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Instituto de investigaciones de la Amazonía Peruana
Instituto de Investigación para el Desarrollo
Laboratorio de Biología y Genética molecular - LBGM
Genética molecular y su aplicación al
estudio del paiche “Arapaima gigas” en la
Amazonía peruana
Dra. Carmen Rosa García Dávila
Jefe del LBGM
Agosto - 2009
Pucallpa - Ucayali
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CONSERVACION
Pesqueria
Piscicultura
•Caracterización
•Manejo sostenido
Genética
Biologia
•Poblaciones
•Especies
•Medio ambiente
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Fenotipo y genotipo
Fenotipo
Genotipo
Set de genes presentes
en un organismo
Set de
características
físicas expresadas
por un organismo
Ambiente
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Relacionamiento genotipico y fenotipico
Gran variación fenotipica = gran variabilidad
genética?
Heredabilidad
Rango de heredabilidad:
0 = cuando toda variación es
completamente ambiental.
1 = cuando toda variación es debido
a diferencias genéticas.
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Genética
=

Reproductores
Progenie
Fenotipo = Genotipo ?
Heredabilidad
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Susceptibilidad al medio ambiente
• Altos niveles de variación fenotipica
• Baja heredabilidad
Crecimiento:
- Disponibilidad
de comida
- asinamiento
Gran susceptibilidad al
medio ambiente
Temperatura:
- Metabolismo
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La diversidad biológica a sido rápidamente destruida en nuestro planeta
debido directa o indirectamente a las actividades humanas. A medida
que los tamaños de las poblaciones de animales y plantas son reducidos,
la perdida de diversidad genética limita sus potencialidades de adaptarse
a los cambios del ambiente. Además de eso la depresión por
endocruzamiento se torna una consecuencia inevitable para muchas
especies.
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Lenguaje de la vida
 “lenguaje” en el que se especifican las instrucciones
para la síntesis de proteínas.
Síntesis de proteínas
Codons
RNAm
Proteína
Val
Transcripción
ala
caracter
leu
Traducción
Expresión
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Evaluación de la variabilidad
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 Morfológica: Variabilidad en caracteres detectables
 ejemplo: Pez disco
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 Citogenética: Estudio de la morfología del cromosoma
Bandeamiento
Tinción Fish
Ventajas:
Cariotipo
-Importante a falta de otras tecnicas
Desventajas:
-Tamaño y nº de cromosomas en peces
- Tiempo, dificultad y costo
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 Izoenzimas: múltiples formas moleculares de una
misma enzima
Interpretación de bandas:
Ventajas:
• Amplia información genética.
• Técnica relativamente
accesible.
barata
y
• Carácter codominante
Limitaciones:
• Número de loci limitado.
• Ausencia de polimorfismo genético
para uno o varios loci.
Enzima
monomérica
Enzima
dimérica
Enzima
trimérica
Enzima
tetramérica
Diferencias en la movilidad de la
enzima representan diferencias en el
ADN
• Baja resolución cuando comparado
a otras técnicas mas modernas.
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Marcadores basados en el análisis directo del ADN
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Digestión y maceración en buffer CTAB y
proteinasa K
Pesado de muestra
(100mg)
EXTRACCIÓN DE ADN Protocolo CTAB
Separación del material genómico
(Doyle & Doyle, 1987)
ADN
Precipitado
Resuspensión del ADN
Agua Milli-q
Secado y resuspensión del DNA
Lavado
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Polimorfismo a lo largo de fragmentos de
restrinción - RFLP


 








Ventajas:
• Carácter codominante
• Mayor detección de
polimorfismo que las
isoenzimas
• Puede cubrir todo el
genoma
Limitaciones:
Sondas
• Gran nº de pasos
• Elevado costo
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Marcadores moleculares basados en PCR
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Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Cebador o primer
Cebador o primer
ADN polimerasa
P
C
R
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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Primers
Palumbi & Benzie (1991)
,
COIa 5 -AGT-ATA-AGC-GTC-TGG-GTA-GTC-3
,
,
COIf 5 -CCT-GCA-GGA-GGA-GGA-GAY-CC- 3
Perfil de temperatura
30 ciclos
Condiciones de amplificación:
MIX Para 30 l
92ºC
DNA molde (50ng/ l)
2,7 l
Tampón de PCR
3,0 l
Mix DNTPs (1mM)
3,0 l
COIa (5 M)
3,0 l
COIf(5 M)
3,0 l
Taq (5 unidades /l)
0,15 l
Agua miliQ
15,15 l
Gel de agarosa 1,0%
(brometo de etídeo)
1’
57ºC
1’
72ºC
72ºC
1’
5’
,
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RAPD (polimorfismo de ADN amplificado
arbitrariamente)
Ventajas:
• Simplicidad, rapidez y bajo costo.
• Detecta diferencias directamente en el
gel.
• No requiere de biblioteca genomica.
Limitaciones:
• Bajo contenido de información obtenida por
loci. Apenas un alelo es detectado
(segmento amplificado).
• Variaciones
alelicas
conjuntamente
como
(dominancia de RAPD).
• No reproducible.
son
un
clasificadas
alelo
nulo
Gen
Exon
Intron
CTAGCAAATTCATTACA
Exon
Exon
CTAGCAAGCATTGGCA
TAGCAATCATTCA

Exon
Exon

 
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 EPIC (Exon Primer Intron Crossing)
Intron
Intron
Intron
Exon
Exon
Exon
Ventajas:
• Utiliza primers que son
conservadas de los exones.
diseñados
en
zonas
• Es fácil de realizar.
• tiene un bajo costo con relación a otras técnicas.
Desventaja:
• Muchas veces sus padrones de bandas son de difícil interpretación.
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Amplificación Directa de Polimorfismo de Longitud (DALP)
Ventajas:
• Amplia información
poblacional.
genética
para
estudios
a
nivel
Limitaciones:
• Disponibilidad de información (en términos de secuencias
nucleotidicas) a respecto de regiones que posean repeticiones
para el organismo que se desea estudiar.
• Altos costos economicos.
Tununtunumba
Shica
Habana
Gel de agarosa 2%
Cerro alto
3’– ACTTTCACAGGAAACAGCTATGACTT – 5’
Dirección de la amplificación
Primer selectivo
Primer reverso
Dirección de la amplificación
Gel de poliacrilamida 6%
5’ – TGAAAGTGTCCTTTGTCGATACTGAA –3’
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SECUENCIAMIENTO NUCLEOTÍDICO
Ventajas:
• Rapidez.
• Uno de los mas eficiente para estudiar
la variabilidad.
• No requiere de biblioteca genomica.
Limitaciones:
• Alto costo
• Requiere
laboratorios
altamente
implementados
y
personal
tecnico
especializado.
CTAGCAAATTCATTACA
A
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
1
2
1
2
1
2
1
2
3
4
3
3
4
4

D
3
 
C
2

B
1
 
Sitio de
restricci
ón

   
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Microsatélites
Ventajas:
• Mayor contenido de información de
polimorfismo para estudios a nivel
poblacional.
• Codominante y multialelico
Limitaciones:
• Gran trabajo previo para el desarrollo de los marcadores.
• Altos costos económicos.
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Arapaima gigas
• Alcanza tallas de 3 metros y pesos de
mas de 200 Kg.
• Se encuentra bajo fuerte explotación
comercial.
• Desde los años 70 Reducción
significativa de tamaño poblacional cerca
de grandes ciudades amazónicas.
• Actualmente las poblaciones naturales
están protegidas (Listada como especie
“con datos deficientes” por la CITES
desde 1975).
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Caracterización molecular del paiche en el lago
Imiria
Objetivo:
Estimar la variabilidad y
diversidad genética de la
población
de
paiche
existente,
para
compararla
con
la
variabilidad genética de
los paiches que serán
sembrados en la laguna.
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Metodología de trabajo:
• Colecta de material biologico
(nativos y a sembrar).
• Extracción y cuantificación de
ADN.
• Amplificacion y lectura de 14
locis microsatelites.
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Utilidad de los resultados obtenidos:
• Monitorear la evolución de la variabilidad genética de la
población con el tiempo y determinar el grado de
adaptación de los paiches sembrados.
• Conocer la proporción de individuos sembrados que
participan efectivamente al aumento de la población (es
decir a la producción de las nuevas generaciones), y si
se están reproduciendo con los paiches nativos.
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Caracterización
molecular del paiche en
el lago el Dorado - RNPS
•
Objetivo:
Evaluar la variación
genética en el lago el
dorado entre diferentes
anos.
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Estudios moleculares del paiche en la Reserva
Nacional Pacaya-Samiria
•
Evaluar la distribución de la
variación genética dentro y entre
localidades de muestreo.
•
Estimar efectos de procesos
demográficos pasados sobre la
distribución de la diversidad
genética.
•
Estimar flujo génico (Nm) y
tamaños poblacionales efectivos
(Ne).
•
Identificar áreas prioritarias de
conservación y manejo sostenido.
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Metodología de trabajo:
• Colecta de material
biologico en cuatro
puntos de la RNPS.
• Extracción y
cuantificación de ADN.
• Amplificación y lectura
de 14 locis
microsatelites.
micSat
r=0.9348 F=34.6626 P =0.0020
0.30
Allele diversity
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Poblaciones con baja diversidad genetica
son (en promedio) las mas divergentes
(por efecto de la deriva genetica)
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.0
0.2
0.4
0.6
Fst
(FST = 0.1745, P < 0.001)
(Bayesian exact test N.S.)
0.8
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Utilidad de los resultados
• Estructura genética en el paiche es también causada por
acción antropogénica?
• Reducción de la variación genética esta asociada con
sobrepesca?
• Existe intercambio entre las poblaciones? (Flujo génico)
• Valores de Ne (Que proporción de la población esta
contribuyendo al mantenimiento de la variabilidad)
• La mayor fracción de variación genética se encuentra
lejos de grandes centros urbanos?.
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Autocorrelacion espacial
• Estimar la distancia geográfica a la cual las poblaciones
se diferencian genéticamente
• Aplicable a especies con distribución continua, o con
poblaciones discretas conectadas por flujo génico (existe
aislamiento por distancia)
• Análisis basado en correlaciones entre una matriz de
distancias genéticas con una matrix binaria (0,1) de
distancias geográficas (0=mayor o 1=menor que un valor
umbral)
Fst1,2
Fst1,3 Fst2,3
Fst1,4 Fst2,4 Fst3,4
Fst1,5 Fst2,5 Fst3,5 Fst4,5
480
1600 1120
2113 1633 513
2770 2290 1170 657
1
0 1
0 0 1
0 0 1 1
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Gracias por su atención
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