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COMPARACIÓN METODOLÓGICA: DETERMINACIÓN DE HORMONA DE CRECIMIENTO
POR DOS INMUNOENSAYOS COMERCIALES EN NIÑOS CON TALLA BAJA
Aguirre, María Cecilia; Sobrero, Gabriela; Martín, Silvia; Tarifa, Cintia; Páez Nuñez, Alejandra;
Álvarez, Julia; Schvab, Gisele, Silvano, Liliana; Castro, Laura; Lescurat, María del Pilar;
Boyanovsky, Adriana; Miras Mirta; Muñoz, Liliana.
Hospital de Niños de la Santísima Trinidad, Servicio de Endocrinología.
Conflicto de interés: los autores declaran no poseer conflicto de interés.
Datos para correspondencia:
María Cecilia Aguirre
Teléfono móvil: 0351-156076653
Dirección electrónica: [email protected]
Dirección Postal: Paraná 550. Piso 6 Dpto: G (Nueva Córdoba). CP: 5000. Córdoba
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Resumen
Introducción: El diagnóstico de deficiencia de hormona de crecimiento (DGH) en niños, se basa
en criterios clínicos, auxológicos, estudios de imágenes y bioquímicos que incluyen el pico
máximo de hormona de crecimiento (GH) obtenido en los diferentes tests de estimulación
farmacológica (TF). Se ha descripto que las concentraciones de GH varían de acuerdo al
método utilizado. Objetivos: Comparar las concentraciones de GH medidas por el
inmunoensayo electroquimioluminiscente Roche, Cobas e 601(EQLIA) y por un ensayo
quimioluminiscente Siemens, Immulite 2000 (IQMA) utilizando la preparación de referencia
internacional (IRP) 98/574. Materiales y Métodos: Se analizaron 245 TF (arginina n: 175 y
clonidina n: 70) realizados en 192 niños con talla baja (edad cronológica, EC: 0,8 - 16 años).
Las concentraciones de GH se determinaron por IQMA y EQLIA, utilizando el IRP 98/574.
Resultados: En la comparación de métodos mediante el procedimiento no paramétrico de
Passing-Bablok, la recta obtenida fue: y= 1,08x +0,07. Se obtuvo muy buena correlación entre
EQLIA e IQMA (r= 0,97 y r² =0,95).
Conclusiones: La utilización de un único calibrador IRP 98/574 ha mejorado la posibilidad de
comparar los métodos para determinar GH. Sin embargo, las mediciones de GH post TF
continúan dependiendo del método empleado.
Palabras claves: Test de estimulación farmacológica, IQMA, EQLIA.
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Introducción
El diagnóstico de deficiencia de hormona de crecimiento (DGH) en niños, se basa en criterios
clínicos, auxológicos, estudios de imágenes y bioquímicos que incluyen el pico máximo de
hormona de crecimiento (GH) obtenido en los diferentes tests de estimulación farmacológica
(TF) (1,2).
En individuos normales, la secreción de GH es muy variable y está regulada por algunos
factores fisiológicos como edad, composición corporal, nutrición, estrés y sueño (3-7).
La GH está presente en circulación en diferentes isoformas e isómeros. La variante de GH más
abundante es la de 22 kDa, secretada por la hipófisis anterior. También se sintetizan
transcriptos alternativos que dan lugar a otras formas de GH hipofisaria (GH 20 kDa y GH 17,5
kDa) aunque en menor cantidad que la forma principal. La isoforma de GH 20 kDa tiene una
vida media más prolongada pero menor potencia que la GH de 22 kDa. La homodimerización y
la heterodimerización de estas moléculas contribuyen a la variedad de isoformas presentes en
circulación. La GH se encuentra unida a proteínas (GHBPs) que constituyen la parte soluble de
su receptor. Las GHBPs son proteínas de almacenamiento intravascular y disminuyen las
fluctuaciones de la concentración hormonal. En condiciones normales, así como en respuesta a
una variedad de estímulos, las distintas isoformas de GH son segregadas en forma paralela
(8,9).
Las discrepancias observadas en la cuantificación de GH entre los diferentes inmunoensayos
están bien documentadas y se encuentran asociadas con la heterogeneidad de las moléculas
de GH en circulación, la interferencia con las GHBPs endógenas, el uso de distintos diseños de
ensayos que emplean anticuerpos monoclonales o policlonales y la disponibilidad de distintas
preparaciones de referencia internacional (IRP) para calibrar los ensayos (3,5,10-15).
3
El Consenso Internacional sobre la estandarización de ensayos de GH recomendó que los
resultados de GH se expresen en unidades de masa del nuevo IRP 98/574 para lograr
armonizar los resultados (16,17).
Los inmunoensayos utilizados para la medición de GH fueron modificados en los últimos años.
Hasta
principio
de
los
años
noventa,
se
empleaban
con
mayor
frecuencia
los
radioinmunoensayos (RIAs) clásicos, los cuales usaban anticuerpos policlonales. Durante la
última década hubo un cambio hacia el uso de inmunoensayos de tipo sándwich que utilizan
anticuerpos monoclonales aumentando de esta manera la sensibilidad y especificidad. Sin
embargo, se observó disparidad en los resultados obtenidos debido a diferentes diseños de los
ensayos que reconocen una, varias o todas las formas moleculares de GH (3,4,11,18).
Recientemente, se propuso el uso de métodos que pueden cuantificar exclusivamente la
isoforma GH 22 kDa con el objetivo de homogeneizar los resultados de GH (15,17).
Debido a la secreción pulsátil de GH, para diagnosticar su deficiencia se valora
fundamentalmente el incremento de GH en respuesta a estímulos fisiológicos o farmacológicos.
Las guías de consenso para el diagnóstico y tratamiento de DGH en la infancia y la
adolescencia hacen referencia a los valores de corte publicados para la interpretación de los
resultados obtenidos en TF, pero al mismo tiempo, expresan su preocupación con respecto a la
comparabilidad de las concentraciones de GH medidas por diferentes inmunoensayos
(16,17,19). En la práctica clínica, durante muchos años se utilizó el valor de corte tradicional de
10 ng/mL validado en los años 70s utilizando RIAs policlonales (2,20-23). Posteriormente, con
la aparición de métodos inmunométricos, diferentes estudios bioquímicos propusieron valores
de corte que oscilaron entre 4 y 7 ng/mL (4, 24-28). En un estudio colaborativo en el que
participaron dos centros de nuestro país, se propuso un valor de corte de 4,70 ng/mL para los
TF de GH medidos por un ensayo quimioluminiscente Siemens, Immulite 2000 (IQMA) con el
IRP 98/574 (26). Sin embargo, en nuestro medio no se ha establecido un valor de corte para el
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inmunoensayo electroquimioluminiscente, Roche, Cobas e 601(EQLIA) empleando el mismo
IRP.
Nuestro objetivo fue comparar las concentraciones de GH medidas por los inmunoensayos
EQLIA e IQMA en muestras obtenidas de los tests de arginina y clonidina en niños con talla
baja.
Sujetos y métodos
Se estudiaron retrospectivamente 192 niños (58 niñas y 134 varones; edad cronológica entre
0,8 y 16 años) que fueron examinados debido a retraso en el crecimiento o baja estatura en el
Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de la Provincia de Córdoba, Argentina, en el período
2012-2014. Los niños fueron evaluados de acuerdo a criterios clínicos, auxológicos y
bioquímicos indicados en las guías consenso para el diagnóstico y tratamiento de DGH en la
niñez y adolescencia (19). Se excluyeron otras causas de déficit de crecimiento, como
hipotiroidismo, enfermedad sistémica crónica, síndrome de Turner y/o trastornos óseos.
Se realizaron 245 TF: arginina n=175 (0,5 g de clorhidrato de arginina/kg de peso corporal) y
Clonidina n= 70 (100 μg/m2 de superficie corporal) y se obtuvieron 1120 muestras. La GH sérica
se midió usando dos métodos: Immulite 2000 (IQMA) y Cobas e 601 (EQLIA), empleando el IRP
98/574.
En la Tabla 1 se muestran las características y los parámetros analíticos de cada metodología
evaluada. Se calculó sensibilidad analítica, sensibilidad funcional y coeficiente de variación
interensayo (CV%). El CV% se obtuvo de un pool de sueros con valores en un rango de
concentración basado en el límite de corte establecido previamente por IQMA.
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TABLA 1: Características y parámetros analíticos de los métodos comerciales utilizados para la determinación de
GH.
Método
Principio del ensayo
Immulite 2000
Sensibilidad
Funcional
(ng/mL)
Sensibilidad
analítica
(ng/mL)
0,15
0,055
6,84
0,18
0,035
5,67
Ensayo inmunométrico
CV (%)
(mAc + pAc), quimioluminiscente (IQMA)
Cobas e 601
Ensayo inmunométrico
(mAc + pAc), electroquimioluminiscente
(EQLIA)
Abreviaturas: pAc, anticuerpo policlonal; mAc, anticuerpo monoclonal
Las muestras se fraccionaron una vez y las alícuotas se mantuvieron congeladas hasta el
momento de su procesamiento.
Metodología estadística
La comparación de las mediciones de GH por ECLIA e IQMA fue realizada por el análisis de
regresión lineal de acuerdo a Passing-Bablok y Bland-Altman.
Resultados
En la comparación de ambos métodos, mediante el procedimiento no paramétrico de PassingBablok, la recta obtenida fue: y= 1,08x +0,07 (Figura I). En este análisis, se obtuvo muy buena
correlación entre EQLIA e IQMA (r= 0,97 y r² =0,95).
Los parámetros de regresión y su intervalo de confianza al 95% fueron:
Pendiente: 1,08 (IC: 1,06 – 1,09)
Ordenada: 0,07 ( IC: 0,05 – 0,08)
Los intervalos de confianza establecidos para la pendiente y la ordenada muestran que se
encuentran ligeramente por encima de la recta de ordenada 0 y pendiente 1 siendo esta
discrepancia significativa (p<0.01). Debido a esto, se pudo observar que a medida que aumentó
la concentración de GH, los valores de EQLIA se encontraron ligeramente por encima de lo que
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cuantificó IQMA. Sin embargo, alrededor del punto de corte establecido previamente para IQMA
(4.70 ng/mL), la discrepancia promedio entre los métodos fue 0,43 ng/mL (9%).
Esta
estimación de la diferencia entre EQLIA e IQMA se realizó utilizando los parámetros generados
durante el procedimiento Passing-Bablok.
FIGURA I: Recta de regresión obtenida por Passing-Bablok
Recta de regresión (línea solida) y región de confianza al 95% (sombreado alrededor de la recta de regresión). La
recta punteada corresponde a la recta con ordenada 0 y pendiente 1.
La Figura II muestra el gráfico de Bland-Altman en el que se observa la relación entre la
diferencia de las determinaciones de GH medidas por EQLIA e IQMA. Este análisis mostró un
incremento en la variabilidad entre las mediciones realizadas por ambos métodos en función de
7
la concentración de GH, observando que a valores más elevados, las discrepancias entre
ECLIA e ICMA serían mayores, aunque no visiblemente sistemáticas.
FIGURA II: Diagrama de Bland-Altman
Diferencia de las determinaciones de GH con EQLIA e IQMA. La recta horizontal sólida indica el cero de la escala de
diferencia, las rectas horizontales segmentadas se encuentran a 1,96 SD. La recta punteada, ligeramente por encima
de cero, es la mediana de la diferencia entre EQLIA e IQMA.
Discusión
Diferencias en la estandarización así como en el diseño de los inmunoensayos conducen a
resultados no comparables de GH (3,5,8,9,25,29,30). En este estudio se realizó una
comparación metodológica entre EQLIA e IQMA. Las concentraciones de GH medidas por
ambos métodos correlacionaron ampliamente de manera similar a lo encontrado por otros
autores para Immulite 2000 (IQMA) y Cobas e 411 (EQLIA) (30,31).
8
Van Helden J y col, evaluaron el desempeño para Elecsys y realizaron una comparación
metodológica con Immulite observándose una alta correlación pero con un desvío de la recta
1,0 levemente mayor al 10% (9). En nuestro estudio, se establecieron los intervalos de
confianza para los parámetros de regresión, y se observó que la discrepancia de la pendiente y
la ordenada calculada con respecto a la recta de ordenada 0 y pendiente 1 fue estadísticamente
significativa (p<0.01). El hecho de que exista una discrepancia significativa no indicaría cuán
importante es la misma. Sin embargo, se pudo observar que alrededor del punto de corte
establecido previamente para IQMA (4.70 ng/mL), la discrepancia promedio entre ECLIA e
ICMA fue pequeña (9%).
Debido a que la pendiente obtenida fue ligeramente mayor a 1, se esperaría que las diferencias
entre los valores de GH medidos por EQLIA e ICMA sean mayores a medida que aumenta la
concentración de GH promedio entre ambos métodos; sin embargo, este comportamiento no se
visualiza con facilidad en el gráfico de Bland-Altman .
Un estudio colaborativo de diferentes centros de España también obtuvo diferencias
estadísticamente significativas entre los métodos Immulite 2000 (IQMA) y Cobas e 411(EQLIA);
los autores sugieren que esta diferencia se debe al tipo de anticuerpo utilizado en el diseño de
cada método (31).
Como se ha descripto, existen discrepancias en la cuantificación de GH debido a las isoformas
que cada método detecta (8,9,15,29). En la información brindada por los fabricantes, Immulite
no especifica la isoforma de GH que reconocen los anticuerpos empleados y Cobas e 601 mide
las isoformas de GH 20 kDa y 22 kDa (32). Sin embargo, el último consenso recomienda que
los ensayos de GH sean específicos para determinar la isoforma 22kDa (17). Por otra parte,
existen factores relacionados con la muestra individual analizada, principalmente la abundancia
relativa de isoformas de GH presentes en la muestra respectiva (11,15).
9
Otro factor que produce discrepancias entre métodos es la presencia de GHBPs. Distintas
concentraciones de GHBP en las muestras pueden modificar los valores de GH medidos por los
inmunoensayos (8,30,33,34).
En ausencia de un método patrón para el establecimiento del valor de corte de GH en los TF, la
interpretación de los resultados sigue dependiendo de valores de corte arbitrarios (13,22,27,34).
Estos valores de corte determinados mediante distintas técnicas de inmunoensayo fueron
cambiando considerablemente en los últimos años. (3,15).
Chaler y col. reevaluaron el punto de corte de GH para los TF de GH de 6,10 ng/mL
determinado mediante un ensayo calibrado frente al IRP 80/505 y lo establecieron en 4,70
ng/mL utilizando el mismo inmunoensayo calibrado frente al IRP 98/574 (26). En esta línea, las
publicaciones más recientes sostienen disminuir el punto de corte para los TF de GH y situarlo
entre 4 -7 ng/mL (4,26). Actualmente en nuestro medio no se ha establecido un valor de corte
para el inmunoensayo EQLIA empleando IRP 98/ 574. Si bien se puede observar que se ha
logrado homogeneizar algunos de los factores responsables de las discrepancias entre
métodos, y a pesar de que ECLIA obtuvo muy buena correlación con IQMA, sería necesario
establecer el nivel de corte de GH por EQLIA.
Coincidimos con la opinión de otros autores, quienes han establecido que la utilización de un
único calibrador IRP 98/574 ha mejorado la posibilidad de comparar los métodos para
determinar GH (4,12,13,26). Sin embargo, las mediciones de GH post TF todavía dependen del
método empleado, lo que limita la aplicabilidad de lineamientos provenientes de consensos
internacionales en la práctica clínica (17).
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Bibliografía
1- Kyriaki S. Alatzoglou, Emma Alice Webb, Paul Le Tissier, and Mehul T Dattani. Isolated
Growth Hormone Deficiency (GHD) in Childhood and Adolescence: Recent Advances.
Endocr Rev 2014; 35(3):376–432.
2- Chaler EA, Rivarola MA, Guercio B, Ciaccio M, Costanzo, Travaglino P, et al. Differences in
serum GH cut-off values for pharmacological tests of GH secretion depend on the serum GH
method. Horm Res 2006;66:231–5.
3- Martin Bidlingmaier, Christian J. Strasburger. What Endocrinologists Should Know About
Growth Hormone Measurements? Endocrinol Metab Clin North Am 2007;36(1): 101–108.
4- Granada Ybern ML, Gómez Gómez C, Moreno Flores F, Audí Parera L. Problemática de las
determinaciones hormonales del eje GH-IGF. Rev Esp Endocrinol Pediatr 2013; 4 (Suppl).
5- Sheppard MC. Growth hormone assay standardization: an important clinical advance. Clin
Endocrinol. 2007;66(2):157-61.
6- Rogol AD, Hayden GF. Etiologies and early diagnosis of short stature and growth failure in
children and adolescents. J Pediatr. 2014;164 (5 Suppl):S1-14.
7-
Barrett
J, Maranda
L,
Nwosu
BU.
The Relationship between Subnormal Peak
Stimulated Growth Hormone Levels and Auxological Characteristics
in Obese Children.
Front Endocrinol. 2014;25(5):35.
8- Junnila RK, Strasburger CJ, Bidlingmaier M. Pitfalls of Insulin-like Growth Factor-I and
Growth Hormone Assays. Endocrinol Metab Clin North Am. 2015;44(1):27-34.
9- Van Helden J, Hermsen D, Von Ahsen N, Bidlingmaier M. Performance evaluation of a fully
automated immunoassay for the detection of human growth hormone on the Elecsys
immunoassay system. Clin Lab. 2014;60(10):1641-51.
10- Silvano L, Franchioni L, Martín S, Sobrero G, Boyanovsky A, Testa G, Rodríguez E, Miras
M. Diagnosis of Growth Hormone Deficiency (GHD) in children. Comparative study of
11
different Immunoassays for GH determination. Supplement: Pediatric Research. June 2001Vol 49 n* 6 part 2 to 2 (Abstract).
11- Bidlingmaier M, Strasburger CJ. Growth hormone assays: current methodologies and their
limitations. Pituitary. 2007; 10 (2):115–119.
12- Meazza C, Albertini R, Pagani S, Sessa N, Laarej K, Falcone R, Bozzola E, Calcaterra
V, Bozzola
M.
Diagnosis of growth
hormone deficiency is affected by calibrators used
in GH immunoassays. Horm Metab Res. 2012;44(12):900-3.
13- Müller A, Scholz M, Blankenstein O, et al. Harmonization of growth hormone measurements
with different immunoassays by data adjustment. Clin Chem Lab Med. 2011;49(7):1135-42.
14- Jansson C, Boguszewski C, Rosberg S, Carlsson L, Albertsson-Wikland K. Growth hormone
(GH) assays: influence of standard preparations, GH isoforms, assay characteristics, and
GH-binding protein. Clin Chem. 1997;43:950-6.
15- Bidlingmaier M, Freda PU. Measurement of human growth hormone by immunoassays:
current status, unsolved problems and clinical consequences. Growth Horm IGF Res 2010;
20(1):19-25.
16- Trainer, P.J., Barth, J., Sturgeon, C. & Wieringa, G. Consensus statement on the
standardization of GH assays. Eur J Endocrinol. 2006; 155, 1–2.
17- Clemmons DR, Consensus statement on the standardization of growth hormone and insulin
like growth factor assays. Clin Chem 2011;57:555-9.
18- Hawkes CP, Grimberg A. Measuring growth hormone and insulin-like growth factorI in infants: what is normal?. Pediatr Endocrinol Rev. 2013;11(2):126-46.
19- GH Research Society. Consensus guidelines for the diagnosis and treatment of growth
hormone (GH) deficiency in childhood and adolescence: summary statement of the GH
Research Society. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:3990-3.
20- Bidlingmaier M. Problems with GH assays and strategies toward standardization. Eur J
Endocrinol. 2008;159 (1):41-4.
12
21- Chaler
E, Belgorosky
A, Maceiras
M, Mendioroz
M, Rivarola
MA.
Between-
assay differences in serum growth hormone (GH) measurements: importance in
the diagnosis of GH deficiency in childhood. Clin Chem. 2001;47(9):1735-8.
22- Stanley T. Diagnosis of growth hormone deficiency in childhood. Curr Opin Endocrinol
Diabetes Obes. 2012;19(1):47-52.
23- Savage MO, Burren CP, Rosenfeld RG. The continuum of growth hormone-IGF-I axis
defects
causing
short
stature:
diagnostic
and
therapeutic
challenges.
Clin
Endocrinol. 2010;72(6):721-8.
24- Hauffa
BP, Lehmann
N, Bettendorf
M, Mehls
O, Dörr
HG, Partsch
CJ, Schwarz
HP, Stahnke N, Steinkamp H, Said E, Sander S, Ranke MB; German KIGS/IGLU Study
Group. Central reassessment of GH concentrations measured at local treatment centers in
children
with
impaired
growth:
consequences
for
patient
management.
Eur
J
Endocrinol. 2004;150(3):291-7.
25- Wieringa GE, Trainer PJ. Commentary: Harmonizing growth hormone measurements:
learning lessons for the future. J Clin Endocrinol Metab. 2007; 92(8):2874-5.
26- Chaler
EA, Ballerini
MA, Belgorosky
Ga, Lazzati
A, Ropelato
G.
JM, Maceiras
Cut
M, Frusti
M, Bergada
I, Rivarola
off values of serum growth hormone (GH)
in
pharmacological stimulation tests (PhT) evaluated in short-statured children using a
chemiluminiscent immunometric assay (ICMA) calibrated with the International Recombinant
Human GH Standard 98/574. Clin Chem Lab Med. 2013; 51(5): 95-7.
27- Binder G, Huller E, Blumenstock G, Schweizer R. Auxology-based cut-off values for
biochemical testing of GH secretion in childhood. Growth Horm IGF Res. 2011;21(4):212-8.
28- Gonçalves JP, Correia F, Cardoso H, Borges T, Oliveira MJ. Provocative tests in the
diagnosis of childhood onset growth hormone insufficiency. Acta Med Port. 2014;27(5):58792.
13
29- Ross HA, Lentjes EW, Menheere PM, Sweep CG; Endocrinology Section and project group
“Calibration 2000” of the SKML (Dutch Foundation for Quality Assessment in Clinical
Laboratories). Harmonization of growth hormone measurement results: the empirical
approach. Clin Chim Acta. 2014 May 15;432:72-6.
30- Boulo S, Hanisch
K, Bidlingmaier
M, Arsene
CG, Panteghini
M, Auclair
G, Sturgeon
C, Schimmel H, Zegers I. Gaps in the traceability chain of human growth hormone
measurements. Clin Chem. 2013; 59(7):1074-82.
31- Product Information. Human growth hormone. Elecsys and cobas e analyzers. Elecsys hGH
Immunoassay. Edition: 2011, Roche Diagnostics.
32- Mauri M, Casamitjana R, Jaen M, Alfayate R, Bastande N, Cardona J , Granada ML.
Comparación de cuatro métodos automatizados para la determinación de somatotropina
(GH) después de la unificación de la estandarización. V Congreso Nacional del Laboratorio
Clínico 9-11 de Noviembre de 2011, Málaga.
33- Wieringa
GE, Sturgeon
CM, Trainer
PJ.
The
harmonisation
of
growth
hormone
measurements: taking the next steps. Clin Chim Acta. 2014; 15(432):68-71.
34- Strasburger CJ, Bidlingmaier M. How robust are laboratory measures of growth hormone
status? Horm Res. 2005;64(2):1-5.
14