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DISEÑO DE FERMENTADORES Y
FACTORES QUE AFECTAN AL
RENDIMIENTO DE LAS
FERMENTACIONES.
Dra. María Cecilia Villa.
Prof. Adj. Microbiología Industrial. UNViMe.
Temario
Fermentadores: Diseño y descripción de los
componentes básicos. Aireación y agitación.
Instrumentación y control. Sistemas de medida.
Sistemas de esterilización. Fermentadores de
laboratorio. Fermentadores a escala piloto. Factores
que afecten al rendimiento de las fermentaciones.
Agitación, aireación y mezclado. Número de
Reynold. Potencia necesaria en un fermentador.
Efecto de la viscosidad, temperatura y pH. Aporte
de oxígeno.
Biorreactores


Equipo
fundamental
microbiología industrial.
de
la
Son los vehículos contenedores de
cualquier proceso de producción
basado en la biotecnología, ya sea
para la fabricación de cerveza,
compuestos orgánicos o aminoácidos,
antibióticos, enzimas o vacunas o
para procesos de biorremediación.
Recipiente donde se realiza el
cultivo.
Su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los
microorganismos.



Para cada proceso se debe diseñar el sistema contenedor más apropiado para
crear el entorno adecuado para optimizar el crecimiento y la actividad
metabólica de los biogenradores.
Los biorreactores pueden ser de dos
tipos distintos:
sistemas no asépticos donde no es imprescindible trabajar con cultivos completamente puros, por
ejemplo los procesos de fabricación de cerveza, o sistemas de eliminación de efluentes
-
sistemas donde las condiciones asépticas son un requisito para una formación de productos exitosa,
como es el caso de los antibióticos, vitaminas y polisacáridos.
-
Etapas para llevar a cabo el diseño de un
fermentador
1. Control de la entrada y salida de
microorganismos, nutrientes y productos de la
fermentación.
2. Control de los intercambios de gases y energía.
3. Proporcionar un ambiente óptimo para el
crecimiento del microorganismo o para el
desarrollo del proceso fermentativo.
4. Optimización del rendimiento del producto
respecto al costo energético y de los sustratos de
fermentación.
5. Facilitar la recuperación de los productos de la
fermentación (ya sea en forma de biomasa o en
el medio de cultivo).
6. Los fermentadores industriales están generalmente
diseñados para procesos concretos.
En todas las formas de fermentación el
objetivo en último término es asegurar que
todas las partes del sistema se someten a las
mismas condiciones.
Consideraciones especiales en el
diseño y selección de un fermentador
1.
2.
3.
El envase o contenedor en donde se realizará la
fermentación debe ser capaz de ser operado
asépticamente durante el tiempo en que
la
operación se realice. Debe diseñarse para evitar la
entrada de organismos contaminantes y para contener
los organismos deseados. Esto es de vital importancia
en procesos continuos.
El volumen de cultivo debe permanecer constante,
es decir que no haya escapes ni evaporación. Las
perdidas por evaporación deben ser mínimas.
El nivel de oxigeno disuelto debe mantenerse por encima de los niveles críticos de
aireación y agitación del cultivo para organismos aerobios. La aeración (o ausencia de
ésta) y la agitación deben realizarse de forma que se cumplan con los requerimientos
metabólicos del microorganismo utilizado. El mezclado debe hacerse en tal forma que los
nutrientes estén uniformemente distribuidos en el fermentador sin que esto conlleve daño
físico al microorganismo. El aire debe estar filtrado para evitar la entrada de
microorganismos en el polvo.
4.
5.
6.
7.
8.
Debe proveer sistemas de control de
parámetros ambientales tales como la
temperatura, pH, etc.
El consumo de energía debe ser tan bajo
como sea posible.
El fermentador debe proveer algún tipo de
sistema para un muestreo eficiente y que no
promueva la contaminación del proceso.
El diseño del envase (o tanque) debe
considerar un fácil manejo para
las
operaciones de limpieza y mantenimiento.
Las paredes del envase (o tanque) deben ser
pulidas, es decir, no deben tener porosidad
que dificulte la limpieza y sanitización.
Los materiales de construcción deben ser
resistentes a los compuestos que se
generen durante el proceso y a la materia
prima, sales, ácidos o bases que se añadan.
Dentro del biorreactor…
Los microorganismos se encuentran suspendidos en un medio nutritivo acuoso que
contiene los sustratos necesarios para el crecimiento del organismo y la
formación del producto requerido.
Los nutrientes incluyendo el oxigeno, deben ser proporcionados para que se
difundan dentro de cada célula.
Los productos de desecho tales como el calor, CO2 y metabolitos de desecho
deben ser eliminados.
Las reacciones de fermentación son multifásicas e implican una fase gaseosa
(que contiene N2, O2 y CO2), una o más fases líquidas (medio acuoso y
sustrato líquido) y una microfase sólida (el microorganismo y, posiblemente,
sustratos sólidos).
Todas las fases deben mantenerse en estrecho contacto para alcanzar una
transferencia de calor y masa rápida.
Los reactivos que entran en el sistema deben mezclarse inmediatamente y se
distribuidos uniformemente para asegurar la homogeneidad dentro del
reactor.
“Tareas" que realiza el biorreactor :
a)
Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de
cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.
b)
Mantener constante y homogénea la temperatura.
c)
Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
d)
Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el cultivo.
e)
El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que
todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el
microorganismo deseado.
a), b) y c) requieren de un sistema
de agitación
d) requiere de un sistema que
inyecte aire en el cultivo
Tanque agitado
El aire se inyecta por la parte inferior del
tanque y es distribuido por una corona que
posee pequeños orificios espaciados
regularmente. El chorro de aire que sale de
cada orificio es "golpeado” por las paletas de
la turbina inferior generándose de este modo
miles de pequeñas burbujas de aire, desde las
cuales difunde el 02 hacia el seno del líquido.
El sistema de agitación se completa con cuatro
o seis deflectores que tienen por finalidad
cortar o romper el movimiento circular que
imprimen las turbinas al líquido, generando de
este modo mayor turbulencia y mejor mezclado
Tanque agitado
El tanque está rodeado por una camisa por la que
circula agua, lo que permite controlar la
temperatura. Para tanques mayores que 1000 ó
2000 litros este sistema ya no es eficiente y es
reemplazado por un serpentín que circula
adyacente a la pared interior del tanque. A
medida que es mayor el volumen de cultivo también
lo es la cantidad de calor generado, por lo que se
hace necesario una mayor área de refrigeración.
Los tanque son de acero inoxidable y están pulidos
a fin de facilitar la limpieza y posterior
esterilización.
El aire que ingresa al biorreactor debe estar
estéril, lo que se consigue haciéndolo pasar por un
filtro cuyo diámetro de poro es de 0,45 micrones,
que impide el paso de mircroorganismos y esporos.
Air lift
En los reactores de tipo "air lift” es el mismo aire
inyectado al cultivo lo que promueve la agitación.
Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y
por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior,
se inyecta aire.
De este modo se genera una circulación de líquido
ascendente en el compartimento interno y
descendiente en el externo, por bombeo neumático
o mecánico que favorece el mezclado.
Son de más bajo consumo energético.
Los fermentadores pueden utilizarse en uno de tres
modos comunes de operación.
FERMENTADOR POR LOTES
(BATCH)
FED-BATCH
CONTINUO.
• El más común.
• Se introduce parte de la
• El fermentador se opera
• En el, una cantidad fija de
materia prima al principio
con una razón de
materia prima se prepara
del proceso.
alimentación de sustrato
y se introduce en el
• Se inocula el
de igual magnitud a la
fermentador.
microorganismo
razón de extracción de
• El fermentador se inocula
seleccionado comenzando
producto (volumen de
• con el microorganismo
el proceso de la
operación del reactor
seleccionado y el proceso
fermentación.
constante).
de fermentación ocurre
• Posteriormente el resto de
• Esto permite operar el
durante un período de
la materia prima se añade.
fermentador por
tiempo específico.
Dentro de esta modalidad
prolongados períodos de
• Luego de terminada la
de fermentación existen dos
tiempo sin la necesidad
fermentación, el producto
tipos principales: la
de preparar inóculos
fermentado se extrae.
incremental y la de volumen
continuamente y
• Se pueden realizar
fijo.
eliminando repetidos
generalmente en una de
períodos de propagación
dos formas: con agitación
de masa celular que
y sin agitación.
consumen gran cantidad
de tiempo.
Fermentaciones Fed Bath
- En la incremental, la concentración de sustrato de la alimentación es igual o mayor a la concentración que había
en el fermentador al comienzo del proceso. El volumen del medio dentro del fermentador aumenta
significativamente .
- En las de volumen fijo, la concentración de sustrato en la alimentación es tan alta que no hay que añadir grandes
cantidades de ésta, lo que resulta que no ocurran cambios significativos.
Algunos tipos de fermentadores continuos:
- Fermentador de torre presenta una geometría tal, que las
células biogeneradoras se depositan en el fondo del recipiente
y el producto se recupera desde la superficie. Es el caso de los
fermentadores que se usan para la fabricación de cerveza.
- Fermentador de células inmovilizadas es uno usualmente en
forma tubular con una matriz porosa en su interior, la cual es
tratada químicamente para que las células del microorganismo
seleccionado se adhieran a las paredes de los poros. Luego de
permitir el crecimiento de las células de microorganismo
dentro de la matriz, la alimentación se introduce al reactor y la
misma mantiene contacto con las células de microorganismo
mientras ésta pasa a través de los poros. La velocidad de la
alimentación debe ser adecuada para que el sustrato
mantenga suficientemente tiempo de contacto con las células
adheridas y reaccione totalmente.
de volumen.
Ventajas y desventajas de los cultivos contínuos
Cultivos contínuos
Los cultivos contínuos son los más comunes. A lo largo del proceso no se añade ningún
nutriente, a excepción del oxígeno. Llega un momento en que los nutrientes son limitantes
para el crecimiento, or lo que se dan fases típicas de un cultivo bacteriano.
En base a la cinética de crecimiento de los microorganismos, podemos clasificar:
Tipo I: El producto deriva directamente del catabolismo. Pudiendo incluso ser la propia
bacteria. El consumo de sustrato y el crecimiento se dan casi simultáneamente. Este es el
caso del etanol.
Tipo II: El producto también es producido durante el metabolismo primario, pero deriva
de una vía biosintética lateral. El consuo de sustrato y la producción de producto están
ligeramente separadas. En un sistema discontínuo el máximo crecimiento y consumo de
sustrato alcanza su máximo cuando la producción es baja o nula y viceversa. La
trofofase y la idiofase se encuentran separadas pero en la misma fase de crecimiento.
Es el caso del ácido cítrico y algunos aminoácidos.
Tipo III: El producto deriva del metabolismo secundario. La trofofase y la idiofase están
en tiempos totalmente separados y en fases diferentes de la curva de crecimiento.
Sistemas de control


En los procesos de fermentación que se desarrollan en un biorreactor se
necesita medir parámetros ambientales y relacionados con el crecimiento,
grabarlos y usar luego la información para mejorar y optimizar el proceso.
Las medidas de control del biorreactor se hacen o bien en línea o fuera de
línea.
En una medida en línea, el sensor se coloca directamente dentro de la corriente
del proceso. La medida en línea está disponible para análisis de temperatura,
pH, oxigeno en solución y CO2.
Para la medida fuera de línea, se toma de forma aséptica una muestra durante el
proceso y se analiza.
El análisis fuera de línea es aún esencial para ADN, ARN, enzimas y biomasa, y
dado que los resultados de estos análisis no están generalmente disponibles
hasta varias horas después del muestreo, no pueden usarse con fines de control
inmediato.
Sistema de control de temperatura
El fermentador está rodeado de una
chaqueta que junto a un sistema de
mezclado permite una distribución de
temperaturas similar en todas las partes
del líquido fermentándose.
Un sensor se utiliza para medir la
temperatura dentro del fermentador. La
señal eléctrica es recibida por una
unidad de control que determina si la
temperatura está dentro de un rango
adecuado.
El controlador activará la válvula de vapor en caso de requerirse aumentar la temperatura;
si se requiere una disminución de temperatura, se activará la válvula que permite el paso de
agua fría; por último, en el caso en que la temperatura se encuentre dentro del rango
aceptable, tanto la válvula de vapor como la de agua fría permanecerán cerradas.
Sistema de control de pH
La señal eléctrica del sensor es recibida por el
controlador que determina la acción por seguir,
según el valor de pH y el rango de operación
de esta variable de control.
Si el pH es más bajo que el permitido en la
lógica de control, el controlador activará la
bomba de base introduciendo un medio alcalino
que permita subir el pH.
En el caso de que el pH sea más alto de lo
establecido en el criterio de control, se activará
la bomba de ácido y el pH bajará.
En el caso de que el pH esté dentro del rango
permitido, ambas bombas permanecerán
desactivadas.
Sistema de control de espuma
En ocasiones es necesario que el fermentador
tenga algún tipo de sistema que controle la
formación de espuma (antifoam control system).
Estos sistemas pueden ser mecánicos o pueden
añadir algún compuesto químico(antiespumante)
que disminuya la tensión superficial del medio en
que se fermenta, evitando la acumulación de
espuma.
Sistema de control de oxígeno disuelto
Los sistemas de control de oxígeno disuelto
tienen un sensor y un controlador al igual que
otros sistemas de control.
En estos casos se establece una cantidad mínima
de oxígeno disuelto, en la cual se activarán
elementos de control para aumentar la cantidad
de oxígeno presente en el medio.
Estos elementos pueden ser compresores o
válvulas de aire.
También los sistemas de control de oxígeno
disuelto pueden aumentar la velocidad de
agitación, causando turbulencia, lo que ayuda a
exponer más área de superficie del líquido al
aire y así aumentar la transferencia de oxígeno al
medio.
También hay sensores de CO2.
Velocidad de transferencia de oxígeno
La VELOCIDAD DE TRANSFERENCIA DE 02, R02, desde el seno de la fase
gaseosa (burbujas) hasta la fase líquida está dada por la siguiente ecuación
Donde:
• KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno
• C la concentración de 02 disuelto en el seno del líquido
• C* la concentración de 02 disuelto que estaría en equilibrio con la presión
parcial de oxígeno de la fase gaseosa.
El KLa depende de:
•
diseño del biorreactor
•
las condiciones de operación (caudal de aire, agitación)
•
de la viscosidad del cultivo. A mayor viscosidad menor K
EL K LA ES UNA MEDIDA DE LA CAPACIDAD QUE POSEE UN BIORREACTOR
PARA SUMÍNISTRAR O2 Y EL RANGO DE VALORES USUALES ESTÁ
COMPRENDIDO ENTRE 50 h-1Y 1000 h-1.
Componentes y sustratos
Esterilización
Agentes biocidas
Ventajas de la esterilización por UHT y
por filtración
Escalado de bioprocesos
Los bioprocesos se desarrollan e implementan de
diferentes maneras, en sus escalas de laboratorio,
piloto y manufactura.
El escalado puede definirse como el procesamiento para
diseñar y construir un sistema de gran escala base de
los resultados de experimentos con equipamiento de
pequeña escala.
El desempeño de los bioprocesos es afectado por varios
parámetros:
•
El diseño geométrico
•
Las variables de operación
•
Propiedades del fluido
•
Procesos de transporte
•
Cinética de los organismos
El diseño de un producto optimizado para lograr la mayor producción debe ser trasladado a
gran escala, considerando toda esta complejidad de variables.
Escalado



En la gran mayoría de los procesos de alto valor, los biorreactores operarán en
forma de batch bajo condiciones de monocultivo aséptico.
La expansión inicial del cultivo de microorganismos comenzará en el biorreactor
más pequeño, y cuando el crecimiento está optimizado, será entonces transferido
a un biorreactor mayor.
La gestión del proceso de aumentar la escala requiere una alta inversión de
capital en el mezclado y aireación, en la monitorización y los sistemas de control,
y en el mantenimiento riguroso de la esterilidad.
5 a 10l
100 a 10000l
laboratorio
planta piloto
20000 a 400000l
planta piloto
Ejemplo de proceso de escalado
Producción de levadura
El problema del salto de escalas viene dado por el hecho de que en las primeras fases se
ha de comprobar el funcionamiento de la bacteria en el laboratorio, donde los objetivos
son diferentes que en la planta. En el laboratorio se intenta optimizar la producción en
términos puramente cuantitativos, mientras que en la planta es la optimización del
rendimiento, considerando también los costos.
Tener éxito en el salto de escala querrá decir conseguir la máxima producción en la
planta, en el mínimo de tiempo y con el mínimo de costos.
Dependiendo del tipo de biocatalizador que tengamos, y de las condiciones de este, será
más rentable usar un tipo u otro de medio y una determinada concentración de agua,
así como inmovilizar el biocatalizador.
Distinguiremos por lo tanto entre cultivos sumergidos o en superficie, así como también
podremos tener el biocatalizador inmovilizado o no. Finalmente, el cultivo podrá ser
sólido, semisólido o líquido.
Existen numeroso métodos
para inmovilizar células,
como se ve en la gráfica.
Instrumentación, control y aspectos
económicos
Productividad: es la producción por tiempo de fermentación. Por eso la
fermentación en contínuo puede resultar mas rentable.
Coeficiente de rendimiento: Cantidad de biomasa producida a través de un
nutriente (Y). Podemos expresarla en base a un elevado número de parámetros
diferentes:
Para que la rentabilidad y rendimiento sean máximos, será necesario que todos los
parámetros del fermentador sean óptimos y se mantengan constantes.
Existen problemas típicos:
-Problemas del calor
-Problema de la aireación
-Problemas de la agitación y de la mezcla
-La viscosidad
Problemas de la agitación y de la
mezcla
Fermentación
microbiana,
sistema de tres
fases
La fermentación implica reacciones entre las tres fases, por lo cual se requiere una buena
homogenización.
La agitación
produce
Problemas de calor y aireación
Es necesario optimizar la agitación, para lo cual se
tendrán cuenta algunos parámetros:
Nº de Reynolds: Se trata de un número adimensional, que permite medir si el flujo es
laminar o turbulento.
Una buena homogenización viene indicada por Re. Para alcanzar el número de
Reynolds deseado los parámetros que se deben ajustar son la agitación y las
dimensiones.
Se deben optimizar también:
-Tiempo de mezcla: tiempo necesario par homogenizar el fermentador hasta el grado
deseado, hasta el Re deseado. Debe de ser mínimo.
-Nº de potencia, Np: Es la energía necesaria para alcanzar el Re. Ha de ser mínima.
La viscosidad
Cuando se analizan las operaciones donde hay movimiento de fluido, lo primero que
debemos estudiar será el comportamiento del fluido (reología), esto es, qué esfuerzo hay
que hacer en un fluido para generar cierto gradiente de velocidad o deslizamiento.
El diseño de numerosas operaciones suele basarse en suponer que el fluido objeto de
estudio presenta un comportamiento reológico solo viscoso de tipo newtoniano, es decir,
que presenta una viscosidad constante e independiente del esfuerzo cortante. El fluido
posiblemente no sea newtoniano.
Sin embargo, los fluidos presentes en procesos biológicos tienen distintos tipos de
comportamiento en función de los nutrientes, los microorganismos y el tipo de producto.
De hecho, muchos fluidos involucrados en bioprocesos precisan proporcionalmente de
menor esfuerzo al aumentar el gradiente de velocidad (pseudoplásticos) o con bajo
esfuerzo no se mueven (fluidos plásticos).
Efectos que puede tener el cambio de
escala
•
•
•
•
•
Disminución del rendimiento
Cambio de cinética
Efecto de esterilización
Efecto del inóculo
Problemas de transporte (homogenización)
La información sobre la cinética referida al
metabolismo del cultivo o microorganismo
obtenido a pequeña escala es independiente
de la escala (pH, temperatura, medio de
cultivo, calidad de materias primas) y no es
necesario tenerlas en cuenta para
determinar la estrategia del escalado. Los
FENÓMENOS DE TRANSPOTE son los
únicos fenómenos que son dependientes
del escalado.
Criterios de escalado
•
•
•
Mantener constante la potencia por volumen
utilizada, P/V
Mantener constante el coeficiente volumétrico de
transferencia de masa, kLa
Mantener constante la velocidad de la punta de
las paletas del agitador
•
Mantener constante el tiempo de mezclado
•
Mantener constante el número de Reynolds, Re
•
•
En los casos de procesos donde el producto es muy
viscoso (plásticos, polisacáridos) o el crecimiento es
filamentoso, la limitación la plantea la relación
P/V (o la agitación) del fluido.
En general en el caso de procesos aeróbicos (como
producción de aminoácidos, levaduras de
panificación y antibióticos) se debe mantener
constante la transferencia de oxígeno (kLa) como
objetivo del escalado.
Recuperación de productos
Etapas del proceso de recuperación
Principales operaciones de recuperación
Tipos de cromatógrafos