C.+ reinhardtii - Tesis Institucionales
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA TESIS Presentada para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS por José Flores Uribe Ingeniero Biotecnólogo MODIFICACIÓN GENÉTICA DEL CLOROPLASTO DE Chlamydomonas reinhardtii CON GENES INVOLUCRADOS EN LA SÍNTESIS DE POLIHIDROXIALCANOATOS Dirigida por Dr. Jesús Agustín Badillo Corona Dr. Edgar Salgado Manjarrez México, D..F. Julio de 2013 “MODIFICACIÓN+GENÉTICA+DEL+CLOROPLASTO+DE+ Chlamydomonas+reinhardtii+CON+GENES+INVOLUCRADOS+EN+ LA+SÍNTESIS+DE+POLIHIDROXIALCANOATOS”+ Tesis+de+Maestría+ José+Flores+Uribe+ + Directores+de+Tesis:+ Dr.+Jesús+Agustín+Badillo+Corona+ Dr.+Edgar+Salgado+Manjarrez+ + + + UNIDAD+PROFESIONAL+INTERDISCIPLINARIA+ DE+BIOTECNOLOGÍA+ Maestría+en+Ciencias+en+Bioprocesos+ + MÉXICO+2013+ ! ! ! ! !! ! ! Resumen+ El! polihidroxibutirato! (PHB)! es! el! miembro! más! sencillo! y! estudiado! de! los! polihiroxialcanoatos,! polímeros! biodegradables! con! propiedades! termoplásticas,! producidos! por!una!gran!cantidad!de!especies!bacterianas.!Tres!enzimas!se!encuentran!involucradas!en!la! producción!de!PHB!a!partir!de!acetilCCoA,!una!βCcetotiolasa,!una!acetoacetilCCoA!reductasa!y! una!PHB!sintasa.!La!producción!actual!de!PHB!está!siendo!llevaca!a!cabo!en!fermentadores!a! gran! escala.! Sin! embargo,! los! altos! costos! de! producción! limitan! la! utilización! del! PHB.! Una! alternativa! a! su! produción! podría! ser! en! microalgas,! las! cuales! pueden! crecer! de! manera! fotosintética! y! donde! subproductos! de! alto! valor! asociado! pueden! ser! producidos! para! aminorar!los!costos!de!producción!del!PHB.! En!este!trabajo!reportamos!la!modificación!del!cloroplasto!de!Chlamydomonas+reinhardtii!con! uno,! dos! y! tres! de! los! genes! codificantes! para! las! enzimas! involucradas! en! la! producción! dePHB.!La!transformación!de!cloroplasto!se!logró!utilizando!el!plásmido!p228,!el!cual!confiere! resitencia! a! espectinomicina,! y! plásmidos! p320! que! contenían! casetes! de! expresión! con! versiones!de!phaA,!phaB!y!phaC!con!uso!de!codones!optimizado,!dirigidos!por!los!promotores! endógenos!PpsbA,!PpsbD!y!PatpA.!Las!líneas!transformadas!contienen!las!combinaciones!phaA! o! phaC,! phaA+phaC! y! phaB+phaA+phaC.+ Después! de! tres! rondas! de! selección! sobre! espectinomicina,! se! extrajo! ADN! de! las! transformantes! y! fue! examinado! por! PCR! para! determinar!la!presencia!de!los!genes!insertados!utilizando!distintos!primers!específicos.!! Las!líneas!transformadas!identificadas!por!PCR!fueron!cultivadas!en!medio!TAP!e!incubadas! con! Rojo! de! Nilo,! colorante! lipofílico! utilizado! para! la! tinción! in+ vivo! de! PHB,! para! ser! analizadas!por!microscopía!confocal!de!barrido!laser!(MCBL)!mediante!la!cual!se!observó!un! cambio!en!el!perfil!de!fluorescencia!al!comparar!la!línea!control!con!las!líneas!transformadas! p320AC!y!p320BAC.+ Además! del! análisis! por! MCBL,! las! líneas! transformadas! fueron! análizadas! por! microscopía! electrónica! de! transmisión! (MET)! para! analizar! los! cloroplastos! de! las! distintas! líneas! obtenidas.! Mediante! la! MET! se! observó! en! las! líneas! p320AC! y! p320BAC! la! presencia! de! granulos!característicos!de!la!acumulación!de!PHB!en!cloroplastos!de!plantas.! Las! líneas! obtenidas! serán! caracterízadas! más! fondo! por! espectrometría! de! masas! para! determinar!la!naturaleza!química!de!los!granulos!observados!en!la!MET.! ! ! Abstract+ Polyhydroxybutyrate! (PHB)! is! the! simplest! and! most! studied! member! of! the! polyhydroxyalkanoates,!biodegradable!polymers!with!thermoplastic!properties,!produced!by! several!bacterial!species.!Three!enzymes!are!involved!in!PHB!production!from!acetylCCoA,!a!βC ketothiolase,! an! acetoacetylCCoA! reductase! and! a! PHB! synthase.! Current! commercial! production! of! PHB! is! being! carried! out! in! largeCscale! fermentors.! However,! high! production! costs! limit! its! use.! An! alternative! to! its! production! could! be! in! microalgae,! which! can! grow! photosynthetically!and!where!highCvalue!byproducts!could!be!produced!to!reduce!production! costs.!! Here!we!report!Chlamydomonas+reinhardtii+chloroplast!modification!with!one,!two!and!three! of!the!genes!coding!for!the!enzymes!involved!in!PHB!production.!Chloroplast!transformation! was! achieved! using! plasmid! p228,! which! confers! resistance! to! spectinomycin,! and! p320! containing! expression! cassettes! with! codon! optimized! versions! of! phaA,! phaB! and! phaC,! driven!by!the!endogenous!promoters!PpsbA,!PpsbD!and!PatpA.!Transformed!lines!harbor!phaA! or!phaC,!phaA+phaC!and!phaB+phaA+phaC+gene!combinations.!After!three!selection!rounds!on! spectinomycin,! DNA! was! extracted! and! the! transformants! were! screened! by! PCR! for! the! presence!of!the!inserted!gene(s)!using!specific!primers.!! Transgenic!lines!identified!by!PCR!were!then!grown!on!TAP!medium,!incubated!with!Nile!Red,! a! lipophilic! dye! used! for! in! vivo! PHB! staining,! and! analyzed! by! confocal! laser! scanning! microscopy!(CLSM)!where!a!change!on!the!fluorescence!profile!was!observed!when!wild!type! were!compared!to!p320AC!and!p320BAC!lines.!! In!adition!to!CLSM!analysis,!transplastomic!lines!chloroplasts!were!examined!by!transmission! electronic!microscopy!(TEM).!!Granules! often! observed! in! PHB! accumulating! plant! chloroplasts!were!observed!by!TEM!analysis!on!p320AC!and!p320BAC!lines.! These! lines! will! be! further! analysed! by! GCCMS! to! assess! the! chemical! nature! of! the! granules! observed!on!the!TEM!analysis.! ! ! ! Agradecimientos+ Gracias! al! Dr.! Jesús! Agustín! Badillo! Corona! por! su! apoyo! para! desarrollar! el! proyecto.! Agradezco!en!especial!la!oportunidad!que!me!brindó!de!integrarme!a!su!equipo!de!trabajo!y! que! haya! sido! más! que! un! guía! en! mi! proceso! de! formación! durante! estos! casi! 4! años! de! trabajar!con!él.! El!presente!proyecto!de!investigación!se!realizó!en!el!Laboratorio!de!Biotecnología!Molecular! de! la! Unidad! Profesional! Interdisciplinaria! de! Biotecnología! (UPIBI)! del! Instituto! Politécnico! Nacional,! bajo! la! dirección! y! supervisión! del! Dr.! Jesús! Agustín! Badillo! Corona! y! el! Dr.! Edgar! Salgado!Manjarrez.! A!la!M.!en!C.!María!Esther!Sánchez!Espíndola!de!la!Central!de!Instrumentación!de!Microscopía! de! la! ENCBCIPN! por! las! facilidades! y! el! apoyo! otorgados! para! la! obtención! de! imágenes! por! microscopía!electrónica!de!transmición.! ! A! la! Dra.! María! de! Jesús! Perea! Flores! y! al! Ing.! Alberto! Peña! Barrientos! del! Centro! de! Nanociencias! y! Micro! y! Nanotecnologías! por! las! facilidades! y! el! apoyo! otorgados! para! la! obtención!de!imágenes!por!microscopía!confocal.! El!financiamiento!para!la!realización!de!este!proyecto!fue!otorgado!por!el!Instituto!de!Ciencia! y! Tecnología! del! Distrito! Federal! (ICyTCDF)! a! través! del! proyecto! PIUTEC10C74! y! por! la! Secretaría!de!Investigación!y!Posgrado!(SIP)!a!través!del!proyecto!Clave!SIP!20120059.! Durante!el!desarrollo!de!esta!tesis!José!Flores!Uribe!obtuvo&el&apoyo&del&CONACyT&a&través&de& la# beca# de# Maestría# con# número# de# registro# 385367! y! de! la! SIP! a! través! del! Programa! Institucional!de!Formación!de!Investigadores!(PIFICIPN).! Finalmente! al! Instituto! Politécnico! Nacional! y! en! especial! a! la! UPIBI! por! haberme! permitido! realizar! mis! estudios! de! posgrado! y! brindarme! las! herramientas! para! mi! ! desarrollo! profesional.! ! ! ! ! Índice+ Lista+de+Figuras+.........................................................................................................................+10! Lista+de+Tablas+...........................................................................................................................+12! 1! Introducción+..........................................................................................................................+1! 1.1! Los!plásticos!................................................................................................................................................!1! 1.2! Plásticos!biodegradables!.......................................................................................................................!2! 1.3! Polihidroxialcanoatos!.............................................................................................................................!3! 1.4! Producción!en!cepas!silvestres!...........................................................................................................!4! 1.4.1! Producción!de!PHA!en!Ralstonia+eutrophus!......................................................................................!4! 1.5! Producción!de!PHA!en!bacterias!recombinantes!........................................................................!4! 1.6! Producción!de!PHA!en!plantas!............................................................................................................!5! 1.6.1! Síntesis!citoplasmática!...............................................................................................................................!5! 1.6.2! Síntesis!en!plástidos!....................................................................................................................................!6! 1.7! Producción!de!PHAs!en!microalgas!...................................................................................................!8! 1.8! Modificación!genética!de!cloroplastos!.............................................................................................!9! Justificación+................................................................................................................................+10! Hipótesis+......................................................................................................................................+10! Objetivo+General+.......................................................................................................................+10! Objetivos+Específicos+...............................................................................................................+10! 2! Materiales+y+métodos+.......................................................................................................+11! 2.1! Materiales!..................................................................................................................................................!11! 2.1.1! Enzimas!y!reactivos!..................................................................................................................................!11! 2.1.2! Soluciones!y!medios!.................................................................................................................................!11! 2.1.3! Plásmidos!......................................................................................................................................................!11! 2.1.4! Genes!sintéticos!..........................................................................................................................................!12! 2.1.5! Primers!...........................................................................................................................................................!13! 2.1.6! Cepas!bacterianas!......................................................................................................................................!13! 2.1.7! Cepas!de!microalgas!.................................................................................................................................!14! 2.2! Metodología!..............................................................................................................................................!14! 2.2.1! Manipulación!de!Escherichia+coli!........................................................................................................!14! 2.2.2! ADN!..................................................................................................................................................................!14! 2.2.3! Análisis!bioinformático!...........................................................................................................................!18! 2.2.4! Método!de!bombardeo!de!partículas!................................................................................................!19! 2.2.5! Microscopía!Confocal!de!Barrido!Laser!...........................................................................................!20! 2.2.6! Microscopía!de!Transmisión!Electrónica!........................................................................................!20! 2.2.7! Manipulación!digital!de!micrografías!...............................................................................................!22! 3! Resultados+............................................................................................................................+23! ! 3.1! Construcción!p320A!y!p320C!para!transformación!de!cloroplasto!.................................!23! 3.2! Construcción!de!p320AC!para!transformación!de!cloroplasto!..........................................!29! 3.3! Construcción!de!p320BAC!para!transformación!de!cloroplasto!.......................................!36! 3.4! Transformación!del!cloroplasto!de!C.+reinhardtii!con!p320A!y!p320C!...........................!43! 3.5! Identificación!de!las!líneas!transplastómicas!phaA!y!phaC!por!PCR!................................!45! 3.6! Transformación!del!cloroplasto!de!C.+reinhardtii!con!p320AC!..........................................!47! 3.7! Transformación!del!cloroplasto!de!C.+reinhardtii!con!p320BAC!.......................................!49! 3.8! Análisis!de!las!líneas!transplastómicas!de!C.+reinhardtii!por!Microscopía!Confocal!de! Barrido!Laser!.......................................................................................................................................................!52! 3.9! Análisis!de!las!líneas!transplastómicas!de!C.+reinhardtii!por!Microscopía!Electrónica! de!Transmisión!...................................................................................................................................................!55! 4! Discusión+..............................................................................................................................+60! 4.1! Discusión!de!resultados!......................................................................................................................!60! 5! Conclusiones+........................................................................................................................+66! 6! Perspectivas+........................................................................................................................+66! 7! Bibliografía+..........................................................................................................................+67! 8! Anexos+...................................................................................................................................+74! 8.1! Genes!phaA,!phaB!y!phaC!...................................................................................................................!74! 8.2! Secuencia!peptídica!de!BKR!..............................................................................................................!75! 8.3! Plásmido!p228!.........................................................................................................................................!75! 8.4! Plásmido!p320!.........................................................................................................................................!76! 8.5! Plásmido!pKM1!.......................................................................................................................................!76! 8.6! Plásmido!pKM2!.......................................................................................................................................!78! 8.7! Plásmido!pSKCKmR!................................................................................................................................!79! Lista!de!Figuras! ! Lista+de+Figuras+ ! Figura!1.!Estructura!química!de!los!Polihidroxialcanoatos.!________________________________________!3! Figura! 2.! Estrategia! para! la! construcción! de! p320A! y! p320C,! vectores! de! transformación! de! cloroplasto!para!la!expresión!de!phaA!o!phaC.!_______________________________________________!24! Figura! 3.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! la! digestión! NdeI/XbaI! de! pJexpress416CphaA,! pJexpress416CphaB!y!pJexpress416CphaC.!___________________________________________________!26! Figura!4.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!la!digestión!BamHI!de!pSKA!y!pSKC.!____________!27! Figura!5.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!la!digestión!BamHI!de!p320A!y!p320C.!_________!28! Figura!6.!Estrategia!para!la!construcción!de!p320AC,!vector!de!transformación!de!cloroplasto! para!la!inserción!de!los!genes!phaA!y!phaC.!__________________________________________________!30! Figura!7.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!plásmidos!pSKA!C1B!(a)!y!pKM1C!(b).!______!32! Figura!8.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!pKM1C!digerido!con!SacII!y!DraIII.! _____________!34! Figura!9.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!plásmidos!p320,!pAC!y!p320AC!digeridos!con! BamHI.!__________________________________________________________________________________________!35! Figura! 10.! Estrategia! para! la! construcción! de! p320BAC,! vector! de! transformación! de! cloroplasto!para!la!inserción!de!los!genes!phaA,!phaB!y!phaC.!_____________________________!37! Figura!11.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!plásmidos!pKM2B!(a),!pUScKM2B!(b)!y!pAC!C 1B!(c).!___________________________________________________________________________________________!39! Figura!12.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!la!digestión!BamHI!de!pBAC.!___________________!41! Figura!13.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!vectores!para!transformación!de!cloroplasto! p320A,!p320C,!p320AC!y!p320BAC!digeridos!con!BamHI.!__________________________________!42! Figura! 14.! Cultivo! de! células! de! C.+ reinhardtii! bombardeadas! con! partículas! de! tungsteno! recubiertas!de!p320A.! _________________________________________________________________________!44! Figura!15.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!productos!de!PCR!de!líneas!transplastómicas! obtenidas!con!los!vectores!de!transformación!de!cloroplasto!p320A!o!p320C.!___________!46! Figura! 16.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! los! productos! de! PCR! de! las! líneas! transplastómicas!obtenidas!con!el!vector!de!transformación!de!cloroplasto!p320AC.!___!48! Figura! 17.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! los! productos! de! PCR! de! las! líneas! transplastómicas!obtenidas!con!el!vector!de!transformación!de!cloroplasto!p320BAC.!_!50! ! Figura! 18.! Micrografías! de! células! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! por! Microscopía! Confocal! de! Barrido!Laser.! __________________________________________________________________________________!54! Figura!19!Micrografía!electrónica!de!células!de!C.+reinhardtii!con!plastoma!silvestre!obtenidas! a!12,000X!(a)!y!10,000X!(b)!aumentos.!_______________________________________________________!57! Figura! 20! Micrografía! electrónica! de! células! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! con! el! vector! de! transformación!de!cloroplasto!p320A!observadas!a!12,000X!aumentos.! _________________!57! Figura! 21! Micrografía! electrónica! de! células! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! con! el! vector! de! transformación!de!cloroplasto!p320C!a!12,000X.!___________________________________________!58! Figura! 22! Micrografía! electrónica! de! células! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! con! el! vector! de! transformación!de!cloroplasto!p320AC!a!10,000X.!__________________________________________!58! Figura! 23! Micrografía! electrónica! de! células! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! con! el! vector! de! transformación!de!cloroplasto!p320BAC!a!12,000X.!________________________________________!59! ! ! ! Lista!de!Tablas! ! Lista+de+Tablas+ + Tabla!1.!Primers!empleados!para!la!secuenciación!de!plásmidos!y!para!amplificar!la!secuencia! codificante!de!los!genes!phaA,!phaB!y!phaC.!____________________________________________!13! Tabla! 2.! Resumen! de! las! líneas! transplastómicas! obtenidas! con! los! vectores! para! transformación!de!cloroplasto!p320A,!p320C,!p320AC!y!p320BAC.!__________________!51! Tabla!3.!Análisis!estadístico!de!las!micrografías!de!células!de!C.+reinhardtii!teñidas!con!Rojo!de! Nilo!obtenidas!por!Microscopía!Confocal!de!Barrido!Laser.!___________________________!53! Tabla! 4.! Análisis! estadístico! de! las! micrografías! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! por! Microscopía! Electrónica!de!Transmisión.!______________________________________________________________!56! ! Introducción! ! 1 Introducción++ 1.1 Los!plásticos! El! término! plástico! aplica! a! un! amplio! rango! de! materiales! que! en! alguna! etapa! de! su! manufactura! son! capaces! de! fluir! de! tal! manera! que! pueden! ser! extruidos,! moldeados,! vaciados,!hilados!o!aplicados!como!recubrimiento.!Los!plásticos!son!usualmente!formados!por! la!adición!de!aditivos!químicos!a!mezclas!de!polímeros!sintéticos,!estos!polímeros!sintéticos! típicamente! son! preparados! a! partir! de! petróleo! o! de! gas,! implicando! un! consumo! de! aproximadamente!el!8!de!la!producción!mundial!de!petróleo!(Thompson!2009).! Los! plásticos! actualmente! son! utilizados! en! casi! todos! los! ámbitos! de! la! vida! diaria,! desde! artículos! usados! día! a! día! como! electrodomésticos,! computadoras! o! ! muebles,! hasta! la! manufactura! industrial! de! automóviles! o! medicinas.! Los! plásticos! ofrecen! ventajas! debido! a! que!al!ser!polímeros!sintéticos,!su!estructura!puede!ser!químicamente!manipulada!para!tener! una! amplia! variedad! de! formas! y! fortalezas! (Reddy! 2003).! Algunos! de! los! polímeros! más! utilizados!en!la!manufactura!de!plásticos!son!el!polietileno,!cloruro!de!polivinilo,!poliéster!o!el! polipropileno.!Los!plásticos!tienen!gran!resistencia!química!y!son,!dependiendo!del!proceso!al! que! sean! sometidos,! elásticos,! por! lo! tanto,! son! utilizados! de! manera! popular! en! muchos! bienes! durables,! desechables! o! como! material! de! empaque,! donde! han! desplazado! a! otros! materiales!como!el!vidrio!y!el!papel!(Reddy!2003;!Thompson!2009).! Sin! embargo,! son! sus! propiedades! las! que! convierten! a! los! plásticos! comunes! en! un! grave! problema! ambiental.! La! acumulación! de! desechos! plásticos! se! ha! convertido! en! una! gran! preocupación! en! términos! del! medio! ambiente,! debido! a! que! los! plásticos! se! producen! en! grandes!cantidades,!240!millones!de!toneladas!anualmente,!de!los!cuales!se!desecha!el!54!%! cada!año!(Suriyamongkol!2007;!Thompson!2009)!y!existen!reportes!de!su!presencia!desde!los! polos!al!ecuador,!así!como!en!el!fondo!del!mar!.! Actualmente!se!cree!que!el!excesivo!peso!molecular,!variando!de!50,000!a!1,000,000!Da!,!es!el! responsable!de!la!resistencia!de!los!plásticos!a!la!degradación!y!su!persistencia!en!los!suelos! por!largos!periodos!de!tiempo!(Madison!y!Huisman!1999;!Reddy!2003).!Además!del!tiempo! requerido!para!la!degradación!de!los!plásticos!convencionales!!se!ha!reportado!que!durante!el! proceso!las!partículas!restantes!resultan!tóxicas!(Suriyamongkol!2007).! Actualmente!dos!de!las!estrategias!comúnmente!empleadas!para!lidiar!con!el!problema!de!la! contaminación! producida! por! los! plásticos! son! la! incineración! y! el! reciclaje.! La! incineración! aparte! de! ser! cara! también! es! peligrosa! y! altamente! contaminante.! Compuestos! químicos! dañinos! como! el! PVC! y! los! ! ácidos! clorhídrico! y! cianhídrico! son! liberados! durante! la! incineración!(Reddy!2003).! El! reciclaje! de! plásticos! es! una! de! las! alternativas! más! importantes! disponibles! actualmente! para!reducir!el!impacto!negativo!de!los!plásticos.!Pero!para!ser!efectiva!requiere!de!procesos! que! permitan! mejorar! la! eficiencia! del! reciclado! además! de! estrategias! que! permitan! la! 1! Introducción! ! reducción!del!uso!de!plásticos,!fomenten!la!reutilización!y!reparación!de!los!mismos.!Por!otra! parte! el! reciclaje! tiene! el! inconveniente! de! que! gran! parte! de! los! desechos! plásticos! se! encuentran!ensuciados!por!restos!de!comida!u!otras!sustancias!biológicas!lo!cual!vuelve!más! complicado!e!indeseable!el!reciclaje!de!estos!desechos!(Gross!y!Kalra!2002).! Adicionalmente,! actualmente! el! mundo! industrializado,! depende! en! gran! medida! de! los! combustibles! fósiles! como! fuente! de! energía! para! muchos! procesos! industriales! y! así! poder! sostener!el!actual!estilo!de!vida!de!la!sociedad.!Por!estas!razones!existe!especial!interés!por! empezar!a!producir!plásticos!a!partir!de!materiales!que!puedan!ser!fácilmente!eliminados!del! ecosistema!en!una!manera!“ambientalmente!amigable”,!además!existe!el!aliciente!de!que!los! “plásticos!verdes”!permitirían!disminuir! el! uso! de! las! reservas! petroquímicas!(Gross!y!Kalra! 2002).! 1.2 Plásticos!biodegradables! En! este! escenario! los! plásticos! biodegradables! ofrecen! una! alternativa! a! considerar! para! el! riesgo! ambiental! que! plantean! los! plásticos! tradicionales.! Existen! tres! tipos! de! plásticos! biodegradables,! los! fotodegradables,! semiCbiodegradables! y! los! completamente! biodegradables.!! Los!plásticos!fotodegradables,!también!conocidos!como!oxoCdegradables,!están!generalmente! compuestos! de! polietileno! acoplado! con! grupos! fotosensibles! directamente! en! su! esqueleto.! Están!diseñados!para!descomponerse!bajo!exposición!a!la!luz!UV,!durante!semanas!o!meses,! calor!o!estrés!mecánico.!Sin!embargo,!no!se!degradan!bien!en!los!rellenos!sanitarios!debido!a! la! falta! de! luz! solar! y! por! lo! tanto! se! conoce! poco! sobre! el! tiempo! que! requieren! para! degradarse!bajo!estas!condiciones!(Reddy!2003;!Thompson!2009).! Los!plásticos!semiCbiodegradables!son!plásticos!entrelazados!con!almidón,!donde!el!almidón! es!incorporado!para!mantener!unidos!pequeños!fragmentos!de!poliestireno.!La!idea!detrás!de! los! plásticos! entrelazados! por! almidón! es! que! una! vez! que! estos! sean! desechados! en! los! rellenos! sanitarios,! las! bacterias! en! el! suelo! ataquen! el! almidón! y! liberen! los! fragmentos! de! polímero!que!pueden!ser!entonces!degradados!por!otras!bacterias,!sin!embargo,!las!bacterias! después!de!metabolizar!el!almidón!se!inactivan!por!los!fragmentos!de!polietileno,!los!cuales!se! mantienen!sin!ser!degradables.!Por!otro!lado!estos!plásticos!son!sensibles!al!agua!por!lo!cual! sus!aplicaciones!se!ven!reducidas!(Gross!y!Kalra!2002;!Reddy!2003)! Por! último! se! encuentra! el! grupo! de! los! plásticos! completamente! biodegradables,! dentro! de! los! cuales! se! encuentran! los! polihidroxialcanoatos! (PHA),! polilácticos! (PLA),! poliésteres! alifáticos,! polisacáridos,! copolímeros! y/o! mezclas! de! los! anteriores.! Los! PLA! y! los! poliglicólidos! (PGA)! son! poliésteres! fabricados! a! partir! de! ácido! láctico! y! glicólido! respectivamente,! ! el! impulso! a! su! producción! se! basó! en! el! desarrollo! de! la! ingeniería! de! procesos,!acoplado!con!el!descenso!en!los!costos!de!la!producción!biológica!de!los!sustratos,!lo! cual! llevó! a! la! producción! comercial! de! PLA! y! PGA.! Actualmente! se! utiliza! para! empaques! (envolturas,! contenedores! termoformados,! y! botellas! de! corta! vida! de! anaquel).! Aunque! tienen! potencial! uso! en! aplicaciones! médicas! como! por! ejemplo! al! aplicar! suturas.! Su! producción!involucra!dos!pasos!esenciales,!la!conversión!de!glucosa!en!ácido!láctico!y!la!otra! 2! ! Introducción! ! convierte! el! ácido! láctico! en! ácido! poliláctico.! Las! propiedades! del! ácido! poliláctico! son! similares!al!poliestireno!y!también!pueden!ser!modificadas!para!volverlo!similar!al!polietileno! o!al!polipropileno!(Gross!y!Kalra!2002;!Reddy!2003).! Los! polihidroxialcanoatos! (PHA)! son! poliésteres! de! varios! hidroxialcanoatos! que! son! sintetizados!por!bacterias!gramCpositivas!y!gramCnegativas!de!al!menos!300!especies!(Reddy! 2003;!Suriyamongkol!2007).!Son!los!únicos!biopolímeros!100!%!biodegradables,!sirven!como! material! de! reserva! para! las! bacterias! cuando! un! nutriente! esencial! como! el! nitrógeno! o! el! fosforo! se! encuentran! disponibles! solo! en! concentraciones! limitantes! en! la! presencia! de! un! exceso! de! fuente! de! carbono! y! una! vez! que! se! restablece! la! concentración! del! nutriente! limitante,!estos!reservorios!energéticos!son!degradados!y!utilizados!(Suriyamongkol!2007).! 1.3 Polihidroxialcanoatos! Los!PHAs!son!un!grupo!grande!de!polímeros!de!ácidos!grasos!3C(R)Chidroxilo!enlazados!por! un! enlace! éster! entre! el! grupo! hidroxilo! y! el! grupo! carboxilo! de! un! monómero! adyacente! (Figura! 1)! (Suriyamongkol! 2007).! Las! propiedades! de! los! PHAs! pueden! ser! modificadas! al! controlar! su! composición! monomérica,! modificando! propiedades! como! peso! molecular,! y! forma!final!ya!sea!como!una!resina!plástica!o!como!una!suspensión!amorfa!de!látex!(Snell!y! Peoples!2002).! ! ! Figura! 1.! Estructura! química! de! los! Polihidroxialcanoatos.! El! grupo! R! (cajas! sombreadas)! varían! en! longitud! de! la! cadena,! de! un! carbón! (C1)! hasta! 14! carbonos! (C14).! Las! estructuras! mostradas! en! el! diagrama! corresponden! a!! polihidroxialcanoato! PHB! (R=! metil)! y! polihidroxivalerato! PHV! (R=etil)! (Suriyamongkol!2007).! Históricamente! el! PHA! más! estudiado! ha! sido! el! polihidroxibutirato! (PHB)! (Figura! 1),! descubierto! en! 1926! por! Lemoigne! en! cultivos! en! suspensión! de! Bacillus+ subtilis! (Lenz! y! Marchessault!2005).!El!PHB!es!el!PHA!más!simple!estructuralmente!hablando,!es!un!plástico! de! limitado! uso! debido! a! que! presenta! propiedades! como! poca! resistencia! y! tendencia! a! ser! quebradizo! (Suriyamongkol! 2007).! Sin! embargo! al! realizar! mezclas! de! sustituyentes! en! el! esqueleto!del!PHA!y!controlando!la!relación!de!los!dos!monómeros!en!el!copolímero!formado,! se!pueden!generar!una!gran!variedad!de!materiales!con!distintas!propiedades!y!aplicaciones! (Snell!y!Peoples!2002).!! 3! Introducción! ! Las!variaciones!de!componentes!del!PHA!dependen!en!mayor!parte!de!la!especificidad!de!la! PHA!sintasa,!una!de!las!enzimas!que!participan!en!la!producción!de!PHAs!por!el!sustrato,!con! lo!cual!el!sustrato!empleado!puede!desviar!la!producción!de!uno!hacia!otro!tipo!de!PHA!.! 1.4 Producción!en!cepas!silvestres! La!información!sobre!el!metabolismo!del!PHB!ha!sido!enriquecida!con!estudios!molecularesC genéticos.! Las! enzimas! involucradas! en! la! producción! de! PHB! son! tres,! una! βCcetotiolasa! (codificada! por! el! gen! phaA)! la! cual! lleva! a! cabo! la! condensación! de! dos! moléculas! de! acetil! CoA! para! formar! acetoacetilCCoA.! Una! acetoacetilCCoA! reductasa! (gen! phaB)! dependiente! de! NADPH,!la!cual!lleva!a!cabo!la!conversión!hacia!3ChidroxibutirilCCoA.!El!tercer!y!último!paso!es! la!reacción!de!polimerización!catalizada!por!la!PHB!sintasa!(gen!phaC)!(Suriyamongkol!2007).! Sin! embargo,! también! se! ha! podido! caracterizar! otras! enzimas! participantes! en! el! proceso! a! través! de! clonación! y! caracterización! de! una! gran! variedad! de! organismos.! Con! esto! se! ha! podido! observar! como! ocurre! la! regulación! de! la! formación! de! PHAs! con! respecto! a! las! condiciones!de!crecimiento!(Madison!y!Huisman!1999;!Reddy!2003).! 1.4.1 Producción!de!PHA!en!Ralstonia+eutrophus! Ralstonia+ eutrophus! ha! sido! estudiada! intensamente! por! su! habilidad! de! acumular! grandes! cantidades! de! PHB! a! partir! de! fuentes! simples! de! carbono,! como! glucosa,! sacarosa! y! ácido! acético! (Madison! y! Huisman! 1999).! Utilizando! gluconato! como! fuente! de! carbono,! haciendo! uso!de!R.+eutrophus!,!se!logró!producir!y!almacenar!en!el!citosol!de!la!célula!PHB!hasta!en!un! 85%!p/v!(Madison!y!Huisman!1999).! Imperial+Chemical+Industries!(ICI,!UK)!utiliza!R.+eutropha!como!plataforma!para!producir!PHB! en! gran! escala! utilizando! como! sustrato! glucosa! y! ácido! propiónico! en! un! cultivo! en! lote! alimentado! (Khanna! y! Srivastava! 2005).! En! su! cultivo,! con! duración! de! 50! h,! se! llega! a! alcanzar! un! contenido! de! hasta! 76%! con! una! productividad! de! 2.42! g/L! h! (Khanna! y! Srivastava! 2005).! Sin! embargo,! los! costos! que! enfrenta! ICI! para! producir! PHB! son! de! $16! US/kg!!el!cual!es!16!veces!mayor!que!el!costo!de!producir!plásticos!derivados!de!petróleo!por! lo!cual!el!proceso!no!es!rentable!y!no!puede!competir!contra!los!polímeros!ya!existentes!en!el! mercado.!Además!el!impacto!ambiental!de!producir!PHAs!con!R.+eutropha!se!ha!calculado!que! es! al! menos! 19! veces! mayor! en! electricidad,! 22! %! superior! en! calor! y! necesita! 7! veces! más! agua!para!producir!PHB!usando!fermentaciones!comparado!con!la!producción!química!para!la! producción!de!polipropileno!(Gerngross!y!Slater!2000).! 1.5 Producción!de!PHA!en!bacterias!recombinantes! Las!bacterias!que!producen!naturalmente!el!PHA!tienen!un!mayor!tiempo!de!duplicación,!lo! cual! hace! que! las! fermentaciones! sean! más! tardadas,! y! temperaturas! de! crecimiento! relativamente!bajas,!lo!cual!requiere!de!sistemas!de!refrigeración!que!aumentan!el!costro!de! producción.! Adicionalmente,! estas! bacterias! son! a! menudo! difíciles! de! lisar! y! contienen! las! enzimas! que! degradan! el! PHA! por! lo! cual! puede! existir! pérdida! del! producto! tanto! en! el! cultivo!como!en!la!recuperación!del!PHA!(Suriyamongkol!2007).! 4! ! Introducción! ! Eschericia+coli!ha!sido!propuesto!como!organismo!productor!de!PHA!de!forma!transgénica,!ya! que! tiene! un! tiempo! de! duplicación! corto! y! es! fácil! de! tratar! en! los! procesos! downstream+ (Suriyamongkol!2007).!E.+coli+ha!demostrado!ser!capaz!de!sintetizar!el!biopolímero!en!niveles! intracelulares!extremadamente!altos,!ser!capaz!de!ser!programada!genéticamente!para!autoC lisarse,!y!tiene!capacidad!para!producir!copolímeros!como!el!PolihidroxibutiratoCcoCvalerato! (PHBV)!el!cual!tiene!menor!cristalinidad,!punto!de!fusión!y!rígidez,!propiedades!deseadas!en! plásticos! de! uso! comercial! masivo! (Khanna! y! Srivastava! 2005).! Sin! embargo,! se! presentan! varios!problemas!al!producir!PHB!en!E.+coli,!a!pesar!de!que!se!ha!llegado!a!alcanzar!hasta!un! 90%!de!acumulación!de!PHB!en!cultivos!por!lote!alimentado;!las!altas!demandas!de!oxígeno! durante! la! fermentación! representan! un! requerimiento! incompatible! para! llevar! la! producción!a!gran!escala!de!una!manera!económicamente!viable!(Khanna!y!Srivastava!2005).! Otro! de! los! mayores! obstáculos! encontrados! al! utilizar! E.+ coli! es! la! inestabilidad! genética! asociada!con!la!pérdida!de!los!genes!productores!de!PHB.!La!pérdida!del!plásmido!debido!al! estrés!metabólico,!a!menudo!limita!la!duración!de!aquellos!cultivos!donde!se!pueden!alcanzar! altos!rendimientos!del!biopolímero!(Suriyamongkol!2007).! 1.6 Producción!de!PHA!en!plantas! Al! ser! caro! producir! PHAs! en! bacterias,! su! producción! en! plantas! puede! ser! una! alternativa! económicamente! atractiva.! La! producción! en! plantas! se! ha! demostrado! que! es! más! efectiva! debido!a!que!estas!son!mejores!productores!de!biomasa!en!comparación!con!las!bacterias.!La! producción! de! PHAs! en! plantas! puede! crear! un! nuevo! mercado! de! productos! de! valor! agregado!para!la!agricultura!y!al!mismo!tiempo!proveer!una!fuente!de!sustrato!de!bajo!costo! para!la!producción!de!plásticos!a!escala!industrial!(Poirier!y!Brumbley!2010;!Suriyamongkol! 2007).! Se!ha!estimado!que!el!costo!de!producir!PHAs!en!plantas!puede!ser!disminuido!hasta!$!0.2C0.5! US/kg!si!las!plantas!son!capaces!de!sintetizarlo!en!niveles!de!20C40%!peso!seco,!esto!debido!a! la! alta! productividad! de! biomasa! alcanzada! en! ciertos! cultivos! así! como! a! la! capacidad! fotosintética!de!las!plantas,!con!lo!cual!el!costo!de!la!fuente!de!carbono!se!elimina!(Poirier!y! Brumbley! 2010).! Otra! ventaja! de! utilizar! plantas! como! plataforma! de! producción! es! la! presencia!en!altas!cantidades!de!acetilCCoA,!el!precursor!de!la!ruta!metabólica!para!la!síntesis! de!los!PHAs!(Nakashita!1999).! Dos!factores!son!de!vital!consideración!para!la!producción!transgénica!de!PHAs!en!plantas,!la! presencia! de! acetilCCoA! y! el! espacio! disponible! para! el! almacenamiento! del! PHA.! En! células! vegetales,!el!acetilCCoA!se!encuentra!presente!en!el!citoplasma,!los!plástidos,!las!mitocondrias! y!!los!peroxisomas.!Por!lo!tanto!la!producción!de!PHAs!puede!llevarse!a!cabo!en!cualquiera!de! estos! compartimentos! celulares,! sin! embargo! considerando! el! gran! espacio! disponible,! el! citoplasma!y!los!plástidos!parecer!ser!los!compartimentos!subcelulares!más!apropiados.! 1.6.1 Síntesis!citoplasmática! El!primer!experimento!descrito!para!producir!PHA!en!plantas!fue!diseñado!para!desviar!una! porción!del!reservorio!citoplasmático!de!acetilCCoA!en!las!hojas!de!Arabidopsis+thaliana!hacia! 5! Introducción! ! PHB.!El!experimento!consistió!en!transformar!con!los!genes!de!R.+eutropha!a!dos!plantas!por! separado,!una!con!phaC!y!otra!con!phaB.!Debido!a!que!A.+thaliana+contiene!un!gen!ortólogo!de! del! gen! phaA,+ el! cual! se! encuentra! en! el! genoma! nuclear,! no! es! necesario! introducir! el! gen! bacteriano! de! nueva! cuenta.! Esta! fue! la! primera! demostración! de! que! era! posible! producir! PHAs!en!plantas,!sin!embargo!el!rendimiento!fue!de!solamente!20!ppm,!demasiado!lejos!del! mínimo!para!ser!rentable!y!poder!ser!comercializado!(Poirier!1992).! En!un!experimento!posterior!se!intentó!la!producción!de!PHB!en!cultivo!en!suspensión!de!A.+ thaliana,! donde! se! logró! demostrar! que! el! PHB! producido! de! manera! transgénica! tenía! estructura! química! y! propiedades! térmicas! similares! a! las! de! PHB! producido! por! bacterias! (Nawrath!1994).!! Experimentos!similares!se!llevaron!a!cabo!en!las!plantas!Zea+mays!y!Nicotiana+tabacum,!en!las! cuales! se! obtuvieron! niveles! de! alrededor! de! 0.15! %! de! peso! seco,! sin! embargo,! todos! los! cultivos! demostraron! retrasos! en! su! crecimiento! (Masani! 2008;! Nakashita! 2001;! Nawrath! 1995).! Además,! las! líneas! transgénicas! resultaron! ser! genéticamente! inestables.! En! estos! estudios!se!demostró!que!la!actividad!del!gen!phaB!introducido!en!tabaco!transgénico!era!100! veces! menor! que! en! plantas! de! Arabidopsis! lo! cual! limita! a! N.+ tabacum! para! la! producción! citosólica!de!PHB,!al!menos!cuando!se!utiliza!ese!gen!phaB!(Nawrath!1994).!! Otros!cultivos!que!también!fueron!propuestos!para!producir!PHB!fueron!las!fibras!de!algodón! (Gossypium+ hirsutum),! donde! se! logró! mejorar! las! propiedades! térmicas,! químicas,! de! absorción! de! agua! y! de! resistencia! de! las! mismas! a! pesar! del! bajo! rendimiento! de! 0.003! %! peso!seco.!Sin!embargo,!la!producción!necesitaba!mejorarse!para!ser!viable!económicamente! (John!y!Keller!1996).! El!bajo!rendimiento!obtenido!en!los!primeros!intentos!reveló!que!el!contenido!de!acetilCCoA! en!el!citoplasma!no!era!suficiente!para!producir!PHB.!El!acetilCCoA!presente!en!el!citoplasma! se!utiliza!casi!en!su!totalidad!para!la!producción!de!mevalonato,!componente!esencial!para!la! síntesis! de! hormonas! y! membrana! celular.! Entonces! el! desviar! las! pequeñas! cantidades! de! acetilCCoA! presentes! en! el! citoplasma! hacia! PHB! afecta! severamente! el! crecimiento! de! la! planta!y!por!lo!tanto!la!productividad!(Masani!2008).! A!pesar!de!que!la!síntesis!de!PHB!estaba!dirigida!hacia!el!citoplasma,!se!encontraron!gránulos! de! PHB! en! varios! compartimentos! celulares! incluyendo! las! vacuolas! y! el! núcleo,! pero! no! en! plástidos! o! mitocondria.! Esto! indicó! que! la! doble! membrana! de! plástidos! y! mitocondria! no! permitía! el! paso! del! PHB! a! estos! compartimentos! (Nawrath! 1994).! El! siguiente! paso! era! dirigir!la!síntesis!hacia!los!plástidos.! 1.6.2 Síntesis!en!plástidos! Los! bajos! niveles! de! acetilCCoA! (<0.5! %! dwt)! en! citoplasma! fueron! asociados! con! los! bajos! niveles!de!acumulación!de!PHB.!En!contraste!los!plástidos!exhiben!niveles!relativamente!altos! de!acetilCCoA!debido!a!que!este!organelo!es!el!sitio!de!la!biosíntesis!de!ácidos!grasos,!la!cual! depende! en! gran! medida! del! suministro! de! acetilCCoA.! Sin! embargo! la! ausencia! de! una! cetotiolasa!endógena!en!los!plástidos!vuelve!necesaria!la!introducción!de!otro!gen!bacteriano! 6! ! Introducción! ! además!del!phaB!y!phaC!si!se!desea!transformar!directamente!el!cloroplasto!(Suriyamongkol! 2007).! Para!incrementar!la!producción!de!PHB!se!propuso!utilizar!una!transformación!nuclear!de!A.+ thaliana! donde! por! medio! de! un! péptido! de! transito! de! cloroplasto! las! enzimas! necesarias! para!producir!el!biopolímero!eran!dirigidas!hacia!los!plástidos!(Nawrath!1994).! Los! genes! que! codificaban! para! el! PHB! eran! traducidos! en! el! citoplasma! y! posteriormente! dirigidos! hacia! el! cloroplasto,! donde! por! modificaciones! postCtraduccionales! se! removía! el! péptido! señal! y! se! dejaba! a! la! enzima! libre! para! actuar! al! interior! del! plástido.! Las! plantas! transformadas!mostraban!altos!niveles!de!acumulación!de!PHB,!de!aproximadamente!14%!del! peso! seco,! entre! 70! y! 100! veces! más! de! lo! obtenido! en! el! primer! reporte! de! producción! de! PHB!en!plantas!(Nawrath!1994;!Poirier!1992)! Debido! a! que! la! estrategia! de! transformación! involucraba! polinización! cruzada,! los! genes! productores! se! encontraban! insertados! en! distintos! loci,! lo! que! originaba! que! no! se! segregaran!juntos.!Para!superar!este!obstáculo!se!diseñó!un!vector!que!contenía!los!tres!genes! juntos.!La!transformación!de!A.+thaliana!con!este!vector!resultó!en!un!incremento!dramático! en!la!producción!de!PHB,!llegando!a!niveles!de!hasta!40%!del!peso!seco!(Bohmert!2000).! Sin!embargo,!las!plantas!que!producían!altos!niveles!de!PHB!mostraban!una!severa!reducción! de!crecimiento!además!de!clorosis!.!Posteriormente!se!identificó!que!la!principal!causa!de!este! fenotipo! era! la! expresión! constitutiva! de! la! βCcetotiolasa! (phaA),! lo! cual! también! se! veía! reflejado!en!una!reducción!en!la!eficiencia!de!transformación!(Bohmert!2002).! También! se! han! intentado! modificar! los! cloroplastos! de! tabaco! con! el! operón! PHB! de! R.+ eutropha,!sin!embargo,!solo!se!obtuvieron!niveles!de!400!ppm,!además!las!plantas!tenían!un! crecimiento! inhibido! y! se! observaba! esterilidad! masculina! en! todas! las! plantas! de! tabaco! transgénico! (Lössl! 2003).! Lo! anterior! fue! confirmado! por! Ruiz! and! Daniell! (2005)! quienes! lograron!producir!plantas!completamente!sanas!de!Arabidopsis!pero!100%!estériles.! Para! tratar! de! superar! los! problemas! asociados! a! la! producción! de! PHB! en! tabaco,! Lössl! (2005)! desarrolló! un! sistema! de! trans! activación! para! regular! la! transcripción! de! los! genes! involucrados! en! la! síntesis! de! PHB! en! el! plástido,! pero! sólo! se! logró! incrementoar! al! doble,! 800! ppm,! de! lo! reportado! en! su! trabajo! de! 2003.! Estas! fallas! podrían! ser! debido! al! uso! del! operón! nativo! de! R.+ eutropha,! incluyendo! promotores,! elementos! reguladores! y! espacios! intergénicos! de! bacterias! que! no! son! los! ideales! para! la! expresión! de! transgenes! en! el! cloroplasto!de!tabaco!(Masani!2008).! Otras! estrategias! se! han! intentado! aplicar! a! la! producción! en! plantas! de! PHB! como! la! optimización! de! codones! ,! el! uso! de! nuevas! especies! agronómicas! como! canola! (Brassica+ napus)+ (Houmiel! 1999)+ ,+ Alfalfa! (Medicago+ sativa)! (Saruul! 2002)! o! Pasto! Varilla! (Panicum+ virgatum+L.)!(Somleva!2008).! El!reporte!más!prometedor!hasta!el!momento!de!producción!de!PHB!en!plantas!proviene!del! grupo! de! investigación! de! Metabolix! Inc.! (EUA).! En! el! 2011! se! reportó! una! estrategia! para! 7! Introducción! ! producir! PHB! en! tabaco! por! transformación! genética! de! cloroplastos! mediante! biobalística! (BohmertCTatarev! 2011),! donde! se! alcanzan! niveles! de! hasta! 20! %! peso! seco! de! plantas! fértiles! homoplásmicas! de! tabaco.! La! estrategia! de! BohmertCTatarev! (2011)! incluye! la! optimización!de!codones!y!el!uso!de!una!técnica!denominada!“vector!de!extensión!de!operón”,! la! cual! consiste! en! introducir! un! conjunto! de! transgenes! después! del! codón! de! paro! de! una! proteína! altamente! expresada! en! el! organismo! que! se! desea! modificar,! aprovechando! los! sitios!de!unión!a!ribosoma,!promotores!y!estabilidad!de!la!proteína!endógena!(Herz!2005).! Sin! embargo! aun! existe! controversia! sobre! el! uso! de! las! plantas! como! biorreactores,! debido! principalmente! al! temor! de! que! los! transgenes! puedan! liberarse! al! medio! ambiente! y! contaminar! los! cultivos! silvestres! con! lo! que! la! biodiversidad! se! pondría! en! riesgo.! Además! aun! hay! varios! obstáculos! que! sortear! tales! como! la! aceptación! pública! a! generar! plantas! transgénicas,!así!como!los!cuellos!de!botella!propios!del!sistema,!como!el!tiempo!empleado!en! los! protocolos! de! transformación,! regeneración! e! incluso! la! obtención! de! líneas! homoplásmicas! en! el! caso! de! plantas! transplastómicas.! Por! lo! anterior! las! algas! eucariotas! podrían! representar! una! alternativa! atractiva! para! la! producción! de! PHAs! y! competir! tanto! contra! plataformas! como! bacterias! o! plantas,! utilizando! las! estrategias! adecuadas! de! producción!(Mayfield!2007;!Walker!2005).! 1.7 Producción!de!PHAs!en!microalgas! Las! microalgas! como! plataforma! de! expresión! de! productos! biotecnológicos! presentan! muchas!ventajas!en!comparación!con!las!plantas,!por!ejemplo!el!hecho!de!que!pueden!crecer! en!biorreactores,!lo!cual!reduce!la!posibilidad!de!contaminación!del!sistema!de!producción!y!! además!previene!el!flujo!de!transgenes!al!medio!ambiente.!El!escalamiento!para!la!expresión! transgénica!en!algas!a!gran!escala!puede!llevarse!a!cabo!en!unas!pocas!semanas,!tiempos!muy! cortos! comparados! con! el! tiempo! de! producción! en! plantas,! los! cuales! son! en! el! orden! de! meses!o!años!en!cultivos!como!tabaco!o!maíz!(Franklin!y!Mayfield!2004;!Specht!2010)! A!la!fecha!no!se!cuenta!con!reportes!de!producción!de!PHA!en!microalgas!de!manera!natural,! sin!embargo!se!conoce!que!la!interrupción!del!gen!PFL1!que!codifica!para!la!piruvatoCformato! liasa!lleva!a!la!amulación!de!3Chidroxibutirato!(3CHB),!el!monómero!que!compone!el!PHB,!al! ser! privadas! de! azufre! durante! la! transición! de! microaerobiosis! a! condiciones! anóxicas! (Burgess! 2012).! La! presencia! de! 3CHB! podría! explicarse! por! la! acción! de! la! βCcetotiolasa! (phaA)! codificada! en! el! núcleo! de! C.+ reinhardtii! y! la! 3CcetoacilC(proteína! transportadora! de! acilo)! reductasa! (BKR),! enzima! con! un! 56! %! de! similitud! a! nivel! de! secuencia! con! la! acetoacetilCCoA!reductasa!(phaB).+ Por! otra! parte! no! se! tiene! conocimiento! de! alguna! enzima! que! pueda! llevar! a! cabo! la! polimerización!del!3CHB!en!C.+reinhardtii!por!lo!cual!para!obtener!el!biopolímero!es!necesario! introducir!el!gen!phaC!que!codifíca!para!la!PHB!sintasa.! Sólo! existen! dos! estudios! sobre! producción! de! PHA! organismos! fotosintéticos! eucariotas! unicelulares! mediante! transformación! genética,! uno! para! P.! tricornutum! (Hempel! 2011)! donde!por!medio!de!transformación!nuclear!empleando!promotores!inducibles!de!respuesta!a! estrés! nutricional! alcanzan! niveles! de! acumulación! de! PHB! en! el! citosol! de! la! diatomea! de! 8! ! Introducción! ! hasta!10.6!%!del!peso!seco.!Por!otra!parte!Wang!(2010)!reportó!la!transformación!nuclear!de! C.+ reinhardtii! ! con! los! genes! phaB! y! phaC! de! R.+ eutropha+ bajo! el! control! de! los! promotores! RBCS2! y! HSP70ANRBCS2! respectivamente! empleando! la! βCcetotiolasa! (phaA)! endógena! del! alga.! Con! esta! estrategia! Wang! (2010)! reportó! acumulación! de! PHB! en! el! citosol! de! C.+ reinhardtii!de!hasta!6✕10C4!%!de!peso!seco.!! Teniendo!en!cuenta!que!los!niveles!de!acetilCCoA,!el!sustrato!para!la!producción!de!PHB,!en!el! cloroplasto! son! mayores! que! en! el! citoplasma! es! de! esperar! que! la! inserción! de! los! genes! involucrados!en!la!síntesis!de!PHB!en!el!genoma!del!cloroplasto!resulte!en!niveles!elevados!de! acumulación!de!PHB!de!manera!similar!a!lo!reportado!en!plantas!(BohmertCTatarev!2011).! 1.8 Modificación!genética!de!cloroplastos! Estudios!tanto!en!plantas!como!en!algas!demuestran!que!la!inserción!de!genes!ocurre!casi!de! manera!exclusiva!mediante!recombinación!homóloga!en!el!cloroplasto.!Esto!no!solo!permite! que! se! lleven! a! cabo! manipulaciones! del! plastoma,! esto! es! el! genoma! de! los! cloroplastos,! de! forma! dirigida! a! sitios! específicos! sino! que! además! se! evita! los! efectos! de! posición! que! son! propios! de! la! inserción! de! genes! en! el! genoma! nuclear,! que! significativamente! afecta! los! niveles!de!expresión!de!la!proteína.!Por!otra!parte!estudios!a!la!fecha!indican!que!la!expresión! de! genes! en! el! cloroplasto! no! está! sujeta! a! modificaciones! transcripcionales! y! postC transcripcionales!que!provoquen!su!silenciamiento!!(Purton!2007).!! En! la! ingeniería! genética! de! cloroplastos,! las! plantas! transgénicas! han! sido! el! sistema! de! expresión!principal!tanto!para!la!expresión!de!proteínas!heterólogas!complejas!como!para!la! introducción! de! novedosas! rutas! para! la! sintesis! de! moléculas! como! vitaminas(Apel! y! Bock! 2009;!Bock!y!Warzecha!2010;!Maliga!y!Bock!2011;!Oey!2009).!Sin!embargo,!existen!grandes! problemas!en!el!uso!de!este!sistema,!como!la!dispersión!de!transgenes!en!el!medio!ambiente,! contaminación!del!producto!por!pesticidas,!herbicidas!y!metabolitos!secundarios!endógenos,! además! de! la! regulación! incierta! para! la! aprobación! de! su! uso! en! seres! humanos! (Walker! 2005).!! Es! por! esto,! que! probablemente! la! manipulación! del! plastoma! en! algas! tomará! parte! importante!en!el!mercado!en!los!próximos!años!en!la!producción!de!productos!recombinantes! y!en!la!manipulación!de!ruta!metabólicas!para!generar!productos!tanto!de!bajo!costo!como!de! alto!valor!agregado!(Franklin!y!Mayfield!2004).! En! el! presente! trabajo! se! modificó! el! genoma! de! C.+ reinhardtii! mediante! la! inserción! de! los! genes! sintéticos! phaA,! phaB! y! phaC,! con! secuencia! optimizada! para! su! expresión! en! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii,! bajo! el! control! de! promotores! endógenos! con! la! finalidad! de! obtener!líneas!transplastómicas!que!contengan!uno!(phaA!o!phaC),!dos!(phaA!y!phaC)!y!tres! de!los!genes!(phaA,!phaB!y!phaC)!involucrados!en!la!síntesis!de!PHB.! ! ! 9! Justificación! ! Justificación+ Debido! a! la! contaminación! ocasionada! por! los! plásticos! derivados! del! petróleo,! es! necesario! desarrollar! métodos! y! estrategias! para! la! producción! de! compuestos! como! los! PHAs,! en! plataformas! alternas! tales! como! los! organismos! eucariotas! fotosintéticos,! lo! cual! podría! atenuar! el! problema! de! acumulación! de! residuos! sólidos! plásticos! además! de! reducir! la! dependencia!actual!de!combustibles!fósiles!para!producir!bienes!de!consumo.! Hipótesis+ Es! posible! introducir! los! genes! phaA,! phaB! y! phaC,! involucrados! en! la! biosíntesis! de! polihidroxialcanoatos,! junto! a! elementos! reguladores! transcripcionales! y! traduccionales! endógenos! de! Chlamydomonas+ reinhardtii! al! cloroplasto! de! la! misma! por! medio! de! transformación!genética!con!microCproyectiles!cubiertos!de!ADN!empleando!biobalística.! Objetivo+General+ Transformar!el!cloroplasto!de!C.+reinhardtii!con!los!genes!phaA,!phaB!y!phaC,!involucrados!en! la!producción!de!polihidroxialcanoatos.! Objetivos+Específicos+ Construir!los!vectores!de!transformación!que!contengan!los!genes!phaA,!phaB!y!phaC!junto!a! los! elementos! necesarios! para! su! control! transcripcional! y! traduccional! en! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii.! Introducir! los! genes! phaA,! phaB! y! phaC+! al! cloroplasto! de! C.+reinhardtii! por! biobalistica! para! recuperar!lineas!transplastómicas.!! Obtener! líneas! transgénicas,! resistentes! al! antibiótico! de! selección,! de! C.+ reinhardtii,! transformadas!por!biobalística!con!los!vectores!construidos.! Realizar!PCR!de!las!líneas!transplastómicas!recuperadas!para!determinar!la!correcta!inserción! de!los!genes!phaA,!phaB!y!phaC+en!el!genoma!del!cloroplasto!de!C.+reinhardtii.!! Analizar!por!Microscopía!Confocal!de!Barrido!Laser!y!Microscopía!Electrónica!de!Transmisión! las!líneas!transgénicas!identificadas!por!PCR!con!el!fin!de!determinar!la!presencia!de!PHB.!!! ! 10! ! Materiales!y!métodos! ! 2 Materiales+y+métodos+ 2.1 Materiales!! 2.1.1 Enzimas!y!reactivos!! Las!enzimas!de!restricción,!la!DNA!T4!Ligasa,!la!Nucleasa!S1!y!la!fosfatasa!alcalina!de!camarón! se!obtuvieron!de!Fermentas.!La!KOD!polymerase!se!obtuvo!de!Novagen.!La!ARNasa!se!obtuvo! Invitrogen.! El! colorante! SYBR+Safe! se! adquirió! de! Invitrogen.! Los! reactivos! se! obtuvieron! de! los!siguientes!proveedores:!Extracto!de!levadura!y!triptona!de!Bioxon,!NaCl!de!J.T.!Baker,!Tris! base! de! Probiotek,! el! cloroformo,! ácido! acético! glacial,! isopropanol! y! acetato! de! potasio! de! Fermont.! El! Etanol,! CaCl2! y! NaOH! de! High! purity,! el! EDTA! y! Agarosa! de! AMRESCO.! La! ampicilina! de! American! Bio! y! la! Espectinomicina! de! Sigma.! Los! elementos! traza! de! Hutner! fueron!obtenidos!del!Chlamydomonas!Center!(Duke!University,!Durham,!NC,!USA).! 2.1.2 Soluciones!y!medios!! Medio! LB:! Triptona! 1! %! (p/v),! extracto! de! levadura! 0.5! %! (p/v),! NaCl! 1! %! (p/v).! El! pH! se! ajustó! a! 7.0! con! NaOH! 0.5! N.! El! medio! se! esterilizó! durante! 15! min! a! 121°C,! 15! psi! en! autoclave.!Para!medios!sólido!se!agregó!15!%!de!agar!(p/v).! Medio!SOC:!Triptona!2!%!(p/v),!extracto!de!levadura!0.5!%!(p/v),!NaCl!0.05!%!(w/v),!KCl!2.5! mM.!!El!pH!se!ajustó!a!7.0!con!NaOH!0.5!N.! Medio!TAP:!Tris!Base!0.24!%(p/v),!Solución!de!sales!I!(25!mL),!Solución!de!fosfatos!!(0.375! mL),!elementos!traza!de!Hutner!(1!mL),!ácido!acético!glacial!(1!mL).!El!pH!se!ajustó!7.0!con! HCl! .El! medio! debe! ser! esterilizado! por! 15! min! a! 121°C,! 15! psi! en! autoclave.! Para! medios! sólidos!1.5!%!de!agar!(p/v).! Solución!de!sales!I:!Cloruro!de!amonio!1.5!%!(p/v),!sulfato!de!magnesio!!heptahidratado!0.4!%! (p/v),!cloruro!de!calcio!0.2!%!(p/v).! Solución! de! fosfatos:! fosfato! diCbásico! de! potasio! 2.88! %! (p/v),! fosfato! de! potasio! 1.44! %! (p/v).! 2.1.3 Plásmidos! p228+ Es!un!derivado!del!plásmido!pUC18,!el!cual!contiene!un!fragmento!de!ADN!del!cloroplasto!de! Chlamydomonas+reinhardtii!cepa!CCC110!sprCuC1C6C2!mt+!de!4.8!kpb!delimitado!por!los!sitios! de!restricción!de!BamHI!y!HindIII!(Newman!y!Boynton!1990).!Dicho!fragmento!contiene!parte!! de!la!secuencia!del!extremo!5’!del!gen!23S!rARN!!y!la!secuencia!completa!del!gen!16S!rARN.! Este!último!tiene!una!mutación!puntual!en!la!base!1123!(A→G),!causando!la!pérdida!del!sitio! de! restricción! para! AatIII! y! confiriendo! un! alto! grado! de! resistencia! al! antibiótico! 11! Materiales!y!métodos! ! espectinomicina.! El! plásmido! p228! contiene! un! gen! que! confiere! resistencia! a! ampicilina! en! cepas!de!E.+coli.! p320! El!plásmido!p320,!realizado!por!nuestro!grupo!de!trabajo,!es!una!modificación!del!plásmido! p322,! es! cual! es! parte! de! una! librería! genómica! de! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii! (Chlamydomonas! Center,! Duke! University,! Durham,! NC,! USA).! Al! p320! se! le! eliminó! un! sitio! BamHI,!remanente!del!sitio!múltiple!de!clonación!de!pBlueScript!KS+!en!el!cual!se!construyó! p322,! mediante! digestión! con! XbaI! y! EcoRI,! rasurado! de! extremos! cohesivos! y! posterior! religación.!Contiene!un!fragmento!de!ADN!del!cloroplasto!de!Chlamydomonas+reinhardtii!cepa! CCC2534! DCMU4! erNuN1a! de! 5.5! kpb! delimitado! por! los! sitios! de! restricción! de! EcoRI! y! XhoI! (Newman!y!Boynton!1990).!Dicho!fragmento!contiene!la!secuencia!del!intrón!4!y!exón!5!del! gen!de!psbA,!la!secuencia!completa!del!gen!5S!rARN!y!parte!de!la!secuencia!del!extremo!5’!!del! gen! 23S! ARN.! Existe! una! mutación! en! la! secuencia! del! exón! 5! del! gen! de! psbA,! que! causa! el! cambio! del! aminoácido! 264! (Ser→Ala)! confiriendo! resistencia! a! DCMU,! además! existe! otra! mutación! puntual! en! la! base! 2622! del! gen! 23s! ARN! (C→T)! que! confiere! la! resistencia! a! eritromicina.!Este!plásmido!contiene!un!gen!que!confiere!resistencia!a!ampicilina!en!cepas!de! E.+coli.! pSKaKmR+ Plásmido! que! contiene! el! gen! aphAN6,! el! cual! codifica! para! una! aminoglicósido! fosfotransferasa! que! confiere! resistencia! a! kanamicina,! unido! al! promotor! PpsbA! y! al! terminador!TrbcL!de!C.+reinhardtii!colocados!dentro!de!los!sitios!KpnI!y!SacI!del!sitio!múltiple! de!clonación!de!pBSKS+!(Bateman!y!Purton!2000).! pKM1+ Plásmido!construido!en!nuestro!grupo!de!investigación!por!Karla!Macedo,!el!cual!contiene!el! promotor! del! gen! atpA! (PatpA)! y! el! terminador! del! gen! psbA! (TpsbA)! del! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii+ en! pBlueScriptII! KS,+ los! sitios! de! restricción! NdeI! y! XbaI! se! encuentran! entre! el! promotor! y! terminador! para! insertar! un! gen! que! contenga! esos! sitios! en! su! región! 5’! y! 3’,! respectivamente.! pKM2+ Plásmido!construido!en!nuestro!grupo!de!investigación!por!Karla!Macedo,!el!cual!contiene!el! promotor! del! gen! psbD! (PpsbD)! y! el! terminador! del! gen! rbcL! (TrbcL)! del! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii+ en! pBlueScriptII! KS,+ los! sitios! de! restricción! NdeI! y! XbaI! se! encuentran! entre! el! promotor! y! terminador! para! insertar! un! gen! que! contenga! esos! sitios! en! su! región! 5’! y! 3’,! respectivamente.! 2.1.4 Genes!sintéticos! Las!secuencias!de!los!genes!phaA!y!phaC!de!Acetinobacter+sp.!y!phaB!de!Bacillus+megaterium! fueron!optimizadas!con!base!en!la!tabla!de!uso!de!codones!para!el!cloroplasto!de!C.+reinhardtii! 12! ! Materiales!y!métodos! ! reportada! en! la! Codon+ Usage+ Database! (http://www.kazusa.or.jp/codon/)! con! el! fin! de! ser! sintetizadas! por! la! compañía! DNA2.0! (www.dna20.com).! Dichos! genes! se! encuentran! en! los! vectores! pJexpress416CphaA,! pJexpress416CphaB! y! pJexpress416CphaC! y! se! encuentran! flanqueados! en! el! extremo! 5’! por! el! sitio! de! restricción! NdeI! y! en! el! extremo! 3’! por! el! sitio! XbaI.! 2.1.5 Primers! Se!diseñaron!y!sintetizaron!diversos!primers!con!el!fin!de!realizar!la!detección!de!la!inserción! de! genes! en! el! cloroplasto! de! las! algas! así! como! para! fines! de! secuenciación! de! los! diversos! vectores.!A!continuación!se!enlistan!la!secuencia!y!nombre!de!los!mismos!! Tabla!1.!Primers!empleados!para!la!secuenciación!de!plásmidos!y!para!amplificar!la!secuencia! codificante!de!los!genes!phaA,!phaB!y!phaC.! Primer! M13F! M13R! LCT59! LCT60! JAB320! JAB321! JAB322! JAB323! JAB324! JAB325! JAB326! JAB327! JAB328! JAB329! Secuencia! TGTAAAACGACGGCCAGT! CAGGAAACAGCTATGAC! CGTGGAGTATTTAATACAGCTA! GGAATTGGATATGGACTAGTTT! ATGAAGGACGTAGTTATTGTAGC! TTAGTCACGTTCAACAGCTAAAG! GTCAACAACGTGCAGCAGCT! AGCTGCTGCACGTTGTTGAC! ATGACGACTCTGCAGGGTAAG! TTACATATATAAACCACCATTAATA! ATGAACCCGAACAGCTTTCAATTC! TTAGAATAAATTAACTAATACGTAACG! GTCATGGCGTAATCCAAATGCA! TGCATTTGGATTACGCCATGAC! Vector!ó!Gen! pSKCKmR,!pKM1,!pKM2! pSKCKmR,!pKM1,!pKM2! p320! p320! phaA! phaA! phaA! phaA! phaB! phaB! phaC! phaC! phaC! phaC! ! 2.1.6 Cepas!bacterianas! Los! cultivos! bacterianos! fueron! mantenidos! en! cajas! Petri! con! medio! LB! (agar! 1! %! (p/v))! a! 4°C! para! almacenamiento! a! corto! plazo! y! a! C80°C! en! medio! LB! líquido! (glicerol! 15! %! (v/v))! para!almacenamiento!a!largo!plazo.! Escherichia-coli+DH5α.+ Genotipo:! FC,! φ80dlacZΔM15,! Δ(lacZYACargF)U169,! deoR,! recA1,! endA1,! hsdR17(rkC,! mk+),! phoA,! supE44,! λC,! thiC1,! gyrA96,! relA1.! Utilizada! para! la! selección! con! base! en! el! color! de! colonias!transformadas!con!vectores!que!expresan!el!péptido!α!de!la!βCgalactosidasa.! Escherichia-coli+Top+10.+ Genotipo:!FC!mcrA!Δ(mrrChsdRMSCmcrBC)!φ80lacZΔM15!ΔlacX74!nupG!recA1!araD139!Δ(araC leu)7697!galE15!galK16!rpsL(StrR)!endA1!λC.!Utilizada!para!la!selección!con!base!en!el!color!de! 13! Materiales!y!métodos! ! colonias! transformadas! con! vectores! que! expresan! el! péptido! α! de! la! βCgalactosidasa! sin! necesidad!de!emplear!IPTG.! 2.1.7 Cepas!de!microalgas! Chlamydomonas-reinhardtii+CCa125+mt++137c+ Esta!cepa!contiene!las!mutaciones!nit1!y!nit2,!!por!lo!cual!dicha!cepa!!no!puede!crecer!cuando! el! nitrato! es! la! única! fuente! de! nitrógeno.! Además! contiene! el! alelo! ! AGG1! (agg1+)! que! promueve!la!agregación!fototáctica! 2.2 Metodología! 2.2.1 Manipulación!de!Escherichia+coli! 2.2.1.1 Preparación!de!células!de!Escherichia+coli+calciocompetentes! Células!calciocompetentes!fueron!preparadas!como!se!describe!en!la!literatura!(Pope!y!Kent,! 1996).! Se! inoculó! con! una! colonia! de! E.+ coli+ (proveniente! de! una! caja! fresca! de! medio! LB! sólido)!un!tubo!que!contenía!5!mL!de!medio!LB!líquido.!El!cultivo!fue!incubado!una!noche!a! 37°C!en!una!incubadora!rotatoria.!Se!transfirió!un!mililitro!a!un!matraz!que!contenía!50!mL! del! mismo! medio! (preincubado! a! 37°C)! y! se! dejó! crecer! durante! 4! h! a! 37°C! con! agitación.! Después!de!este!periodo,!el!cultivo!se!colocó!en!hielo!por!30!min,!entonces!se!transfirió!a!un! tubo! de! polipropileno! de! 50! mL! y! se! centrifugó! a! 4000! x! g! por! 10! min.! El! sobrenadante! se! decantó!y!la!pastilla!se!resuspendió!en!medio!volumen!de!CaCl2!0.1!M!a!4°C.!La!centrifugación! y!resuspensión!en!CaCl2!se!repitió!tres!veces!para!finalmente!resuspender!la!pastilla!en!2!mL! de! CaCl2!0.1! M,! se! agregó! glicerol! a! una! concentración! final! de! 15! %! (v/v)! y! se! almacenaron! alícuotas!de!100!μL!a!C80°C.!! 2.2.1.2 Transformación!de!Escherichia+coli!por!choque!térmico! Alícuotas!congeladas!de!100!μL!de!células!de!E.+coli!calciocompetentes!fueron!mezcladas!con!1! μL! de! ADN! plasmídico! e! incubadas! en! hielo! por!25! min.! Posteriormente! las! alícuotas! fueron! transferidas!a!un!baño!de!agua!a!42°C!durante!1!min!e!inmediatamente!después!se!colocaron! en!hielo!por!al!menos!2!min.!Se!agregaron!400!μL!de!medio!SOC!a!cada!tubo!y!se!incubaron! durante!al!menos!1!h!a!37°C.!Después!de!la!incubación!entre!100C300!μL!de!la!mezcla!fueron! esparcidos!en!cajas!de!Petri!con!medio!LB!sólido!(agar!1!%!(w/v))!adicionado!con!ampicilina! (100!μg/mL)!previamente!incubadas!a!37°C!durante!tres!horas.!Las!cajas!fueron!incubadas!a! 37°C!durante!una!noche.! 2.2.2 ADN! 2.2.2.1 MiniCpreparación!de!ADN!plasmídico!de!Escherichia+coli!! Para! obtener! miniCpreparaciones! de! ADN! plasmídico! (0.1C1! μg)! de! E.+ coli,! se! siguió! el! protocolo!descrito!por!Sambrook!y!Russell!(2001).!Se!inoculó!una!colonia!de!E.+coli!en!un!tubo! de! vidrio! de! 25! mL! que! contenía! 5! mL! de! medio! LB! líquido,! adicionado! con! ampicilina! 100! μg/mL.! El! cultivo! fue! incubado! una! noche! a! 37°C! en! una! incubadora! rotatoria! con! agitación! vigorosa.!Un!mililitro!y!medio!fue!vertido!en!un!tubo!de!polipropileno!para!microcentrífuga!y! se!centrífugo!a!16000!x!g!por!1!min.!! 14! ! Materiales!y!métodos! ! La!pastilla!se!resuspendió!en!100!μL!de!solución!I!de!lisis!alcalina!(glucosa!50!mM,!TrisCHCl!25! mM!pH!8.0,!EDTA!10!mM).!Posteriormente!se!agregaron!200!μL!de!solución!II!de!lisis!alcalina! recién!preparada!(NaOH!0.2M,!SDS!1!%!(p/v))!y!se!incubó!la!mezcla!a!temperatura!ambiente! por!5!min.!Después!de!la!incubación,!se!agregó!150!μL!de!solución!III!de!lisis!alcalina!(acetato! de! potasio! 5! M! 60! mL,! ácido! acético! glacial! 11.5! mL,! H2O! 28.5! mL).! Se! centrifugó! el! tubo! a! 16000! x! g! por! 5! min.! El! sobrenadante! se! transfirió! a! un! tubo! nuevo! donde! se! le! agregó! 2! volúmenes!de!etanol!a!temperatura!!ambiente!y!se!mezcló!la!solución!utilizando!vortex.!! Después!de!dejar!incubar!2!min!a!temperatura!ambiente!la!mezcla,!se!centrifugó!a!16000!x!g! por!5!min!a!4°C.!Se!desechó!el!etanol!y!la!pastilla!fue!lavada!una!vez!con!etanol!al!70!%!(v/v).! Se!volvió!a!centrifugar!por!2!min!a!4°C!y!se!desechó!el!etanol!al!70!%!(v/v),!el!tubo!se!dejó! abierto! en! una! posición! invertida! hasta! que! la! pastilla,! que! contenía! el! plásmido,! se! secó.! Se! resuspendió! el! ADN! plasmídico! en! 30C50! μL! de! agua! milliCQ! que! contenía! 20! μg! de! ARNasa/mL.! 2.2.2.2 Extracción!a!pequeña!escala!de!ADN!plasmídico!de!Escherichia+coli! Para!extracción!de!ADN!bacteriano!a!pequeña!escala,!se!utilizó!el!Wizard®+Plus+SV+Minipreps+ DNA+ Purification+ System! de! Promega! (Wizard®! Plus! SV! Minipreps! DNA! Purification! System! Handbook,!Promega,!2011).!Se!inoculó!una!colonia!de!E.+Coli!en!un!tubo!de!vidrio!de!25!mL! que!contenía!5!mL!de!medio!LB!líquido!con!ampicilina!100!μg/mL.!El!cultivo!fue!incubado!una! noche! a! 37°C! con! agitación! vigorosa.! Un! mililitro! y! medio! fue! vertido! en! un! tubo! de! polipropileno!para!microcentrífuga!y!se!centrífugo!a!16000!x!g!por!1!min.!! La!pastilla!fue!resuspendida!en!250!μL!de!Cell+Resuspension+Solution.!Se!agregaron!250!μL!de! Cell+Lysis+Solution!a!cada!muestra!y!se!mezcló!el!tubo!por!inversión.!Se!adicionaron!10!μL!de! Alkaline+ Protease+ Solution,! mezclando! por! inversión;! el! tubo! se! dejó! reposar! 5! min! a! temperatura! ambiente.! Se! agregaron! 350! μL! de! Neutralization+ Solution! y! se! mezcló! 4! veces! por!inversión.!! El!tubo!se!centrifugó!a!20000!x!g!durante!10!min!a!temperatura!ambiente!y!el!sobrenadante! se! decantó! en! una! columna! Promega.! La! columna! se! centrifugó! a! 16000! x! g! por! 1! min.! Se! desechó!la!solución!que!atravesó!la!columna!y!se!lavó!agregando!750!μL!de!Wash+Solution!y! centrifugando!a!16000!x!g!durante!1!min.!Se!desechó!la!solución!de!lavado!y!el!ADN!se!eluyó! de!la!columna!por!centrifugación!con!50!μL!de!agua!MilliCQ.! 2.2.2.3 Extracción!a!gran!escala!de!ADN!plasmídico!de!Escherichia+coli! Para! extracción! de! ADN! bacteriano! a! gran! escala,! se! utilizó! el! HiSpeed+ Plasmid+ Maxi+ kit! de! Qiagen!(HiSpeed+Plasmid+Purification+Handbook,!Qiagen,!2005).!Se!transfirió!una!colonia!de!E.+ coli+ de! medio! LB! sólido! a! un! tubo! de! 25! mL! que! contenía! 5! mL! de! medio! LB! líquido! con! ampicilina!100!μg/mL!y!se!dejó!incubando!por!15!h!a!37°C!en!agitación!vigorosa.!Un!mililitro! del! cultivo! se! transfirió! a! 150! mL! de! medio! LB! líquido! con! 100! μg/mL! de! ampicilina! y! se! incubó!durante!15!h!a!37°C!en!una!agitadora!orbital.!! El!cultivo!se!centrifugó!a!6000!x!g!durante!15!min!y!la!pastilla!fue!resuspendida!en!10!mL!de! Buffer! P1! (ARNasa! A! 100! mg/mL,! TrisCHCl! 50! mM! pH! 8.0,! EDTA.Na2! 10! mM),! después! se! 15! Materiales!y!métodos! ! agregó! 10! mL! de! Buffer! P2! (NaOH! 0.2! M,! SDS! 1! %! (w/v))! y! se! incubó! la! reacción! a! temperatura!ambiente!por!5!min.!Posteriormente,!se!agregaron!10!mL!de!buffer!P3!(acetato! de!potasio!3!M,!pH!4.8)!helado,!se!mezcló!suavemente!la!solución!y!se!incubó!durante!10!min.! Se!filtró!la!solución!utilizando!un!cartucho!QIAfilter+Maxi.!El!filtrado!se!hizo!pasar!a!través!de! una!boquilla!HiSpeed+Maxi!(previamente!equilibrada!con!10!mL!de!Buffer!QBT!(NaCl!750!mM,! MOPSCNaOH!50!mM!!pH!7.0,!etanol!15!%!(v/v),!Triton!XC100!0.15!%!(v/v)).!Posteriormente!de! que!la!solución!pasó!a!través!de!la!columna!por!gravedad,!se!lavó!la!columna!dos!veces!con!30! mL! de! Buffer! QC! (NaCl! 1! M,! MOPSCNaOH! 50! mM! ! pH! 7.0,! etanol! 15! %! (v/v))! y! el! ADN! fue! eluído!de!la!boquilla!HiSpeed+Maxi!con!15!mL!de!Buffer!QF!(NaCl!1.25!M,!TrisCHCl!50!mM!!pH! 8.5,!etanol!15!%!(v/v)).!El!ADN!eluído!se!precipitó!con!la!adición!de!0.7!vol!de!isopropanol.!La! solución!se!pasó!a!través!de!un!modulo!QIA+precipitator+Maxi!y!entonces!se!agregaron!2!mL!de! etanol!70!%!(v/v)!para!lavarla.!El!ADN!se!eluyó!del!módulo!QIA+precipitator+Maxi!con!0.5!mL! de!Buffer!TE!(TrisCHCl!10!mM,!EDTA!1mM!pH!7.5).! 2.2.2.4 Digestión!de!ADN!plasmídico!con!enzimas!de!restricción!! Las! reacciones! con! enzimas! de! restricción! fueron! realizadas! en! volúmenes! ! de! 20C50! μL.! Un! buffer! a! 10x! específico! para! cada! enzima,! proporcionado! por! el! fabricante,! fue! utilizado.! La! cantidad! de! enzima! de! restricción! utilizada! dependía! de! la! cantidad! de! ADN! presente! en! la! reacción! (~1! μg)! pero! usualmente! se! encontraba! en! el! intervalo! de! 1C10! U! por! reacción.! Se! agregaba! albúmina! de! suero! bovino! (BSA)! cuando! era! recomendado! por! el! fabricante! de! la! enzima.!!Las!reacciones!fueron!incubadas!a!la!temperatura!apropiada!durante!4C16!h.!Cuando! se! realizaba! una! doble! digestión,! las! condiciones! de! la! reacción! sugeridas! por! el! fabricante! fueron!utilizadas.! 2.2.2.5 Tratamiento!de!ADN!plasmídico!con!fosfatasa!alcalina!de!camarón! (SAP)! La!remoción!de!los!grupos!fosfato!5’!del!ADN!plasmídico!digerido!por!reacciones!de!digestión! se!llevó!a!cabo!utilizando!fosfatasa!alcalina!de!camarón!(SAP),!siguiendo!las!instrucciones!del! fabricante.! La! reacción! consistía! en! incubar! 1! U! de! SAP! con! 0.5! μg! del! ADN! y! el! buffer! proporcionado!por!el!fabricante!(TrisCHCl!0.1!M!pH!7.5,!MgCl2!0.1!M,!BSA!1!mg/mL)!durante!1! h!a!37°C.!Para!la!inactivación!de!la!SAP,!la!reacción!era!incubada!durante!20!min!a!65°C.! 2.2.2.6 Ligación!de!fragmentos!de!ADN! Las! moléculas! de! ADN! eran! unidas! por! ligación! utilizando! T4! DNA! Ligasa! (Fermentas).! El! volumen! de! las! reacciones! fue! de! 20! μL! y! estas! contenían! la! cantidad! apropiada! de! buffer! 10x,1C5! U! de! T4! DNA! Ligasa! y! los! fragmentos! de! ADN! a! unir.! La! relación! molar! de! vector:inserto!varió!para!cada!una!de!las! construcciones!pero!se!mantuvo!en!el!intervalo!de! 1:1! a! 1:3.! Estas! reacciones! fueron! incubadas! durante! una! noche! a! 4°C! (Sambrook! y! Russell! 2001).! 2.2.2.7 Electroforesis!de!ADN!en!gel!de!agarosa!! Los!fragmentos!de!ADN!fueron!separados!por!electroforesis!de!ADN!en!gel!de!agarosa!(0.7C3! %! (p/v))! dependiendo! del! tamaño! de! fragmentos! a! ser! analizado.! Se! suspendió! agarosa! en! buffer!TBE!0.5x!(Tris!89!mM,!ácido!bórico!89!mM,!EDTA!2mM!pH!8.3)!y!calentada!en!un!horno! 16! ! Materiales!y!métodos! ! de! microondas.! Cuando! la! solución! se! disolvió! se! decantó! la! misma! en! una! canastilla! para! geles! de! agarosa,! la! cual! al! gelificar! fue! transferida! a! una! cámara! de! electroforesis! la! cual! contenía!suficiente!TBE!para!cubrir!la!superficie!del!gel!por!1!mm.!El!ADN!se!mezcló!con!1!μL! de! buffer! de! carga! 10x! y! 0.5! μL! de! Rojo! Texas! antes! de! depositarlo! en! los! pozos! del! gel.! La! electroforesis! se! llevó! a! cabo! por! 1! h! a! un! voltaje! constante! de! 90! V.! El! tamaño! de! los! fragmentos! fue! estimado! por! comparación! con! un! carril! de! referencia! que! contenía! el! marcador!de!peso!molecular!GeneRuler!1kb!Ladder+Plus!(Invitrogen).! 2.2.2.8 Determinación! de! espectrofotometría! la! concentración! de! ADN! por! Cinco! microlitros! de! la! solución! de! ADN! fueron! diluidos! en! 95! μL! de! agua! desionizada.! El! espectrofotómetro! (Lambda! XLS,! Perkin! Elmer)! se! ajustó! a! cero! utilizando! la! misma! agua! utilizada!para!diluir!el!ADN.!La!cantidad!de!ADN!fue!determinada!midiendo!la!absorbancia!a! 260!nm.!La!concentración!de!ADN!fue!calculada!considerando!que!A260nm=1.0!!es!equivalente!a! 50!μg/mL!de!ADN!de!doble!cadena!(Sambrook!y!Russell!2001).! 2.2.2.9 Determinación! de! la! concentración! de! ADN! por! electroforesis! en! gel!de!agarosa! Para!la!determinación!de!la!concentración!de!ADN!por!gel!de!electroforesis,!las!muestras!eran! separadas!en!el!mismo!gel!junto!a!un!marcador!de!peso!molecular!de!ADN.!La!concentración! de! la! muestra! era! estimada! por! comparación! con! un! carril! de! referencia! que! contenía! el! marcador! de! peso! molecular! GeneRuler! 1kb! Ladder+ Plus! (Fermentas)! utilizando! la! función! Band+Analysis+del!Kodak!Molecular!Imaging!Software!v!4.0.3!(Kodak).! 2.2.2.10 Purificación!de!fragmentos!de!ADN!a!partir!de!gel!de!agarosa! Para!purificación!de!fragmentos!de!ADN!separados!en!gel!de!agarosa,!se!utilizó!el!Wizard®+SV+ Gel+and+PCR+CleanNUp+System!(Wizard®+SV+Gel+and+PCR+CleanNUp+System!Handbook,!Promega,! 2011).!Se!llevó!a!cabo!una!electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!ADN,!terminado!el!programa!de! la! cámara! de! electroforesis! se! registró! el! peso! de! un! tubo! de! 1.5! mL! tipo! eppendorf.! Se! visualizó! y! fotografió! el! gel! para! después! cortar! el! fragmento! de! agarosa! que! contenía! el! fragmento!de!ADN!deseado!con!una!navaja!de!bisturí!tratando!de!arrastrar!la!menor!cantidad! posible!de!agarosa.!Se!introdujo!el!fragmento!de!agarosa!en!el!tubo!previamente!pesado!y!se! volvió!a!registrar!el!peso!!para!por!diferencia!determinar!el!peso!del!fragmento!de!agarosa.! Se!agregó!al!tubo!Membrane+Binding+Solution!en!una!relación!10!μL!de!solución!por!cada!10!μg! de!gel!de!agarosa,!se!mezcló!el!contenido!utilizando!un!vortex!y!se!incubó!por!10!min!a!65°C.! Cuando! el! fragmento! de! gel! de! agarosa! quedó! fundido! se! agregó! el! total! de! la! mezcla! a! una! minicolumna! SV! previamente! posicionada! sobre! un! tubo! de! recolección.! Se! dejó! incubar! la! mezcla! 1! min! en! la! columna! y! después! se! centrifugó! a! 16000! x! g! por! 1! min.! Se! desechó! la! solución! que! atravesó! la! columna! y! se! lavó! agregando! 700! μL! de! Wash+ Solution! y! centrifugando!a!16000!x!g!durante!1!min.!Se!volvió!a!lavar!la!columna!empleando!500!μL!de! Wash+Solution!y!centrifugando!16000!x!g!durante!5!min.!Se!desechó!la!solución!de!lavado!que! atravesó! por! la! columna! y! se! centrifugó! la! columna! vacía! por! 1! min! a! 16000! x! g! con! la! finalidad! de! secarla.! Se! transfirió! la! columna! a! otro! tubo! de! polipropileno! de! 1.5! mL! y! se! 17! Materiales!y!métodos! ! agregaron!50!μL!de!agua!MilliCQ!a!la!columna,!se!dejó!incubando!durante!1!min!y!finalmente! se!eluyó!el!ADN!de!la!columna!por!centrifugación!a!16000!x!g!por!1!min.! 2.2.2.11 Extracción! de! ADN! celular! total! de! Chlamydomonas+ reinhardtii+ Para! extracción! de! ADN! total! de! C.+ reinhardtii! se! utilizó! el! kit! Wizard®+ Genomic+ DNA+ Purification+ Kit! de! Promega! (Wizard®+ Genomic+ DNA+ Purification+ Kit! Handbook,! Promega,! 2011).! Se! tomó! una! asada! de! cultivo! en! caja,! se! disolvió! en! 300! μL! de! Solución! de! Lisis! de! Núcleo!y!se!mezcló!3!s!en!un!vortex.!Se!dejó!incubar!a!65°C!durante!15!min.!Se!agregó!1.5!μL! de! solución! de! ARNasa! al! lisado! celular,! posteriormente! se! mezcló! la! muestra! volteando! el! tubo!de!5!veces.!Se!incubó!la!mezcla!a!37°C!por!15!min.!Posteriormente!se!dejó!enfriando!la! muestra! a! temperatura! ambiente! ! por! 5! min! antes! de! continuar.! Se! ! agregaron! 100! μL! de! Solución! de! Precipitación! de! Proteínas! y! se! mezcló! en! vortex! durante! 20! s.! Se! centrifugó! durante! 3! min! a! 16000! x! g! para! posteriormente! transferir! el! sobrenadante! a! un! tubo! de! polipropileno!nuevo!de!1.5!mL!que!contenía!300!μL!de!isopropanol!a!temperatura!ambiente.! Se!mezcló!la!solución!por!inversión!del!tubo!5!veces!y!se!centrifugó!a!16000!x!g!durante!1!min! a!temperatura!ambiente.!Se!decantó!el!sobrenadante!y!se!agregaron!300!μL!de!etanol!al!70!%! y!se!mezcló!la!mezcla!por!inversión.!Se!centrifugó!a!16,000!x!g!durante!1!min!a!temperatura! ambiente.! Se! retiró! el! etanol! del! tubo! y! se! dejó! secar! por! inversión! sobre! papel! absorbente! limpio! durante! 15! min.! Se! agregaron! 50! μL! de! Solución! de! rehidratación! de! ADN! y! se! dejó! rehidratar!el!ADN!por!incubación!de!la!solución!a!4°C!durante!toda!la!noche.!Posteriormente! se!almacenó!a!4°C! 2.2.2.12 Identificación! de! líneas! transplastómicas! por! reacción! en! cadena!de!polimerasa!(PCR)! Para! la! identificación! de! las! líneas! transformadas! se! realizaron! amplificaciones! de! ADN! por! PCR! de! las! líneas! de! C.+ reinhardtii+ resistentes! a! espectinomicina.! Las! reacciones! de! PCR! se! llevaron! a! cabo! en! un! termociclador! Palm+ Cycler! de! Corbett! Research! utilizando! la! enzima! KOD+ Hot+ Start+ DNA+ Polymerase! (Novagen)! siguiendo! las! instrucciones! del! proveedor.! La! reacción! consiste! de! Buffer! (TrisCHCl! 20! mM! pH! 7.5,! MgCl2! 8! mM,! DTT! 0.5! mM,! BSA! 50! μg/mL),!dNTPs!!2mM,!MgSO4!1!mM,!primers!sentido!y!antisentido!0.3!μM!cada!uno!y!1!μL!del! ADN!total!de!C.+reinhardtii!en!una!reacción!de!20!μL.!Las!condiciones!de!la!PCR!dependen!de! los! primers! utilizados! y! la! longitud! del! fragmento! a! ser! amplificado! pero! en! general! consistieron!en!1!ciclo!de!2!min!a!94°C,!30!ciclos!de!15!s!a!94°C,!30!s!a!60°C!y!1C2!min!a!68°C.! 2.2.2.13 Secuenciación!de!ADN! La!secuenciación!de!ADN!fue!realizada!por!Macrogen!Korea,!Seúl,!Corea!del!Sur.!La!secuencia! de!nucleótidos!fue!determinada!por!el!método!de!Sanger!modificado!La!secuencia!producida! fue!analizada!utilizando!el!paquete!de!software!Consed!v!23.0(Gordon!1998)!.! 2.2.3 Análisis!bioinformático! 2.2.3.1 Alineamiento!de!secuencias!de!aminoácidos! 18! ! Materiales!y!métodos! ! Se! utilizó! el! programa! de! alineamiento! de! aminoácidos! BLASTp! 2.2.26+(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)!para!el!análisis!de!secuencias!de!proteínas.! 2.2.3.2 Predicción!de!péptido!señal! Para! predecir! la! localización! subcelular! de! una! proteína! se! utilizó! la! versión! online! del! software! PredAlgo! (Tardif! 2012)! localizada! en! https://giavapCgenomes.ibpc.fr/cgiC bin/predalgodb.perl.!Se!introducía!en!formato!FASTA!la!secuencia!a!analizar!y!se!esperaba!el! resultado! del! análisis,! de! los! tres! resultados! entregados! por! PredAlgo! aquel! organelo! que! presentara!la!mayor!puntuación!era!el!considerado!como!destino!final!de!la!proteína.! 2.2.4 Método!de!bombardeo!de!partículas! 2.2.4.1 Lavado!de!partículas!de!tungsteno! Para! la! preparación! de! las! partículas,! 30! mg! de! partículas! de! tungsteno! (MC10,! BioCRad)! fueron!lavadas!en!vortex!con!1!mL!de!etanol!70!%!(v/v).!Las!partículas!se!dejaron!remojando! en! etanol! durante! 15! min! y! fueron! centrifugadas! a! 9000! x! g! durante! 1! min.! Se! desechó! el! etanol!y!las!partículas!fueron!lavadas!tres!veces!con!agua!desionizada!estéril!para!finalmente! ser! llevadas! a! un! volumen! final! de! 500! μL! en! una! solución! de! glicerol! al! 50! %! (v/v).! La! suspensión!de!partículas!se!almacenaba!a!C20°C!por!hasta!3!semanas.! ! 2.2.4.2 Recubrimiento!de!partículas!de!tungsteno!con!ADN! Treinta!microlitros!de!las!partículas!suspendidas!en!glicerol!fueron!transferidos!a!un!tubo!de! microcentrífuga! nuevo! y! agitados! en! vortex! continuamente! durante! 5! min! para! después! agregar!de!manera!secuencial!5!μg!de!p228!y!!5!μg!del!vector!a!utilizar,!50!μL!de!CaCl2!2.5!M!y! 20!μL!de!espermidina!0.1!M.!La!reacción!se!dejó!agitar!en!el!vortex!durante!3!min.!Después!se! centrifugó!la!mezcla!durante!1!min!a!4000!x!g.!La!pastilla!formada!se!lavó!una!vez!con!140!μL! de!etanol!70!%!(v/v)!y!después!se!resuspendió!en!100!μL!de!etanol!absoluto.! 2.2.4.3 Bombardeo!de!Chlamydomonas+reinhardtii! Diez! microlitros! de! las! partículas! recubiertas! con! ADN! fueron! esparcidos! en! un! disco! macroacarreador! (BioCRad)! y! se! dejaron! secar! hasta! que! el! etanol! se! evaporó.! Se! colocaron! apróximadamente! 1✕108! células! de! C.+ reinhardtii! sobre! una! caja! de! medio! TAP! sólido! con! espectinomicina! (150! μg/mL),! las! cajas! se! dejaron! reposar! en! oscuridad! 2! h! antes! del! bombardeo.!El!bombardeo!se!llevó!a!cabo!utilizando!el!equipo!Biolistic!PDSC1000/He!de!BioC Rad!con!discos!de!ruptura!de!1100!psi!y!20!mm!Hg!de!vacio!en!la!cámara.!La!distancia!de!la! rejilla!de!paro!al!objetivo!fue!de!9!cm.!Posterior!al!bombardeo,!las!cajas!fueron!mantenidas!en! obscuridad! durante! 24! h! antes! de! ser! transferidas! a! la! cámara! de! crecimiento! MLRC351H! (Sanyo)!a!25°C!con!un!fotoperiodo!de!16/8!h!de!luz/oscuridad.! 2.2.4.4 Recuperación!de!transformantes! Las!cajas!fueron!mantenidas!en!una!cámara!de!crecimiento!MLRC351H!(Sanyo)!a!25°C!con!un! fotoperiodo!de!16/8!h!de!luz/oscuridad!durante!un!promedio!de!4!semanas.!Después!de!este! tiempo!las!colonias!resistentes!a!espectinomicina!fueron!transferidas!a!cajas!Petri!con!medio! TAP! (agar! 10! %,! espectinomicina! 150! μg/mL)! tres! veces! seguidas,! con! un! intervalo! aproximado!!de!dos!semanas!entre!resiembras.! 19! Materiales!y!métodos! ! 2.2.5 Microscopía!Confocal!de!Barrido!Laser! 2.2.5.1 Preparación!de!la!muestra! Para!preparar!la!muestra!de!C.+reinhardtii!antes!de!ser!observada!en!el!Microscopio!Confocal! de!Barrido!Laser!(MCBL)!se!inoculó!una!asada!de!C.+reinhardtii!en!un!matraz!de!250!mL!que! contenía! 50! mL! de! medio! TAP! líquido! adicionado! con! ampicilina! 100! μg/mL! para! la! cepa! silvestre!y!con!100!y!150!μg/mL!!de!ampicilina!y!espectinomicina,!respectivamente,!para!las! cepas!transplastómicas!detectadas!por!PCR.!El!cultivo!fue!incubado!5!días!a!25°C!a!150!rpm! con!un!fotoperiodo!de!16/8!h!de!luz/oscuridad.!Se!recolectaron!dos!mililitros!del!cultivo!y!se! virtieron! en! un! tubo! de! polipropileno! para! microcentrífuga! y! se! centrífugo! a! 8000! x! g! por! 1! min.!La!pastilla!se!lavó!por!duplicado!con!1!mL!de!solución!PBS!(NaCl!137!mM,!KCl!2.7!mM,! Na2HPO4!2!H2O!10!mM,!KH2PO4!2!mM).!Posteriormente!se!resuspendió!la!pastilla!en!1!mL!de! PBS!adicionado!con!Rojo!de!Nilo!1.5!!μg/mL!y!se!incubó!en!oscuridad!durante!2!h.!Después!de! la! incubación! se! colocó! 20! μL! de! la! muestra! teñida! con! Rojo! de! Nilo! en! un! portaobjetos,! se! cubrió!con!un!cubreobjetos!y!se!mantuvo!en!oscuridad!hasta!ser!observada.! 2.2.5.2 Observación!de!la!muestra!y!captura!de!imágenes! La! observación! de! la! muestra! se! llevó! a! cabo! en! un! Microscopio! Confocal! de! Barrido! Laser! modelo! LSM! 710! (Carl! Zeiss,! Alemania)! utilizando! un! objetivo! planCapo! de! 63X/1,4! de! inmersión! en! aceite.! Primero! se! localizaron! en! la! muestra! por! campo! claro! conjuntos! de! células! en! un! mismo! plano! focal.! Posteriormente! la! muestra! fue! excitada! a! 488! nm! y! los! intervalos! de! emisión! para! detectar! la! fluorescencia! del! Rojo! de! Nilo! y! la! clorofila! fueron! de! 550C605!y!647C721!nm!respectivamente.!Las!imágenes!correspondientes!a!cada!intervalo!de! emisión!fueron!capturadas!y!empalmadas!utilizando!el!software!Zen!2010!(Carl!Zeiss,!2010)! asignando!el!color!rojo!a!la!señal!obtenida!con!el!Rojo!de!Nilo!y!el!color!verde!para!la!señal! detectada!con!la!clorofila.! 2.2.6 Microscopía!de!Transmisión!Electrónica! 2.2.6.1 Preparación!de!la!muestra! Para! preparar! la! muestra! de! C.+ reinhardtii! antes! de! ser! observada! en! el! Microscopio! de! transmisión! electrónica,! se! inoculó! una! asada! de! C.+reinhardtii! en! un! matraz! de! 250! mL! que! contenía! 50! mL! de! medio! TAP! líquido! adicionado! con! ampicilina! 100! μg/mL! para! la! cepa! silvestre!y!con!100!y!150!μg/mL!!de!ampicilina!y!espectinomicina,!respectivamente,!para!las! cepas!transplastómicas!detectadas!por!PCR.!El!cultivo!fue!incubado!5!días!a!25°C!a!150!rpm! con! un! fotoperiodo! de! 16/8! h! de! luz/oscuridad,! posteriormente! se! mantuvo! un! día! en! oscuridad! para! que! las! células! consumieran! el! almidón.! Después! de! la! incubación! en! oscuridad! se! recolectaron! dos! mililitros! del! cultivo! vertiendo! en! un! tubo! de! polipropileno! para!microcentrífuga!y!se!centrífugo!a!8000!x!g!por!1!min.! Se! desechó! el! sobrenadante! y! se! cubrió! la! pastilla! con! solución! PBS! adicionada! con! glutaraldehído!3!%!p/v.!Se!dejó!incubando!durante!2!h,!la!solución!fijadora!se!retiró!con!una! pipeta! Pasteur! y! se! realizaron! 3! lavados! de! la! pastilla,! durante! 10! min,! con! PBS.! La! pastilla! lavada! fue! incubada! durante! 2! h! en! una! solución! de! PBS! adicionado! con! tetróxido! de! osmio! (OsO4)! al! 1! %,! al! termino! de! la! incubación! se! lavó! la! pastilla! con! PBS! durante! 10! min! por! 20! ! Materiales!y!métodos! ! triplicado.! Posteriormente! la! pastilla! se! deshidrató! durante! 15! min! en! forma! seriada! utilizando!soluciones!de!etanol!en!las!siguientes!concentraciones:!10!%,!20!%,!30!%,!40!%,!50! %,!60!%,!70!%,!80!%,!90!%!y!en!etanol!absoluto!(sólo!en!esta!última!concentración!se!realizó! por!triplicado).!! Una!vez!deshidratada!la!pastilla!se!procedió!a!la!preCinclusión!utilizando!óxido!de!propileno! (Electron!Microscopy!Sciences,!EUA).!Se!agregaron!a!la!muestra!250!mL!de!una!mezcla!etanol! absoluto:óxido!de!propileno!en!una!proporción!2:1!dejando!incubar!durante!30!min.!Se!retiró! la!mezcla!y!se!agregaron!250!mL!de!una!mezcla!etanol!absoluto:óxido!de!propileno!esta!vez!en! una!proporción!1:2!dejando!incubar!durante!30!min.!Se!retiró!la!mezcla!y!se!dejó!incubar!la! pastilla!durante!30!min!en!250!mL!de!etanol!absoluto:óxido!de!propileno!en!proporción!1:2.! Después!de!la!incubación!se!retiró!la!mezcla!y!se!dejó!incubar!en!óxido!de!propileno!por!30! min.!Posteriormente!se!procedió!a!la!preCinclusión!de!la!muestra.!! Para! la! preCinclusión! de! la! muestra! de! resina,! se! dejó! incubar! la! pastilla! durante! 30! min! en! 250! mL! de! una! mezcla! de! óxido! de! propileno:resina! (EPON! 812,! Electron! Microscopy! Sciences)! en! distintas! proporciones,! 2:1,! 1:1! y! 1:2.! Se! retiró! de! la! muestra! la! mezcla! 1:2,! se! incubó! la! pastilla! en! 250! mL! de! EPON! 812! durante! 30! min.! Después! de! la! preCinclusión! la! muestra! fue! transferida! a! una! capsula! de! inclusión! Been,! el! cual! ! contenía! 250! mL! de! EPON! 812!y!fue!incubada!en!un!horno!a!60°C!por!24!h.!Después!de!la!polimerización!se!extrajo!la! resina!de!la!capsula!Been!y!se!almacenó!hasta!la!realización!de!los!cortes!semifinos.! Se! montó! el! bloqué! de! resina! en! un! ultramicrotomo! EMUC7! (Leica,! Alemania)! y! se! talló! una! pirámide!en!una!de!sus!caras,!se!realizaron!cortes!semifinos!(~200!nm)!a!una!velocidad!de!1.2! mm/s,!se!montaron!en!un!portaobjetos!y!fueron!teñidos!con!azul!de!toluidina!al!1!%!(p/v).!Se! observó! al! microscopio! óptico! a! 40X! y! si! los! cortes! mostraban! células! de! C.+ reinhardtii! se! procedía! a! realizar! los! cortes! ultrafinos! (~80! nm! a! 0.8! mm/s)! en! esa! cara! de! la! pirámide! utilizando! una! cuchilla! de! diamante! (Electron! Microscopy! Sciences,! EUA).! Los! cortes! ultrafinos!fueron!colocados!en!rejillas!de!cobre!malla!200!recubiertas!de!“Formvar”!(Electron! Microscopy!Sciences,!EUA)!antes!de!ser!postCcontrastadas.!! En! el! postCcontraste! se! utilizaron! acetato! de! uranilo! acuoso,! ! acetato! de! uranilo! alcohólico! y! citrato! de! plomo,! los! cuales! fueron! centrifugados! durante! 20! min! a! 12000! rpm! antes! de! ser! utilizados.!Las!rejillas!de!cobre!se!incubaron!durante!5!min!en!oscuridad,!primero!con!acetato! de! uranio! acuoso! y! posteriormente! con! acetato! de! uranilo! alcohólico,! lavando! entre! cada! incubación! con! agua! destilada! y! desionizada,! y! secando! el! agua! con! papel! filtro.! Finalmente! eran!incubadas!en!oscuridad!con!citrato!de!plomo!durante!7!min!y!lavadas!con!agua!destilada! y!desionizada,!secadas!y!almacenadas!en!cajas!EMS!para!rejillas.! 2.2.6.2 Observación!de!la!muestra!y!captura!de!imágenes! Las!imágenes!fueron!adquiridas!utilizando!un!microscopio!electrónico!JEOL!JEMC1010!(JEOL! Ltd.,! Japón)! operado! a! 60! kV! acoplado! a! una! cámara! digital! ORCA! (Hamamatsu,! Japón)! utilizando!el!software!de!captura!de!imágenes!AMT+Advantage!v5.4.2!(Advanced!Microscopy! Techniques,!USA).! 21! Materiales!y!métodos! ! 2.2.7 Manipulación!digital!de!micrografías! 2.2.7.1 Superposición! de! micrografías! obtenidas! por! Microscopía! Confocal!de!Barrido!Laser! Para!lograr!la!superposición!de!las!señales!obtenidas!al!detectar!la!emisión!de!fluorescencia! del!Rojo!de!Nilo!o!la!Clorofila!en!el!MCBL,!se!asignaba!a!cada!imagen!el!canal!correspondiente! al!color!rojo!o!verde!según!correspondiera,!dentro!del!paquete!informático!de!manipulación! de! imágenes! FIJI! (Schindelin! 2012).! Posteriormente! se! unían! los! dos! canales! en! una! sola! imagen!mediante!‘Merge+channels’!para!lograr!la!superposición!de!las!dos!señales.! 2.2.7.2 Análisis! de! las! micrografías! obtenidas! por! Microscopía! Confocal! de!Barrido!Laser! Para! el! análisis! de! la! señal! emitida! por! el! Rojo! de! Nilo! se! utilizó! software! FIJI! (Schindelin! 2012).! Para! cada! muestra! se! analizaba! primero! la! micrografía! correspondiente! a! la! señal! emitida! por! la! clorofila,! esto! para! delinear! el! contorno! de! la! célula,! se! convertía! la! imagen! a! formato!de!8Cbits!y!se!binarizaba!utilizando!la!herramienta!‘Threshold!‘utilizando!el!algoritmo! RenyiEntropy! (Kapur! 1985).! Posteriormente! se! realizaba! un! análisis! de! partículas! bajo! los! siguientes!parámetros:!área!1C150!μm2,!Circularidad!0C1!cuyos!resultados!se!almacenaban!en! el!Administrador!ROI!para!tener!delimitadas!las!zonas!correspondientes!a!las!algas.!! La!micrografía!correspondiente!a!la!señal!emitida!por!el!Rojo!de!Nilo!también!era!binariada!y! sometida! a! un! análisis! de! partículas! bajo! las! siguientes! condiciones:! área! 0C2! μm2,! Circularidad!0C1;!estos!resultados!eran!exportados!en!formato!.xls!y!examinados!utilizando!el! software!Mathematica!8.0!(Wolfram!Research,!Inc,!EUA)..!! Finalmente!para!asignar!cada!señal!emitida!por!el!Rojo!de!Nilo!a!la!célula!de!la!que!provenía! se!modificó!el!PlugNIn!“CountCellMaxi”!de!Peter!Haub!(Anexo!).! 2.2.7.3 Análisis!de!las!micrografías!obtenidas!por!Microscopía!Electrónica! de!Transmisión.! Para!realizar!el!conteo!y!la!determinación!del!área!de!los!granos!presentes!en!los!cloroplastos! de! C.+ reinhardtii! se! utilizaron! las! micrografías! obtenidas! con! el! microscopio! electrónico.! La! escala! era! establecida! utilizando! la! escala! proporcionada! incluida! en! la! imagen! digital! como! referencia,!posteriormente!se!binarizaba!la!imagen!con!la!herramienta!‘Threshold’!utilizando! el! algoritmo! MaxEntropy! reportado! por! Kapur! (1985).! Una! vez! binarizada,! se! ejecutaba! un! análisis! de! partículas! bajo! los! siguientes! parámetros:! área! 0.01C1! μm2,! Circularidad! 0C1,! Outlines.! Los! resultados! del! análisis! eran! exportados! en! formato! .txt.! para! ser! analizados! utilizando!el!software!Mathematica!8.0!(Wolfram!Research,!Inc,!EUA).! ! 22! ! Resultados! ! 3 +Resultados+ 3.1 Construcción! p320A! y! p320C! para! transformación! de! cloroplasto! Los! plásmidos! para! transformación! de! cloroplasto! p320A! y! p320C! son! el! resultado! de! la! inserción! de! un! casete! de! expresión! derivado! de! pSKA! o! pSKC,! respectivamente,! ! en! un! plásmido!p320.!Los!plásmidos!p320A!y!p320C!dirigen!la!inserción!del!casete!de!expresión!de! phaA!o!phaC,!a!la!región!comprendida!entre!el!exón!5!del!gen!psbA!y!5S!rRNA!de!cloroplasto! de!!C.+reinhardtii!(Figura!2).! La! estrategia! de! clonación! para! construir! p320phaA! consistió! básicamente! de! dos! pasos,! primero!la!sustitución!del!gen!aphAN6!en!el!plásmido!pSKCKmR!(Bateman!y!Purton!2000)!por! el!gen!phaA!y!posteriormente!la!inserción!del!casete!de!expresión!al!vector!de!transformación! de! cloroplasto! p320! (Figura! 2).! El! plásmido! pSKCKmR! (Bateman! y! Purton! 2000)! contiene! el! gen! aphAN6! flanqueado! por! los! sitios! de! restricción! NdeI! y! NheI! en! los! extremos! 5’! y! 3’! respectivamente,!dichos!sitios!fueron!utilizados!para!sustituir!el!gen!aphAN6!por!el!gen!phaA! del!plásmido!pJexpress416CphaA!en!donde!el!gen!phaA!cuenta!con!un!sitio!NdeI!en!su!extremo! 5’!y!un!sitio!XbaI,!compatible!con!NheI,!en!el!extremo!3’!de!esta!manera!el!gen!phaA!se!insertó! entre! el! promotor! PpsbA! y! el! terminador! TrbcL! para! producir! pSKA.! El! plásmido! pSKCKmR! contiene! el! promotor! del! gen! psbA! (PpsbA)! flanqueado! por! sitios! BamHI! y! NdeI+(Bateman! y! Purton!2000).!El!promotor!PpsbA!es!uno!de!los!promotores!con!mayor!nivel!de!transcripción! en! el! cloroplasto! de! C.+reinhardtii! (Blowers! 1989)! y! dirige! la! transcripción! del! gen! psbA! que! codifica!para!la!subunidad!D1!del!centro!de!reacción!del!fotosistema!II!y!está!flanqueado!por! BamHI!y!NdeI.!El!terminador!(TrbcL)!del!gen!rbcL,!el!cual!codifica!para!la!subunidad!grande!de! la! ribulosaCbifosfato! carboxilasa/oxigenasa! (RuBisCO),! de! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii! está! flanqueado!por!!sitios!NheI+y!BamHI+(Bateman!y!Purton!2000).!El!casete!PpsbA::phaA::TrbcL! fue! escindido! de! pSKA! con! la! enzima! BamHI! e! insertado! en! sitio! BamHI! del! vector! de! transformación! de! cloroplasto! p320! para! obtener! p320A.! El! mismo! procedimiento! se! utilizó! para!construir!p320C+(Figura!2).! ! 23! ! Resultados! ! ! Figura! 2.! Estrategia! para! la! construcción! de! p320A! y! p320C,! vectores! de! transformación! de! cloroplasto! para! la! expresión! de! phaA! o! phaC.! El! gen! aphAC6! se! sustituyó! en! el! plásmido! pSKCKmR! con! el! gen! phaA! que! se! extrajo! con! los! sitios! NdeI! y! XbaI! de! pJexpress416CphaA! y! se! ligó! en! los! sitios! NdeI! y! NheI! de! pSKCKmR! para! obtener! pSKA.! El! fragmento! PpsbA::phaA::TrbcL! se! escindió! con! BamHI! de! pSKA! y! se! ligó! dentro! de! p320! previamente! digerido! con!BamHI! para! obtener! p320A.! El! mismo! procedimiento!se!utilizó!para!construir!p320C!excepto!que!el!gen!phaC!se!extrajo!del! plásmido!pJexpress416CphaC.! 24! ! Resultados! ! El!gen!phaA!que!codifica!para!la!βCcetotiolasa!y!phaC!que!codifica!para!la!PHB!sintasa!fueron! sintetizados!con!secuencias!optimizadas!para!el!uso!de!codones!preferente!de!cloroplasto!de! C.+ reinhardtii! y! están! presentes! en! los! plásmidos! pJexpress416CphaA! y! pJexpress416CphaC! respectivamente.! Los! plásmidos! pJexpress416CphaA! y! pJexpress416CphaC! contienen! versiones! de! los! genes! phaA! y! phaC,! cuya! secuencia! se! encuentra! optimizada! según! el! uso! preferente! de! codones! del! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii+ (Franklin! 2002).! Estos! genes! están! flanqueados!en!sus!extremos!5’!y!3’!por!sitios!NdeI!y!XbaI!respectivamente.!Para!extraer!los! genes! phaA! o! phaC! se! realizaron! reacciones! de! digestión! enzimática! utilizando! NdeI! y! XbaI! durante!3!h!a!37°C.!La!liberación!de!los!fragmentos!correspondientes!a!los!genes!phaA!o!phaC,! se!comprobó!por!electroforesis!corriendo!una!alícuota!de!la!reacción!de!digestión!en!un!gel!de! agarosa! al! 0.7! %! (p/v).! Se! observaron! dos! bandas,! correspondientes! al! esqueleto! de! los! plásmidos!pJexpress416!y!otra!a!los!genes!phaA+(1.1!kpb)!o!phaC!(1.7!kpb).!Posteriormente!el! resto! de! la! reacción! de! digestión! se! purificó! a! partir! de! un! gel! de! agarosa! utilizando! el! kit! Wizard®+SV+Gel+and+PCR+CleanNUp+System!tal!como!se!describe!en!la!Sección!2.2.2.10.! Simultáneamente! se! separó! el! gen! aphAN6! del! plásmido! pSKCKmR! utilizando! las! enzimas! de! restricción!NdeI!y!NheI,!el!cual!es!compatible!con!el!sitio!XbaI,!para!después!ser!separado!por! electroforesis! en! gel! de! agarosa! el! esqueleto! del! vector! pSKCKmR! sin! aphAN6.! Del! gel! de! agarosa!se!purificó!la!banda!correspondiente!al!tamaño!del!vector!que!contenía!solamente!el! promotor!PpsbA+y!el!terminador!TrbcL.! Posteriormente!se!llevó!a!cabo!una!ligación!durante!una!noche!de!los!genes!phaA!y!phaC!con! el! vector! pSKCKmR! purificado! de! gel! empleando! ADN! Ligasa! T4! de! Fermentas! (Figura! 4)! (Sección!2.2.2.6).!Se!utilizó!una!alícuota!de!cada!reacción!de!ligación!para!transformar!células! calciocompetentes!de!E.+coli!por!choque!térmico!(Sección!2.2.1.2).!De!las!colonias!resistentes!a! ampicilina!recuperadas!se!inocularon!tubos!con!5!mL!de!medio!LB!y!después!se!extrajo!ADN! plasmídico! por! lisis! alcalina! (Sección! 2.2.2.1).! El! ADN! plasmídico! recuperado! para! cada! experimento!fue!digerido!con!BamHI!para!examinar!mediante!electroforesis!en!gel!de!agarosa! al! 0.7! %! (p/v)! si! se! liberaban! las! bandas! de! 1.9! kpb! y! 2.5! kpb! correspondientes! a! PpsbA::phaA::TrbcL!y!PpsbA::phaC::TrbcL!respectivamente!(Figura!4).! Los!plásmidos!pSKA!y!pSKC+fueron!enviados!a!la!compañía!Macrogen!Inc.!(Seúl,!Corea)!para! ser! secuenciados! utilizando! los! primers! M13F! y! M13R! (Tabla! 1).! Los! resultados! de! secuenciación! fueron! analizados! utilizando! el! software! Consed! v23.0! (Gordon! 1998)! realizando! ensambles! de! secuencia! contigua! utilizando! como! molde! secuencias! de! texto! ensambladas! in+ vitro! con! el! software! Serial! Cloner! ! de! los! casetes! de! expresión,! para! comprobar! el! ensamble! correcto! y! verificar! que! los! elementos! de! regulación,! como! 5´! UTR,! promotores! y! terminadores! fueran! correctos! y! que! los! codones! AUG! permanecieran! dentro! del!marco!de!lectura!correcto.! 25! Resultados! ! ! Figura! 3.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! la! digestión! con! NdeI! y! XbaI! de! pJexpress416C phaA,! pJexpress416CphaB! y! pJexpress416CphaC.! Los! plásmidos! fueron! digeridos! con! NdeI! y! XbaI!para!liberar!los!genes!phaA!(1.1!kpb),!phaB!(0.7!kpb)!y!phaC!(1.7!kpb).!La!banda!de!7!kpb! corresponde!al!esqueleto!del!plásmido!pJexpress416.!La!reacción!de!digestión!se!llevó!a!cabo! durante! 3! h! a! 37°C! y! una! alícuota! de! la! reacción! fue! separada! por! electroforesis! en! gel! de! agarosa!al!0.7!%!(p/v)!a!90!V!durante!1!h.!M:!Marcador!de!peso!molecular!1!Kb!DNA+Ladder! (NEB).! Carriles! 1,! 3! y! 5:! plásmidos! pJexpress416CphaA,! pJexpress416CphaB! y! pJexpress416C phaC+ respectivamente.! Carriles! 2,! 4! y! 6:! Reacciones! de! digestión! con! NdeI/XbaI! de! los! plásmidos!pJexpress416CphaA,!pJexpress416CphaB!y!pJexpress416CphaC,+respectivamente.! ! ! 26! ! Resultados! ! ! Figura! 4.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! la! digestión! con! BamHI! de! pSKA! y! pSKC.! Los! plásmidos! pSKA! y! pSKC! fueron! digeridos! con! BamHI! para! liberar! los! casetes! de! expresión! PpsbA::phaA::TrbcL!(1.9!kpb)!y!PpsbA::phaC::TrbcL!(2.5!kpb),!respectivamente.!La!banda!de!3! kpb!corresponde!al!esqueleto!del!plásmido.!La!reacción!de!digestión!se!llevó!a!cabo!durante!3! h!a!37°C!y!se!utilizó!una!alícuota!de!la!reacción!para!ser!separada!por!electroforesis!en!gel!de! agarosa!al!0.7!%!(p/v)!a!90!V!durante!1!h.!M:!Marcador!de!peso!molecular!1!Kb!DNA+Ladder! (NEB).! Carriles! 1! y! 3:! plásmidos! pSKA! y! pSKC,+ respectivamente.! Carriles! 2! y! 4:! Reacciones! de! digestión! con! BamHI+ de! los! plásmidos! pSKA! y! pSKC,! respectivamente.! 27! Resultados! ! Los!casetes!PpsbA::phaA::TrbcL!y!PpsbA::phaC::TrbcL+fueron!extraídos!de!los!plásmidos!pSKA! y! pSKC! por! digestión! con! BamHI! obteniendo! fragmentos! de! 1.9! y! 2.5! kpb! respectivamente! (Figura!4).!Los!fragmentos!fueron!purificados!por!electroforesis!en!gel!de!agarosa!al!0.7!%!y! ligados! con! el! vector! de! transformación! de! cloroplastos! p320! previamente! digerido! con! BamHI! y! desfosforilado! con! fosfatasa! alcalina! de! camarón! (SAP)! para! evitar! su! religación! (Sección! 2.2.2.5).! Se! utilizó! una! alícuota! de! cada! reacción! de! ligación! para! transformar! por! choque! térmico! células! de! E.+coli! DH5α! calciocompetentes! (Sección! 2.2.1.2).! Se! recuperaron! colonias! resistentes! a! ampicilina! y! se! inocularon! tubos! con! 5! mL! de! medio! LB,! de! estos! cultivos! se! extrajo! ADN! plasmídico! por! lisis! alcalina! (Sección! 2.2.2.1).! El! ADN! plasmídico! recuperado! de! las! células! transformadas! con! las! ligaciones! p320A! y! p320C! fue! digerido! con! BamHI!y!fue!separado!por!electroforesis!en!gel!de!agarosa!al!0.7!%!(p/v),!observando!en!el!gel! las!bandas!de!1.9!kpb!y!2.5!kpb!correspondientes!a!PpsbA::phaA::TrbcL!y!PpsbA::phaC::TrbcL! respectivamente,!así!como!la!banda!de!8!kpb!de!p320!(Figura!5,!carriles!1!y!2).! Los! plásmidos! p320A! y! p320C! fueron! secuenciados! con! los! primers! lct59! y! lct60! (Tabla! 1)! para! verificar! la! inserción! y! determinar! orientación! de! los! casetes! PpsbA::phaA::TrbcL! y! PpsbA::phaC::TrbcL.!Después!de!comprobar!la!inserción!del!casete!en!los!vectores!!y!verificar! que!la!secuencia!fuera!correcta,!estos!fueron!utilizados!para!llevar!a!cabo!la!transformación!de! cloroplastos.+! ! Figura!5.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!la!digestión!con!BamHI!de!p320A!y!p320C.!Los! plásmidos!p320A!y!p320C!fueron!digeridos!con!BamHI!para!liberar!los!casetes!de!expresión! PpsbA::phaA::TrbcL!(1.9!kpb)!y!PpsbA::phaC::TrbcL!(2.5!kpb)!respectivamente.!La!banda!de!8! kpb!corresponde!al!esqueleto!de!p320.!La!reacción!de!digestión!se!llevó!a!cabo!durante!3!h!a! 37°C! y! se! utilizó! una! alícuota! de! la! reacción! para! ser! separada! por! electroforesis! en! gel! de! agarosa!al!0.7!%!(p/v)!a!90!V!durante!1!h.!M:!Marcador!de!peso!molecular!1!Kb!DNA+Ladder! (NEB).Carriles!1C2:!Digestión!con!BamHI+de!los!plásmidos!p320A!y!p320C!respectivamente.! 28! ! Resultados! ! 3.2 Construcción!de!p320AC!para!transformación!de!cloroplasto+ El! vector! de! transformación! de! cloroplasto! p320AC! es! un! derivado! de! p320! que! permite! la! inserción!de!los!casetes!de!expresión!de!phaA!y!phaC!entre!el!exón!5!del!gen!psbA!y!el!5S!rRNA! en!el!genoma!del!cloroplasto!de!Chlamydomonas+reinhardtii!(Figura!6).! En! el! vector! de! transformación! p320AC! el! gen! phaA! al! igual! que! en! p320A+(Sección! 3.2)! se! encuentra!bajo!el!control!del!promotor!PpsbA!del!gen!fotosintético!psbA!(Ishikura!1999)!y!el! terminador! del! gen! rbcL! que! codifica! para! la! subunidad! grande! de! la! RuBisCO,! TrbcL.! Para! construir! el! casete! PpsbA::phaA::TrbcL! se! usó! como! base! el! plásmido! pSKCKmR! C1B.! El!plásmido!pSKCKmR!C1B,!construido!en!nuestro!grupo!de!investigación!por!Karla!Macedo!y! Víctor!Pérez,!es!un!derivado!de!pSKCKmR!(Bateman!y!Purton!2000)!al!cual!se!le!removieron! los!sitios!EcoRI,+PstI,+SmaI!y!BamHI,+por!digestión!con!XbaI!y!religación!con+ADN!Ligasa!T4.+El! promotor! PpsbA! se! encuentra! presente! en! pSKCKmR! C1B! flanqueado! por! los! sitios! BamHI/NdeI,! el! terminador! TrbcL! está! flanqueado! por! sitios! NheI+y! SacII.! El! gen! aphAN6! del! casete!PpsbA::aphaAN6::TrbcL!se!sustituyó!con!el!gen!phaA!mediante!la!escisión!de!aphAN6!con! NdeI! y! NheI! y! la! ligación! del! gen! phaA! escindido! con! NdeI! y! XbaI! de! pJexpress416CphaA.! De! esta! forma! se! construyó! el! casete! PpsbA::phaA::TrbcL! flanqueado! por! BamHI! y! SacII! en! los! extremos!5’!y!3’!respectivamente!formando!así!pSKA!C1B!(Figura!6).!! Por! otra! parte! se! generó! el! ! casete! de! expresión! de! phaC! en! el! vector! pKM1! para! posteriormente!ser!transferido!a!pSKA.!El!gen!phaC!se!insertó!entre!el!promotor!del!gen!atpA! (PatpA)! y! TrbcL,! terminador! del! gen! fotosintético! rbcL! para! obtener! pKM1C.! El! plásmido! pKM1,!construido!en!nuestro!grupo!de!investigación!por!Karla!Macedo,!contiene!el!!promotor! endógeno!PatpA,!que!dirige!la!transcripción!y!traducción!del!gen!atpA,!el!cual!codifica!para!la! subunidad! !de!la!ATP!sintasa,!flanqueado!por!sitios!SacII/BamHI!y!NdeI!(Figura!6).!Al!igual! que!PpsbA!el!promotor!PatpA!permite!alcanzar!uno!de!los!mayores!niveles!de!acumulación!de! transcrito! en! el! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii! según! lo! reportado! por! Blowers! (1989).! El! terminador!del!gen!fotosintético!rbcL!(TrbcL)!también!se!encuentra!presente!en!pKM1!y!está! flanqueado! por! sitios! XbaI! y! SacII! (Figura! 6).! ! El! casete! PatpA::phaC::TrbcL! fue! separado! de! pKM1C!por!restricción!con!SacII!y!se!insertó!en!pSKA!C1B,!previamente!digerido!con!SacII!y! desfosforilado! con! SAP,! para! producir! pAC.! El! conjunto! de! casetes! PpsbA::phaA::TrbcL::TpsbA::phaC::PatpA!fue!purificado!a!partir!de!la!digestión!con!BamHI!de! pAC+ y! se! ligó! con! el! vector! de! transformación! de! cloroplastos! p320! para! producir! p320AC! (Figura!6).! 29! Resultados! ! ! Figura!6.!Estrategia!para!la!construcción!de!p320AC,!vector!de!transformación!de!cloroplasto! para! la! inserción! de! los! genes! phaA! y! phaC.! El! gen! aphAC6! se! sustituyó! en! el! plásmido! pSKC KmR!C1B!con!el!gen!phaA.!El!gen!phaA!se!extrajo!con!los!sitios!NdeI!y!XbaI!de!pJexpress416C phaA! y! se! ligó! en! los! sitios! NdeI! y! NheI! de! pSKCKmR! C1B! para! obtener! pSKA! C1B.! Simultáneamente! se! insertó! phaC! en! los! sitios! NdeI! y! XbaI! de! pKM1.! El! casete! PatpA::phaC::TrbcL! se! escindió! con! SacII! del! plásmido! pKM1C! y! se! ligó! con! pSKA! C1B,! previamente! digerido! con! SacII! para! obtener! pAC.! Para! generar! p320AC! el! fragmento! que! contenía!los!casetes!de!expresión!para!los!genes!phaA!y!phaC!fue!separado!con!BamHI!de!pAC! y!se!clonó!dentro!del!sitio!BamHI!del!vector!de!transformación!de!cloroplastos!p320.! 30! ! Resultados! ! En!el!plásmido!pJexpress416CphaA!el!gen!phaA!se!encuentra!flanqueado!por!los!sitios!NdeI!y! XbaI.!Se!realizó!una!reacción!de!digestión!utilizando!NdeI/XbaI!durante!3!h!a!37°C!para!liberar! el! fragmento! correspondiente! a! phaA.! Se! comprobó! la! escisión! de! phaA! del! esqueleto! pJexpress416!corriendo!una!alícuota!de!la!reacción!de!digestión!en!un!gel!de!agarosa!al!0.7!%! (p/v).! La! separación! por! electroforesis! del! fragmento! correspondiente! al! esqueleto! de! pJexpress416!y!la!del!gen!phaA+(1.1!kpb)!se!observó!en!el!gel!(Figura!3,!carril!2).!El!resto!de!la! reacción!de!digestión!se!purificó!a!partir!de!un!gel!de!agarosa!utilizando!el!kit!Wizard®+SV+Gel+ and+PCR+CleanNUp+System!(Promega)!(Sección!2.2.2.10).! Para!remover!el!gen!aphAN6!de!plásmido!pSKCKmR!C1B!se!utilizó!una!reacción!con!NdeI!y!NheI,! dicha! reacción! se! corrió! en! un! gel! de! agarosa! por! electroforesis! para! purificar! la! banda! correspondiente! a! 3.7! kpb! que! contenía! solamente! el! esqueleto! de! pSKCKmR! C1B.! El! vector! purificado!se!dejó!ligando!con!ADN!Ligasa!T4!con!el!gen!phaA!utilizando!los!sitios!NdeI/XbaI! con! NdeI/NheI! de! manera! similar! a! la! que! se! utilizó! para! construir! pSKA! (Sección! 2.2.2.6)! (Figura! 6).! Una! alícuota! de! la! reacción! de! ligación! se! utilizó! para! transformar! células! calciocompetentes! de! E.+ coli! DH5 ! por! choque! térmico! (Sección! 2.2.1.2).! De! las! colonias! resistentes!a!ampicilina!recuperadas!se!inocularon!tubos!con!5!mL!de!medio!LB!y!después!se! extrajo!ADN!plasmídico!por!lisis!alcalina!(Sección!2.2.2.1).!El!ADN!plasmídico!recuperado!fue! digerido!con!BamHI/SacII,+una!alícuota!de!la!reacción!se!examinó!por!!electroforesis!en!gel!de! agarosa!al!0.7!%!(p/v)!para!comprobar!si!se!liberaba!el!fragmento!de!1.9!kpb!correspondiente! a!PpsbA::phaA::TrbcL!(Figura!7!a).! El! casete! de! expresión! PpsbA::phaA::TrbcL! dentro! de! pSKA! C1B! se! secuenció! utilizando! los! primers!M13F!y!M13R!(Tabla!1).!La!secuencia!se!analizó!según!se!describe!en!la!Sección!0.!Se! verificó! el! ensamble! del! plásmido! así! como! que! los! elementos! de! regulación,! 5´! UTR,! promotores!y!terminadores!fueran!correctos!y!la!conservación!del!marco!de!lectura!adecuado! para!el!codón!AUG.! El! plásmido! pJexpress416CphaC! contiene! el! gen! phaC,! el! cual! cuenta! con! sitios! NdeI! en! el! extremo!5’!y!XbaI!en!el!3’.!Se!realizó!una!reacción!de!digestión!con!NdeI!y!XbaI!durante!3!h!a! 37°C! con! el! plásmido! pJexpress416CphaC! para! separar! el! gen! phaC! y! purificar! la! banda! correspondiente! al! tamaño! del! gen! (1.7! kpb)! por! electroforesis! en! gel! de! agarosa! (Figura! 3,! carril! 4)! utilizando! el! kit! Wizard®+ SV+ Gel+ and+ PCR+ CleanNUp+ System! (Promega)! tal! como! se! indica! en! la! Sección! 2.2.2.10.! Después! de! la! purificación,! se! realizó! una! ligación! con! ADN! Ligasa! T4! (Sección! 2.2.2.6)! del! gen! phaC! con! el! plásmido! pKM1,! previamente! digerido! con! NdeI!y!XbaI,!para!introducir!phaC!entre!el!promotor!PatpA!y!el!terminador!TrbcL.!Una!alícuota! de! la! reacción! de! ligación! se! utilizó! para! transformar! células! químicocompetentes! de! E.+coli! DH5α! por! choque! térmico! (Sección! 2.2.1.2).! Se! extrajo! ADN! plasmídico! de! las! colonias! recuperadas!de!la!transformación,!el!cual!fue!digerido!con!NdeI!y!XbaI!+para!liberar!de!pKM1! el!fragmento!que!corresponde!al!gen!phaC!(1.7!kpb)!(Figura!7,!b).!Se! utilizaron! !los!primers! M13F! y! M13R! (Tabla! 1)! para! secuenciar! pKM1C,! una! vez! analizados! los! resultados! de! la! secuenciación!(Sección!0),!se!procedió!a!construir!pAC.!! 31! Resultados! ! ! Figura! 7.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! los! plásmidos! pSKA! C1B! (a)! y! pKM1C! (b).!! El! plásmido! pSKA+ C1B! fue! digerido! con! BamHI! y! SacII! para! liberar! el! casete! de! expresión! PpsbA::phaA::TrbcL! (1.9! kpb),! carril! 1.! M:! Marcador! de! peso! molecular! 1! Kb! DNA+ Ladder! (NEB).!En!B!los!plásmidos!pKM1C!(carril!1)!y!pJexpress416CphaC!(carril!2)!fueron!digeridos! con! NdeI! y! XbaI! para! liberar! phaC! (1.7! kpb).! M:! Marcador! de! peso! molecular! 1! Kb! plus! DNA+ Ladder!(Fermentas).! 32! ! Resultados! ! El!casete!PatpA::phaC::TrbcL!dentro!de!pKM1C!se!encuentra!flanqueado!por!BamHI!y+SacII!!en! los!extremos!5’!y!3’,!respetivamente!(Figura!6).!El!plásmido!pKM1C!tiene!un!peso!de!5.7!kpb! de! los! cuales! 2.8! kpb! corresponden! al! casete! PatpA::phaC::TrbcL! y! el! resto,! 2.9! kpb,! a! su! esqueleto.!Debido!a!la!poca!diferencia!de!peso!entre!el!casete!de!expresión!y!esqueleto,!con!el! fin!de!facilitar!la!separación!de!los!mismos,!!se!realizó!una!reacción!de!digestión!con!SacII!y! DraIII!durante!3!h!a!37°C!del!plásmido!pKM1C!para!liberar!el!casete!de!expresión!de!phaC,!la! reacción! fue! separada! por! electroforesis! en! gel! de! agarosa! 1! %! (p/v)! a! 90V! y! el! fragmento! correspondiente! al! casete! (2.8! kb)! (Figura! 8)! se! purificó! con! el! kit! Wizard®+SV+Gel+and+PCR+ CleanNUp+System! (Promega)! tal! como! se! indica! en! la! Sección! 2.2.2.10.! Una! vez! purificado,! se! utilizó!una!reacción!de!ligación!(Sección!2.2.2.6)!para!unir!el!casete!PatpA::phaC::TrbcL!con!el! plásmido!pSKA!C1B,!previamente!digerido!con!SacII!y!desfosforilado!con!SAP!(Sección!2.2.2.5)! (Figura! 6).! ! Se! transformaron! células! de! E.+ coli! DH5α! con! una! alícuota! de! la! reacción! de! ligación! por! choque! térmico! (Sección! 2.2.1.2)! y! de! las! colonias! recuperadas! de! la! transformación!se!extrajo!ADN!plasmídico!(Sección!2.2.2.1).!! Debido! a! que! la! inserción! del! casete! PatpA::phaC::TrbcL! en! pSKA! C1B! no! fue! por! clonación! direccional,! es! decir! aquella! en! la! que! el! casete! se! hubiera! insertado! en! una! orientación! específica,!fue!necesario!realizar!la!selección!de!los!plásmidos!en!los!cuales!se!encontraba!la! construcción! PpsbA::phaA::TrbcLCTrbcL::phaC::PatpA! (Figura! 6)! y! descartar! aquellos! en! los! que! el! casete! de! phaC! se! hubiera! insertado! en! la! orientación! contraria.! El! análisis! de! orientación!se!realizó!mediante!la!digestión!del!ADN!plasmídico!con!BamHI,!que!en!el!caso!de! PpsbA::phaA::TrbcLCTrbcL::phaC::PatpA! liberaba! fragmentos! de! 4.7! y! 3! kpb! (Figura! 6)! y! al! digerir! PpsbA::phaA::TrbcLCPatpA::phaC::TrbcL! fragmentos! de! 5.7! y! 1.9! kpb.! Se! seleccionó! uno! de! los! plásmidos! cuya! digestión! con! BamHI! permitía! diferenciar! por! electroforesis! en! gel! de! agarosa! el! fragmento! de! 4.7! kpb,! correspondiente! al! casete! de! los! genes! phaA! y! phaC+ (Figura! 9,! carril! 2).! Adicionalmente! la! orientación! del! casete! PatpA::phaC::TrbcL! en! el! plásmido! se! verificó! analizando! los! resultados! de! la! secuenciación!! del!plásmido!con!los!primers!M13F!y!M13R!(Tabla!1)!(Sección!0).! El! plásmido! pAC! se! utilizó! en! una! reacción! de! digestión! con! BamHI! para! extraer! el! casete! PpsbA::phaA::TrbcLCTrbcL::phaC::PatpA+(Figura! 6).! ! El! fragmento! que! correspondía! al! casete! con!un!peso!de!4.7!kpb!se!purificó!por!electroforesis!en!gel!de!agarosa!al!0.7!%!y!se!ligó!con!el! vector! de! transformación! de! cloroplastos! p320,! previamente! digerido! con! BamHI! y! desfosforilado!con!fosfatasa!alcalina!de!camarón!(SAP)!para!evitar!religación!(Sección!2.2.2.5).! Se! utilizó! una! alícuota! de! cada! reacción! de! ligación! para! transformar! por! choque! térmico! células! de! E.+coli! DH5α! calciocompetentes.! De!las!colonias!recuperadas!de!la!transformación! se!extrajo!ADN!plasmídico!(Sección!2.2.2.1)!el!cual!fue!digerido!con!BamHI!y!fue!separado!por! electroforesis!en!gel!de!agarosa!al!0.7!%!(p/v),!observando!en!el!mismo!fragmentos!de!8.3!kpb! y! 4.7! kpb! correspondientes! a! p320! vacío! y! al! casete! PpsbA::phaA::TrbcLCTrbcL::phaC::PatpA+ respectivamente!(Figura!9).! 33! Resultados! ! ! Figura! 8.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! pKM1C! digerido! con! SacII! y! DraIII.! Debido! a! la! poca! diferencia! de! tamaño! entre! el! casete! PatpA::phaC::TrbcL! (2.8! kpb)! y! el! esqueleto! de! pKM1C!(2.9!kpb),!con!el!fin!de!separarlos!y!poder!purificar!el!casete!de!expresión,!se!realizó! una! digestión! doble! durante! 3! h! a! 37°C,! utilizando! SacII! para! liberar! el! casete! y! DraIII! para! disminuir! el! peso! del! esqueleto! pKM1.! La! reacción! de! digestión! fue! separada! por! electroforesis!en!gel!de!agarosa!1!%!(p/v)!a!90V.!M:!Marcador!de!peso!molecular!GeneRuler!1! Kb!(Fermentas).!Carril!1:!Digestión!con!SacII!y!DraIII!de!pKM1C.! 34! ! Resultados! ! El!plásmido!p320AC!fue!secuenciado!con!los!primers!lct59!y!lct60!(Tabla!1)!para!verificar!la! inserción!y!determinar!la!orientación!del!casete.!Después!de!analizar!la!secuencia!del!vector!y! verificar! que! esta! fuera! correcta,! este! se! utilizó! para! llevar! a! cabo! la! transformación! de! C.+ reinhardtii.! ! !Figura!9.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!plásmidos!p320,!pAC!y!p320AC!digeridos!con! BamHI.+ Los! plásmidos! pAC! y! p320AC! fueron! digeridos! con! BamHI! para! liberar! el! casete! de! expresión! PpsbA::phaA::TrbcLCTrbcL::phaC::PatpA! (4.7! kpb,! Carriles! 2! y! 3).! La! banda! de! 8.3! kpb!(Carriles!1!y!3)!corresponde!al!esqueleto!de!p320.!La!reacción!de!digestión!se!llevó!a!cabo! durante!3!h!a!37°C!y!se!utilizó!una!alícuota!de!la!reacción!para!ser!separada!por!electroforesis! en!gel!de!agarosa!al!0.7!%!(p/v)!a!90!V!durante!1!h.!M:!Marcador!de!peso!molecular!GeneRuler! 1! Kb! (Fermentas).! Carril! 1:! Digestión! con! BamHI+del! plásmido! p320.! Carril! 2:! Digestión! con! BamHI+del!plásmido!pAC.!Carril!3:!Digestión!con!BamHI+del!plásmido!p320AC.!! 35! Resultados! ! 3.3 Construcción! de! p320BAC! para! transformación! de! cloroplasto+ Con! el! fin! de! expresar! los! tres! genes! principales! de! la! ruta! bacteriana! de! síntesis! de! PHB! (Suriyamongkol! 2007)! se! construyó! el! vector! de! transformación! de! cloroplastos! p320BAC,! vector!que!dirige!la!inserción!de!casetes!de!expresión!para!phaA,!phaB!y!phaC!hacia!la!región! exón!5!de!psbA!–!5S!rRNA!del!cloroplasto!de!C.+reinhardtii.!!En!la!Figura!10!se!puede!observar! una! representación! esquemática! de! p320BAC,! así! como! la! estrategia! general! seguida! para! construirlo.! En!p320BAC,!los!genes!phaA!y!phaC!se!encuentran!bajo!el!control!de!los!mismos!promotores!y! terminadores! que! en! p320AC! (Sección! 3.2),! es! decir! PpsbA::TrbcL! y! PatpA::TrbcL! respectivamente! ,! mientras! que! el! gen! phaB! está! regulado! por! el! promotor! del! gen! psbD,+el! cual! codifica! para! la! proteína! D2! del! centro! de! reacción! del! fotosistema! II! de! C.+ reinhardtii!! (PpsbD)!y!el!terminador!del!gen!fotosintético!rbcL!(TrbcL).!Por!este!motivo!la!construcción!de! p320BAC!fue!similar!a!la!de!p320AC!(Sección!3.2).! Primero!el!gen!phaA!se!insertó!entre!el!promotor!PpsbA!y!el!terminador!TrbcL!utilizando!los! sitios!NdeI/NheI!!de!pSKCKmR!C2B,!plásmido!construido!en!nuestro!grupo!de!investigación!por! Karla! Macedo! y! Víctor! Pérez! derivado! de! pSKCKmR! (Bateman! y! Purton! 2000)! al! cual! se! le! removieron! los! sitios! BamHI,! ! reemplazando! al! gen! aphAN6! para! obtener! pSKA! C2B.! Posteriormente! el! casete! de! expresión! de! phaC! fue! removido! de! pKM1C! (Sección! 3.2),! plásmido! donde! el! gen! phaC! se! encuentra! unido! al! promotor! PatpA! y! al! terminador! del! gen! rbcL! (TrbcL),! mediante! una! reacción! con! SacII! y! se! ligó! con! pSKA! C2B! previamente! digerido! con!SacII!y!desfosforilado!con!SAP!obteniendo!así!pAC!C1B!(Figura!10).!! Por! otra! parte! el! gen! phaB,! proveniente! de! pJexpress416CphaB,! se! insertó! en! los! sitios! NdeI/XbaI! de! pKM2,! plásmido! construido! en! nuestro! grupo! de! investigación! por! Karla! Macedo,! para! obtener! pKM2B.! Dentro! de! pKM2B! se! encuentra! el! promotor! del! gen! fotosintético! psbD! (PpsbD)! flanqueado! por! + NotI! y! NdeI! en! los! extremos! 5’! y! 3’! respectivamente.!El!terminador!presente!en!pKM2B!(TrbcL)!es!el!del!gen!rbcL!y!cuenta!con!un! sitio! XbaI! en! el! extremo! 5’! y! un! sitio! NotI! en! 3’.! Con! el! fin! de! agregar! sitios! SmaI! en! los! extremos! del! casete! PpsbD::phaB::TrbcL,! el! fragmento! NotI! de! pKM2B! se! insertó! en! el! sitio! NotI!de!pBlueScript!II!KS+!para!obtener!pBSIIKM2B,!del!cual!se!extrajo!el!casete!con!EcoRI!y! SacI! para! ser! clonado! en! pUC19! y! obtener! pUBsKM2B.! El! casete! PpsbD::phaB::TrbcL! fue! separado! de! pUBsKM2B! utilizando! SmaI! e! insertado! en! pAC! C1B! previamente! digerido! con! SmaI,! para! obtener! pBAC! (Figura! 10).! En! pBAC! el! tándem! de! casetes! de! expresión! para! los! genes!phaA,!phaB+y!phaC!fue!escindido!mediante!reacción!con!BamHI,!purificado!a!partir!de! gel! y! ligado! en! p320,! previamente! digerido! con! BamHI,! para! obtener! el! vector! de! transformación!de!cloroplastos!p320BAC!(Figura!10).!! 36! ! Resultados! ! ! Figura! 10.! Estrategia! para! la! construcción! de! p320BAC,! vector! de! transformación! de! cloroplasto! para! la! inserción! de! los! genes! phaA,! phaB! y! phaC.! Se!construyó!pAC!C1B!partiendo!como!base!de!pSKCKmR!C2B!donde!se!sustituyó!el!gen!aphAN6,! separado! con! una! reacción! NdeI/NheI,! con! el! gen! phaA,! proveniente! de! pJexpress416CphaA! con! extremos! NdeI/XbaI.! El! casete! PatpA::phaC::TpsbA! de! pKM1C! se! escindió! con! SacII! y! se! ligó!con!pAC!C1B,!previamente!digerido!con!SacII!para!obtener!pAC!C1B.!El!gen!phaB!se!insertó! en!los!sitios!NdeI!y!XbaI!de!pKM2,!para!producir!pKM2B.!Se!subclonó!sucesivamente!pKM2B! en!pUC19!y!pBlueScript!II!KS+!para!llegar!a!pUBsKM2B.!El!fragmento!SmaI!de!pUBsKM2B!que! contenía! el! casete! PpsbD::phaB::TrbcL! se! purificó! y! fue! ligado! con! pAC! C1B,! previamente! digerido!con!SmaI,!para!producir!pBAC! 37! Resultados! ! El! casete! de! expresión! PpsbD::phaB::TpsbA! se! construyó! mediante! la! inserción! de! phaB! en! los! sitios! NdeI! y! XbaI! de! pKM2.! El! plásmido! pJexpress416CphaB! contiene! el! gen! phaB,!flanqueado!por!sitios!NdeI!y!XbaI!en!los!extremos!5’!y!3’!respectivamente.!En!pKM2,!el! promotor!del!gen!fotosintético!psbD!(PpsbD)!está!flanqueado!por!NotI!y!NdeI,!mientras!que!el! terminador! de! rbcL! (TrbcL)! está! flanqueado! por! XbaI! y! NotI.! Se! realizó! una! reacción! de! digestión!con!NdeI!y!XbaI!durante!3!h!a!37°C!de!pJexpress416CphaB!para!separar!el!gen!phaB! y!purificar!el!fragmento!correspondiente!al!gen!(0.7!kpb)!por!electroforesis!en!gel!de!agarosa! (Figura! 3,! carril! 3)! utilizando! el! kit! Wizard®+ SV+ Gel+ and+ PCR+ CleanNUp+ System! de! Promega! (Sección! 2.2.2.10).! Después! de! la! purificación,! se! ligó! phaB! con! pKM2,! previamente! digerido! con! NdeI! y! XbaI.! Una! alícuota! de! la! reacción! de! ligación! se! utilizó! para! transformar! células! calciocompetentes! de! E.+ coli! DH5α! por! choque! térmico! (Sección! 2.2.1.2)! y! se! extrajo! ADN! plasmídico! de! las! colonias! recuperadas! de! la! transformación,! el! cual! fue! digerido! con! NotI! para!liberar!de!pKM2B!el!fragmento!que!corresponde!al!casete!de!phaB+(1.7!kpb)!(Figura!11,! a).+El!fragmento!NotI!de!pKM2B!se!ligó!con!pBlueScript!II!KS+,!previamente!digerido!con!NotI,! una!alícuota!de!la!reacción!de!ligación!se!utilizó!para!transformar!células!calciocompetentes! de!E.+coli!Top10!por!choque!térmico!(Sección!2.2.1.2)!sobre!cajas!de!medio!LB!con!XCgal!para! realizar!una!selección!“blancasCazules”.!Se!seleccionó!una!colonia!blanca!de!la!cual!se!realizó! una!preparación!de!ADN!plasmídico!(Sección!2.2.2.1).!Del!plásmido!recuperado!se!extrajo!el! fragmento! EcoRI/SacI! y! se! ligó! con! pUC19,! previamente! digerido! con! EcoRI! y! SacI,! se! transformaron! células! calciocompetentes! de! E.+ coli! Top10! por! choque! térmico! (Sección! 2.2.1.2)! y! se! realizó! una! selección! “blancasCazules”.! Se! recuperó! ADN! plasmídico! de! las! colonias! transformadas! y! fue! digerido! con! SmaI! para! comprobar! la! liberación! del! casete! PpsbD::phaB::TrbcL!(1.7!kpb)!(Figura!11,!b)!Se!realizó!la!secuenciación!de!pUBsKM2B!con!los! primers!M13F!y!M13R!(Tabla!1)!y!se!comprobó!su!correcta!construcción!(Sección!0).! Para!construir!pAC!C1B!se!siguió!básicamente!el!mismo!procedimiento!que!para!pAC!(Sección! 3.2! y! Figura! 6),! excepto! que! la! base! utilizada! para! el! gen! phaA! fue! pSKA! C2B,! versión! modificada!de!pSKCKmR!(Bateman!y!Purton!2000)!a!la!cual!se!le!removieron!los!sitios!BamHI.! El!plásmido!pAC!C1B!surge!de!la!ligación!del!fragmento!SacII!de!pKM1C!con!plásmido!pSKA!C 2B,! previamente! digerido! con! SacII! (Sección! 2.2.2.4)! y! desfosforilado! con! SAP! (Sección! 2.2.2.5).! Para! comprobar! que! los! casetes! de! expresión! de! phaA! y! phaC! se! encontraban! en! el! orden!deseado,!se!realizó!una!digestión!con!SmaI!y!BamHI!para!observar!la!liberación!del!par! de!casetes!(Figura!10!y!Figura!11,!c)!y!posteriormente!pSKA!C2B!fue!secuenciado!con!!M13F!y! M13R!(Tabla!1).! 38! ! Resultados! ! ! Figura!11.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!plásmidos!pKM2B!(a),!pUScKM2B!(b)!y!pAC!C 1B! (c).! El! plásmido! pKM2B! fue! digerido! con! NotI! para! liberar! el! casete! de! expresión! PpsbD::phaB::TrbcL! (1.7! kpb),! carril! 1.! M:! Marcador! de! peso! molecular! 1! Kb! DNA+ Ladder! (NEB).!En!B,!pUScKM2B!(carril!1)!fue!digerido!SmaI!para!liberar!el!casete!de!phaB!(1.7!kpb).! M:! Marcador! de! peso! molecular! 1! Kb! plus! DNA+ Ladder! (Fermentas).! Mientras! que! en! C! se! observa!la!digestión!de!pAC!C1B!con!SmaI!y!BamHI,!liberando!el!fragmento!correspondiente!a! los!casetes!de!expresión!para!los!genes!phaA!y!phaC!(4.7!kpb).!M:!Marcador!de!peso!molecular! 1!Kb!plus!DNA+Ladder!(Fermentas).!Las!reacciones!de!digestión!se!llevaron!a!cabo!durante!3!h! a!37°C!y!se!utilizó!una!alícuota!de!la!reacción!para!ser!separada!por!electroforesis!en!gel!de! agarosa!al!0.7!%!(p/v)!a!90!V.! 39! Resultados! ! Para!la!construcción!de!pBAC!(Figura!10),!se!insertó!el!casete!PpsbD::phaB::TrbcL!en!el!sitio! SmaI!de!pSKA!C2B.!El!plásmido!pUBsKM2B!fue!digerido!con!SmaI!durante!3!h!a!37°C,!después! de!la!digestión!se!purificó!el!fragmento!de!1.7!kpb!correspondiente!al!casete!de!expresión!de! phaB! por! electroforesis! en! gel! de! agarosa! 0.7! %! a! 90V! utilizando! el! kit! Wizard®+SV+Gel+and+ PCR+ CleanNUp+ System! de! Promega! como! se! indica! en! la! Sección! 2.2.2.10.! El! fragmento! purificado! se! insertó! en! el! sitio! SmaI! de! pSKA! C2B,! previamente! digerido! con! SmaI! y! desfosforilado! con! SAP! (Sección! 2.2.2.5),! utilizando! ADN! Ligasa! T4! (Sección! 2.2.2.6).! Una! alícuota! de! la! reacción! de! ligación! se! utilizó! para! transformar! por! choque! térmico! células! calciocompetentes! de! E.+ coli! DH5α! (Sección! 2.2.1.2),! y! de! las! colonias! transformadas! recuperadas! se! extrajo! ADN! plasmídico,! el! cual! fue! digerido! con! BamHI! para! seleccionar! aquellos!plásmidos!en!los!que!el!conjunto!de!los!tres!casetes!(6.4!kpb)!fuera!liberado!entero! del! esqueleto! de! pBAC! (2.9! kpb)! ! (Figura! 12).! La! presencia! de! ! PpsbD::phaB::TrbcL! en! pBAC! fue! comprobada! por! secuenciación! utilizando! los! primers! M13F! y! M13R! (Tabla! 1)! y! los! resultados!se!analizaron!como!se!describe!en!la!Sección!2.2.2.13.! Una!vez!comprobado!el!ensamble!de!los!tres!casetes!se!construyó!el!vector!de!transformación! de! cloroplastos! p320BAC.! El! plásmido! pBAC! fue! digerido! utilizando! BamHI! (Figura! 10)! durante! 3! h! a! 37°C! y! el! fragmento! TpsbA::phaB::PpsbDC! PpsbA::phaA::TrbcLC TpsbA::phaC::PatpA!de!6.4!kpb!(Figura!12)!fue!purificado!a!partir!de!una!electroforesis!a!90!V! en!gel!de!agarosa!0.7!%!(p/v)!tal!como!se!indica!en!la!Sección!2.2.2.10.!Una!vez!purificado,!el! conjunto!de!casetes!se!ligó!con!el!vector!de!transformación!de!cloroplastos!p320,!previamente! digerido!con!BamHI!y!desfosforilado!con!SAP!(Sección!2.2.2.5).!La!reacción!de!ligación!se! usó! para! transformar! células! calciocompetentes! de! E.+ coli! DH5α! utilizando! choque! térmico!(Sección!2.2.1.2)!y!se!extrajo!ADN!plasmídico!de!las!colonias!transformadas!tal!como! se! indica! en! la! Sección! 2.2.2.6.! El! ADN! plasmídico! recuperado! liberaba! un! fragmento! de! 6.4! kpb,!correspondiente!al!conjunto!de!casetes,!y!otro!de!8.3!kpb,!correspondiente!al!esqueleto! del!vector!de!transformación!de!cloroplastos,!al!ser!tratado!con!BamHI!(Figura!13,!carril!4).!A! este!vector!se!le!denominó!p320BAC.!! La! secuencia! de! los! casetes! de! expresión! de! phaA,! phaB! y! phaC! en! el! vector! final! para! transformación! de! cloroplastos! p320BAC! se! comprobó! mediante! secuenciación! con! los! primers! lct59,! lct68,! JAB320,! JAB321,! JAB322,! JAB323,! JAB324,! JAB325,! JAB326,! JAB327! JAB328!y!JAB329!(Tabla!1).!El!resultado!de!la!secuenciación!se!analizó!con!el!software!Consed! tal!como!se!indica!en!la!Sección! 2.2.2.6!para! determinar! la! orientación! del! casete! dentro! del! vector!y!el!correcto!ensamble!de!las!regiones!codificantes!con!los!promotores!y!terminadores.! La!construcción!de!p320BAC!fue!correcta!y!el!vector!se!utilizó!para!transformar!el!cloroplasto! de!C.+reinhardtii,!como!se!describe!en!la!Sección!2.2.4.! 40! ! Resultados! ! ! Figura! 12.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! la! digestión! con! BamHI! de! pBAC.! Se!utilizó!una!digestión!con!BamHI!del!plásmido!pBAC!para!liberar!el!conjunto!de!los!casetes! de! expresión! para! phaB,! phaA! y! phaC! (6.4! kpb)! respectivamente.! La! banda! de! 3! kpb! corresponde!al!esqueleto!del!plásmido.!La!reacción!de!digestión!se!llevó!a!cabo!durante!3!h!a! 37°C! y! se! utilizó! una! alícuota! de! la! reacción! para! ser! separada! por! electroforesis! en! gel! de! agarosa! al! 0.7! %! (p/v)! a! 90! V! durante! 1! h.!! M:! Marcador! de! peso! molecular! GeneRuler! 1! Kb! (Fermentas).!! Carril!1:!Plásmido!pBAC!sin!digerir.!Carril!2:!Digestión!con!BamHI+de!pBAC.! 41! Resultados! ! ! Figura!13.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!vectores!para!transformación!de!cloroplasto! p320A,! p320C,! p320AC! y! p320BAC! digeridos! con! BamHI.+ Los!vectores!para!transformación!de!cloroplasto!fueron!digeridos!con!BamHI!para!liberar!el! casete!o!conjunto!de!casetes!de!expresión!que!contenían,!liberando!el!fragmento!del!tamaño! correspondiente.!Al!casete!para!el!gen!phaA!en!p320A!corresponde!la!banda!de!1.9!kpb!(Línea! 1),!en!la!línea!2!se!observa!el!fragmento!de!2.5!kpb!correspondiente!al!casete!del!gen!phaC.!La! banda!de!4.7kpb!presente!en!la!línea!3!es!la!que!corresponde!a!la!unión!de!los!casetes!para!los! genes!phaA!y!phaC,!mientras!que!el!fragmento!de!6.4!kpb!en!la!línea!4!contiene!el!conjunto!de! los! genes! phaB,! phaA! y! phaC! con! sus! respectivos! casetes! de! expresión.! La! banda! de! 8.3! kpb! corresponde!al!esqueleto!de!p320.!La!reacción!de!digestión!se!llevó!a!cabo!durante!3!h!a!37°C! y!una!alícuota!de!la!reacción!fue!separada!por!electroforesis!en!gel!de!agarosa!al!0.7!%!(p/v)!a! 90!V!durante!1!h.!M:!Marcador!de!peso!molecular!GeneRuler!1!Kb!Plus!(Fermentas).!Carril!1:! Digestión!con!BamHI+del!plásmido!p320A.!Carril!2:!Digestión!con!BamHI+del!plásmido!p320C.! Carril! 3:! Digestión! con! BamHI+ del! plásmido! p320AC.! Carril! 4:! Digestión! con! BamHI+ del! plásmido!p320BAC.! 42! ! Resultados! ! 3.4 Transformación!del!cloroplasto!de!C.+reinhardtii!con!p320A! y!p320C! Utilizando! los! vectores! p320A! y! p320C! (Sección! 3.1)! se! recubrieron! partículas! de! tungsteno! (MC10,!BioRad)!para!llevar!a!cabo!la!transformación!de!cloroplasto!de!células!de!C.+reinhardtii! (~1✕108! cél)! por! biobalística,! empleando! un! equipo! de! bombardeo! de! micropartículas! Biolistic!PDSC1000/He!(BioCRad),!como!se!indica!en!la!Sección!2.2.4.3.! Se!bombardearon!15!cajas!con!partículas!de!tungsteno!recubiertas!con!los!vectores!p320A!y! p228,! y! 14! cajas! con! p320C.! Los! eventos! de! bombardeo! con! cada! uno! de! los! vectores! se! realizaron! coCbombardeando! el! ! vector! p228,! el! cual! confiere! resistencia! a! espectinomicina! (Sección!2.2.32).! Después! de! 4! semanas,! las! colonias! resistentes! a! espectinomicina! (Figura! 14c)! fueron! resembradas! tres! veces! consecutivas! en! medio! TAP! (espectinomicina! 150! μg/mL)! con! un! intervalo! de! 2! semanas! entre! cada! resiembra! (Figura! 14d).! De! las! 15! cajas! con! algas! bombardeadas!con!p320A,!se!obtuvieron!!16!colonias!resistentes!a!espectinomicina!mientras! que! de! los! 14! bombardeos! con! p320C,! fueron! obtenidas! 19! líneas! resistentes! a! espectinomicina!(Figura!14c).! 43! Resultados! ! ! Figura! 14.! Cultivo! de! células! de! C.+ reinhardtii! bombardeadas! con! partículas! de! tungsteno! recubiertas!con!p320A.!a)!Cajas!de!medio!TAP!(espectinomicina!150!μg/mL)!con!células!de!C.+ reinhardtii! (~1✕108! cél)! el! día! que! fueron! bombardeadas! con! partículas! de! tungsteno! recubiertas! con! p228! y! p320A.! b)! Control! negativo! a! las! cuatro! semanas! del! bombardeo,! células!de!C.+reinhardtii!en!TAP!(espectinomicina!150!μg/mL)!que!no!fueron!bombardeadas.! c)! Células! de! C.+ reinhardtii! bombardeadas! con! p228! y! p320A,! cuatro! semanas! después! del! bombardeo.! d)! Líneas! resistentes! a! espectinomicina! recuperadas! y! resembradas! 45! días! después!del!bombardeo.! 44! ! Resultados! ! 3.5 Identificación! de! las! líneas! transplastómicas! phaA! y! phaC! por!PCR!! Las! líneas! resistentes! a! espectinomicina! en! la! tercer! resiembra! (9C11! semanas! después! del! bombardeo)! fueron! analizadas! por! PCR! para! determinar! la! presencia! de! los! genes! phaA! o! phaC,! utilizando! como! molde! ADN! celular! total,! extraído! con! el! Wizard®+ Genomic+ DNA+ Purification+ Kit! de! Promega! tal! como! se! describe! en! la! Sección! 2.2.2.11.! Se! utilizaron! los! primers!específicos!para!amplificar!phaA,!JAB320!y!JAB321,!y!phaC,!JAB325!y!JAB326!(Tabla! 1).!Los!sitios!de!alineamiento!de!los!primers!se!indican!en!la!Figura!15.!El!tamaño!esperado! para!los!fragmentos!de!ADN!generado!por!los!primers!para!phaA!y!phaC!son!1179!y!1770!pb! respectivamente.! El! ADN! celular! total! extraído! de! las! 16! líneas! resistentes! a! espectinomicina! obtenidas! por! la! coCtransformación!con!los!vectores!p320A!y!p228!fue!utilizado!para!realizar!PCR,!una!alícuota! de!la!reacción!fue!separada!por!electroforesis!en!gel!de!agarosa!0.7!%!(p/v).!De!las!15!líneas! resistentes!a!espectinomicina!examinadas!(sólo!se!muestran!cuatro),!cuatro!fueron!positivas! para! phaA,! como! se! muestra! en! la! Figura! 15.! Estas! líneas! fueron! identificadas! como! A4,! A5,! A10!y!A11.! De! las! 19! líneas! resistentes! a! espectinomicina! (sólo! se! muestran! cinco)! obtenidas! por! la! coC transformación! con! los! vectores! p320C! y! p228,! 12! fueron! positivas! para! phaC! al! ser! analizadas!por!PCR!(Figura!15).!Estas!líneas!fueron!identificadas!como!C1,!C2,!C3,!C5,!C7,!C9,! C10,!C12,!C15,!C16,!C17!y!C18.! En! promedio! se! obtuvo! 1! línea! resistente! a! espectinomicina! por! cada! caja! bombardeada.! La! resistencia! a! espectinomicina! era! proporcionada! por! una! mutación! puntual! en! el! gen! 16S! dentro!de!p228!(Sección!2.1.3),!misma!que!puede!ocurrir!de!forma!espontánea,!aunque!no!se! ha! reportado! una! incidencia! elevada! de! la! misma! (Newman! y! Boynton! 1990).! Por! dicho! motivo,!se!infiere!que!la!resistencia!a!espectinomicina!de!las!líneas!positivas!para!phaA!o!phaC! se!debe!a!que!fueron!coCtransformadas!con!p228!y!p320A!o!p320C!mientras!que!en!las!líneas! resistentes!a!espectinomicina!pero!negativas!para!la!presencia!de!los!genes,!la!resistencia!se! debió!solamente!a!la!integración!de!p228!en!su!plastoma.! 45! Resultados! ! ! Figura!15.!Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!productos!de!PCR!de!líneas!transplastómicas! obtenidas! con! los! vectores! de! transformación! de! cloroplasto! p320A! o! p320C.! Se! diseñaron! primers!específicos!que!se!alineaban!con!la!secuencia!codificante!del!gen!phaA+(a)!o!phaC!(c)! para! la! detección! de! los! mismos! por! PCR.! El! tamaño! esperado! del! producto! de! la! PCR! para! amplificar!el!gen!phaA!es!de!1179!pb!y!de!1773!pb!para!phaC.!Se!extrajo!ADN!celular!total!de! las!líneas!resistentes!a!espectinomicina!en!la!tercer!resiembra,!el!cual!fue!analizado!por!PCR! para!identificar!las!líneas!transplastómicas!que!contenían!el!gen!de!interés.!b)!Electroforesis! en!gel!de!agarosa!de!los!productos!de!PCR!obtenidos!con!los!primers!JAB320!y!JAB321!para! amplificar! el! gen! phaA! en! líneas! resistentes! a! espectinomicina! obtenidas! con! p320A.! d)! Electroforesis!en!gel!de!agarosa!de!los!productos!de!PCR!obtenidos!con!los!primers!JAB326!y! JAB327! para! amplificar! el! gen+ phaC! en! líneas! resistentes! a! espectinomicina! obtenidas! con! p320C.!M:!Marcador!de!peso!molecular!1!Kb!DNA+Ladder!(NEB)!P:!Control!positivo!(Reacción! de!PCR!con!p320A!o!p320C!como!molde)!N:!Control!negativo!(Reacción!de!PCR!sin!ADN)!wt:! Control!negativo!(Reacción!de!PCR!con!ADN!de!C.+reinhardtii!silvestre).! 46! ! Resultados! ! 3.6 Transformación!del!cloroplasto!de!C.+reinhardtii!con!p320AC! Se! utilizó! el! vector! ! p320AC! para! transformar! células! de! C.+ reinhardtii! en! fase! log! (1x108! cél/mL)! con! partículas! de! tungsteno! (MC10,! BioRad)! recubiertas! de! ADN,! empleando! un! equipo!de!bobardeo!de!micropartículas!Biolistic!PDSC1000/He!(BioCRad),!como!se!indica!en!la! Sección!2.2.4.3.! Diecinueve!cajas!fueron!bombardeadas!con!los!vectores!p320AC!y!p228!utilizando!partículas! de! tungsteno.! La! selección! de! transformadas! se! realizó! sobre! medio! TAP! adicionado! con! espectinomicina! (150! μg/mL)! y! fueron! resembradas! cada! dos! semanas,! con! un! total! de! tres! resiembras,!como!se!describe!en!la!Sección!2.2.4.4.!Diez!semanas!después!del!bombardeo!se! recuperaron!14!líneas!resistentes!a!espectinomicina.! Para! determinar! la! presencia! de! los! genes! phaA! y! phaC! en! estas! líneas! resistentes! a! espectinomicina! recuperadas,! se! les! extrajo! ADN! celular! total! con! el! Wizard®+Genomic+DNA+ Purification+ Kit! de! Promega! (Sección! 2.2.2.11),! el! cual! fue! utilizado! para! realizar! una! PCR! utilizando! primers! específicos! para! amplificar! phaA! (JAB320/JAB321)! y! phaC! (JAB326/JAB327)! (Tabla! 1).! Se! esperaba! que! la! PCR! produjera! fragmentos! de! ADN! con! un! tamaño!de!1179!pb!para!el!par!de!primers!JAB320/JAB321!(phaA)!y!de!1770!pb!para!el!par! JAB326/JAB327! (phaC).! En! la! Figura! 16! se! muestra! una! representación! esquemática! del! vector!p320AC!indicando!los!sitios!de!alineamiento!de!los!primers!JAB320,!JAB321,!JAB326!y! JAB327!así!como!los!tamaños!de!los!fragmentos!esperados.! De! las! 14! líneas! resistentes! a! espectinomicina! obtenidas! con! el! vector! de! transformación! p320AC,!siete!fueron!positivas!para!la!presencia!de!phaA!y!phaC!(Figura!16,!se!muestran!solo! dos! de! la! líneas! identificadas! como! transformadas)! al! ser! analizadas! por! PCR.! Estas! líneas! fueron! denominadas! AC2,! AC3,! AC7,! AC11,! AC12,! AC13! y! AC15.! El! resto! de! las! líneas! resistentes! a! espectinomicina,! como! se! mencionó! anteriormente,! pueden! ser! en! mayor! medida!el!resultado!de!la!transformación!con!solo!p228!o!en!menor!medida!de!una!mutación! espontánea! en! el! gen! 16S! rRNA! que! también! confiere! resistencia! a! espectinomicina! (Harris! 1989).! 47! Resultados! ! ! Figura! 16.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! los! productos! de! PCR! de! las! líneas! transplastómicas!obtenidas!con!el!vector!de!transformación!de!cloroplasto!p320AC.!La!PCR!se! llevó!a!cabo!utilizando!ADN!celular!total!extraído!de!C.+reinhardtii!silvestre!(wt)!y!de!las!líneas! resistentes!a!espectinomicina!en!la!tercer!resiembra!usando!primers!específicos!para!phaA!y! phaC.!a)!Representación!esquemática!del!genoma!de!cloroplasto!de!C.+reinhardtii!modificado! con! el! casete! de! expresión! proveniente! del! vector! p320AC.! Los! tamaños! esperados! de! los! productos! de! PCR! para! phaA! y! phaC! se! representan! con! las! barras! negras.! b)! Productos! de! PCR!de!las!reacciones!llevadas!a!cabo!con!primers!específicos!para!amplificar!phaA!(1.17!kb)!y! para! phaC! (1.77! kb)! en! las! líneas! resistentes! a! espectinomicina! obtenidas! con! p320AC.! M:! Marcador!de!peso!molecular!1!Kb!DNA+Ladder!(NEB)!P:!Control!positivo!(Reacción!de!PCR!con! p320AC! como! molde)! N:! Control! negativo! (Reacción! de! PCR! sin! ADN)! wt:! Control! negativo! (Reacción!de!PCR!con!ADN!de!C.+reinhardtii!silvestre).! 48! ! Resultados! ! 3.7 Transformación! del! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii! con! p320BAC! La! transformación! del! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii! se! llevó! a! cabo! esencialmente! como! se! describe! en! las! Secciones! 2.2.4.3! Veintiocho! cajas! con! C.+ reinhardtii! (1x108! cél/mL)! fueron! bombardeadas!con!partículas!de!tungsteno!recubiertas!con!los!vectores!p320BAC!y!p228!para! llevar!a!cabo!la!coCtransformación!empleando!una!pistola!BioCRad!Biolistic!PDSC1000/He.!! Veintiocho!cajas!fueron!bombardeadas!con!los!vectores!p320BAC!y!p228!utilizando!partículas! de!tungsteno.!La!selección!de!transformadas!se!llevó!a!cabo!sobre!medio!TAP!adicionado!con! espectinomicina! (150! μg/mL)! como! se! describe! en! la! Sección! 2.2.4.4! Después! de! diez! semanas,!se!recuperaron!8!líneas!resistentes!a!espectinomicina.!Estas!líneas!fueron!analizadas! por! PCR! para! determinar! la! presencia! de! los! genes! phaA,! phaB! y! phaC.! Se! les! extrajo! ADN! celular! total! como! se! describe! en! la! Sección! 2.2.2.11,! el! cual! fue! utilizado! como! molde! en! la! reacción!de!PCR!utilizando!primers!específicos!para!amplificar!phaA!(JAB320/JAB321),!phaB! (JAB324/JAB325)! y! phaC! (JAB326/JAB327)! (Tabla! 1),! se! esperaba! que! la! PCR! produjera! fragmentos!de!ADN!con!un!tamaño!de!1179!pb!para!el!set!de!primers!JAB320/JAB321!(phaA),! de!773!pb!para!JAB324/325!(phaB)!y!de!1770!pb!JAB325/JAB326!(phaC).!En!la!Figura!17!se! muestra! una! representación! esquemática! del! vector! p320BAC! indicando! los! sitios! de! alineamiento!de!los!primers!utilizados!para!la!identificación!de!las!líneas!transformadas!con! phaA,!phaB!y!phaC.! De! las! 8! líneas! resistentes! a! espectinomicina! obtenidas! con! el! vector! de! transformación! p320BAC,! cinco! fueron! positivas! para! la! presencia! de! phaA,! phaB! y! phaC! (Figura! 17)! al! ser! analizadas! por! PCR! (Sólo! se! muestra! una).! Estas! líneas! fueron! denominadas! BAC1,! BAC2,! BAC6,! BAC7! y! BAC8.! Al! igual! que! en! el! caso! de! la! líneas! obtenidas! con! los! vectores! p320A,! p320C!y!p320AC,!las!líneas!resistentes!a!espectinomicina,!pero!que!no!contienen!los!genes!de! interés,!pueden!ser!el!resultado!de!la!transformación!solamente!con!p228!o!de!una!mutación! espontánea!en!el!gen!16S!rRNA!que!confiere!resistencia!a!espectinomicina!(Harris!1989).! ! 49! ! Resultados! ! ! Figura! 17.! Electroforesis! en! gel! de! agarosa! de! los! productos! de! PCR! de! las! líneas! transplastómicas!obtenidas!con!el!vector!de!transformación!de!cloroplasto!p320BAC.!La!PCR! se! llevó! a! cabo! utilizando! ADN! celular! total! extraído! de! C.+reinhardtii! silvestre! (wt)! y! de! las! líneas! resistentes! a! espectinomicina! en! la! tercer! resiembra! usando! primers! específicos! para! phaA,!phaB!y!phaC.!a)!Representación!esquemática!del!genoma!de!cloroplasto!de!C.+reinhardtii! modificado! con! el! casete! de! expresión! proveniente! del! vector! p320BAC.! Los! tamaños! esperados! de! los! productos! de! PCR! para! phaA,+ phaB! y! phaC! se! representan! con! las! barras! negras.! b)! Productos! de! PCR! de! las! reacciones! realizadas! con! los! primers! JAB320/JAB321! para! amplificar! phaA! (1.17! kb),! JAB324/JAB325! para! amplificar! phaB! (0.74! kb)! y! JAB326/JAB327!para!phaC!(1.77!kb)!en!las!líneas!resistentes!a!espectinomicina!obtenidas!con! p320BAC.+ M:! Marcador! de! peso! molecular! 1! Kb! DNA+ Ladder! (NEB)! P:! Control! positivo! (Reacción!de!PCR!con!p320AC!como!molde)!N:!Control!negativo!(Reacción!de!PCR!sin!ADN)! wt:!Control!negativo!(Reacción!de!PCR!con!ADN!de!C.+reinhardtii!silvestre).! ! ! 50! ! Resultados! ! La!eficiencia!de!transformación!para!los!vectores!de!transformación!de!cloroplasto!p320A,! p320C,!p320AC!y!p320BAC!se!condensa!en!la!Tabla!2! Tabla! 2.! Resumen! de! las! líneas! transplastómicas! obtenidas! con! los! vectores! para! transformación!de!cloroplasto!p320A,!p320C,!p320AC!y!p320BAC.! Vector! Cajas! bombardeadas! p320A! 15! p320C! 14! p320AC! 19! p320BAC! 28! Lineas! Lineas! positivas! que! resistentes!a! contienen! los! genes! Identificador!de!línea! espectinomicina!! de!interés+ 15! A4,!A5,!A10,!A11! 6+PHAA+,! C1,!C2,!C3,!C5,!C7,!C9,! 19! C10,!C12,!C15,!C16,! 12!PHAC+,! C17,!C18! AC2,!AC3,!AC7,!AC11,! 14! 7!PHAA+/PHAC+! AC12,!AC13,!AC15! + + BAC1,!BAC2,!BAC6,! 5!PHAA /+PHAB /+ 8! + BAC7,BAC8! PHAC ! ,!variando!desde!aproximadamente!1!línea!resistente!a!espectinomicina!por!cada!cuatro! bombardeos,!como!en!el!caso!de!p320BAC,!a!obtener!una!línea!resistente!por!caja! bombardeada!como!se!observó!para!p320A.! Tabla! 2.! Resumen! de! las! líneas! transplastómicas! obtenidas! con! los! vectores! para! transformación!de!cloroplasto!p320A,!p320C,!p320AC!y!p320BAC.! Vector! Cajas! bombardeadas! p320A! 15! p320C! 14! p320AC! 19! p320BAC! 28! 51! Lineas! Lineas! positivas! que! resistentes!a! contienen! los! genes! Identificador!de!línea! espectinomicina!! de!interés+ 15! A4,!A5,!A10,!A11! 6+PHAA+,! C1,!C2,!C3,!C5,!C7,!C9,! 19! C10,!C12,!C15,!C16,! 12!PHAC+,! C17,!C18! AC2,!AC3,!AC7,!AC11,! 14! 7!PHAA+/PHAC+! AC12,!AC13,!AC15! + + BAC1,!BAC2,!BAC6,! 5!PHAA /+PHAB /+ 8! + BAC7,BAC8! PHAC ! Resultados! ! 3.8 Análisis! de! las! líneas! transplastómicas! de! C.+reinhardtii! por! Microscopía!Confocal!de!Barrido!Laser! Para! determinar! la! presencia! de! gránulos! de! PHB! en! las! líneas! transplastómicas! de! C.+ reinhardtii! transformadas! con! los! vectores! de! transformación! de! cloroplasto! p320A,! p320C,! p320AC! y! p320BAC! estas! fueron! observadas! por! Microscopía! Confocal! de! Barrido! Laser! (MCBL)!siguiendo!el!procedimiento!descrito!en!la!Sección!0.! Se!establecieron!cultivos!líquidos!de!C.+reinhardtii!bajo!fotoperiodo!16/8!h!de!oscuridad/luz! de!la!cepa!control!CCC125!mt+!137c!(wt)!y!líneas!transplastómicas!obtenidas!con!los!vectores! de! transformación! de! cloroplasto! p320A,! p320C,! p320AC! y! p320BAC! confirmadas! por! PCR! (Secciones!3.5,!3.6!y!3.7).!Después!de!5!días!se!tomó!una!alícuota!de!los!cultivos!y!se!incubó! durante!2!h!con!Rojo!de!Nilo!tal!como!se!describe!en!la!Sección!2.2.5.1.! En! la! Figura! 18! se! muestran! algunas! de! las! micrografías! de! fluorescencia! obtenidas! con! el! MCBL!de!cada!línea!analizada,!excitando!a!488!nm!y!detectando!la!emisión!de!la!fluorescencia! del! Rojo! de! Nilo! y! de! la! clorofila! en! los! intervalos! 550C605! y! 647C721! nm.! En! la! columna! izquierda!de!la!Figura!18!y!de!color!verde!se!observan!células!de!C.+reinhardtii,!localizadas!a! través!de!la!señal!emitida!por!la!autofluorescencia!de!la!clorofila!(Figura!18,!a,!b,!c,!d!y!e),!con! un!diámetro!entre!10!y!20!μm.!Después!de!obtener!la!señal!correspondiente!a!la!clorofila!se! procedió!a!excitar!el!Rojo!de!Nilo!y!detectar!la!señal!emitida.En!la!columna!central!de!la!Figura! 18! se! logra! identificar! en! color! rojo! la! señal! emitida! por! el! colorante! lipofílico! Rojo! de! Nilo! (Figura! 18,! a1,! b1,! c1,! d1! y! e1),! a! pesar! de! que! todas! las! muestras! emitieron! fluorescencia! como!resultado!de!la!interacción!con!el!Rojo!de!Nilo,!se!logró!diferenciar!un!patrón!distinto!en! la!fluorescencia!emitida!por!la!muestra!correspondiente!a!la!línea!transformada!con!p320BAC! la! cual! mostró! mayor! intensidad! en! la! señal! (Figura! 18,! e1),! pudiendo! observar! incluso! un! delineado!de!la!célula!lo!cual!podría!deberse!a!la!saturación!del!detector!de!emisión.! Al!realizar!el!superposición!de!las!señales!emitidas!por!la!autofluorescencia!de!la!clorofila!y!la! fluorescencia!del!Rojo!de!Nilo!se!observa!que!las!partículas!fluorescentes!con!Rojo!de!Nilo!se! transponen!con!los!cloroplastos!de!las!células,!identificados!por!medio!de!la!autofluorescencia! de! la! clorofila,! (Figura! 18,! a2,! b2,! c2,! d2! y! e2)! con! lo! cual! se! verifica! que! las! estructuras! corresponden!a!elementos!celulares!y!no!al!medio.! Las! micrografías! fueron! analizadas! utilizando! el! software! ImageJ,! tal! como! se! detalla! en! la! Sección!2.2.7.2,!recolectando!información!sobre!el!número!de!células!presentes!en!la!muestra! que!presentaban!fluorescencia,!el!promedio!de!partículas!fluorescentes!en!las!células!y!el!área! de!las!mismas,!estos!datos!se!resumen!en!la!Tabla!3.!Los!datos!fueron!examinados!por!análisis! de!varianza!de!una!vía!(ANOVA)!empleando!el!software!Mathematica!9.0!(Wolfram!Research! Inc.,! EUA)! para! determinar! si! existía! diferencia! estadísticamente! significativa! entre! las! diferentes! líneas! transformadas! con! respecto! a! la! línea! control! wt! mediante! contraste! de! Dunnett!(α=0.15).!! Al!realizar!el!ANOVA!del!porcentaje!de!células!teñidas!con!el!RN!de!las!líneas!transformadas,! se!determinó!que!sólo!las!líneas!p320AC!(78.3!%)!y!p320BAC!(86.1!%)!presentan!diferencia! 52! ! Resultados! ! significativa! respecto! al! 56.7! %! de! la! línea! control! wt! (Tabla! 3).! En! cuanto! al! número! de! partículas!fluorescentes!presentes!en!cada!célula,!a!excepción!de!la!línea!p320C!que!mostraba! un!porcentaje!menor!de!partículas!(3.72),!las!líneas!p320A!(4.76),!p320AC!(3.72)!y!p320BAC! (4.09)!no!se!diferenciaban!significativamente!del!control!wt!(4.81).!También!se!determinó!que! no! existe! diferencia! significativa! entre! el! área! promedio! (0.30! –! 0.36! μm2)! de! las! partículas! fluorescentes!presentes!en!las!líneas!transformadas!al!ser!comparadas!con!la!línea!control!wt.! Debido!a!lo!anterior!no!es!posible!asegurar!que!las!estructuras!fluorescentes!correspondan!a! gránulos!de!PHB,!y!por!lo!tanto!la!diferencia!!en!la!señal!detectada!pudiera!deberse!a!perfiles! distintos!de!acumulación!de!lípidos!probablemente!relacionados!con!la!modificación!genética.!! ! !Tabla! 3.! Análisis! estadístico! de! las! micrografías! de! células! de! C.+ reinhardtii! teñidas! con!Rojo!de!Nilo!obtenidas!por!Microscopía!Confocal!de!Barrido!Laser.!! wt! ! Células!en!la!muestra! con!Partículas! Fluorescentes! 56.7!a! teñidas!por!el!! Rojo!de!Nilo! (!%)! Número!promedio! de!Partículas! 4.81!b! Fluorescentes!por! célula! Área!promedio!de! !a las!!Partículas!(μm2)! 0.32 ! p320A! p320C! p320AC! p320BAC! 53.1!a! 57.4!a! 78.3!b! 86.1!b! 4.76!b! 2.52!a! 3.72!b! 4.09!b! 0.36!!a! 0.30!!a! 0.33!!a! 0.31!a! Análisis!de!Varianza!seguido!de!contraste!de!Dunnett.!Para!el!porcentaje!de!la!población!con! partículas!fluorescentes!(F4,221=4.34558,!P!≤ 0.0021,!α=0.15),!para!el!promedio!de!partículas! en!cada!célula!(F4,217=3.41753,!P!≤!0.0098,!α=0.05)!y!para!el!Área!promedio!de!las!partículas! en! cada! muestra! (F4,217=3.41753,! P! ≤! 0.0098,! α=0.05)! ! a! y! b! se! asignaron! según! existiera! diferencia!significativa!entre!las!diferentes!líneas!celulares!o!no.! 53! Resultados! ! ! Figura! 18.! Micrografías! de! células! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! por! Microscopía! Confocal! de! Barrido! Laser.! Una! alícuota! proveniente! de! un! cultivo! líquido! de! C.+ reinhardtii! de! 5! días! en! fotoperiodo! 16/8! h! luz/oscuridad! fue! incubada! con! el! colorante! lipofílico! Rojo! de! Nilo! (1.5! ! μg/mL)! durante! 2! h.! Las! muestras! fueron! observadas! a! 63X! y! excitadas! a! 488! nm,! detectando! la! señal! proveniente! de! la! autofluorescencia! de! la! clorofila! en! el! rango! 550C605! nm! (a,! b,! c,! d! y! e)! y! en! el! espectro! 647C721! nm! la! señal! emitida! por! la! fluorescencia! del! Rojo! de! Nilo! (a1,! b1,! c1,! d1! y! e1).! Para! comprobar! que! las! estructuras! que! emitían! fluorescencia! con! el! Rojo! de! Nilo! correspondían! a! las! células! se! realizó! la! superposición! de! las! imágenes! (a2,! b2,! c2,! d2! y! e2).! Columna! a:! Muestra! control! de! C.+ reinhardtii! con! plastoma! silvestre.! Columnas! b,! c,! d! y! e:! líneas! transplastómicas! obtenidas! con! p320A,! p320C,! p320AC!y!p320BAC!respectivamente.!! 54! ! Resultados! ! 3.9 Análisis! de! las! líneas! transplastómicas! de! C.+reinhardtii! por! Microscopía!Electrónica!de!Transmisión! Después!del!análisis!por!MCBL!de!las!líneas!transplastómicas!se!procedió!a!examinarlas!por! Microscopía!Electrónica!de!Transmisión!(TEM)!en!un!microscopio!JEOL!JEMC1010!(JEOL!Ltd.,! Japón)! con! aumentos! de! 10000X! a! 12000X.! Las! diferentes! muestras! fueron! fijadas,! contrastadas,! deshidratadas! y! embebidas! en! resina! EPON! 812! antes! de! ser! segmentadas! en! discos!de!~80!nm!de!espesor!y!postCcontrastadas!con!acetato!de!uranilo!y!citrato!de!plomo!tal! como!se!detalla!en!la!Sección!2.2.6.1.! Se!establecieron!cultivos!líquidos!de!C.+reinhardtii!bajo!fotoperiodo!16/8!h!de!oscuridad/luz! de!la!cepa!control!CCC125!mt+!137c!(wt)!y!líneas!transplastómicas!obtenidas!con!los!vectores! de! transformación! de! cloroplasto! p320A,! p320C,! p320AC! y! p320BAC! confirmadas! por! PCR! (Secciones!3.5,!3.6!y!3.7).!Después!de!5!días!de!crecimiento,!se!incubó!el!matraz!en!obscuridad! con! la! finalidad! de! que! las! células! consumieran! el! almidón,! posteriormente! se! tomó! una! alícuota! de! los! cultivos! la! cual! fue! procesada! tal! como! se! describe! en! la! Sección! 2.2.6.1! para! obtener!cortes!ultrafinos!(~80!nm)!los!cuales!fueron!teñidos!con!acetato!de!uranilo!acuoso!y! alcohólico!y!con!citrato!de!plomo!antes!de!ser!observados.! Se!obtuvieron!micrografías!electrónicas!de!secciones!transversales!de!células!de!C.+reinhardtii! wt! (Figura! 19),! las! cuales! fueron! utilizadas! como! control,! y! de! las! líneas! transformadas! con! p320A!(Figura!20),!p320C!(Figura!21),!p320AC!(Figura!22)!y!p320BAC!(!Figura!23).!En!dichas! micrografías! es! posible! identificar! distintos! componentes! celulares! como:! Cloroplasto! (C,+ Figura! 19),! Estigma! (E,+ Figura! 19),! Núcleo! (N,+ ! Figura! 23),! la! pared! celular! (Pc,+ Figura! 22! Figura!23),!granos!de!almidón!(A,+ Figura!19),!plastoglóbulos!(Pg,+ Figura!21Figura!22!Figura! 23)! y! en! algunos! casos! cuerpos! binarios! compuestos! de! material! electroClúcido! y! material! electroCdenso!(G,!Figura!22!y!!Figura!23).! En! el! caso! de! las! micrografías! obtenidas! de! la! línea! p320AC,! es! posible! observar! un! cuerpo! binario! (G,! Figura! 22a)! derivado! de! la! asociación! de! un! cuerpo! con! material! electroCdenso,! correspondiente! a! un! plastoglóbulo,! con! un! cuerpo! electroClúcido! que! probablemente! sea! PHB,! mientras! que! en! las! micrografías! correspondientes! a! la! línea! de! p320BAC! se! puede! observar! que! la! pared! celular! se! encuentra! distendida! (Pc,! ! Figura! 23a)! además! es! posible! apreciar! distintos! granos! electroClúcidos! recubiertos! por! pequeños! cuerpos! electroCdensos,! que!podría!representar!la!formación!del!cuerpo!binario!(G,!!Figura!23b).! La!presencia!de!cuerpos!binarios!y!la!modificación!de!la!pared!celular!han!sido!características! descritas! anteriormente! en! células! vegetales! que! acumulan! PHB! en! cloroplastos! (BohmertC Tatarev!2011;!Choi!2009;!Somleva!2008).!! A! pesar! de! que! las! células! fueron! incubadas! durante! 24! h! en! oscuridad,! para! disminuir! los! granos! de! almidón,! aún! es! posible! identificar! granos! electroClúcidos! en! todas! las! líneas! celulares.!Las!micrografías!fueron!analizadas!utilizando!el!software!ImageJ,!tal!como!se!detalla! en! la! Sección! 2.2.7.2,! recopilando! información! sobre! el! número! de! granos! electroClúcidos! presentes!en!las!diferentes!muestras,!estos!datos!se!presentan!en!la!Tabla!4.! 55! Resultados! ! Los! datos! recopilados! fueron! analizados! mediante! análisis! de! varianza! de! una! vía,! con! un! α=0.05.!Para!determinar!si!existe!diferencia!significativa!entre!el!número!promedio!de!granos! electroClúcidos!acumulados!por!célula!entre!las!diferentes!líneas!transformadas!respecto!a!la! línea!control!wt!se!utilizó!la!prueba!de!contraste!de!Dunnett.! Al!realizar!el!ANOVA!de!los!datos!recabados!(Tabla!4),!se!determinó!que!sólo!la!línea!p320BAC! presenta!en!promedio!un!número!significativamente!mayor!(19.83)!de!granos!electroClúcidos! acumulados! por! célula! a! diferencia! del! control! wt! (7.75),! mientras! que! las! líneas! transplastómicas! p320A! (8.58),! p320C! (8.68)! y! p320AC! (7.39)! no! presentan! diferencia! significativa!entre!sí!ni!en!comparación!a!wt!(7.75).! El! resultado! obtenido! del! análisis! estadístico! aunado! a! la! presencia! de! cuerpos! binarios! y! la! modificación!de!la!pared!celular,!sugiere!que!podría!estar!llevándose!a!cabo!la!acumulación!de! PHB!en!el!cloroplasto!de!las!líneas!transformadas!con!p320AC!y!p320BAC.!Sin!embargo!con! las!técnicas!desarrolladas!en!este!trabajo,!no!es!posible!asegurar!que!los!cuerpos!presentes!en! p320AC!y!p320BAC!correspondan!a!granos!de!PHB.! Tabla! 4.! Análisis! estadístico! de! las! micrografías! de! C.+ reinhardtii! obtenidas! por! Microscopía!Electrónica!de!Transmisión.! ! Granos!electroClúcidos! !por!célula! Número!Mínimo!de! Granos!ElectroClúcidos! presentes!en!una!célula! Número!Mínimo!de! Granos!ElectroClúcidos! presentes!en!una!célula! wt+ p320A! p320C! p320AC! p320BAC! 7.75!a! 8.58!a! 8.68!a! 7.39!a! 19.83!b! 2! 2! 4! 4! 5! 12! 18! 15! 19! 44! Análisis!de!Varianza!de!una!vía!seguido!de!contraste!de!Dunnett.!Para!el!promedio!de!granos! electroClúcidos!en!cada!célula!(F4,84=11.6302,!P!≤!0.0000001,!α=0.05)!a!y!b!se!asignaron!según! existiera!diferencia!significativa!entre!las!diferentes!líneas!celulares!o!no.! ! 56! ! Resultados! ! ! Figura! 19! Micrografía! electrónica! de! células! de! C.+ reinhardtii! con! plastoma! silvestre! obtenidas!a!12,000X!(a)!y!10,000X!(b)!aumentos.!Se!observa!la!localización!de!granos! de! almidón! (A)! de! entre! 0.1C0.5! μm! de! diámetro! dentro! del! cloroplasto! (C).! E:! Estigma,!N:!Núcleo,!A:!Grano!de!Almidón,!C:!Cloroplasto.! ! Figura!20!Micrografía!electrónica!de!células!de!C.+reinhardtii!obtenidas!con!el!vector! de! transformación! de! cloroplasto! p320A! observadas! a! 12,000X! aumentos.! Se! observan! células! de! C.+ reinhardtii! de! entre! 8C10! μm! de! diámetro,! en! las! cuales! se! ubican!granos!de!almidón!(A)!de!entre!0.1C0.5!μm!de!diámetro!dentro!del!cloroplasto! (C)! alrededor! del! pirenoide! (P).! E:! Estigma,! P:! Pirenoide,! A:! Grano! de! Almidón,! C:! Cloroplasto.! ! 57! Resultados! ! ! Figura!21!Micrografía!electrónica!de!células!de!C.+reinhardtii!obtenidas!con!el!vector! de!transformación!de!cloroplasto!p320C!a!12,000X.!Se!observan!dentro!de!las!células! de! C.+ reinhardtii! granos! de! almidón! rodeando! el! pirenoide! (P)! (a)! o! recubriéndolo! (b),! además! se! pueden! identificar! cuerpos! electroCdensos! correspondientes! a! los! plastoglóbulos! (Pg)! localizados! dentro! del! cloroplasto! (C).! E:! Estigma,! P:! Pirenoide,! A:!Grano!de!Almidón,!C:!Cloroplasto,!Pg:!Plastoglóbulo.! ! Figura!22!Micrografía!electrónica!de!células!de!C.+reinhardtii!obtenidas!con!el!vector! de!transformación!de!cloroplasto!p320AC!a!10,000X.!Se!logra!apreciar!plastoglóbulos! (Pg)! de! diferentes! tamaños! (0.2C0.8! μm)! además! de! granos! de! almidón! (A)! distribuidos! en! el! cloroplasto! (C).! Por! otra! parte! en! a)! se! puede! observar! un! cuerpo! binario! (G)! de! material! electroCdenso! y! material! electroClúcido.! E:! Estigma,! A:! Grano! de! Almidón,! C:! Cloroplasto,! Pg:! Plastoglóbulo,! G:! Grano! Binario,! Pc:! Pared! Celular. 58! ! Resultados! ! ! ! !Figura!23!Micrografía!electrónica!de!células!de!C.+reinhardtii!obtenidas!con!el!vector! de!transformación!de!cloroplasto!p320BAC!a!12,000X.!Células!de!C.+reinhardtii!en!las! cuales!se!identifican!plastoglóbulos!(Pg)!localizados!en!el!estroma!además!de!granos! de! almidón! (A)! rodeando! el! pirenoide! (P)! y! una! acumulación! inusual! de! partículas! electroClúcidas! dentro! del! cloroplasto! (C)! algunas! de! las! cuales! presentan! partículas! electroCdensas!en!su!superficie!(b,!G).!También!es!notable!la!modificación!sufrida!por! la! pared! celular! (Pc)! la! cual! se! ve! atrofiada! en! comparación! a! las! demás! líneas.! A:! Grano! de! Almidón,! P:! Pirenoide,! C:! Cloroplasto,! Pg:! Plastoglóbulo,! G:! Grano! Binario,! V:!Vacuola,!N:!Núcleo,!Pc:!Pared!Celular.! !! 59! Discusión! ! 4 Discusión+ 4.1 Discusión!de!resultados! ! En! años! recientes! el! interés! por! utilizar! las! microalgas! para! la! obtención! de! productos! biotecnológicos!de!interés!industrial!se!ha!incrementado!considerablemente.!En!particular!el! interés! por! las! microalgas! es! debido! a! que! tienen! características! que! las! hacen! atractivas! desde! un! punto! de! vista! biotecnológico;! tienen! altas! velocidades! de! crecimiento,! crecen! en! medios!de!cultivo!simples,!en!la!mayoria!de!los!casos!de!forma!heterotrófica!utilizando!el!CO2! atmosférico,! y! son! capaces! de! producir! compuestos! que! van! desde! carotenoides! (Guedes! 2011),!lípidos!(Work!2010)!y!biomasa!(Milledge!2010),!hasta!biocombustibles!como!alcoholes! (Georgianna! y! Mayfield! 2012)! o! hidrogeno! (Melis! 2000)! y! proteínas! recombinantes! de! uso! terapeutico!(Specht!2010).! El! polihidroxibutirato! (PHB)! es! el! más! sencillo! y! estudiado! de! los! polihidroxialcanoatos,! familia! de! biopolímeros! con! carácterísticas! similares! a! las! de! los! plásticos! tradicionales! derivados!del!petroleo,!que!debido!a!su!biodegradabilidad!son!atractivos!como!material!para! sustituir!en!algunas!aplicaciones!a!los!plásticos!utilizados!actualmente!(Suriyamongkol!2007).! La! ruta! de! sintesis! ha! sido! exhaustivamente! caracterizada! (Steinbüchel! y! LütkeCEversloh! 2003)!en!una!gran!cantidad!de!bacterias!entre!las!que!se!encuentra!Bacillus,!Pseudomonas!y! Alcaligenes! (Chen! 2010;! Khanna! y! Srivastava! 2005;! Reddy! 2003;! Suriyamongkol! 2007).! Recientemente!se!describió!la!producción!de!PHB!de!manera!natural!en!arroz!(Oryza+sativa),! trigo! (Triticum+ aestivum)! y! rábano! (Raphanus+ sativus)+ (Tsuda! 2012),! fenómeno! que! se! presenta! cuando! las! raíces! de! las! plantas! son! sumergidas! en! acetato,! sin! embargo,! se! desconoce!tanto!el!mecanismo!exacto!de!producción!de!PHB!como!la!función!que!este!pudiera! tener! en! microorganismos! fotosintéticos.! También! recientemente,! ! en! una! cepa! de! C.+ reinhardtii+ se! describió! la! producción! de! 3CHidroxibutirato,! el! monómero! que! compone! al! PHB,! después! de! que! se! silenció! el! gen! de! la! piruvatoCformato! liasa! (PFL1)! y! cultivando! las! células!bajo!condiciones!anóxicas!(Burgess!2012).! En! el! presente! trabajo! realizamos! ingenieria! metabólica! y! reportamos! por! primera! vez! la! introducción!completa!de!la!ruta!biosintética!involucrada!en!la!sintésis!de!polihidroxibutirato! (PHB)! en! el! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii.! El! análisis! por! MCBL! y! MEB! de! las! líneas! trasformadas! sugiere! fuertemente! que! granulos! de! PHB! se! están! acumulando! al! interior! del! cloroplasto.! La! ruta! introducida! consta! de! tres! ! genes! que! codifican! para! las! enzimas! que! realizan!la!sintésis!de!PHB:!una!βCcetotiolasa!(codificada!en!el!gen!phaA)!que!lleva!a!cabo!la! condensación! de! dos! moléculas! de! AcetilCCoA! hacia! AcetoacetilCCoA,! una! AcetoacetilCCoA! reductasa! (gen! phaB),! la! cual! lleva! a! cabo! la! conversión! hacia! 3CHidroxibutirilCCoA! y! finalmente!una!PHB!sintasa!(gen!phaC)!que!lleva!a!cabo!la!reacción!de!polimerización!!de!los! 3CHidroxibutirilCCoA! para! formar! PHB! (Suriyamongkol! 2007).! ! La! modificación! genética! de! bacterias!ha!sido!explorada!en!repeditas!ocasiones!(Khanna!y!Srivastava!2005;!Li!2007;!Park! 2005).! Respecto! a! organismos! fotosintéticos,! se! ha! explorado! la! capacidad! de! Nicotiana+ 60! ! Discusión! ! tabacum+ (BohmertCTatarev! 2011),! Arabidopsis! thaliana! (Choi! 2009),! Phaeodactylum! tricornutum! (Hempel! 2011)! y! Chlamydomonas! reinhardtii! (Wang! 2010)! entre! otros! para! producir!PHB!de!manera!fotosintética!(Somleva!2013).! Como! ya! se! describió! se! generaron! líneas! transplastómicas! de! C.+ reinhardtii,+ con! cuatro! vectores!de!transformación!distintos!con!el!fin!de!evaluar!la!producción!de!PHB.!Los!vectores! utilizados! fueron! p320A,! p320C,! p320AC! y! p320BAC! los! cuales! contenían! los! genes! phaA,! phaC,!phaA+phaC!y!phaB+phaA+phaC!respetivamente.!Los!vectores!p320A!y!p320C,!contenían! los! genes! phaA! y! phaC! respectivamente,! ambos! bajo! el! control! del! promotor! PpsbA! y! el! terminador!TrbcL.!En!p320AC,!como!en!p320A,!el!gen!phaA!se!encontraba!bajo!el!control!del! promotor!fotosintético!PpsbA+y!el!terminador!TrbcL,!mientras!que!el!gen!phaC!fue!acoplado!al! promotor! PatpA! y! al! terminador! TpsbA.! El! vector! p320BAC! contenía! los! genes! phaA,! phaB! y! phaC,! el! gen! phaA! se! encuentra! bajo! el! control! del! promotor! fotosintético! PpsbA+ y! el! terminador!TrbcL,!el!gen!phaC!con!el!promotor!PatpA+y!terminador!TpsbA!mientras!que!el!gen! phaB!se!encuentra!acoplado!al!promotor!PpsbD!y!al!terminador!TrbcL.! El!promotor!PpsbA!dirige!la!transcripción!y!traducción!del!gen!psbA+y!hasta!la!fecha!es!el!más! empleado!para!la!expresión!de!proteínas!recombinantes!en!el!cloroplasto!de!C.+reinhardtii.+Las! proteínas! producidas! van! desde! marcadores! de! selección! (Bateman! y! Purton! 2000)! y! proteínas! reporteras! (Franklin! 2002;! Mayfield! y! Schultz! 2003)! hasta! proteínas! terapéuticas! (Rasala! 2011;! Rasala! 2010;! Surzycki! 2009;! Wang! 2008).! Diversos! estudios! han! demostrado! que!el!promotor!es!más!relevante!que!el!terminador!en!cuestión!de!niveles!de!expresión,!ya! que!en!principio!cualquier!terminador!proporciona!al!transcrito!la!estabilidad!necesaria!para! ser! traducido! de! forma! adecuada! mientras! que! la! eficiencia! entre! promotores! presenta! grandes!variaciones!(Barnes!2005).! Con!los!vectores!de!transformación!de!cloroplasto!p320A!y!p320C!se!obtuvieron!6!y!12!líneas! transplastómicas!respectivamente!(Tabla!2)!la!diferencia!en!el!número!de!líneas!recuperadas! puede! deberse! a! un! posible! efecto! dañino! del! gen! phaA! al! interior! del! cloroplasto.! Se! ha! observado! en! plantas! que! la! expresión! nuclear! constitutiva! de! la! Ccetotiolasa,! pero! localizada!hacia!el!cloroplasto,!es!dañina!para!la!planta!desde!etapas!tan!tempranas!como!la! selección! de! transformantes! lo! cual! actúa! en! perjuicio! para! la! producción! eficiente! de! PHB!! transgénico! (Bohmert! 2002).! Entre! las! estrategias! empleadas! para! sortear! el! problema! se! estudió! la! expresión! de! phaA! en! Arabidopsis,+ tabaco! (Nicotiana+ tabacum)! y! papa! (Solanum+ tuberosum)! bajo! el! control! de! promotores! inducibles! o! por! activación! somática,! lo! cual! permitió!aumentar!la!tasa!de!recuperación!de!líneas!productoras!en!todos!los!casos!(Bohmert! 2002;!Lössl!2005).!Estudios!recientes!sugieren!que!una!selección!cuidadosa!de!condiciones!de! cultivo! y! elementos! de! control! de! la! expresión! de! phaA! podrían! ayudar! a! obtener! plantas! sanas!con!niveles!elevados!de!acumulación!de!PHB!(BohmertCTatarev!2011;!Choi!2009).! Las!líneas!resistentes!a!espectinomicina!recuperadas!(Tabla!2)!fueron!analizadas!por!PCR!y!se! confirmó! la! presencia! de! los! genes! pha! en! el! genoma! del! cloroplasto! sin! embargo,! no! se! determinó! que! las! líneas! transplastómicas! fueran! homoplásmicas,! es! decir! que! todas! las! copias!del!genoma!en!el!cloroplasto!contenían!la!inserción!de!los!transgenes.!Aunque!en!este! trabajo!no!se!realizó!el!análisis!de!homoplasmía,!estudios!realizados!con!qPCR!han!reportado! 61! Discusión! ! que!se!necesitan!alrededor!de!7C10!pases,!lo!cual!se!realizó!en!este!trabajo,!en!medio!selectivo! para!lograr!homoplasmía!en!C.+reinhardtii+(Johnson!2013).!Posteriormente!para!determinar!la! expresión!de!los!transgenes!se!podrían!examinar!las!líneas!mediante!qRTCPCR!(Ausubel!2003)! buscando!amplificar!cDNA!correspondiente!a!los!mensajeros!producidos!de!los!genes!phaA!o! phaC!a!partir!del!RNA!total,!utilizando!alguna!transcriptasa!reversa.!En!caso!de!demostrarse!la! expresión!del!gen,!el!siguiente!paso!sería!llevar!a!cabo!un!Western+Blot!(Sambrook!y!Russell! 2001)!con!los!anticuerpos!adecuados!para!detectar!cada!enzima.! Con!el!fin!de!identificar!la!presencia!de!granulos!de!PHB!se!realizó!una!tinción!con!el!colorante! lipofílico! Rojo! de! Nilo! (Tabla! 3)! seguida! de! observacción! por! MCBL.! Se! realizaron! también! observaciones!al!MET!para!identificar!gránulos!electroClúcidos!(Tabla!4).!!Ambos!análisis!han! sido! utilizados! regularmente! en! estudios! de! transformación! genética! para! la! producción! de! PHB!(Bohmert!2002;!Hempel!2011;!Somleva!2008).!Al!observar!al!MCBL!se!esperaba!detectar! fluoresencia! al! excitar! las! muestras! a! 488! nm.! La! tinción! con! Rojo! de! Nilo! de! las! cepas! obtenidas!con!el!vetor!p320A!no!presentó!una!diferencia!significativa!respecto!al!control!de!la! cepa!silvestre!de!C.+reinhardtii!(wt).!Lo!mismo!se!determinó!para!las!muestras!analizadas!de!la! línea! modificada! con! p320C,! la! cual! solo! presentó! diferencia! significativa! en! el! número! promedio! de! partículas! fluorescentes! por! célula,! el! cual! es! menor! al! ser! comparado! con! las! demás!líneas!transformadas!y!con!el!control!wt.!!Al!analizar!por!MET,!en!el!número!de!granos! electroClúcidos!la!muestra!p320C!no!mostró!diferencia!significativa!respecto!al!control!wt.! Tsuda! reportó! en! 2012! la! producción! de! PHB! de! manera! natural! en! arroz,! trigo! y! rábano.! A! pesar! de! que,! de! los! tres! genes! involucrados! en! la! síntesis! de! PHB! solamente! phaA! se! encuentra! presente! en! el! genoma! nuclear! de! las! tres! plantas.! Realizando! un! análisis! bioinformático! es! posible! encontrar! que! existe! codificada! en! el! genoma! nuclear! de! C.+ reinhardtii!una!proteína!localizada!en!el!cloroplasto!que!podría!llegar!a!desempeñar!la!función! de! la! acetoacetilCreductasa! (phaB),!de!esta!manera!la!ruta!de!biosintética!de!PHB!podría!ser! completada!con!la!sola!introducción!en!el!cloroplasto!de!phaC,!si!aunado!a!lo!anterior!tenemos! en! cuenta! el! reporte! sobre! la! producción! de! 3CHidroxibutirato! (3CHB),! monómero! que! conforma! al! PHB,! en! C.+reinhardtii! (Burgess! 2012)! es! probable! que! la! introducción! de! phaC! logre!utilizar!el!3CHB!para!producir!PHB.! Después! de! introducir! de! forma! separada! los! genes! phaA! y! phaC! se! buscó! transformar! el! cloroplasto!de!Chlamydomonas!con!ambos!genes!en!un!solo!paso,!para!lo!cual!se!construyó!el! vector!de!transformación!de!cloroplasto!p320AC!tal!como!se!describe!en!la!Sección!3.2.!Si!bien! al!introducir!solamente!phaA!y!phaC!la!ruta!biosintética!bacteriana!de!PHB!queda!incompleta! debido! a! la! ausencia! de! la! acetoacetilCCoA! reductasa! (gen! phaB),! BohmertCTatarev! (2011)! reportó! la! producción! de! PHB! introduciendo! solamente! phaA! y! phaC! en! el! cloroplasto! de! tabaco,! sin! realizar! la! introducción! de! la! acetoacetilCCoA! reductasa! (phaB),! lo! cual! sugiere! la! intervención! de! una! enzima! endógena! con! capacidad! de! realizar! la! misma! función! que! la! acetoacetilCCoA! reductasa.! De! los! bombardeos! con! p320AC! se! lograron! recuperar! 7! líneas! identificadas!por!PCR!como!positivas!para!la!presencia!de!phaA!y!phaC!(Tabla!2).!! Las!muestras!provenientes!de!líneas!transformadas!con!p320AC!al!ser!analizadas!por!MCBL! mostraron!un!incremento!significativo!(P!≤!0.0021,!α=0.15)!en!el!porcentaje!de!células!en!la! 62! ! Discusión! ! muestra!que!interactuaban!con!el!Rojo!de!Nilo!(78.3!%)!al!compararlo!con!la!línea!control!wt! (56.7! %)! y! las! líneas! transformadas! p320A! (53.1! %)! y! p320C! (57.4! %);! sin! embargo,! fue! menor! que! el! presentado! por! p320BAC! (86.1! %)(Tabla! 3,! ver! más! abajo).! Si! aunado! a! lo! anterior!se!toma!en!cuenta,!que!como!resultado!del!análisis!por!MET,!se!observó!la!presencia! de! un! cuerpo! binario! (G,! Figura! 22a)! de! material! electroClúcido! con! material! electroCdenso,! correspondiente! a! un! plastoglóbulo,! se! puede! decir! que! este! efecto! se! debe! a! la! transformación! genética! en! la! línea! celular.! Este! hecho! sugiere! la! acumulación! de! PHB! en! el! cloroplasto! y! quizá! en! menor! medida! un! cambio! en! el! perfil! de! acumulación! de! lípidos! derivado! de! la! desviación! de! la! ruta! de! ácidos! grasos! ocasionado! por! la! βCcetotiolasa! introducida!en!el!plastoma.! A! pesar! de! que! no! se! conoce! con! certeza! cuál! enzima! es! la! responsable! de! llevar! a! cabo! la! función!de!la!enzima!acetoacetilCCoA!reductasa!(phaB),!una!candidata!podría!ser!la!3CcetoacilC (proteína!transportadora!de!acilo)!reductasa!(EC!1.1.1.100)!la!cual!se!encuentra!involucrada! en!la!síntesis!de!ácidos!grasos!y!cuya!proteína!homóloga!en!E.+coli!permite!la!acumulación!de! PHAs!(Nomura!2008;!Park!2005).!Al!realizar!el!alineamiento!de!aminoácidos!con!blastp!entre! la! acetoacetilCCoA! reductasa! y! la! 3CcetoacilC(proteína! transportadora! de! acilo)! reductasa! (BKR),!codificada!en!el!genoma!nuclear!de!C.+reinhardtii,!se!encuentra!que!presentan!un!56!%! de!similitud!a!nivel!de!secuencia.!Por!otra!parte!al!analizar!la!secuencia!peptídica!de!BKR!con! PredAlgo! (Tardif! 2012)! herramienta! bioinformática! que! permite! realizar! la! predicción! subcelular!de!proteínas!en!C.+reinhardtii,!se!determinó!que!la!enzima!tiene!un!péptido!señal!de!! aproximadamente! 94! aminoácidos! que! la! dirige! hacia! el! cloroplasto,! con! lo! cual! se! podría! explicar! la! acumulación! de! PHB! reportado! en! diversos! estudios! (BohmertCTatarev! 2011;! Tsuda!2012).! Utilizando!el!vector!p320BAC!se!lograron!recuperar!5!líneas!transplastómicas!que!contenían! los! genes! phaA,! phaB! y! phaC,! según! la! confirmación! por! PCR! (Figura! 17).! Una! de! las! líneas! generadas! al! ser! examinada! por! MCBL! y! MET! mostró! un! incremento! significativo! en! el! porcentaje!de!células!que!reaccionaban!con!el!Rojo!de!Nilo!el!cual!llega!a!86.1!%!(Tabla!3)!y!en! la! cantidad! de! granos! electroClúcidos! presentes! en! el! cloroplasto! (19.83! granos/cél)! al! ser! comparada! con! los! 7.75! granos! de! la! línea! control! wt+ (Tabla! 4).! Además,! al! analizar! las! micrografías! electrónicas! producidas! por! MET! resaltan! los! cuerpos! electroClúcidos! recubiertos! por! material! electroCdenso! (G,! ! Figura! 23b),! fenómeno! que! no! se! hace! presente! con!los!granos!de!almidón,!y!la!distención!de!la!pared!celular!(Pc,!!Figura!23b)!la!cual!no!se! hace!presente!en!las!micrografías!obtenidas!con!las!otras!líneas!célulares!(wt,!p320A,!p320C!y! p320AC).! Mediante!la!microscopía!electrónica!de!transmisión!(MET)!ha!sido!posible!identificar!granos! de! PHB! en! distintos! organismos! fotosintéticos! (BohmertCTatarev! 2011;! Choi! 2009;! Hempel! 2011;! Saruul! 2002;! Somleva! 2008;! Wang! 2010),! en! todos! los! casos! mencionados! las! células! son!incubadas!entre!24!y!48!h!para!reducir!la!cantidad!de!granos!de!almidón!en!el!cloroplasto.! En! los! casos! donde! los! granos! de! almidón! permanecen! dentro! del! cloroplasto,! a! pesar! de! la! incubación!en!oscuridad,!se!discrimina!entre!granos!de!PHB!y!de!almidón!siguiendo!el!criterio! de! la! forma! de! los! granos,! mientras! que! usualmente! los! granos! de! almidón! tienen! forma! 63! Discusión! ! irregular,!los!de!PHB!se!aglomeran!en!formas!circulares!a!excepción!de!C.+reinhardtii!donde!la! formación!de!granos!de!PHB!en!el!citosol!se!dio!con!forma!irregular!(Wang!2010).! Otro! criterio! a! evaluar! por! MET! en! organismos! fotosintéticos! productores! de! PHB! es! la! presencia! de! cuerpos! binarios! PHBCPlastoglóbulo! dentro! del! cloroplasto,! estos! cuerpos! han! sido!observados!solamente!cuando!la!acumulación!de!PHB!se!lleva!a!cabo!en!el!cloroplasto!y! se!ha!reportado!en!diversos!estudios!(Lössl!2005;!Somleva!2008).!Además!de!la!presencia!de! cuerpos! binarios,! en! A.+ thaliana! se! observó! la! distención! de! la! pared! celular! en! líneas! productoras!de!PHB!(Choi!2009).!A!pesar!de!que!se!desconoce!la!causa!de!estos!fenómenos,!es! probable! que! esté! relacionada! con! la! alteración! en! los! niveles! de! expresión! de! los! genes! involucrados!en!la!síntesis!tanto!de!plastoglóbulos!como!de!componentes!de!la!pared!celular! (Choi! 2009).! Ambas! características! fueron! observadas! tanto! en! la! línea! transformada! con! p320AC!(G,!Figura!22a)!como!en!las!líneas!transformadas!con!p320BAC!(G!y!Pc,!Figura!23b)! Los!resultados!obtenidos!por!MCBL!y!MET!sugieren!fuertemente!que!la!modificación!genética! resultó! en! acumulación! de! PHB;! sin! embargo,! es! necesario! examinar! las! diferentes! líneas! celulares! con! un! método! analítico! como! HPLC! (John! y! Keller! 1996)! o! CGCMS! (Hempel! 2011;! Wang!2010)!con!el!fin!de!determinar!si!hay!presencia!de!PHB!y!cuantificarlo.!! Si!la!línea!p320AC!llegara!a!producir!PHB,!lo!esperado!es!que!los!niveles!de!acumulación!sean! menores! que! en! la! línea! p320BAC,! lo! cual! estaría! en! concordancia! con! lo! reportado! por! BohmertCTatarev!(2011)!para!la!planta!de!tabaco,!donde!la!línea!transformada!con!los!genes! phaA! y! phaC! producía! PHB! en! cantidades! mucho! menores! (0.03! %! p.s.)! comparada! con! las! líneas!que!contenían!phaA,!phaB!y!phaC!(18.8!%!p.s.).!Esta!situación!se!debió!probablemente!a! que!la!enzima!endógena!que!suplía!la!función!de!la!acetoacetilCCoA!reductasa!(phaB)!lograba! hacerlo!pero!a!un!nivel!bajo!representando!un!cuello!de!botella!para!el!proceso!de!formación! del!PHB.! Hempel! (2011)! reportó! la! acumulación! de! PHB! en! el! citosol! de! la! diatomea! Phaeodactylum+ tricornutum!hasta!en!un!10!%!de!peso!seco,!en!su!estudio!se!utilizó!el!promotor!inducible!de!la! nitrato!reductasa,!el!cual!era!inducido!en!la!fase!estacionaria!del!cultivo!de!P.+tricornutum!para! expresar! phaA,! phaB! y! phaC! provenientes! de! Ralstonia+ eutropha! lo! cual! podría! explicar,! en! parte,!la!diferencia!en!los!niveles!de!acumulación!de!PHB!respecto!a!otro!estudio!publicado!en! el!2010!por!Wang!(2010).!Wang!(2010)!estudió!la!producción!de!PHB!en!el!citoplasma!de!!C.+ reinhardtii!por!transformación!nuclear,!introduciendo!los!genes!phaB!y!phaC!provenientes!de! R.+eutropha,! bajo! el! control! de! los! promotores! endógenos! de! expresión! constitutiva! RBCS2! y! Hsp70CRBCS2!logrando!acumular!solamente!6!ppm.!! El!bajo!nivel!de!expresión!en!C.+reinhardtii!comparado!con!P.+tricornutum!podría!responder!a! la! expresión! no! coordinada! de! las! tres! enzimas,! ya! que! a! pesar! de! que! la!phaA! se! encuentra! codificada!de!manera!endógena!en!el!núcleo!de!C.+reinhardtii,!su!nivel!de!expresión!podría!no! ser!el!requerido!para!una!acumulación!elevada!de!PHB,!por!otro!lado!se!sabe!que!los!niveles! citosólicos! de! AcetilCCoA,! el! sustrato! para! la! Ccetotiolasa,! son! muy! inferiores! a! los! encontrados! en! el! cloroplasto! organelo! donde! se! han! alcanzado! los! niveles! de! acumulación! más!altos!de!PHB!en!plantas!(Arai!2001;!Bohmert!2000).! 64! ! Discusión! ! Hasta! nuestro! conocimiento! este! estudio! es! el! primer! reporte! de! modificación! genética! de! cloroplasto!de!C.+reinhardtii!con!una!ruta!metabólica!completa,!la!cual!ha!sido!considerada!la! más! compleja! insertada! en! los! cloroplastos! de! plantas! (Wang! 2009),! ya! que! reportes! anteriores! habían! conseguido! la! introducción! del! gene! apc,! el! cual! codifica! para! las! subunidades! alfa! y! beta! de! la! aloficocianina,! una! de! las! proteínas! fotosintéticas! antena! de! cianobacterias! y! algas! rojas,! en! forma! de! bicistrón! (Su! 2005)! o! la! introducción! de! tres! marcadores!de!selección:!GFP,!aadA+y!aphAC6!(NoorCMohammadi!2012).!La!falta!de!reportes! que! busquen! la! introducción! de! rutas! metabolicas! o! de! un! gran! número! de! genes,! pudiera! deberse! a! que! practicamente! la! totalidad! de! los! reportes! de! transformación! genética! de! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii! emplea! para! la! construcción! de! los! vectores! de! transformación! técnicas!de!biología!molecular!clásicas!como!son!la!digestión!con!enzimas!de!restricción!y!la! ligación! de! fragmentos! mediante! Ligasas! de! ADN,! técnicas! que! pueden! llegar! a! consumir! mucho! tiempo! de! planeación! y! experimentación! además! de! que! restringen! la! secuencia! utilizada!en!promotores,!regiones!codificantes!y!terminadores,!etc.! Conforme!las!técnicas!de! construcción! de! vectores! no! convencionales! como! la! construcción! de! plastomas! sintéticos! (NoorCMohammadi!2012;!O’Neill!2012)!o!ensambles!independientes!de!la!secuenciaCligación! SLIC! (Jeong! 2012)! cobren! más! popularidad,! la! generación! de! vectores! de! transformación! de! cloroplasto!que!inserten!rutas!más!complejas!será!más!fácil.! Una! vez! determinada! la! presencia! de! PHB! por! HPLC! se! requerirá! de! una! caracterización! molecular!más!exahustiva!de!las!diferentes!líneas!obtenidas,!así!como!de!la!evaluación!de!los! parámetros!de!crecimiento!que!permitan!modular!la!expresión!de!las!enzimas!aprovechando! las! capacidades! inducibles! de! los! promotores! fotosintéticos! acoplados! a! phaA! y! phaC! para! determinar! la! factibilidad! de! obtener! plásticos! biodegradables! a! partir! del! CO2! y! la! energía! solar!mediante!las!microalgas.!En!caso!de!necesitar!aumentar!los!niveles!de!expresión!de!las! enzimas! involucradas! se! tienen! a! la! mano! diversas! herramientas! desde! el! análisis! de! flujos! metabólicos!que!pudiera!permitir!redirigir!el!acetilCCoA!de!la!síntesis!de!ácidos!grasos!hacia! PHB!(Chang!2011;!Park!2005)!y!la!ingeniería!de!procesos!(Bumbak!2011)!hasta!la!utilización! de!elementos!de!control!transcripcional/traduccional!sintéticos!e!híbridos!(Oey!2009;!Specht! y!Mayfield!2013).! ! 65! ! Conclusiones! ! 5 Conclusiones+ Se!diseñaron!y!construyeron!vectores!para!realizar!la!modificación!genética!del!cloroplasto!de! C.+reinhardtii! que! contienen! los! genes! phaA! (p320A),! phaC! (p320C),! phaA/phaC! (p320AC)! y! phaA/phaB/phaC!(p320BAC).! Se!demostró!la!funcionalidad!de!los!vectores!construidos,!con!los!cuales!se!obtuvieron!6!líneas! transformadas!con!p320A,!12!con!p320C,!7!con!p320AC!y!5!con!p320BAC,!las!cuales!contenian! los!genes!de!interés.! Las! líneas! transgénicas! obtenidas! fueron! examinadas! por! Microscopía! Confocal! de! Barrido! Laser! y! Microscopía! Electrónica! de! Transmisión! determinando! que! existe! diferencia! significativa! (P! ≤! 0.0021,! α=0.15)! en! el! fenotipo! de! las! muestras! de! la! línea! p320BAC! y! las! muestras!de!la!cepa!silvestre;!diferencia!que!pudiera!ser!atribuida!a!la!acumulación!ce!PHB.! Se! determinó! la! presencia! de! cuerpos! binarios,! compuestos! de! Plastoglóbulos! y! material! electroClúcido,!observados!por!Microscopía!Electrónica!de!Transmisión!en!las!líneas!p320AC!! y!p320BAC,!lo!cual!sugiere!fuertemente!la!acumulación!de!gránulos!plastoglóbuloCPHB.! 6 Perspectivas+ Determinar! el! estado! del! genoma! de! cloroplasto! en! las! líneas! transgénicas! para! verificar! el! grado!de!homoplasmía!alcanzado!por!cada!una!de!las!muestras!obtenidas.! Realizar! el! análisis! químico! cuantitativo! (HPLC! o! GCCMS)! de! las! líneas! transformadas! para! determinar!la!naturaleza!química!de!la!composición!de!las!muestras.! En!caso!de!comprobar!la!acumulación!de!PHB!en!las!líneas!transgénicas,!realizar!ensayos!de! producción!del!biopolímero!bajo!diferentes!condiciones!de!crecimiento.! Emplear!análisis!de!flujos!metabólicos!con!la!finalidad!de!redirigir!el!flujo!de!los!componentes! celulares!hacia!la!síntesis!de!PHB.! Introducir! genes! adicionales! involucrados! en! la! síntesis! de! polihidroxialcanoatos! con! la! finalidad!de!obtener!PHAs!con!propiedades!distintas!a!las!de!PHB.! ! ! 66! ! Bibliografía! ! 7 Bibliografía+ Apel!W,!Bock!R!(2009)!Enhancement!of!carotenoid!biosynthesis!in!transplastomic!tomatoes! by!induced!lycopeneCtoCprovitamin!A!conversion.!Plant!Physiol!151:59–66.!doi:! 10.1104/pp.109.140533! Arai!Y,!Nakashita!H,!Doi!Y,!Yamaguchi!I!(2001)!Plastid!targeting!of!polyhydroxybutyrate! biosynthetic!pathway!in!tobacco.!Plant!Biotechnology!! Ausubel!FM,!Brent!R,!Kingston!RE,!Moore!DD,!Seidman!JG,!Smith!JA,!Struhl!K,!Wiley!CJ,!Allison! RD,!Bittner!M,!Blackshaw!S!(2003)!Current!Protocols!in!Molecular!Biology.!! Barnes!D,!Franklin!SE,!Schultz!J,!Henry!RE,!Brown!E,!Coragliotti!AT,!Mayfield!SP!(2005)! Contribution!of!5’C!and!3'Cuntranslated!regions!of!plastid!mRNAs!to!the!expression!of! Chlamydomonas!reinhardtii!chloroplast!genes.!Mol!Genet!Genomics!274:625–36.!doi:! 10.1007/s00438C005C0055Cy! 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Anexos! ! 8 Anexos+ ! 8.1 Genes!phaA,!phaB!y!phaC! Secuencia!de!los!genes!phaA,!phaB!y!phaC!optimizada!para!el!uso!de!codones!preferentes!en! cloroplasto!de!C.+reinhardtii.! !>phaA! ATGAAGGACGTAGTTATTGTAGCAGCAAAACGCACGGCAATCGGCAGCTTTTTGGGTAGCTTAGCT TCATTATCTGCTCCACAATTAGGTCAGACAGCTATACGTGCAGTTTTAGACTCAGCAAACGTAAAA CCAGAACAAGTAGACCAAGTTATCATGGGTAATGTATTAACTACAGGTGTAGGTCAAAACCCAGCT CGTCAAGCTGCTATTGCTGCTGGTATTCCTGTACAAGTTCCAGCTTCAACTTTAAATGTTGTATGT GGTTCAGGTTTACGTGCTGTTCATTTAGCAGCACAAGCTATTCAGTGCGATGAAGCAGACATCGTA GTAGCTGGTGGTCAAGAATCTATGAGTCAAAGTGCTCACTATATGCAACTTCGTAATGGACAAAAA ATGGGCAATGCACAATTAGTTGATTCAATGGTAGCTGATGGTTTAACTGATGCTTATAACCAATAC CAAATGGGTATTACAGCTGAAAATATTGTTGAAAAATTAGGCTTAAACCGTGAAGAACAAGACCAA CTTGCTTTAACAAGTCAACAACGTGCAGCAGCTGCACAAGCAGCTGGCAAATTCAAAGATGAAATT GCTGTAGTTAGTATACCACAACGTAAAGGTGAACCTGTTGTTTTTGCAGAAGATGAATACATTAAA GCTAATACATCATTAGAATCACTTACTAAACTTAGACCTGCATTTAAAAAAGATGGTTCTGTTACT GCAGGTAATGCATCTGGCATTAATGATGGAGCTGCTGCTGTTTTAATGATGAGTGCAGATAAAGCT GCTGAGCTTGGTTTAAAACCATTAGCTCGTATTAAAGGTTATGCAATGAGTGGTATTGAACCAGAA ATTATGGGTTTAGGTCCTGTTGATGCAGTTAAAAAAACATTAAATAAAGCAGGTTGGTCTTTAGAT CAAGTAGATTTAATTGAGGCTAATGAAGCATTTGCTGCACAGGCTTTAGGTGTAGCAAAAGAACTT GGTTTAGATTTAGATAAAGTAAACGTTAATGGTGGAGCTATTGCTTTAGGTCATCCTATTGGTGCT TCTGGTTGTCGTATTTTAGTTACTTTATTACACGAGATGCAACGTAGAGATGCAAAAAAAGGAATT GCAACATTATGTGTTGGAGGTGGAATGGGAGTAGCTTTAGCTGTTGAACGTGACTAA ! >phaB! ATGACGACTCTGCAGGGTAAGGTGGCAATTGTGACTGGTGGCAGCAAAGGTATTGGCGCGGCAATT ACACGTGAATTAGCTTCTAACGGCGTAAAAGTTGCTGTAAACTACAATTCATCAAAAGAATCAGCA GAAGCAATTGTTAAAGAAATAAAAGACAATGGTGGTGAAGCTATTGCTGTACAAGCTGATGTTAGT TATGTTGATCAAGCTAAACACCTTATTGAAGAAACTAAAGCTGCTTTTGGTCAATTAGATATTTTA GTTAATAATGCTGGAATAACTCGTGATCGTTCTTTTAAAAAATTAGGAGAAGAAGACTGGAAAAAA GTAATTGATGTTAATTTACATAGTGTATATAATACTACATCTGCAGCATTAACACATCTTTTAGAG TCAGAAGGTGGTAGAGTTATTAACATCTCTTCTATTATTGGTCAAGCAGGTGGCTTCGGTCAAACA AATTATTCAGCAGCTAAAGCAGGAATGTTAGGTTTCACAAAAAGTCTTGCATTAGAATTAGCTAAA ACAGGTGTTACTGTTAACGCAATTTGTCCAGGTTTTATTGAGACAGAAATGGTTATGGCTATTCCA GAAGACGTTCGTGCAAAAATTGTAGCTAAAATTCCTACACGTCGTTTAGGACACGCTGAAGAAATT GCTCGTGGTGTAGTATATTTAGCAAAAGATGGTGCTTACATCACTGGACAGCAATTAAATATTAAT GGTGGTTTATATATGTAA ! 74! ! Anexos! ! >phaC+ ATGAACCCGAACAGCTTTCAATTCAAAGAGAATATTCTGCAGTTTTTCAGCGTACACGACGACATC TGGAAAAAATTACAAGAATTTTATTATGGACAATCACCAATTAACGAAGCATTAGCACAATTAAAC AAAGAAGATATGTCATTATTCTTTGAAGCATTATCTAAAAATCCTGCAAGAATGATGGAAATGCAA TGGTCATGGTGGCAGGGACAAATTCAAATCTATCAAAATGTTTTAATGCGTTCTGTTGCAAAAGAT GTTGCTCCATTTATACAACCTGAGTCAGGTGATCGTCGTTTTAATTCTCCATTATGGCAGGAACAT CCTAATTTCGATCTTTTATCTCAATCATATTTATTATTTAGTCAATTAGTTCAAAATATGGTTGAT GTAGTAGAAGGCGTACCAGATAAAGTACGTTATCGTATTCATTTCTTTACTCGTCAAATGATTAAT GCTTTATCACCAAGTAATTTTCTTTGGACAAATCCAGAAGTTATTCAACAAACAGTAGCTGAACAA GGTGAAAATTTAGTACGTGGTATGCAAGTTTTCCACGACGATGTTATGAACTCAGGCAAATACTTA AGTATACGTATGGTAAATAGTGATTCTTTTTCTTTAGGTAAAGATTTAGCATATACTCCAGGTGCT GTTGTTTTTGAAAACGATATTTTTCAGTTATTACAATATGAAGCTACAACAGAAAATGTTTATCAA ACTCCTATTCTTGTTGTACCACCATTTATCAATAAATATTATGTATTAGATTTAAGAGAACAAAAT TCTTTAGTAAATTGGTTACGTCAACAAGGTCACACAGTTTTTTTAATGTCATGGCGTAATCCAAAT GCAGAACAAAAAGAATTAACTTTTGCAGACTTAATTACTCAAGGTAGTGTAGAGGCTTTACGTGTA ATTGAAGAAATTACTGGTGAAAAAGAAGCTAATTGTATTGGTTACTGTATTGGAGGTACATTACTT GCTGCTACACAAGCATATTATGTTGCTAAACGTCTTAAAAACCACGTTAAATCAGCAACATATATG GCTACAATTATAGATTTTGAAAATCCTGGTTCTTTAGGAGTATTCATTAACGAGCCAGTTGTATCT GGTTTAGAAAATCTTAATAACCAATTAGGTTATTTTGACGGACGTCAATTAGCAGTTACTTTCTCT TTATTACGTGAAAATACTCTTTATTGGAATTACTATATTGATAACTATTTAAAAGGTAAAGAGCCA AGTGATTTTGATATTCTTTATTGGAATAGTGACGGTACAAATATTCCAGCTAAAATTCATAATTTC TTATTAAGAAACTTATACTTAAATAACGAGTTAATTAGTCCAAACGCTGTTAAAGTAAATGGTGTA GGTTTAAACTTATCACGTGTAAAAACTCCTTCATTTTTTATTGCAACACAAGAAGACCACATTGCA TTATGGGACACATGCTTCCGTGGTGCTGATTATCTTGGTGGTGAGAGTACTTTAGTATTAGGTGAA TCAGGTCATGTTGCTGGTATTGTTAATCCTCCTTCACGTAACAAATACGGCTGTTATACAAATGCT GCTAAATTCGAAAATACAAAACAATGGTTAGATGGTGCTGAATACCACCCAGAAAGTTGGTGGTTA CGTTGGCAGGCTTGGGTAACACCTTACACTGGTGAGCAAGTTCCTGCTCGTAATTTAGGCAATGCA CAATATCCTTCTATCGAAGCTGCTCCAGGTCGTTACGTATTAGTTAATTTATTCTAA 8.2 Secuencia!peptídica!de!BKR! Secuencia!de!peptídica!de!la!enzima!3CcetoacetilC(proteína!transportadora!de!acilo)!reductasa! de!C.+reinhardtii.! >gi|158280397|gb|EDP06155.1| BRK [Chlamydomonas reinhardtii] MLAAKHAQATVRGVRAQAPMMAALRASSSVHPFTAASGASAFLSLAASSSAAPRAAAAPARGRAGL VVKAQAADASAERPVCLVTGASRGIGKAIALALGKQGARVAINYASSAGAAEEVAAAVVAAGGEAM VVGANVGKREEIDRMFKEVMDKWGRVDVLVNNAGITRDTLMMRMKPEMWDDVIATNLSGVFYCTQN ATKIMGKQKKGRIINITSVVGIVGNAGQANYSAAKAGVIGLTKTTAREYSGRTITCNAVAPGFIAS DMTAAIDKKYEETILKGIPLGRYGQPEEVAGLVRFLALDPAAAYITGQVYNVDGGMVM ! 8.3 Plásmido!p228! ! 75! Anexos! ! ! ! Es!un!derivado!del!plásmido!pUC18,!el!cual!contiene!un!fragmento!de!ADN!del!cloroplasto!de! Chlamydomonas+reinhardtii!cepa!CCC110!sprCuC1C6C2!mt+!de!4.8!kpb!delimitado!por!los!sitios! de! restricción! de! BamHI! y! HindIII! (Newman,! 1990).! Dicho! fragmento! contiene! parte! de! la! secuencia! del! extremo! 5’! del! gen! 23S! rARN! ! y! la! secuencia! completa! del! gen! 16S! rARN.! Este! último! tiene! una! mutación! puntual! en! la! base! 1123! (A→G),! causando! la! pérdida! del! sitio! de! restricción! para! AatIII! y! confiriendo! un! alto! grado! de! resistencia! al! antibiótico! espectinomicina.!Dicho!plásmido!confiere!resistencia!a!ampicilina!en!cepas!de!E.+coli.! ! 8.4 Plásmido!p320! ! ! ! El!plásmido!p320!es!una!modificación!de!p322,!realizada!por!Alma!Almaraz,!plásmido!parte! de! una! librería! genómica! de! cloroplasto! de! C.+ reinhardtii! (Chlamydomonas! Center,! Duke! University,! Durham,! NC,! USA),! al! cual! se! le! eliminó! un! sitio! BamHI,! remanente! del! sitio! múltiple! de! clonación! de! pBlueScript! KS+! en! el! cual! se! construyó! p322,! mediante! digestión! con! XbaI! y! EcoRI,! rasurado! de! extremos! cohesivos! y! posterior! religación.! Contiene! un! fragmento!de!ADN!del!cloroplasto!de!Chlamydomonas!reinhardtii!cepa!CCC2534!DCMU4!erNuN 1a!de!5.5!kpb!delimitado!por!los!sitios!de!restricción!de!EcoRI!y!XhoI!(Newman,!1990).!Dicho! fragmento!contiene!la!secuencia!del!intrón!4!y!exón!5!del!gen!de!psbA,!la!secuencia!completa! del!gen!5S!rARN!y!parte!de!la!secuencia!del!extremo!5’!!del!gen!23S!ARN.!! Existe! una! mutación! en! la! secuencia! del! exón! 5! del! gen! de! psbA,! que! causa! el! cambio! del! aminoácido! 264! (Ser→Ala)! confiriendo! resistencia! a! DCMU,! además! existe! otra! mutación! puntual! en! la! base! 2622! del! gen! 23s! ARN! (C→T)! que! confiere! la! resistencia! a! eritromicina.! Dicho!plásmido!confiere!resistencia!para!ampicilina!en!cepas!de!E.+coli.! ! 8.5 Plásmido!pKM1! 76! ! Anexos! ! ! ! Plásmido!pKM1!construido!por!Karla!Macedo,!es!un!derivado!del!plásmido!pBlueScript!II! KS!contiene!el!promotor!y!5’!UTR!del!gen!atpA!(PatpA)!y!el!terminador!y!3’!UTR!del!gen! psbA! (TpsbA)! de! C.+reinhardtii.! Cuenta! con! los! sitios! NdeI! y! XbaI! para! la! introducción! de! genes!entre!PatpA!y!TpsbA.! ! 77! ! Anexos! ! 8.6 Plásmido!pKM2! ! ! Plásmido!pKM2!construido!por!Karla!Macedo,!es!un!derivado!del!plásmido!pBlueScript!II! KS!contiene!el!promotor!y!5’!UTR!del!gen!psbD!(PpsbD)!y!el!terminador!y!3’!UTR!del!gen! rbcL! (TrbcL)! de! C.+ reinhardtii.! Cuenta! con! los! sitios! NdeI! y! XbaI! para! la! introducción! de! genes!entre!PpsbD!y!TrbcL.! 78! ! Anexos! ! 8.7 Plásmido!pSKCKmR! ! ! a) Plásmido!pSKCKmR!construido!por!Bateman!y!Purton!(2000)!contiene!el!gen!aphAN6!el! cual! codifica! para! una! aminoglicósido! fosfotransferasa! ! que! confiere! resistencia! a! kanamicina.! El! gen! se! encuentra! bajo! el! control! traduccional! y! transcripcional! del! promotor!y!5’!UTR!del!gen!psbA!(PpsbA)!y!el!terminador!y!3’!UTR!del!gen!rbcL!(TrbcL)! de!C.+reinhardtii.! b) Plásmido! pSKCKmR+ C1B! fue! construído! por! Victor! Pérez! y! se! deriva! de! pSKCKmR.! El! plásmido! pSKCKmR! fue! digerido! con! XbaI! y! religado! con! ADN! Ligasa! de! T4! para! 79! Anexos! ! remover!los!sitios!EcoRI,!PstI,!SmaI,!BamHI!y!uno!de!los!dos!sitios!XbaI!originalmente! presentes!en!pSKCKmR.! c) Plásmido!pSKCKmR+C2B!fue!construído!por!Victor!Pérez!y!se!deriva!de!pSKCKmR+C1B.!El! plásmido!pSKCKmR!C1B!fue!digerido!con!BamHI!y!rellenado!con!ADN!polimerasa!de!T4! para!eliminar!el!sitio!BamHI.! 80! !
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