentes químicos, entre otros (Bitton, 2005). Algunos de los métodos
más importantes están representados por los procesos de oxidación avanzada “AOP” por
sus siglas en ingles (oxidación fotocatalitica (UV-TiO2), ozonización, oxidación fenton
(Fe2+/H2O2), entre otros (Rajeswari and Kanmani, 2011). El trabajo antes mencionado
tuvo objetivo de evaluar los efectos sinérgicos de los procesos individuales y combinados,
mediante la comparación de la degradación a partir de procesos de oxidación avanzada,
3
como ya se ha comentado anteriormente se generan gran cantidad de efluentes que
contienen este tipo de contaminantes, sin embargo, a pesar del acuerdo para trabajar con
los AOP pocas aplicaciones industriales han sido reportadas.
2.1.3. Tratamientos Biológicos
Por otra parte, se han realizado investigaciones sobre la degradación del AT usando
microorganismos y dependiendo de su necesidad de oxigeno es que se han clasificado
como tratamientos anaerobios y aerobios. La degradación aerobia de este tipo de
contaminantes se lleva a cabo por cepas puras, las cuales degradan en un menor tiempo
los contaminantes comparado con los tratamientos anaerobios.(kleerebezem and
Lettinga, 2000; Campos-Tejeda et al., 2011)
Además de la aparición natural de los compuestos aromáticos y contaminantes, las
actividades humanas los han arrojado en grandes cantidades a la naturaleza a través de
la manufactura de productos plásticos, minería y combustión. Debido a que la remoción
de los ácidos y esteres ftálicos procede muy lentamente con tiempos de vida medios para
la hidrólisis química entre 4 meses y 100 años, el principal método para la degradación de
estos compuestos es la actividad microbiana (Kleerebezem et al., 1999c) la cual podemos
clasificarla en dos grupos, Anaerobia y Aerobia los cuales se describen a continuación.
Procesos Anaerobios. La mineralización anaerobia de una gran cantidad de compuestos
mono-aromáticos ha sido realizada usando inóculos de varios orígenes. Muchos
compuestos aromáticos con al menos un grupo funcional fenólico o carboxílico e incluso
hidrocarburos aromáticos como Tolueno y orto-xileno, se encontró que pueden ser
mineralizados bajo condiciones metanogénicas (Kleerebezem et al., 1999a). El método de
tratamiento tradicional de las aguas residuales generadas durante la producción de estos
compuestos aromáticos comprende un sistema de lodos activados, casi siempre
combinado con la incineración de los residuos sólidos producidos (Kleerebezem et al.,
1999c).
2.
Procesos Aerobios. Este tipo de tratamientos se lleva a cabo con cepas puras, esta
es una gran ventaja debido a que no se requiere del mantenimiento de un consorcio
microbiano además se simplifica la degradación del compuesto a solo una ruta
metabólica, sin embargo, se presenta la consecuencia de la producción en grandes
cantidades de biomasa lo cual unido a otros desechos genera lodos residuales. En la
4
siguiente sección se hablará con mayor detalle de los microorganismos que se han
usado para la degradación de ácido tereftálico de manera aerobia.
2.1.
Degradación de ácido tereftálico.
2.2.1. Microorganismos probados para la degradación aerobia de ácido tereftálico.
Se ha reportado que algunos de los microorganismos degradadores de ácido tereftálico
son:
Género Rhodococcus. Es posible encontrar distintos tipos de cepas degradadoras de
ácidos ftálicos. En una investigación realizada anteriormente (Bell et al., 1998a) se ha
dispuesto una descripción de este microorganismo, el cual, ha adquirido una gran
importancia debido a las habilidades metabólicas de varias de sus especies,
principalmente porque pueden degradar un amplio rango de contaminantes ambientales,
así como, transformar o sintetizar compuestos con posibles aplicaciones útiles.
El género Rhodococcus está formado por bacteria aerobias, Gram positivas, no móviles,
que contienen ácido micólico en la pared celular. Son actinomicetos que presentan “forma
de nocardio” (Goodfellow, 1989). El término “forma de nocardio” es morfológicamente
descriptivo y se refiere a crecimiento micelial con fragmentación en la biela o en los
elementos cocoides (Lechevalier, 1989).
En la bibliografía se ha reportado que bacterias del género Rhodococcus pueden
sobrevivir en suelos y en aguas residuales (Warhurst and Fewson, 1994), incluso en
condiciones adversas, por ejemplo escases de fuente de carbono y energía, además, otra
característica importante es que la asimilación de los contaminantes no se ve afectada por
la presencia de substratos más fácilmente degradables. Algunas cepas de Rhodococcus
son psicrofílicas lo cual es muy importante para la remediación en climas fríos (Koronelli,
1996; Yagafarova and Skvortsova, 1996).
Debido a esto, las bacterias del género Rhodococcus y algunos microorganismos
relacionados, han sido estudiados en diferentes microcosmos, en estas investigaciones se
han obtenido resultados interesantes, como el incremento del conteo de bacterias
oxidantes de hidrocarburos en suelos de composta contaminados con aceites, mediante
el inoculo de R. ruber (Christofi et al., 1998). Por otro lado, se debe comentar que este
actinomiceto también puede formar parte de sociedades de microorganismos, en este
caso, existe el estudio realizado con un consorcio aislado de esteras que flotaban en
5
aguas contaminadas con aceites en el golfo Arábigo, este grupo de microorganismos fue
inoculado en suelos arenosos dando como resultado el incremento en la remoción del
aceite, y observando que los microorganismos del género Rhodococcus aparecieron
como organismos predominantes en la población (Sorkhoh et al., 1995).
Otra de las cepas de Rhodococcus que ha adquirido gran importancia es la cepa RHA1, la
cual ha sido totalmente estudiada a tal grado que, en el reporte de Mcleod y sus
colaboradores (2006), han logrado secuenciar el genoma completo de esta cepa, el cual
está comprendido por 9,702,737 pb (67% G-C), arreglados en cromosomas lineares y tres
plásmidos lineares. Su gran importancia radica en que es un potente actinomiceto
degradador de compuestos como los bifenilos policlorados que están presentes en los
suelos contaminados. Este género de actinomicetos es muy variado en la cantidad de
cepas y funciones que presenta. Sin embargo, no es el único microorganismo que es
capaz de degradar los contaminantes ambientales (McLeod et al., 2006).
Figura 2.1. Vías (orto)-para la degradación del (cloro) catecol. a) vía 3 clorocatecol de una bacteria
Gram negativa. b) Vía 3 clorocatecol de R. erythropolis 1CP. c) Vía 4 clorocatecol de R. erythropolis
1CP. (Ferraroni et al., 2006)
6
Entre la variedad de microorganismos capaces de degradar fenoles halogenados se
encuentra la bacteria Gram positiva Rhodococcus opacus 1CP, que fue aislada por su
habilidad para mineralizar 2,4-diclorofenol también como 4-clorofenol mediante una vía
“orto” modificada. Más tarde se obtuvo una variante de R. opacus 1CP capaz de crecer en
2-clorofenol como única fuente de carbono y energía, donde se observo una vía que
provocaba una división orto, compuesta de enzimas con diferentes substratos específicos
con respecto a la vía 4-clorocatecol. En la Figura 2.1 se muestran las vías mencionadas
para Rhodococcus opacus (Ferraroni et al., 2006).
Delftia tsuruhatensis. Recientemente se ha aislado una bacteria asimiladora de AT
perteneciente al género Delftia, la cual puede usarlo como única fuente de carbono y
energía. Algunas de las características que dieron nombre al esta cepa, en base a los
análisis fenotípicos y genotípicos, son por ejemplo, la no detección del 3- hidroxioctanoato
(3-OH C8:0), el cual es un ácido graso característico de los miembros del genero Delftia, y
el contenido de G+C en el DNA aislado fue de 66.2% ligeramente menor a la media para
las cepas de este género. Shigematsu y colaboradores (2003) también describen a Delftia
tsuruhatensis, con las siguientes características: es Gram negativa, móvil, ligeramente
curva, sus células aparecen individualmente o en pares, el rango de temperatura para su
crecimiento es de 10 a 40°C, con el óptimo de crecimiento a 35°C, puede crecer en el
intervalo de pH de 5.0-9.0, con el óptimo en 7.0. El tiempo de duplicación es de 1.06 h
bajo óptimas condiciones de crecimiento. Es no fermentativa y presenta actividad de la
ureasa y división “meta” del protocatecuato. No tiene la capacidad de desnitrificación, sin
embargo, es capaz de reducir el nitrato. Es capaz de usar como fuente de carbono y
energía algunos compuestos como azucares, tereftalato y sus derivados (Shigematsu et
al., 2003).
Género Pseudomonas. Jiménez y colaboradores (2002) proponen, mediante análisis
proteómicos, que la cepa P. putida presenta cuatro principales vías para la degradación
de los intermediarios aromáticos centrales. (1) La rama del catecol de la vía del cetoadipato (división orto del anillo aromático) codificada por los genes cat; (2) La rama
del protocatecuato de la vía del -cetoadipato codificada por los genes pca; (3) La vía del
homogentisato codificado por los genes hmg/fah/mai y (4) la vía del fenilacetato codificada
por lo genes pha (Jimenez et al., 2002). Estas vías se muestran en la Figura 2.2.
7
El género Pseudomonas ha sido ampliamente usado como huésped para la clonación y
expresión de genes. P. putida KT2440 es conocida principalmente por su habilidad para
degradar compuestos aromáticos, y también se le considera como un huésped ideal para
el reclutamiento de genes de otros microorganismos mediante la transformación genética,
obteniendo así un amplio rango de sustratos que puede degradar y/o biotransformar en
productos de valor agregado (Jimenez et al., 2002).
Las cepas anteriormente mencionadas se encuentran en diferentes ambientes de donde
posiblemente pueden ser aisladas, algunos de los lugares más comunes para encontrar
los organismos celulares en su vida silvestre es el tema que se presenta a continuación.
2.2.1. Origen o fuente de los microorganismos degradadores de ácido tereftálico.
Algunas de las fuentes más utilizadas para el aislamiento de bacterias son las siguientes:
Suelo y sitios contaminados. Los diferentes tipos de bacterias pueden ser encontrados,
tomados y aislados del suelo, por ejemplo los actinomicetos se encuentran en grandes
cantidades en tierra fértil así como también podemos encontrar otro tipo de bacterias en
sitios contaminados con hidrocarburos del petróleo (Bell et al., 1998b; Jimenez et al.,
2002).
Agua. Es muy común poder aislar microorganismos de aguas, ya que existe una gran
diversidad de ambientes, lo que trae como consecuencia un muy amplio rango de
especies microbianas disponibles para su estudio, ya que va desde aguas profundas a
temperaturas bajo cero, hasta sedimentos que contienen consorcios microbianos
degradadores de compuestos azufrados (Jimenez et al., 2002; Wang and Gu, 2006).
Colecciones microbianas. Las colecciones microbianas son muy útiles, pues mantienen el
linaje de las especies, es decir, las mantienen puras, sin embargo, se debe pagar los
derechos de poder utilizar uno de estos microorganismos puros (WFCC, ATCC, CDBB
Cinvestav-México).
8
O
OMe
HO
Alcohol coniferilo
OH
O
Fenilalanina
?
O
Aldehido
coniferilo
HN
2
OMe
HO
Phh
AB
OH
O
HN
PO
coumar
O
Benzila
Tirosina
ato
OH
OH
Fe
mina
?
OH
O
s
CoA
Quin
Tyr
Ec
-OOC
Feruloil- S
COOO
HO ato
B1
OH
h
CoA
Benz
-OOC
Tyr
Ec
Ec
OH
V
O
OH
oato
4B2
h
h
dh
Ac
BenA
OH
O
4hidroxibenz
Pob
d
BC
OMe
QuiA
hidroxifenilpir
OH
oato
H
A
A
OH
QuiB
Cate
uvato
OH
OH
OH
Vanilina
?at -OOC
col
QuiC1?
Hpd
O
OH
1?
Cat
V
Van
Protocatec
O
A
dh -OOC
OMe AB
HO
COOuato
Vanilato
Pca
Homogentisat
COOCis-cisBetaOH
OHoo
GH
Muconato
O
carboxi-cis-OOC
Hm
COOOH V
Cat
cisO
COOCafeato
gA
muconato
B
dh
OH
O
COONH
Ec
Pca
O
O Muconola
h
B
O
ctona
-OOC
O
COOH
Fe
O
O
Gama
Malcilacetoac
H
s
Feniletila
carboximuconat
etato
Cat
Pca
-OOC
mina
O
?o
C
C
C
at
B
Fe
s
O
Feru
lato
O
NH2
2
OMe
O
2
O
O
H
Fenilacetal
dehido
-OOC
Pad
O
-OOC
O
Fenilacetat
o
PhE
O
O
Beta-cetoadipato
Pca enol-lactona
D
COOCOO- Betacetoadipat
Pca
o
IJ BetaCOSCoA
cetoadipilCOOO
O
CoA
Pca
O
F
+
O
S
CoA
Succinil-CoA
O
PhaFO
GHI
Pha
LPhaAB
Acetil-CoA
O
O
H
-OOC
H
Fumarilaceto
acetato
O
Fah
Acetoacetato
O
O
+
Fenilacetati
l-CoA
O
O
CoA
S
Mai
COO-
Fumarato
O
CoA
O
S
O
TCA cycle
CPD
Ciclo de los ácidos
tricarboxili
Figura 2.2 Vías y pasos bioquímicos para
el catabolismo de compuestos aromáticos en Pseudomonas putida KT2440 (Jimenez et
tricarboxilicos
al., 2002).
9
2.2.
Problemas generados por el tratamiento aerobio de ácido
tereftálico.
Es necesario comprender que de los sistemas de tratamiento del agua se generan lodos
como subproducto, provenientes ya sea de los sólidos propios del efluente o por la
formación de nuevos, como resultado de la transformación de los sólidos disueltos o
coloidales, así como también la generación de biomasa durante el proceso de tratamiento.
En los siguientes párrafos se hará una descripción de las características generales de los
lodos, los cuales en la actualidad se consideran como desechos.
2.3.1. Lodos.
Una consecuencia a considerar cuando se realiza el tratamiento de compuestos
aromáticos como el ácido tereftálico es la generación de una enorme cantidad de biomasa
los cuales se pueden considerar como lodos (Jiménez, 2001). Hay varios factores que
afectan a la producción y disposición de los lodos dentro de los cuales se encuentran las
Propiedades físicas, como concentración de sólidos, tamaño de partícula, la forma en la
que se encuentra el agua, las características reológicas de los lodos, drenabilidad, todas
estas características se relacionan directamente con la necesidad de transporte, de
secado o la posibilidad de la incineración. También se toman en cuenta las propiedades
químicas dentro de las que podemos encontrar olor, composición química, como resultado
de los procesos de tratamiento, los elementos químicos contaminantes del influente pasan
a formar parte de los lodos ya sea por precipitación en forma de sulfuros, óxidos,
bicarbonatos; por absorción; por quelación con compuestos orgánicos, o por partición
entre la fase solida y la liquida durante el proceso de separación de los sólidos. La
composición precisa depende de las características del agua residual que se trata y el
proceso que se lleve a cabo y por ultimo pasamos a las Propiedades biológicas, en las
cuales se busca determinar la cantidad de microorganismos patógenos para limitar el
manejo de los residuos.
Dependiendo de las propiedades del lodo es posible clasificarlos en cuatro tipos: lodos
líquidos (los cuales fluyen por gravedad), lodos plásticos (pueden ser bombeados), lodos
sólidos susceptibles de ser compactados (no se pueden bombear, pero su volumen
decrece en la medida que se secan) y lodos con volumen constante (no reducen volumen
al perder agua). Otra conclusión a la que se ha llegado es una cadena de jerarquías en la
que se ordenan los tratamientos de agua con respecto a qué cantidad de lodo generan y
10
decrece en el orden siguiente: procesos físico-químicos, sistemas biológicos aerobios y
por ultimo sistemas biológicos anaerobios.
Debido a la cantidad de sólidos ya mencionada anteriormente se tiene que proponer una
solución para el confinamiento o disposición. A continuación se hace referencia a los tipos
de disposición de los lodos.
2.3.2. Disposición de los lodos.
Los costos de las instalaciones para tratar los lodos pueden ser hasta del 50% del costo
total de la planta, por lo que la selección de los procesos que intervienen es de suma
importancia. El tratamiento se refiere a su estabilización (control de patógenos y vectores
más que a su digestión o mineralización. Las características de los tratamientos más
comunes en plantas municipales son: Espesamiento de los lodos por gravedad,
deshidratación, digestión anaerobia, digestión aerobia y estabilización química. En la
¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se presentan las ventajas y
esventajas de los tratamientos anteriores.
Otras formas de disposición para los lodos son las siguientes: Aplicación de biosólidos en
suelos, disposición de lodos en relleno sanitario y utilización de los lodos como composta.
11
Cuadro 2-1 Ventajas y desventajas de los principales procesos de estabilización de los lodos.
Proceso
Ventajas
Desventajas
Digestión
anaerobia.
Buena reducción de SSV (40% a 60%).
Los costos de operación pueden ser bajos si se
utiliza el gas metano.
Amplia aplicación.
Los sólidos obtenidos son apropiados para uso
agrícola.
Reducción de la masa total.
Bajos requerimientos netos de energía.
Digestión aerobia.
Bajo costo inicial, particularmente para plantas
pequeñas.
El sobrenadante es de mejor calidad que el
anaerobio.
Control operacional simple.
Amplia aplicación.
Bajo potencial de producción de olores con diseño y
operación apropiados.
Reduce la masa total.
Requiere que los operadores sean experimentados.
Pueden formarse espumas.
Los
organismos
metanogénicos
pueden
crecer
lentamente en “digestores ácidos”.
Se recobra lentamente después de un colapso.
Sobrenadante con alto contenido de DQO, DBO, SST y
NH3.
La limpieza es difícil.
Puede generar olores desagradables.
Alto Costo inicial.
Incrustación potencial de minerales.
Medidas de seguridad por la producción de gas
inflamable.
Alto costo de energía.
Generalmente, menor reducción de SSV que en
anaerobia.
pH y alcalinidad reducidos.
Se pueden formar espumas.
Potencial dispersión de patógenos por formación de
aerosoles.
El
lodo
es
típicamente
difícil
de
desaguar
mecánicamente.
Las bajas temperaturas afectan adversamente la
eficiencia.
El lodo es apropiado, principalmente para aplicación en
suelos ácidos.
Incrementa la masa de sólidos.
Estabilización con Bajo costo.
cal.
Fácil operación
Bueno como método emergente de estabilización.
Fuente:(Jiménez, 2001)
12
2.3.
Área de oportunidad.
Es sabido que los costos por instalaciones para el tratamiento de lodos puede ascender al
50% del total de los costos de la planta, por lo que es de suma importancia la elección de
los procesos que intervienen en el tratamiento (Jiménez, 2001) y es de importancia el
desarrollo de nuevas alternativas dentro de este mismo rubro de tecnologías para mejorar
la eficiencia y costo de los procesos. Una de ellas puede ser la ingeniería genética, de la
cual se da una breve descripción a continuación.
2.4.1. Ingeniería Genética y biotecnología.
La biotecnología es el uso de organismos vivos para llevar a cabo procesos químicos
concretos destinados a la aplicación industrial o comercial. En nuestros días el uso que se
le da a la palabra biotecnología implica que el organismo que se ha utilizado para llevar a
cabo el proceso ha sido manipulado mediante técnicas genéticas in vivo e in vitro.
La mayor parte de la ingeniería genética se basa en la clonación molecular. En esta un
fragmento de ADN procedente de prácticamente cualquier tipo de elemento genético
compuesto de un ADN bicatenario, se recombina con un vector y se introduce en un
hospedero adecuado. En muchos casos, la aplicación biotecnológica especifica no solo
depende de la capacidad para identificar y clonar un gen, sino también de la manipulación
que se haga de la expresión del gen para producir e identificar la proteína (Madigan et al.,
2004).
Es aquí donde entra en juego la clasificación que se les da a los hospedadores para
vectores de clonación.
Si lo que se desea es sólo obtener grandes cantidades de ADN clonado, las
características ideales de un hospedador son el crecimiento rápido, la capacidad para
crecer en un medio de cultivo barato, la ausencia de potencial nocivo o patógeno, la
capacidad para absorber el ADN y la estabilidad en el cultivo. El hospedador debe
disponer de las enzimas necesarias para permitir la replicación del vector. Como ejemplo
se tienen (Madigan et al., 2004):

Hospedadores procarióticos (Escherichia coli y Bacillus subtilis).

Hospedadores eucarióticos (Saccharomyces cerevisiae).
13
Desde hace tiempo se han realizado infinidad de estudios en busca del clon idóneo. Y es
por eso que se han buscado diferentes organismos hospedadores, diferentes técnicas y
mejoramiento de estas técnicas para que los resultados de clonación sean los mejores
(Madigan et al., 2004; Seleem et al., 2008; Donofrio et al., 2010).
La práctica de la ingeniería genética suele comenzar con el aislamiento de un clon que
contiene el gen de interés. En este punto, se hace mención de algunas de las formas que
pueden utilizarse para identificar un clon original. Para clonar el ADN puede utilizarse una
gran variedad de métodos. Por ejemplo es posible crear bibliotecas de genes (genotecas)
a partir de un DNA genómico total o simplemente clonar un fragmento de ADN mediante
PCR. En primer lugar consideramos la situación en la que el gen se expresa (es decir, en
la que la proteína se sintetiza) en el hospedero de clonación (Madigan et al., 2004).
Es por esta razón que se ha observado un área de oportunidad mediante la aplicación de
las herramientas de la ingeniería genética, con las cuales se puede lograr la
transformación genética de uno de los microorganismos degradadores de AT y en
investigaciones sucesivas lograr mejorar la degradación de este compuesto contaminante.
2.4.2. Microorganismos genéticamente transformados que han sido exitosos en la
industria.
Uno de los hechos más comunes en la industria es la actualización de las tecnologías de
proceso, lo que lleva desde el mejoramiento de equipos hasta la búsqueda de mejores
microorganismos que realicen el trabajo en menor tiempo y con mayor eficacia, es aquí,
donde en éste particular caso inicia el papel de la ingeniería genética en los procesos
industriales.
Mediante las herramientas provistas por la manipulación genética se ha logrado beneficiar
al género humano, desde una simple fermentación hasta la producción de protoenzimas.
Dentro de este rubro podemos encontrar la transformación genética de algunos
microorganismos que han sido exitosos en el campo de la industria. Por ejemplo,
Escherichia coli la cual es enfocada a la clonación de DNA y expresión de DNA exógeno
(Cohen et al., 1972; Hanahan, 1983), también es posible encontrar a Corynebacterium
glutamicum la cual se ha enfocado a la producción industrial de aminoácidos (Kirchner
and Tauch, 2003) y por ultimo otro organismo que ha sido estudiado y utilizado es
Saccharomyces cerevisiae utilizado para la producción de etanol (Hughes et al., 2009).
14
Es posible que logrando la obtención de un protocolo para la transformación genética de
estos microorganismos como Brevundimonas sp. y Rhodococcus sp., los cuales ya se ha
comprobado que son degradadores de AT (Warhurst and Fewson, 1994; Campos-Tejeda
et al., 2011), se puedan mejorar las capacidades de degradación de estas cepas, lo que
permitiría que la generación intensiva de biomasa no se vea como lodos, los cuales serán
tratados como un desecho, sino que al modificarlos puedan ser considerados como
productores de compuestos de interés industrial, así como todo tipo de productos que
pudieran ser requeridos en grandes cantidades.
15
3. Justificación
Debido al crecimiento económico que se ha basado en el uso intensivo de materias
primas y energía, se han generado diversos contaminantes resistentes a la degradación
química o física, por lo que se han provocado problemas al medio ambiente, tal es el caso
del ácido tereftálico contenido en las aguas residuales de tipo industrial.
El ácido tereftálico es un compuesto contaminante que cuando está presente en el medio
ambiente tiene un efecto teratogénico y carcinogénico. De esta forma es necesario
encontrar una vía de degradación del ácido tereftálico que se encuentra en dichas
corrientes, una alternativa es a partir de microorganismos aerobios, estos pueden ser
transformados genéticamente para la alta eficiencia de degradación de ácido tereftálico y
al mismo tiempo que la generación de lodos durante la biodegradación de este compuesto
no sean un residuo, sino que pueda generar un metabólito de interés.
La contribución de este trabajo es la posibilidad de que microorganismos poco estudiados
sean capaces de seguir degradando el AT, después de que hayan sido transformados
genéticamente.
16
4. Hipótesis
La transformación genética de CGO-01, CG0-02, J1 y/o J2 no afectará las variables
específicas de crecimiento, así como tampoco la capacidad de degradación de AT.
5. Objetivos
5.1.
Generales.

Aislar e identificar los microorganismos nombrados CGO-01, CGO-02, J1 y/o J2.

Llevar a cabo la transformación genética de las cepas CGO-01, CGO-02, J1 y/o J2
para determinar las variables de crecimiento y averiguar si existe alguna diferencia
en la biodegradación de AT.
5.2. Particulares.
 Identificar los microorganismos nombrados CGO-01, CGO-02, J1 y/o J2, mediante
la secuenciación del gen 16S.
 Realizar la transformación genética de los microorganismos CGO-01, CGO-02, J1
y J2 mediante los protocolos propuestos, utilizando los plásmidos BlueScrip II, pET
28b y pUC 18.
 Determinar la capacidad de degradación de las cepas CGO-01, CGO-02, J1 y J2
para la biodegradación de AT y se comparará la degradación de AT de las cepas
originales y las transformadas genéticamente.
 Llevar a cabo cinéticas de crecimiento de los microorganismos y degradación de
AT.
17
6. Materiales y métodos.
La estrategia experimental se explica a grandes rasgos a continuación: Se identificaron
las cepas nombradas como CGO-01, CGO-02, J1 y J2 mediante la secuenciación del gen
16S, se realizó la extracción del DNA genómico y la amplificación de la región
comprendida por este gen mediante PCR, como siguiente paso se realizó la
secuenciación del ADN extraído y se realizó la comparación de este ADN con el reportado
en las bases de datos (NCBI). Además, se realizaron las cinéticas de crecimiento de los
microorganismos mencionados arriba mediante el protocolo de la APHA (1989). Y se
midió la degradación de AT mediante la técnica de HPLC desarrollado en este trabajo, en
cual se trabaja con H2SO4 0.005M como fase móvil en una columna Aminex HPX-87H de
exclusión de Iones. En la Figura 6.1 se hace referencia a la estrategia experimental que
se uso para la resolución del problema planteado en esta tesis.
Identificación de los
microorganismos
mediante
la
secuenciación del gen
16S.
Transformación genética
de las cepas.
Cinéticas de crecimiento
y degradación con la
cepas transformadas y
sin transformar.
Figura 6.1. Estrategia metodológica.
18
6.1.
Materiales
6.1.1. Reactivos y soluciones.
Reactivos.
Los reactivos que se usaron en el desarrollo de esta tesis son los siguientes: Ácido bórico,
ácido clorhídrico, ácido tereftálico, ácido sulfúrico, agua destilada, agua tridestilada, agua
desionizada, CaCl2·2H2O, CH3CN (grado HPLC), CH3OH (grado HPLC), EDTA, K2SO4,
KH2PO4, NaOH, NH4NO3, MgCl2·6H2O, MgSO4·7H2O, polietilenglicol, tris base, sacarosa.
Soluciones para HPLC.
Fase móvil para el HPLC. Se realizó una solución H2SO4 0.005 M: CH3CN (87.5:12.5). en
la cual se agregó 1.17 mL de ácido sulfúrico a 436.33 mL de agua, para tener una
concentración 0.005 M, posteriormente se añadieron 62.5 mL de acetonitrilo (grado
HPLC).
Soluciones utilizadas en los métodos de biología molecular..
Buffer P. Para realizar la solución del buffer P se requirió de 10.3 g sacarosa, 25 mg de
K2SO4, 202 mg MgCl2·6H2O disolver en 80 mL de agua y esterilizar. Lo siguiente que se
agregó fue 1 mL de 0.5% [p/v] KH2PO4, 10 mL de 3.68% [w/v] CaCl2·2H2O.
TBE 5X y 0.5X (Sambrook et al., 2001). El TBE se realizaba usualmente a una
concentración de 5X para su almacenamiento. Y se preparaba de la siguiente manera se
requería de 54g de tris base, 27.5 de acido bórico, 20 mL de 0.5 M EDTA (pH 8.0). La
solución concentrada tenía un pH de aproximadamente 8.3. Era necesario diluir el buffer,
antes de usarlo para obtener la concentración de 0.5X.
6.1.2. Equipo y Medios de cultivo.
Campana de flujo laminar. CFLV 101, SEV MR, México.
Centrifuga. Rotor Sorvall GSA.
Columna BIO RAD. Columna Aminex HPX-87H Ion exclusion Column 300mm X 7.8 mm.
Espectrofotómetro. Lambda XLS, Perking Elmer, Reino Unido.
Fotodocumentador. Gel Logic 440 imaging system, Kodak, EUA.
19
Fuente de poder para electroforesis. EPS 601, Amersham bioscience, Reino unido.
HPLC. Detector de arreglo de diodos Varian Pro Star 335, EUA.
Incubadora orbital. Prendo INO-650 M. México
Medidor de pH/mV/ºC. pH 510 series, Oakton, Malaysia.
Microcentrifuga. HERMLE Z 233 MK-2. Alemania.
Parrilla de agitación y calentamiento. Cimarec, Barstead-Thermolyne, EUA.
Termociclador. Multigene Mini2, Labnet, Reino Unido.
Medios de cultivo
Medio Luria-Bertani. Para realizar 1 L de este medio se requirió de triptona 10 g, extracto
de levadura 5 g, cloruro de sodio 10 g, se ajusta el pH a 7. Dependiendo si será medio
solido se agregan 15 g de agar. Por último debe ser esterilizado a 121ºC por 15 minutos.
Medio con ácido tereftálico. Para realizar 1 L de medio de ácido tereftálico fueron
agregados 5 g del mismo, NH4NO3 0.814 g, KH2PO4 0.150 g, MgSO4·7H2O 0.075 y NaCl
0.075 g. Por motivos de disolución se agregó además
NaOH 1.24 g, esto es para
convertir el ácido tereftálico en la sal, es por ello que se requiere de 2 moles de NaOH por
cada mol de ácido.
6.1.3. Microorganismos.
Las cepas madre fueron aisladas de aguas residuales del canal del rio de los remedios
(México, D.F.) en trabajos realizados anteriormente por el grupo de trabajo, en los cuales
se llevó a cabo el aislamiento de los microorganismos degradadores de estos compuestos
bajo condiciones aerobias y en cultivo mixto.
Los microorganismos que se usaron en este trabajo fueron aislados de dos cepas madre
(J1 y J2) congeladas a -70C. De estás, fueron tomados cuatro diferentes cultivos a los
cuales se les nombró CGO-01, CGO-02, J1 y J2 Además se realizaron todos los métodos
de biología molecular y manipulación genética con la cepa Escherichia coli DH5para
tener un control positivo. Para el aislamiento de las líneas puras se sembraron las cuatro
cepas en medio selectivo de ácido tereftálico así como también en medio enriquecido
Luria-Bertani.
20
6.1.4. Plásmidos
Las principales características de los plásmidos con los cuales se trabajó en esta tesis
son las siguientes:
BlueScript II (Fermentas, Thermocientific, Canadá)

Tiene una longitud de 2961 pb, contiene MCSs y promotor al lado del MCS,
contiene el gen lacZ que codifica para la región N-terminal de la betagalactosidasa.

Además contiene: f1 (IG) – la región intergénica del fago f1, rep (pMB1)-el replicón
pMB1 responsable por la replicación del plásmido, el gen bla (ApR) que codifica
para la beta-lactamasa la cual confiere resistencia a ampicilina y lacZ la parte 5’terminal de este gen.
pET 28b (EMD, Merck, Alemania)

Es un plásmido con 5368 bp. Los genes clonados se encuentran bajo el estricto
control de las señales de transcripción y translación del bacteriófago T7. La RNA
polimerasa es tan selectiva y activa que cuando se induce totalmente, casi todas
las maquinaria celular es utilizada para la expresión.
pUC 18 (Fermentas, Thermocientific, Canadá)

pUC 18 es pequeño, tiene un alto número de copias, es un plásmido de E. coli,
tiene una longitud de 2686 pb.

El plásmido pUC 18 contiene: pMB1 replicón rep responsable por la replicación del
plásmido, el gen Bla que codifica para la beta-lactamasa, la cual confiere la
resistencia a ampicilina, la región de E. coli lac operón el cual contiene el sitio de
unión de la proteína CAP, el promotor P lac, el represor lac y la parte 5’-terminal del
gen lacZ que codifica para la parte N-terminal del fragmento de la betagalactosidasa.
21
6.2.
Métodos
6.2.1. Métodos para la identificación de cepas CGO-01, CGO-02, J1 y J2.
Extracción de DNA.
La extracción del DNA se realizó ya sea por el método de la lisis alcalina o mediante el
uso del Charge Switch® gDNA minibacteria KIT.
Lisis Alcalina.
1. Se inocularon 2 mL de medio enriquecido LB que contiene los antibióticos apropiados
con una colonia de bacteria. Y se Incubó el cultivo toda la noche a 37ºC con agitación
vigorosa.
2. Se colocaron 1.5 mL del cultivo en un tubo de microcentrífuga, y centrifugaron a
máxima velocidad por 30 s a 4ºC. Después se almacenó la porción del cultivo no
utilizada a 4ºC.
3. Fue removido el medio sobrante, por decantación, dejando el pellet bacteriano lo más
seco posible.
4. Posteriormente fue resuspendido el pellet bacteriano en 200 L de solución de lisis
alcalina I fría (a 4ºC) y se agitó mediante el vortex con agitación vigorosa
5. Se adicionaron 200 L de la solución de lisis alcalina II fresca al tubo. Cerrar el tubo y
mezclar por inversión rápida 5 veces. No usar vortex.
6. Subsiguientemente fueron adicionados 200 L de la solución de lisis alcalina III fría a
4ºC. Se cerró el tubo y fue mezclado por inversión varias veces. Al final de este paso
el tubo fue almacenado en hielo por un intervalo de tiempo de entre 3-5 minutos.
7. Se centrifugó a velocidad máxima por 5 minutos a 4ºC en microcentrífuga,
posteriormente el sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo.
8. Posteriormente se adicionó un volumen de fenol-cloroformo (250 L: 250 L) y se
mezclaron las fases acuosas y orgánicas por vortex, después fue centrifugado a
máxima velocidad por 2 minutos a 4ºC. Y se transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo.
9. Los ácidos nucleicos fueron precipitados por la adición de 2 volúmenes de etanol a
temperatura ambiente, se mezclaron los ácidos y la solución mediante el vortex,
además se incubaron por 2 minutos a temperatura ambiente.
10. Los ácidos nucleicos fueron precipitados y recolectados por centrifugación a máxima
velocidad por 10 minutos a 4ºC.
22
11. El sobrenadante fue removido por decantación. A continuación se dejó el tubo en
posición invertida en una sanita y se removieron los residuos con una pipeta.
12. Se adicionó 1 mL de etanol al 70% al pellet y se mezcló por inversión varias veces. La
recuperación del DNA fue realizada por centrifugación a velocidad máxima por 2
minutos a 4ºC.
13. El sobrenadante fue removido por decantación, y se cuidó que el pellet no se
despegará, pues en ocasiones no queda fijo en el tubo.
14. Se removieron todos los residuos de etanol, a continuación se dejó el tubo abierto y se
colocó a temperatura ambiente hasta que se evaporó todo el etanol (5-10 minutos).
15. Los ácidos nucleicos se disolvieron en 50 L de agua milli Q estéril y agitaron con
vortex. Por último se dejaron almacenados a 4ºC.
Charge Switch® gDNA minibacteria KIT (Invitrogen, EUA). El protocolo se basa en el las
instrucciones del proveedor, y se describe a continuación.
Lisis celular.
1. Se usaron baños de agua a las siguientes temperaturas 37ºC, 55ºC y 80ºC.
2. De un cultivo crecido por una noche, las células fueron recuperadas por
centrifugación, en un volumen de 0.5 mL.
3. Se resuspendió el pellet celular en 100 L de buffer de resuspensión (R4) conteniendo
RNasa A y 5 L de solución de lisozima (50 mg/mL) y se agitó mediante pipeteo o
agitación en vortex. Hay que asegurarse de que las células están distribuidas
uniformemente.
4. Se incubó la muestra por 10 minutos a 37ºC.
5. Durante la incubación, se pre-mezclaron 500 L buffer de lisis (L14) con 10 L de
solución proteinasa K para cada muestra.
6. Fueron agregados los 500 L de mezcla cada muestra y agita el tubo por inversión 6
veces.
7. Se Incubaron las muestras de la siguiente manera:

Bacteria Gram Negativa, incubar por de 1-1.5 h a 80ºC.

Bacteria Gram positiva, incubar por 10 minutos a 55ºC.
Unión del DNA a as perlas
23
1. Se agitó por vortex el tubo que contiene las perlas magnéticas hasta que se
resuspendieron y distribuyeron uniformemente en el buffer de almacenamiento.
2. Posteriormente se agregaron 40 L de buffer con perlas magnéticas a la muestra del
paso 7, protocolo anterior.
3. Fue necesario agitar mediante pipeteo suave, teniendo cuidado de no formar burbujas.
4. A continuación se añadieron 300 L de buffer de enlace (B8) y se agitó en vortex de 12 segundos.
5. Después, se incubó por 1 minuto en un cuarto de temperatura.
6. Y se colocó en la muestra en el MagnaRack® gradilla magnética por 1 minuto o hasta
que las perlas formaron un pellet
7. Sin remover el tubo de la gradilla, cuidadosamente se removió el sobrenadante sin
tocar el pellet, se descartó y se procedió al lavado de DNA
Lavado de DNA.
1. En este paso fue retirado el tubo con las perlas magnéticas de la gradilla.
2. A continuación se agregó 1 mL de buffer de lavado (W12) a el tubo y se mezclo
mediante pipeteo suave 3 veces sin formar burbujas.
3. En seguida se colocó la muestra sobre la gradilla magnética por 1 minuto o hasta que
se formo el pellet.
4. consecutivamente, se retiró el sobrenadante, teniendo cuidado de no tocar el pellet. Y
fue descartado.
5. Y nuevamente se retiró el tubo de la gradilla magnética.
6. Se repitieron los pasos del 2-4.
7. Inmediatamente se procedió a la elución del DNA.
Elución del DNA
1. Se retiró el tubo que contenía la muestra de la gradilla.
2. Posteriormente se agregaron 200 L de buffer de elución (E5) a el tubo y se mezcló
por pipeteo de 5-10 veces, sin permitir la formación de burbujas.
3. Se colocó por 5 minutos en una incubadora a 37ºC.
4. Y nuevamente se puso el tubo en la gradilla magnética.
5. Sin remover el tubo de la gradilla se retiró cuidadosamente el sobrenadante que
contienen el DNA y se coloco en un tubo de microcentrífuga estéril.
6. Se descartaron las perlas magnéticas y se almacenó a -20ºC.
24
PCR.
El método desarrollado se basa en el protocolo del proveedor del Kit Taq DNA
Polymerase, Recombinant (Invitrogen, Brasil). El cual se describe a continuación, se
agregaron los reactivos listados en la Cuadro 6-1 componentes a un tubo estéril para
microcentrífuga de 0.5mL y fueron colocados en un baño de hielo.
Cuadro 6-1 Reactivos usados para la reacción de PCR
Concentración Volumen (L)
Componentes
PCR buffer menos Mg
10X
5
Mezcla dNTPs
2mM
5
Primer Forward
10mM
1
Primer Reverse
10mM
1
MgCl2
50mM
2
Taq DNA polymerase
5U/L
0.2
DNA
n/a
5
Agua destilada
n/a
Hasta 50
n/a = no aplica, primers universales para el gen 16S rRNA.
Para iniciar se recomienda, que los reactivos sean mezclados en caso de que se fueran a
realizar múltiples reacciones, a esta unión de reactivos se le llamó mix, esto se hizo con el
fin de minimizar perdidas de reactivos y tener mayor precisión en el pipeteo.
Posteriormente se separó el volumen del mix en el número de reacciones necesarias en
tubos para PCR, se agregó el DNA molde y se inició la reacción en el termociclador
(Multigene Mini24, Labnet, Reino Unido) con las condiciones mostradas en el Cuadro 6-2
Condiciones necesarias para llevar a cavo la PCR.Cuadro 6-2
Cuadro 6-2 Condiciones necesarias para llevar a cavo la PCR.
Etapa
Temperatura (ºC) Tiempo (min)
Activación de la Polimerasa
94
3
Desnaturalización
94
0.5
Alineamiento
57
0.5
Extensión
72
0.5
Enfriado
30
3
30 ciclos
25
Por último, se analizó la amplificación de los productos mediante el uso de la
electroforesis en gel de agarosa ayudados por el estándar de peso molecular apropiado.
Reacciones de secuenciación.
Para realizar la secuenciación, se envió el DNA a secuenciar al Instituto Nacional de
Medicina Genómica (INMEGEN, México DF) y por otra parte, a la compañía MACROGEN
(Seúl, Corea), las secuencias se recibieron en formato digital (.ab1) los cuales se
analizaron y editaron con el programa BIOEDIT (Carlsbad, C.A., EUA, disponible en red:
http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) y fueron comparadas en “BLAST” (Basic
Local Alignment Search Tool, por sus siglas en ingles, NCBI, disponible en red:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) obteniendo así, la identificación de de cada una de
las cepas de interés.
Determinación de resistencia a antibióticos
Se realizaron pruebas sencillas para observar la mínima concentración inhibitoria que los
antibióticos generan sobre los microorganismos ensayados, se emplearon kanamicina
(KAN), espectinomicina (Spec), ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet). Aplicando una serie
de siembras con los cuatro antibióticos a diferentes concentraciones en medio de ácido
tereftálico, lo cual es posible observar en el Cuadro 6-3.
Cuadro 6-3 Determinación de la concentración mínima inhibitoria.
Concentración de
30
50
100
150
200
300
antibiótico (g/mL)
CGO-01 CGO-01 CGO-01 CGO-01 CGO-01 CGO-01
Microorganismo
CGO-02 CGO-02 CGO-02 CGO-02 CGO-02 CGO-02
J1
J1
J1
J1
J1
J1
J2
J2
J2
J2
J2
J2
Por otra parte, se realizó la prueba de susceptibilidad para la cepa transformada tomando
como control la cepa silvestre, a las mismas concentraciones usando solamente la
Kanamicina como antibiótico en medio de AT.
26
6.2.2. Métodos para la transformación genética de las cepas
Método del cloruro de calcio para realizar células competentes.
Método del Cloruro de Calcio reportado por (Sambrook et al., 2001): Se tomó una colonia
aislada (de 2-3 mm de diámetro) de una placa que haya sido crecida de 16-20 h e
incubada a 37ºC o 30ºC (Dependiendo la cepa con la que se está trabajando). La colonia
transfirió en 50 mL de medio LB en un matraz de 250 mL, esto se incubó durante 4 horas
a la temperatura correspondiente con agitación vigorosa. Se transfirió el cultivo bacteriano
a un tubo falcón de 50 mL frio, y se almacenaron los tubos por 10 minutos a una
temperatura de 0ºC. Las células fueron recuperadas por centrifugación a 4100 rpm en un
rotor Sorvall GSA por 10 minutos a 4ºC. El medio contenido en los tubos fue decantado,
posteriormente fueron colocados en posición invertida sobre una toalla de papel por 1
minuto para permitir que el medio sea secado totalmente. Cada Pellet fue resuspendido
mediante pipeteo cuidadoso o vortex suave en 30 mL de solución de CaCl 2 0.1M. Y se
recuperaron las células mediante centrifugación a 4100 rpm en un rotor Sorvall GSA por
10 minutos a 4ºC. El medio contenido en los tubos fue decantado, posteriormente fueron
colocados en posición invertida sobre una toalla de papel por 1 minuto para permitir que el
medio sea secado totalmente. Y por último se resuspendió el pellet mediante pipeteo
cuidadoso o vortex suave en 2 mL de solución de CaCl 2 0.1M por cada 50 mL del cultivo
original.
Método del Cloruro de Calcio Modificado para realizar células competentes.
Para Iniciar se tomó una colonia aislada (de 2-3 mm de diámetro) de una placa que haya
sido crecida de 16-20 h e incubada a 37ºC o 30ºC (Dependiendo la cepa con la que se
está trabajando). Se transfirió la colonia a 50 mL de medio LB en un matraz de 250 mL,
esto se incubó durante 4 horas a la temperatura correspondiente con agitación vigorosa.
Posteriormente se transfirió el cultivo bacteriano a un tubo falcón de 50 mL frio,
almacenando los tubos por 10 minutos a una temperatura de 0ºC. Las células fueron
recuperadas por centrifugación a 4100 rpm en un rotor Sorvall GSA por 10 minutos a 4ºC.
Se decantó el medio de los tubos y colocarlos en posición invertida sobre una toalla de
papel por 1 minuto para permitir que el medio sea secado totalmente. Se resuspendió
cada pellet mediante pipeteo cuidadoso o vortex suave en 20 mL, 10 mL y 5 mL de
solución de CaCl2 0.1M en diferentes pasos. Se recuperaron nuevamente las células
mediante centrifugación a 4100 rpm en un rotor Sorvall GSA por 10 minutos a 4ºC para
cada uno de los pasos anteriormente realizados. El medio contenido en los tubos fue
27
decantado, y se colocaron en posición invertida sobre una toalla de papel por 1 minuto
para secar totalmente. Por último se resuspendió el pellet mediante pipeteo cuidadoso o
vortex suave en 2 mL de solución de CaCl2 0.1M por cada 50 mL del cultivo original.
Para los dos métodos anteriormente descritos, en este punto pueden usarse las células
directamente para la transformación como se describe en los siguientes pasos o realizar
alícuotas y congelarlas a -70ºC.
Métodos utilizados para las transformaciones genéticas:
Células competentes e inserción de los plásmidos Bluescrip II, pUC 18 y pET 28b
(Sambrook et al., 2001)
Se deben Incluir los debidos controles positivo y negativo para la transformación. Se
transfirieron 200 L de cada suspensión de células competentes a un tubo eppendorf frio
usando una punta de micropipeta fría. Posteriormente se agregó el plásmido, tomando en
cuenta que se trabajó con tres diferentes Bluescrip II, pUC 18 y pET 28b se debe agregar
solo con el que se esté trabajando en momento (no más de 50 ng en un volumen de 10 L
o menos) por cada tubo y se mezcló, después se almacenó en hielo por 30 minutos. A
continuación se transfirieron los tubos a un baño con recirculación precalentado a 42ºC
por exactamente 90 segundos, no agitar los tubos. Los tubos se pasaron a un baño de
hielo de 1-2 minutos. Posteriormente se agregaron 800 L de medio LB, y se incubaron
por 45 minutos en un baño establecido con anterioridad a una de 37ºC para permitir que
la bacteria se recupere y se exprese la resistencia al antibiótico codificada por el
plásmido. Se transfirió el volumen apropiado (Arriba de 200 L por placa 90 mm) de
células competentes transformadas en medio LB solido que contenía el antibiótico
apropiado. Por último se almacenaron las placas a la temperatura adecuada hasta que el
líquido fue absorbido, después se deben invertir las placas, y las colonias deben aparecer
entre 12-16 horas.
Método de transformación para el género Arthrobacter
El método para la transformación de Arthrobacter fue reportado (Roberts et al., 1987). En
este estudio se adapta un protocolo de transformación para el género Streptomyces y se
realizó de la siguiente manera. Se inoculó un volumen conocido de medio con una colonia
de Arthrobacter y se dejó crecer por una noche a una temperatura de crecimiento de
30ºC, posteriormente se realizó una dilución 1:10 y se colocó en una incubadora
preestablecida a 30ºC por 4 h para su crecimiento. Fueron tomados 10 mL del cultivo
28
anterior y se cosecharon las células mediante centrifugación a 5000 rpm a 22ºC por 8
minutos. El pellet fue lavado con 7.5 mL de una solución de sacarosa al 10.3% y
resuspendido en 2 mL de buffer P el cual contenía 5 mg de lisozima/mL. El cultivo fue
incubado a 30ºC con agitación esporádica. Después de 1 h se agregaron 2.5 mL de buffer
P y se incubó por 1 h más resultando en la formación de protoplastos osmóticamente
sensibles. Estos fueron centrifugados a 5000 rpm y 22ºC por 10 minutos, lavados con 5
mL de buffer P y entonces fue resuspendido en 0.3 mL de buffer P. Se separó en
alícuotas de 50 L, fue agregado el plásmido a estás alícuotas, dependiendo del plásmido
con el que se estuviera trabajando, contenido en un volumen de 1-10 L y se mezcló
mediante inversión cuidadosa. Inmediatamente después se agregaron 200 L de buffer P
adicionado con 50% de polietilenglicol 1000, agitando cuidadosamente por pipeteo. Las
muestras fueron diluidas con 750 L de buffer P agitando por inversión de 2-3 veces. Se
realizaron las diluciones apropiadas para poder sembrar en medio agar LB y crecer a
30ºC por 24 h o hasta que se presente crecimiento. Por último se observaron las colonias
transformadas.
Extracción de DNA plasmídico.
El método usado se basa en el protocolo insertado en el Kit QIA prep Spin Miniprep, el
cual contiene los siguientes materiales: Buffer P1, P2, N3, PB, PE, EB y se requirió de
una microcentrífuga. Se inocularon 5 mL de medio LB con las cepas CGO-01, CGO-02,
J1 y J2. Posteriormente se dejó crecer por una noche a la temperatura especifica de
crecimiento, a partir de este cultivo se llena un tubo eppendorf de 1.5 mL, el cual se
centrifuga a velocidad máxima por 3 min. Este paso se debe repetir hasta que se termine
el pre-cultivo y formar así un pellet. Este pellet se resuspendió en 250 L de buffer P1 y se
transfirió a un tubo para centrifuga, se agregaron 250 L de buffer P2 y se mezcló
cuidadosamente invirtiendo el tubo de 4-6 veces, posteriormente se agregaron 350 L de
buffer N3 y se mezcló inmediatamente, de manera cuidadosa invirtiendo el tubo de 4-6
veces, y se centrifugó el tubo por 10 minutos a 13000 rpm, posteriormente se pasó el
sobrenadante a una columna QIA prep por decantación o pipeteo. Nuevamente se
centrifugó de 30-60 s y se decantó el filtrado, como siguiente paso se lavó la columna
agregando 500 L de buffer PB y nuevamente se centrifugó por de 30-60 s y se decantó
el filtrado. La columna se lavó nuevamente agregando 750 L de buffer PE y se centrifugó
de 30-60, se decantó el filtrado y se centrifugó por 1 minuto más para remover el buffer
residual. Por último se transfirió la columna a un tubo de centrífuga y se eluyó el DNA
29
agregando 50 L de buffer EB o agua, se esperó durante 1 minuto mientras se realiza la
elución y se centrifugó por 1 minuto. El volumen de elución puede variar dependiendo que
tan concentrada se encuentre la muestra a tratar.
Electroforesis en gel.
La electroforesis fue realizada mediante un protocolo estándar tomado del manual de
laboratorio para biología molecular (Sambrook et al., 2001). A continuación se describe el
protocolo utilizado:
1. Se sellaron los bordes de un placa de vidrio limpia y seca, o por otro lado, era posible
usar la bandeja de plástico provista con el aparato de electroforesis, sellando los
bordes con masking tape . Se colocó el molde en la sección horizontal de la bandeja.
2. Se preparó suficiente buffer de electroforesis (TBE al 0.5X) para llenar el tanque y
colocó el gel dentro del mismo (es importante usar el mismo lote de solución para que
no se presente variación en pH o fuerza iónica).
3. Se preparó la solución de agarosa en el buffer a la concentración apropiada (1% de
agarosa) para lograr una mejor separación con respecto al tamaño esperado del
fragmento en la muestra de DNA. Se preparó en un matraz de Erlenmeyer agregando
1 g de agarosa y 100 mL de buffer.
4. Con una toalla de papel se tomó el matraz por el cuello, teniendo cuidado de no
apretarlo demasiado, y se disolvió la agarosa en un microondas.
5. Mientras la solución de agarosa se estaba enfriando, se seleccionó un peine
apropiado para formar los pozos del gel.
6. Teniendo el cuidado necesario, se vertió la solución en el molde previamente sellado.
7. Se dejó secar hasta que la solución gelifico (de 30 45 minutos), entonces se vertió un
pequeño volumen de buffer para electroforesis y se retiró el peine cuidadosamente. En
seguida se retiró la cinta masking tape, y por último se colocó el gel en el tanque de
electroforesis.
8. Se llenó en el tanque con la cantidad de buffer aproximada para cubrir el gel con una
profundidad aproximada de 1 mm.
9. Se mezclaron 2 L de DNA muestra con 1 L de buffer de carga.
10. Lentamente, se cargó la mezcla dentro de los pozos usando una micropipeta con
puntas desechables. Debe cargarse en ambos lados del gel el estándar de peso
correspondiente.
30
11. Se colocó la tapa del tanque y se conectan los cables, así que el DNA migra hacia el
positivo (cable rojo). Se aplico un voltaje de 3 V/cm.
12. Cuando las muestras de DNA o colorantes hubieran migrado una distancia suficiente a
través del gel, se debió apagar la corriente y remover los cables de las conexiones en
el tanque. Después se debe examinar el gel mediante UV.
13. Para fotografiar los geles se cuenta con un fotodocumentador (Kodak, EUA) con el
cual se toman las imágenes de los geles trabajados.
6.2.3. Métodos para la cuantificación de ácido tereftálico.
Cinéticas de crecimiento para cepas originales y transformadas.
Las cinéticas se realizaron en condiciones de cultivo batch con unas condiciones iniciales:
Temperatura de 37C, pH 7.0, monitoreo para medio AT durante 168 h tomando muestra
del cultivo cada 12 h, medio de cultivo con una concentración 5 g/L de AT. Para el medio
Luria-Bertani (LB) el monitoreo se realizó durante 12 h tomando muestra cada hora.
El Análisis de las muestras recuperadas se realizó mediante el conteo en placa (UFC/mL)
la cual se basa en NOM-092-SSA1-1994 y el método de turbidimetría (540 nm), y
degradación de AT por la técnica de cromatografía liquida (HPLC).
Además se realizó el peso seco para las cinéticas, el cual viene reportado en las buenas
prácticas de laboratorio de la American Public Health Assosiation por sus siglas en ingles
(APHA et al., 1989). Y es el siguiente método el cual se basa en la obtención de una
curva de calibración la cual nos relacionara la absorbancia de la muestra con la
concentración de sólidos suspendidos que se encuentran en la muestra. Cabe mencionar
que la metodología fue modificada para el uso de medio de ácido tereftálico por lo tanto
los tiempos son mayores que para un medio rico, y se determina de la siguiente manera:
1. Previamente crecer la cepa de interés hasta el tiempo donde se tenga la mayor
absorbancia alcanzada por el cultivo (aproximadamente el día 8, 192 horas) a
30ºC y 200 rpm en el medio de interés (AT) en matraces de 250 mL a un volumen
de 50 mL y se pusieron a peso constante las charolas a 150ºC durante 24 horas.
2. Se colocaron 50 mL del medio del matraz con la cepa de interés en un tubo falcón
y se centrifugó a 8500 rpm durante 18 min. A temperatura ambiente.
posteriormente se tiró el sobrenadante.
31
3. Se realizaron dos lavados a la muestra con agua destilada (adicionando el
volumen
inicial)
y
se
centrifugó
a
8500
rpm,
durante
18
minutos.
Subsiguientemente se tiró el sobrenadante.
4. A la biomasa final, se le adicionó 50 mL de agua destilada (adicionando el
volumen inicial) y se realizaron factores de dilución (FD), el volumen mínimo total
debe ser de 5 mL.
6-1
5. Se Leyó la absorbancia de los factores de dilución a 540 nm utilizando como
blanco agua destilada.
6. Se colocaron 5 mL de la muestra correspondiente en una charola previamente
pesada y dejar secando durante 24 horas a 150ºC
Pesar las charolas. Determinar la biomasa de cada muestra en g/L y graficar en el eje de
las “x” biomasa en peso seco y en el eje de las “y” la absorbancia.
Cinética de degradación mediante la determinación de Ácido Tereftálico por
Cromatografía de líquidos (HPLC).
La degradación de ácido tereftálico se midió mediante HPLC, un sistema isocrático con un
detector de arreglo de diodos Varian Pro Star 335 con la columna Aminex HPX-87H de
exclusión de Iones. La fase móvil fue H2SO4 0.005M: CH3CN (90:10) con un flujo de 0.8
mL/min. Una presión aproximada de 100 bars. Con el detector UV trabajando a 254 nm
(Dioumaeva et al., 2010).
6.2.4. Metodología para el cálculo de variables cinéticas.
Se usaron las herramientas matemáticas reportadas, con el objetivo de interpretar los
datos experimentales de las cinéticas de biodegradación y crecimiento celular. De
acuerdo a los reportes anteriores para calcular la velocidad de crecimiento celular en la
fase exponencial se usa la siguiente ecuación debido a que se tiene un cultivo en lote
(Andrews, 1968; Mathews et al., 2000; Abuhamed et al., 2004).
6-2
Y la ecuación para el cálculo de la velocidad específica degradación del ácido tereftálico
se muestra en la siguiente ecuación:
6-3
32
En donde:  es la velocidad específica de crecimiento, Yx/s es velocidad específica de
biodegradación de AT (h-1), s es concentración del sustrato (g/L) y x es concentra celular
(g/L). Además se calculó la velocidad de degradación de sustrato (qs) con la siguiente
ecuación:
6-4
7. Resultados
7.1.
Aislamiento e Identificación de las cepas CGO-01, CGO-02, J1 y
J2.
De las cepas madre se aislaron cuatro microorganismos llamados CGO-01, CGO-02, J1 y
J2, los cuales son mostrados en la Figura 7.1 creciendo en AT.
Después de haber aislado los microorganismos fue necesario saber con qué
microorganismos se estaba trabajando, por lo que se realizó la secuenciación del gen 16S
(Madigan et al., 2004), el cual es reportado en la bibliografía como el gen más usado para
la identificación de células procariotas. La amplificación se realizó mediante los primers
Bac1F-Bac910R y 800F-1400R, a los cuales se les considera ser universales, en la
Cuadro 7-1 se describe cada uno de ellos:
Cuadro 7-1 Tamaños y secuencias de nucleótidos características de los primers usados.
Primer
Tamaño
Secuencia
(pb)
Bac 1F
20
AGAGTTTGATCVTGGCTCAG
Bac 910R
21
CTTGCGRCCGTACTCCCCAGG
800F
23
ATTAGATACCCTGGTAGTCCACG
1400R
19
GCGGTGTGTACAAGGCCCG
33
A
B
C
D
Figura 7.1 Crecimiento en medio con AT sólido A) cepa CGO-01 donde se puede observar el
crecimiento de colonias circulares con diámetro de 1-2 mm brillante, B) cepa CGO-02 donde se puede
observar el crecimiento de cepas circulares de diámetro con producción de pigmento, C) cepa J1, se
observa el crecimiento de colonias puntiformes blanco mate, y D) cepa J2, se observa el crecimiento
de colonias puntiformes blanco mate.
Debido a que se trabajo con los primers mencionados en la Cuadro 7-1 se obtuvieron dos
fragmentos amplificados, un fragmento pesaba aproximadamente 900 pb el cual se puede
observar en los carriles 2-6 para las cuatro cepas aisladas y E. coli de la Figura 7.2, el
otro fragmento pesaba 600 pb y puede ser observado en los carriles 7-11 de la Figura 7.2
Los archivos fueron recibidos como electroferogramas, cabe mencionar que se obtuvieron
dos archivos con secuencias complementarias, así que fue necesaria una edición manual
de las secuencias y los resultados obtenidos se procesaron mediante el BLAST del NCBI
(Cuadro 7-2). Las secuencias editadas pueden consultarse en el ANEXO 1.
34
900
600
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Figura 7.2 Imagen de electroforesis en gel de agarosa para la identificación de las secuencia de 900 pb
y la secuencia de 600 pb. Muestra los fragmentos de ADN de peso de 900pb y 600pb. 1 marcador, 2
CGO-01 Bac1F-Bac910R (900nt), 3 CGO-02 Bac1F-Bac910R (900nt), 4 J1 Bac1F-Bac910R (900nt), 5 J2
Bac1F-Bac910R (900nt), 6 E. coli Bac1F-Bac910R (900nt), 7 CGO-01 800F-1400R (600nt), 8 CGO-02
800F-1400R (600nt), 9 J1 800F-1400R (600nt), 10 J2 800F-1400R (600nt), 11 E. coli 800F-1400R (600nt) y
12 Control negativo.
Cuadro 7-2. Identificación de los microorganismos degradadores de ácido tereftálico.
Cepa
Medio de cultivo
Resultado de la secuencia Semejanza (%)
CGO-01
AT
Arthrobacter sp.
100
CGO-02
AT
Brevundimonas sp.
100
J1
AT
Agrobacterium sp
99
J2
AT
Ochrobactrum sp.
99
E. coli
LB
E. coli
99
Teniendo los resultados del Cuadro 7-2, los cuales indican la identificación de las cepas,
es necesario describir algunas de las características principales para poder diseñar una
estrategia para la transformación genética. Por lo tanto, se presenta una breve
descripción bibliográfica de estas cepas en el apartado de Discusión. A continuación se
presentan los resultados de la prueba de resistencia a antibióticos.
35
7.2.
Resistencia a antibióticos
Con las cepas identificadas mediante la secuenciación del gen 16S rRNA, el siguiente
paso en el esquema general fue la transformación genética. Para lo cual se siguieron
estos
pasos:
consulta
bibliografica
del
efecto
de
los
antibioticos
sobre
los
microorganismos Arthrobacter sp, Brevundimonas sp., Agrobacterium sp. y Ochrobactrum
sp. (mencionadas en la sección 7.1.), posteriormente se realizo la prueba de
susceptibilidad de estos mismos microorganismos con los antibioticos ampicilina,
kanamicina, espectinomicina y tetraciclina, y por ultimo, sabiendo cual de estos antibiótico
tenia efecto, se paso a la selección del plásmido que conferia el gen de resistencia al
antibiotico seleccionado.
La búsqueda bibliográfica arrojo las respuestas, se recopilaron todos o algunos de los
datos de susceptibilidad (los resultados de la búsqueda se muestran en la sección 8.2)
para los microorganismos que, en ese momento, se querían transformar genéticamente,
sin embargo, para tener un acercamiento a los antibióticos que se trabajan comúnmente,
se realizó una prueba de susceptibilidad y los resultados se resumen en la Cuadro 7-3
Prueba
de
susceptibilidad
de
las
cepas
con
los
antibióticos
más
usado
comúnmente.Cuadro 7-3.
Cuadro 7-3 Prueba de susceptibilidad de las cepas con los antibióticos más usado comúnmente.
Microorganismo
CGO-01 CGO-02
J2
J1
s/antibiótico




AMP
R
R
R
R
KAN
S
S
S
S
SPECT
R
R
R
R
TET
S
S
S
S
= presencia de crecimiento, R= Resistente, S= Susceptible.
NOTA: Todos los antibióticos se probaron a 100 g/mL.
Los datos presentados en el cuadro anterior (Cuadro 7-3) muestran el efecto de la
kanamicina y la tetraciclina sobre él crecimiento microbiano, y permiten seleccionar de
entre los tres plásmidos cual será el que se usará, dependiendo de las características ya
mencionadas en la metodología se cuenta con el pUC 18 (Fermentas, Thermocientific,
Canadá), pET 28b (EMD, Merck, Alemania), BlueScrip II (Fermentas, Thermocientific,
36
Canadá). Debido a que provee el gen que da la capacidad de resistencia a kanamicina
(Km-R) (Jobling and Holmes, 1990) se decidió trabajar con el plásmido pET 28b para
lograr la transformación genética.
7.3.
Transformación de los microorganismos.
Se realizaron los protocolos de transformación descritos en la sección “Determinación de
resistencia a antibióticos
Se realizaron pruebas sencillas para observar la mínima concentración inhibitoria que los
antibióticos generan sobre los microorganismos ensayados, se emplearon kanamicina
(KAN), espectinomicina (Spec), ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet). Aplicando una serie
de siembras con los cuatro antibióticos a diferentes concentraciones en medio de ácido
tereftálico, lo cual es posible observar en el Cuadro 6-3.
Cuadro 6-3 Determinación de la concentración mínima inhibitoria.
Concentración de
30
50
100
150
200
300
antibiótico (g/mL)
CGO-01 CGO-01 CGO-01 CGO-01 CGO-01 CGO-01
Microorganismo
CGO-02 CGO-02 CGO-02 CGO-02 CGO-02 CGO-02
J1
J1
J1
J1
J1
J1
J2
J2
J2
J2
J2
J2
Por otra parte, se realizó la prueba de susceptibilidad para la cepa transformada tomando
como control la cepa silvestre, a las mismas concentraciones usando solamente la
Kanamicina como antibiótico en medio de AT.
6.2.5. Métodos para la transformación genética de las cepas
Método del cloruro de calcio para realizar células competentes., Métodos utilizados para
las transformaciones genéticas:Método de transformación para el género Arthrobacter” en
el capitulo 6.2.1, en la cuadro siguiente se muestra el resumen de los resultados
obtenidos.
37
Cuadro 7-4 Resultados obtenidos para los métodos de transformación.
Microorganismo
Método
Resultado
Arthrobacter sp.
Cloruro de calcio
N
Cloruro de calcio modificado
N
Modificado para Arthrobacter*
N
Cloruro de calcio
N
Cloruro de calcio modificado
N
Cloruro de calcio
N
Cloruro de calcio modificado
N
Cloruro de calcio
N
Cloruro de calcio modificado
T
Cloruro de calcio
T
Cloruro de calcio modificado
T
Brevundimonas sp.
Agrobacterium sp.
Ochrobactrum sp.
E. coli
T= cepa transformada, N= cepa no transformada. NOTA: Todos los antibióticos se
colocaron a una concentración de 100 g/mL.* Método desarrollado para la
transformación de Arthrobacter reportado en la bibliografía (Roberts et al., 1987).
En el ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. es una prueba que sugiere
ue se ha logrado la transformación del microorganismo Ochrobactrum sp. por el método
del cloruro de calcio modificado. La Figura 7.3 muestra el crecimiento de la cepa
transformada el medio selectivo, este resultado simplemente sugiere el crecimiento del
microorganismo, por lo que era necesario presentar una evidencia de la inserción del
plásmido en la bacteria. Esto se realizó mediante la extracción de este ADN plasmídico, y
su posterior visualización mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 7.4) lo cual
nos comprueba que el plásmido se encuentra insertado.
38
Figura 7.3 Crecimiento de la cepa Ochrobactrum sp. en medio selectivo de AT g/L) y la adición de
100 g/L de kanamicina. Siembra mediante estría cruzada, donde se puede observar el crecimiento de
colonia puntiformes mate.
1 2
Figura 7.4 Electroforesis en gel de la extracción del plásmido pET 28b de un cultivo líquido de
Ochrobactrum sp 1-Marcador (1 Kb) y 2- Cepa Ochrobactrum sp. Transformada.
En la Figura 7.4 se muestra la extracción del ADN plasmídico, el carril 2 presentan la
extracción de las cepas Ochrobactrum sp.transformada, la banda que se esperaba tener
es la que se encuentra en la parte superior de la figura, se puede observar un ligero
corrimiento, lo cual nos habla de que hay ADN plasmídico, desplazada hacia abajo se
39
encuentra la segunda banda donde se observa la aparición del plásmido (5000 pb). Lo
cual comprueba la inserción de este a la célula de la cepa. con lo cual se procedió a la
realización de las cinéticas de crecimiento que se describen en la siguiente sección.
7.4.
Cinéticas de crecimiento para cepas originales y degradación de
ácido tereftálico.
Las cinéticas de crecimiento se realizaron según la norma NOM-092-SSA1-1994 y según
el protocolo de la APHA (1989) para la medición de densidad celular en un cultivo de
microorganismos. Para iniciar, se realizaron en un tiempo de 5 días (96 h), y se determinó
la degradación parcial del ácido tereftálico siguiendo la metodología de la sección
Métodos para la cuantificación de ácido tereftálico.6.2.3 Métodos para la cuantificación de
ácido tereftálico.
Como primer paso se obtuvo la curva de calibración de densidad óptica contra sólidos
solubles, la cual se muestra en la Figura 7.5. Donde se obtuvo la siguiente ecuación:
7-1
Se puede observar la linealidad de la ecuación, además de que se cuenta con un
coeficiente de correlación (R2) de 0.9266.
0.8
0.7
y = 120.32x - 0.0611
R² = 0.9266
Absorbancia
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.0000
0.0010
0.0020
0.0030
0.0040
0.0050
Solidos suspendidos (g/L)
0.0060
0.0070
Figura 7.5 Curva de calibración para la densidad óptica y los sólidos suspendidos. Permite determinar
la cantidad de sólidos presentes en el cultivo.
40
La Figura 7.5 nos permite determinar de manera indirecta la cantidad de sólidos presentes
en el cultivo sólo con interpolar la absorbancia medida para cada una de las muestras
obtenidas conforme transcurría el tiempo. Partiendo de estos cálculos podemos obtener
las graficas de las cinéticas de crecimiento y degradación.
Se trabajaron diferentes longitudes de onda consultadas en la bibliografía (Madigan et al.,
2004) para obtener las medidas de absorbancia, sin embargo, a 540 nm es básicamente
la más usada en la bibliografía para medidas de densidad celular.
Después se inicio la realización la curva de calibración para obtener la concentración del
ácido tereftálico mediante el HPLC. Obteniendo un coeficiente R2 de 0.9825 y un factor
RDS de 50.68%. En la Figura 7.6 se muestra una imagen de esta grafica.
Figura 7.6 Fotografía de la curva de calibración para el HPLC. Mediante esta curva se realiza
determinación de la degradación del AT.
la
Obteniendo los siguientes datos para la curva de calibración: curva tipo linear, con la
forma de la ecuación 7.3
7-2
Además, se obtuvieron las graficas de crecimiento de los microorganismos y degradación
de ácido tereftálico parcial y total con las cuales se determinó la velocidad de crecimiento
especifica (), la velocidad de crecimiento especifica máxima (max) y constante de
41
saturación (Ks) de los microorganismos, estos resultados se muestran en el Cuadro 7-5 y
en él Cuadro 7-6. Por otra parte, en la Figura 7.7 se muestran una grafica de las cinéticas
realizadas hasta 96 horas.
6.000
0.035
5.000
0.03
0.025
4.000
0.02
3.000
0.015
0.01
2.000
0.005
1.000
Concentración de AT (g/L)
Solidos suspendidos (g/L)
0.04
0
-0.005
0
20
40
60
Tíempo (h)
80
100
120
0.000
Figura 7.7 Cinética de crecimiento de microorganismos y degradación de AT para Brevundimonas sp.
Presentando una velocidad de crecimiento  de 0.020 h-1 a 30ºC ( Sólidos suspendidos, 
Concentración de AT).
Este resultado nos sugiere la degradación parcial del AT, sin embargo, no se logro la
degradación total del AT, fue necesaria la realización de cinéticas de mayor tiempo, para
la degradación de ácido tereftálico, debido a que solamente hubo un 19.83% de
degradación.
Obteniendo una μ de 0.021 h-1 donde se observa una disminución en la velocidad de
crecimiento con respecto al trabajo de Campos-Tejeda (2011) pero esta discusión se
realiza en la sección 8.4, y también es posible observar una disminución con respecto al
valor calculado en las cinéticas de 96 h con un valor de velocidad de degradación (Vd) de
0.1229 g/L/h.
En la sección 7.4 se hablará sobre la cinética de degradación realizada para la cepa
Ochrobactrum sp. transformada, como se describe en las siguientes secciones.
42
7
0.0014
6
0.0012
5
0.001
4
0.0008
3
0.0006
2
0.0004
1
0.0002
0
Concentración de AT (g/L)
Solidos suspendidos (g/L)
0.0016
0
0
50
100
150
Tíempo (h)
200
250
Figura 7.8 Cinética de crecimiento de Ochrobactrum sp. y degradación de AT. Durante 204 horas:
velocidad de crecimiento  de 0.021 h-1 y una velocidad de degradación de 0.1129 g/L/h a 30ºC. (
Sólidos suspendidos,  Concentración de AT).
7.5.
Cinéticas
de
crecimiento
y
degradación
para
la
cepa
transformada.
En esta sección se describe la cinética de degradación para la cepa que fue transformada
genéticamente (Ochrobactrum sp. con la inserción del plásmido pET28b) para el
crecimiento celular y la degradación de ácido tereftálico. En la Figura 7.9 se muestra el
comportamiento que se obtuvo para Ochrobactrum sp. Transformado genéticamente.
Se sigue presentando el mismo fenómeno, pues se tiene una  de 0.003 h-1 en la cual se
observa una disminución con respecto a la cepa original, cabe mencionar que la
transformación que se realizó en este momento no tenía como objetivo modificar la ruta
de degradación del AT, sin embargo, se observa un aumento en la afinidad que tenía el
microorganismo por el sustrato y una disminución con respecto a la velocidad de
crecimiento de la cepa original, por otra parte se tiene una Vd de AT de 0.1127 g/L/h, este
valor también disminuye con respecto a la cepa original.
Es posible que el aumento en la capacidad de degradación del ácido tereftálico sea
provocado por la misma adaptación del microorganismo al medio con AT, ya que se han
reportado algunos microorganismos que presentan la capacidad de degradar este
43
compuesto (Campos-Tejeda et al., 2011), y que mediante resiembras sucesivas pueden
pasar de concentraciones menores a concentraciones mayores de AT (como 7.1, 9.7 y
0.0014
7
0.0012
6
0.001
5
0.0008
4
0.0006
3
0.0004
2
0.0002
1
0
0
0
50
100
150
Tiempo (h)
200
Concentración de AT (g/L)
Solidos suspendidos (g/L)
14.5 g/L) mostrando la capacidad de crecer aun en diferentes condiciones de crecimiento.
250
Figura 7.9 Cinética de crecimiento Ochrobactrum sp. Transformada genéticamente mediante la
inserción pET 28b y degradación de AT. Durante 204 horas: obteniendo una  de 0.003 h-1 y Vd 0.1127
g/L/h a 30ºC. ( Sólidos solubles,  Concentración de AT).
Se puede observar que la cepa transformada alcanzó una velocidad de crecimiento menor
en la fase exponencial, aunque con esta comparación la velocidad de crecimiento
especifica máxima puede considerarse parecida entre la cepa transformada y sin
transformar.
Cuadro 7-5. Velocidades de crecimiento, rendimiento biomasa sustrato y rendimiento de degradación
de sustrato para las cepas Ochrobactrum sp. y Ochrobactrum sp. transformada y velocidad de
degradación de AT, a una temperatura de crecimiento de 30ºC
Microorganismo
exp (h-1)
max (h-1)
Ks (g/L)
Yx/s
qs
(gbio/gsust) (gsust/(gbio*h)
Ochrobactrum sp.
0,021
0,022
3.2
0,0004
36,934
Ochrobactrum sp
0,003
0,028
1.2
0,0001
30,132
transformada.
44
Cuadro 7-6 Velocidad de degradación, porciento de degradación, concentración inicial y final del AT
en las cinéticas de degradación hechas para la cepas Ochrobactrum sp. y Ochrobactrum sp.
transformad, a una temperatura de crecimiento de 30ºC
% de
Microorganismo
CAT0 (h-1)
CATF (h-1)
Ochrobactrum sp.
6.366
0.464
92.7
0.1229
6.108
0.484
92.07
0.1127
Ochrobactrum sp
transformada.
degradación
Vd (g/L/h)
Donde CAT0 es la concentración inicial de ácido tereftálico dentro del medio, CATF es la
concentración final de ácido tereftálico dentro del medio y Vd es la velocidad de
biodegradación del ácido tereftálico.
Donde podemos observar que la velocidad de crecimiento en la fase exponencial
disminuyo de 0.021 a 0.003 h-1, el resultado anterior en conjunto con la disminución de la
Ks, la cual nos estima la afinidad que el microorganismo tiene por el sustrato, nos
permiten observar que se presento una elevación en la afinidad por el sustrato, y se
disminuyo el crecimiento de biomasa ya que se obtuvo aproximadamente el mismo
porcentaje de degradación. Es por ello, que en las siguientes líneas se muestra un posible
forma de degradación (Pirt, 1975; Roels, 1983; Sinclair and Kristiansen, 1987). Tomando
en cuenta el C-mol, podemos decir que la reacción que se lleva a cabo en la oxidación del
ácido tereftálico es la siguiente:
7-3
Sabiendo la forma en que se oxida el AT y la reacción que se lleva a cabo, se paso a la
determinación de la degradación de este compuesto contaminante. Por lo tanto, se realizó
la comparación de los datos obtenidos con los reportados en la bibliografía. Lo cual es
posible observar en el siguiente cuadro:
En Cuadro 7-7se muestran los datos obtenidos en el referente directo de este trabajo,
donde se obtuvo la velocidad de crecimiento de las cepas Rhodococcus sp. y Arthrobacter
sp. Se obtuvo una  de 0.059±0.00006 (h-1), a la cual se puede comparar la cepa
Ochrobactrum sp, en la que se presentó una velocidad de 0.021 h-1 y 0.003 h-1, siendo
todos los resultados obtenidos en el presente trabajo menores que él reportado por
Campos-Tejada (2011).
45
Cuadro 7-7 Velocidades de crecimiento especificas de cepas capaces de degradar ácido tereftálico
(AT), en comparación con cepas reportadas en la literatura.
Microorganismo
h-1)
maxh-1)
Ks (g/L)
Yx/s
Vd(g/L/h)
(gbio/gsust)
*Rhodococcus sp.
0.059
0.20
5
0,23
0.077
Ochrobactrum sp
0,021
0,022
3.2
0,0004
0.1229
Ochrobactrum. sp.
0,003
0,028
1.2
0,0001
0.1127
transformada.
*Campos-Tejeda (2011)
8. Discusión.
8.1.
Características de los microorganismos identificados mediante la
secuenciación del gen 16S.
Arthrobacter sp. Este organismo pertenece al súper reino de las bacterias, filo y clase
actinobacteria, subclase actinobacteridae, orden actinomicetales, orden micrococcineae, a
la familia micrococcaceae (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
Este microorganismo se caracteriza marcadamente por el cambio de forma que ocurre
durante el ciclo de crecimiento en medios complejos. Los cultivos en fase estacionaria (27 días) están compuestos completamente o casi en su totalidad por células en forma de
bacilos. Conforme se da el crecimiento, los bacilos se hacen más pequeños y son
eventualmente remplazados por formas cocoides características de la fase estacionaria.
Cabe mencionar que las dos formas celulares son Gram positivas, pero pueden
decolorarse fácilmente y no son ácido alcohol resistentes. Los bacilos son no móviles o
móviles
ya
se
mediante
sub-polaridad
o
un
pequeño
flagelo
lateral.
Estos
microorganismos son aerobios obligados y su modo de metabolismo es la cadena
respiratoria, no pueden llevar a cabo fermentaciones. No se presenta formación de ácidos
cuando se crecen en medio de peptona y el peptidoglicano de la pared celular contiene
lisina como di aminoácido principal (Bergey and Holt, 1994; Jonnes and Keddie, 2006).
Brevundimonas sp. Este organismo celular pertenece taxonómicamente al súper reino de
las bacterias, el “filo” protobacteria, a la clase -protobacteria, orden Caulobacterales y a
la familia Caulobacteraceae (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
46
Se caracteriza por ser una bacteria Gram negativa, no fermentadora, pertenece a las
bacterias en forma de bacilo dentro de las -protobacterias. Tiene similitudes genéticas,
metabólicas y morfológicas con bacterias heterotróficas (HPC’s) encontradas en sistemas
de distribución de agua. Esta cepa puede ser distinguida por algunas características que
la separan de otras, como la morfología flagelar, tolerancia a los pH ácidos, presencia de
pigmentación y además puede mantener reservas de carbono (Segers et al., 1994a;
Brown et al., 2011).
Agrobacterium sp. Este organismo celular pertenece al súper reino bacteria, al “filo”
protobacteria, a la clase -protobacteria, orden Rhizobiales y a la familia Rhizobiaceae
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
En general las agrobacterias son Gram negativas, no formadoras de esporas, tienen
forma de bacilos cortos, son capaces de usar glucosa como fuente de carbono en
condiciones aerobias, este microorganismo se ha clasificado dependiendo el tipo de
fitopatogenicidad que presente, pero más generalmente se ha clasificado en 3 biotipos
(biovars). Biovar1 no tiene requerimientos de cofactor de crecimiento y pueden crecer en
2% de cloruro de sodio, algunas cepas son capaces de crecer a 37ºC. Biovar 2 estas
bacterias requieren de biotina para su crecimiento, además no son capaces de crecer en
presencia de una concentración de 0.5% de cloruro de sodio, así como tampoco pueden
crecer a la temperatura de 37ºC, algunas cepas pueden crecer en tartrato produciendo
álcali. Y Por último el biovar 3 semejante al biovar 1 algunos microorganismos
pertenecientes a este son capaces de crecer en presencia de 2% de cloruro de sodio y a
una temperatura de 37ºC, es necesario mencionar que algunas de las cepas que se
encuentran dentro de este rubro requieren de biotina para su crecimiento. Todos los
biovars producen ácido cuando son crecidos en manitol y adonitol.(Bergey and Holt, 1994;
Matthysse, 2006)
Ochrobactrum sp. Este organismo celular pertenece al súper reino bacteria, al “filo”
protobacteria, a la clase -protobacteria, al orden Rhizobiales, a la familia Brucellacea
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
Es un microorganismo Gram negativo, no fermentador, tiene forma de bacilos y es
aerobio. Actualmente este comprende varias especies aisladas de una amplia variedad de
fuentes ambientales tales como el suelo o la rizosfera, así como también en plantas,
47
animales y humanos (Holmes et al., 1988; Velasco et al., 1998; Lebuhn et al., 2000;
Kampfer et al., 2003; Trujillo et al., 2005; Tripathi et al., 2006; Chain et al., 2011)
Es posible que esta sea la característica más importante para este trabajo, debido a que
uno de los resultados de mayor trascendencia es la susceptibilidad a kanamicina el cual
es un antibiótico de amplio espectro, por lo tanto, es capaz de imposibilitar el crecimiento
microbiano.
8.2.
Resistencia a antibióticos
Debido a que era requerido el efecto de los antibióticos sobre los microorganismos, se
realizó la busqueda bibliografica (la cual se puede analizar en la sección 8.1)para obtener
bases suficientes para sustentar esta prueba de susceptibilidad, y se han encontrado
varios reportes con respecto a la susceptibilidad para el género Arthrobacter (Funke et
al., 1998; Jonnes and Keddie, 2006; Mages et al., 2008) dentro de los cuales se maneja la
susceptibilidad para a penicilina, ampicilina, eritromicina, ciprofloxacina y gentamicina.
Por otro lado, se ha encontrado que el género Brevundimonas sp. es susceptible a
amikacina, levofloxacina, ciprofloxacina (Segers et al., 1994b).
El género Agrobacterium sp. es un fitopatógeno común es por ello que para erradicarlo
se debe usar un antibiótico que no dañe al tejido de las plantas, Matthysse (2006) en el
manual “The Prokaryotes” reporta que uno de los antibioticos utilizados para este caso es
la cefotoxima.
También se han realizado estudios sobre la susceptibilidad de los organismos celulares
pertenecientes al género Ochrobactrum sp. Thoma, et al (2009) han reportado que la
mayoria de las cepas pertenecientes a este género son susceptibles a ciprofloxacina y a
trimethoprima/ sulfamethoxazol.
Siguiendo con esta prueba, cabe mencionar que es un resultado interesante, debido a
que comparado con la bibliografía, no se han encontrado otros reportes que hayan
probado a los microorganismos Arthrobacter sp, Brevundimonas sp., Agrobacterium sp. y
Ochrobactrum sp. (mencionados en la sección 7.1.) a los antibioticos utilizados en este
experimento , en el cual se observá que el efecto antimicrobiano se da en presencia de la
kanamicina y la tetraciclina. La kanamicina es un antibiótico de amplió espectro ya que
puede actuar con microorganismos Gram postivas, Gram negativas y especificamente con
48
Mycobacterium, esto comprueba el efecto de la kanamician sobre los cuatro
microorganismos (Jobling and Holmes, 1990).
8.3.
Transformación genética.
En este trabajo se logro la transformación genética de Ochorbactrum sp. Como lo indica el
Cuadro 7-2. Este resultado se puede contrastar con el reporte de Seelem et al., (2008)
donde se transformó el mismo microorganismo usando el método de electroporación y
además se realizó la optimización del sistema obteniendo 2.1X10 9 células transformadas
por g de ADN.
Por otra parte, cabe mencionar el sustento del presente trabajo, el cual se basa en la
diferencia de métodos de transformación, aunque también es importante mencionar que la
diferencia en los medios de crecimiento también es un factor que se debe tomar en
cuenta, debido a que el crecimiento del microorganismo en ácido tereftálico adicionado
con 100g/mL de kanamicina no se ha reportado en ninguna otra investigación. En la
bibliografía simplemente se reporta el uso de este microorganismo para la extracción de
algunas enzimas importantes como D-aminopeptidasa, L-aminopeptidasa (DmpA), Daminoácido amidasa y L-amidasa, y su posible aplicación en otros ambitos (Asano et al.,
1989a; Asano et al., 1989b; Fanuel et al., 1999a; Fanuel et al., 1999b; Sonke et al., 2005;
Lebuhn et al., 2006),y también se le ha encontrado interés en el aprovechamiento de
residuos del petróleo (Katsivela et al., 2005; Lebuhn et al., 2006).
Las pruebas que sugieren la transformación de la cepa Ochrobactrum sp. son las
siguientes: primero se muestra en la Figura 7.1 el inciso “d” el crecimiento de la misma
bacteria, posteriormente se muestra en la Figura 7.3 el crecimiento de colonias
puntiformes en medió de ácido tereftálico con 100 g/mL de kanamicina, lo cual sugiere
que el plásmido fue insertado. Por otra parte, se muestra la Figura 7.4 donde se muestra
el corrimiento característico del ADN cuando se presenta un plásmido y por último se
muestra la Figura 8.1 donde se observa la extracción de ADN genómico lo cual nos
comprueba la inserción del plásmido, observando la diferencia de las bandas, y debido a
esto es posible la comprobación de este experimento.
Por otra parte, para el microorganismo Arthrobacter sp. ya se ha reportado un protocolo
de transformación genética, el cual se logró con éxito, la diferencia con este trabajo es el
plásmido que se ha utilizado, debido a que en el reporte de Roberts et al. (1987) se
utilizaron varias secuencias de ADN las cuales se introducían con el origen de replicación
49
pBR-ori, este es parcialmente parecido al origen de replicación que se presenta en el
plásmido pET 28b que es un derivado de pMB1 (este vector puede ser usado tanto en
actinomicetos, como en algunas levaduras como S. cerevisiae) sin embargo, a los
vectores usados por Roberts et al. (1987) se le da un tratamiento previo el cual puede
influir en la expresión del gen reportero (Katz et al., 1983). Es, por lo tanto, una razón para
que la cepa de Arthrobacter sp. con la que se realizó esta investigación no logro ser
transformada mediante este método reportado. Y debido a estas complicaciones la única
cepa que se logró transformar fue Ochrobactrum sp.
1 2
3
4
5
6
7
Figura 8.1 Electroforesis en gel del plásmido pET 28b de un cultivo liquido de Ochrobactrum sp. 1Marcador (1 Kb), 2- Control Negativo (EC), 3- Cepa Ochrobactrum sp. Original, 4- Cepa Ochrobactrum
sp. Transformada, 5 Agua, 6-Control positivo (Plásmido pET 28b).
Después de conocer las características más importantes de las cepas descritas en la
sección 7.1 y aunado a la búsqueda bibliográfica se ha podido establecer que para las
cepas Agrobacterium sp, Arthrobacter sp., Brevundimonas sp. y Ochrobactrum sp. Ya han
sido reportados protocolos de transformación (Holsters et al., 1978; Wen-jun and Forde,
1989; Seleem et al., 2008; Donofrio et al., 2010). Con la transformación y la comprobación
de esta, se procedió a realizar las cinéticas para la cepa transformada, este y otros
resultados serán abordados en la siguiente sección.
50
8.4.
Cinéticas de degradación.
Evaluando la cinética que se presenta en la Figura 7.7, la cual representa las cinéticas de
prueba que se realizaron en 96 h, se puede observar que presenta la degradación de
ácido tereftálico con los valores ya mencionados, y como consecuencia se dice que en el
antecedente directo de este trabajo se determinó la degradación de ácido tereftálico a
diferentes concentraciones (Campos-Tejeda et al., 2011) obteniendo como punto
importante la degradación de AT aproximadamente en 82 horas, por lo cual fue necesario
observar el comportamiento de las cepas originales por mayor tiempo en presencia de
ácido tereftálico. Por lo que se realizaron cinéticas de crecimiento y degradación por 204
horas. La grafica que presenta la cinética de la cepa Ochrobactrum sp. se presenta en la
Figura 7.8.
En Cuadro 7-7 se muestran los datos obtenidos en el referente directo de este trabajo,
donde se obtuvo la velocidad de crecimiento de las cepas Rhodococcus sp. y Arthrobacter
sp. Se obtuvo una  de 0.059±0.00006 (h-1), a la cual se puede comparar la cepa
Ochrobactrum sp, en la que se presentó una velocidad de 0.021 h-1 y 0.003 h-1, siendo
todos los resultados obtenidos en el presente trabajo menores que él reportado por
Campos-Tejada (2011). Sin embargo, como se ha discutido anteriormente se presenta
una menor Ks la cual nos demuestra que se tiene una mayor afinidad por el sustrato
comprobando este resultado, con una mayor velocidad de degradación, lo anterior se
puede observar en la Cuadro 7-7. Cabe mencionar que se presenta una mayor velocidad
de degradación debido a que la cepa tiene mayor afinidad por el sustrato el cual puede
ser distribuido ya sea a la generación de biomasa o al mantenimiento celular, en este
caso las evidencias sugieren que la energía que se obtiene de la degradación de AT es
dirigida al mantenimiento celular, es por esta razón que hay menor cantidad de biomasa.
Es posible que mediante el desarrollo de este trabajo, en conjunto con los reportes
existentes sobre este tema, se abran caminos para el mejor manejo de los
microorganismos que pueden ser aplicados en la bioremediación de aguas residuales
modificando las rutas metabólicas de manera que sean de interés para los investigadores
de las nuevas generaciones, y ser capaces de erradicar la contaminación de este
compuesto xenobiótico (AT) mediante el uso de los microorganismos, que son una fuente
inagotable de conocimiento y desarrollo de tecnologías para el bien estar y la comodidad
del género humano.
51
9. Conclusiones.

Se han aislado e identificado cuatro cepas (Agrobacterium sp., Arthrobacter sp.,
Brevundimonas sp. y Ochrobactrum sp) que son capaces de crecer en presencia del
ácido tereftálico compuesto aromático considerado como contaminante.

Se determinaron las constantes cinéticas de Ochrobactrum sp: la exp es de 0.021 h-1,
max es de 0.022 h-1, Ks 3.2, Yx/s es de 0.0004 y qs es de 36.9348 y Ochrobactrum
transformada: exp es de 0.003 h-1, max es de 0.028 h-1, Ks 1.2, Yx/s es de 0.0001 y
qs es de 30.1321.

Por pruebas de susceptibilidad a antibióticos se determinó que las cepas
(Agrobacterium sp., Arthrobacter sp., Brevundimonas sp. y Ochrobactrum sp) son
sensibles a Kanamicina y tetraciclina.

La transformación de la cepa Ochrobactrum sp. ha sido lograda mediante el método
del cloruro de calcio, con la inserción del plásmido pET 28b, el cual confiere la
resistencia a Kanamicina.

El punto más importante de este desarrollo ha sido la respuesta a la degradación de
ácido tereftálico de estas cepas aisladas y el método de transformación utilizado, la
cual no ha sido reportada en ninguna otra investigación, además de que en este
estudio se logró un 92% de degradación de AT.
52
10.
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59
11.
ANEXO 1.
Este anexo tiene el fin de mostrar las pruebas de identificación de las cepas probadas, las
cuales sugieren los resultados que se muestran en el Cuadro 7-2, a continuación se
muestran las secuencias que fueron editadas y comparadas con la base de datos BLAST
de NCBI.
En la siguiente secuencia se muestra la evidencia que indica que se ha cultivado la cepa
Arthrobacter sp. Con un valor de semejanza de 100% para 549 bases.
CGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCA
AGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGAT
TAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGAACCGGTAACGCCTG
GAGACAGGTGCCCCGCTTGCGGTCGGTTTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT
CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTG
CCAGCACGTGATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGG
TGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAAT
GGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCT
CAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGC
AGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG
La siguiente secuencia muestra la evidencia que indica que se tiene a la cepa
Brevundimonas diminuta, con un valor de semejanza de 100%m para 482 bases
CAGTTCGGTGACGCAGCTAACGCATTAAGCAATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAA
GATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ACGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCACCTTTTGACATGCCTGGACCGCCACGGAGAC
GTGGCTTTCCCTTCGGGGACTAGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCATTAGTTGCCA
TCATTTAGTTGGGAACTCTAATGGGACTGCCGGTGCTAAGCCGGAGGAAGGTGGGG
ATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACAGGGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCA
ACTACAGAGGGTTAATCCTTAAAAGTTGTCTCAGTTCGGATTGTCCTCGAGGGCATGA
AGTTGGAATCGCTAATAATCGCGGATCA
A continuación se presenta la secuencia que indica la identificación de un segmento de
bacteria Agrobacterium tumefaciens con un valor de semejanza de 99%, con 1319 bases
y es el siguiente:
TGTGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCCCCGC
AAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGAGTAACGCGTGGGAACATACCCTTTCCTGCGGA
ATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATC
GGGGAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAG
GCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACG
GCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCT
GATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCG
GAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGC
CGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACG
60
TAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCCTTT
GATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAA
ATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTG
ACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC
GCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAAC
GCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGA
CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAAC
CTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTTTGGGCAGTGGAGACATTGTCCTTCAGTTAGG
CTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG
GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCA
CTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCC
TCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCA
GCGAGACAGCGATGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCT
GCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGT
GAATACGTTCCCGGGCCTTG
En la siguiente secuencia se presenta la prueba que indica que se tiene a la cepa
Ochrobactrum anthropi con un valor de semejanza de 100%, y 1308 bases comprendidas
en la secuencia.
AGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGA
GCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGCTACGGAATAACTCAG
GGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGA
TCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATC
CATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT
CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCC
ATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATA
ATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
ACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGAC
TTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGA
AGTCTTGAGTATGGTAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGA
TATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACCATTACTGACGCTGAG
GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAA
CGATGAATGTTAGCCGTTGGGGAGTTTACTCTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAA
CATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC
CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGC
CCTTGACATACCGGTCGCGGACACAGAGATGTGTCTTTCAGTTCGGCTGGACCGGAT
ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGC
AACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGAC
TGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTA
CGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGA
GTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGC
ATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG
GGCCTTG
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