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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE
PRODUCTOS BIÓTICOS
DEPARTAMENTO DE DESARROLLO TECNOLÓGICO
Estudios estructurales y moleculares del almidón de fuentes no
convencionales: mango (Mangifera indica L.), plátano (Musa
paradisíaca) y okenia (Okenia hypogaea)
Tesis que presenta:
I.B.Q CLAUDIA EDITH MILLÁN TESTA
Para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Desarrollo de Productos
Bióticos
DIRECTOR: DR. LUIS ARTURO BELLO PÉREZ
Yautepec, Morelos 2004
Este
trabajo fue realizado en el Laboratorio de Control de Calidad del
Departamento de Desarrollo Tecnológico del Centro de Desarrollo de Productos
Bióticos, en el Laboratorio de Investigación del Instituto Tecnológico de Acapulco
y el Departamento de Ciencias de Alimentos de la Universidad de Nottingham
Campus en Sutton Bonington, Inglaterra, bajo la dirección del Dr. Luis Arturo
Bello Pérez.
El trabajo de investigación se realizó gracias al apoyo económico otorgado por
CONACYT y por el Programa Institucional de Formación de Investigadores
(PIFI).
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
COORDINACIÓN GENERAL DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
CARTA CESIÓN DE DERECHOS
En la Ciudad de Yautepec, Morelos el día 29 del mes de Julio del año 2004, el que
suscribe IBQ. Claudia Edith Millán Testa alumna del Programa de MAESTRÍA EN
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS con número de registro B021745, adscrita al
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, manifiesta que es autora intelectual del presente
trabajo de Tesis bajo la dirección del Dr. Luis Arturo Bello Pérez y cede los derechos del
trabajo intitulado“Estudios estructurales y moleculares del almidón de fuentes no
convencionales: mango (Mangifera indica L.), plátano (Musa paradisiaca) y okenia (Okenia
hypogaea)” al Instituto Politécnico Nacional para su difusión, con fines académicos y de
investigación.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos
del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser obtenido
escribiendo a la siguiente dirección: Carretera Yautepec-Jojutla, Km. 8.5, Col. San Isidro,
Apartado Postal 24, 62731 Yautepec, Morelos, México. Fax: 01 (55) 57296000 ext. 82512.
Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente
del mismo.
Agradecimientos
Dr. Luis Arturo Bello, por su generosidad al brindarme la oportunidad de recurrir a su
capacidad y experiencia científica en un marco de confianza y apoyo fundamentales para la
concreción de este trabajo.
Dra. Martha Lucia Arenas Ocampo, por su apoyo
consejera de estudios durante estos dos años.
y
por
ser
Dr. Octavio Paredes López, Dr. Javier Solorza Feria y al M. C.
Francisco J. Gracia Suárez, por sus sabios comentarios y
sugerencias para realizar este trabajo.
M. C. Guadalupe Méndez Montealvo, por darme su apoyo para realizar este trabajo y sobre
todo por su amistad incondicional.
Al Departamento de Desarrollo Tecnológico, por otorgarme las facilidades para realizar este
trabajo.
A mis compañeros de maestría por su amistad: Laura, Mirna, Fernando, Juan Pablo, Andrés,
Nelly, Paul, Polo, Alex Mora, Alex.
Dr. Imad Farhat y Marie-Astrid Ottenhof del Departamento de Ciencias de Alimentos de
la Universidad de Nottingham Campus en Sutton Bonington, Inglaterra, por su apoyo para
realizar mis experimentos.
Glenis Ortega McEwen, Presidenta de Glen-Tech Services, por asesoría y sabios conocimientos
brindados.
CONACYT y el Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) por el apoyo
financiero otorgado para realizar este trabajo de investigación.
Dedicatoria
A Dios y a la Virgen de Guadalupe, por darme la fuerza y seguridad necesaria.
A mis padres, que me han dado todo lo que ellos no tuvieron, que me hayan enseñado a guiarme
con el corazón y mente, los dos son increíbles.
A mis hermanos, por darme su confianza, cariño y apoyo durante tanto tiempo.
A mi tío Eladio, tía Bety y a mis primos Armando y Marco, por estar siempre apoyándome en
los buenos y malos momentos.
A Omar, por su comprensión, cariño y confianza, brindado todo este tiempo que tenemos
juntos.
A mis amigos del alma que siempre han estado conmigo y me han enseñado el significado de la
verdadera amistad: Sergio, Erika, July, Lupita, Roselis, Edith, Carlos, Vivian, Chris,
Suwanna.
Contenido
CONTENIDO
Pág.
RESUMEN
1
ABSTRACT
3
I
INTRODUCCIÓN
5
II
ANTECEDENTES
6
2.1 Almidón
6
2.1.1 Composición química del almidón
8
2.1.1.1 Amilosa
8
2.1.1.2 Amilopectina
8
2.1.1.2.1 Modelos estructurales
2.1.1.3 Amilosa y amilopectina en el gránulo
10
11
2.2 Cristalinidad del almidón
15
2.3 Relación estructura-función del almidón
18
2.4 Solubilización: una medida importante para la caracterización estructural
de los almidones
2.5 Sistemas utilizados para la caracterización estructural de los almidones
20
22
2.5.1 Cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por
tamaño (CLARET)
2.5.2 Detector de dispersión de luz en forma estática (DLE)
2.5.2.1 Modo por lote (obtención de diagramas de Zimm)
2.5.3 Detector de índice de refracción (IR)
22
22
23
23
2.5.4 Combinación de cromatografía (CLARET) con los detectores de
dispersión de luz en forma estática (DLE) e índice de refracción
(IR)
25
Contenido
2.5.4.1 Aplicaciones de cromatografía de permeación por geles
(CPG) y cromatografía de líquido de alta resolución de
exclusión por tamaño (CLARET) en almidones
2.6 Técnicas utilizadas para la caracterización molecular de los almidones
2.6.1 Espectroscopía de infrarrojo
2.6.1.1 Uso de espectroscopia de infrarrojo
2.6.2 Difracción de rayos-X
25
26
26
28
28
2.6.2.1 Método de Hermans y Weidinger (Cálculo para obtener el
porcentaje de cristalinidad)
30
2.7 Método térmico: calorimetría diferencial de barrido (CDB)
33
III
JUSTIFICACIÓN
35
IV
OBJETIVOS
36
4.1 Objetivo General
36
4.2 Objetivos Específicos
36
MATERIALES Y MÉTODOS
37
5.1 Materiales
37
V
5.1.1 Materia prima
37
5.1.2 Reactivos
37
5.2 Métodos
37
5.2.1 Aislamiento del almidón de mango y plátano
37
5.2.2 Aislamiento del almidón de okenia
38
5.2.3 Composición química
39
5.2.4 Estudios microscópicos del almidón
39
5.2.4.1 Microscopía electrónica de barrido
39
5.2.4.2 Microscopía de luz polarizada
40
5.2.5 Estudios moleculares del almidón
5.2.6
40
5.2.5.1 Espectroscopía de infrarrojo
40
5.2.5.2 Difracción de rayos-X
41
Estudios estructurales del almidón
5.2.6.1 Tratamiento con dimetilsulfóxido
41
41
Contenido
5.2.6.2 Solubilización en agua
41
5.2.6.3 Determinación de carbohidratos totales
42
5.2.6.4 Determinación de masa molar y radio de giro promedio
(Detector de dispersión de luz en forma estática (DLE))
5.2.7 Calorimetría diferencial de barrido (CDB)
VI
42
43
5.3 Análisis estadístico
44
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
45
6.1 Composición química
45
6.2 Estudios microscópicos del almidón
47
6.2.1 Microscopía electrónica de barrido
47
6.2.2 Microscopía de luz polarizada
49
6.3 Estudios moleculares del almidón
49
6.3.1 Espectroscopía de infrarrojo
49
6.3.2 Difracción de rayos-X
52
6.4 Estudios estructurales del almidón
54
6.4.1 Determinación de masa molar y radio de giro promedio (Detector
de dispersión de luz en forma estática (DLE))
54
6.4.1.1 Teoría de fractales
59
6.5 Perfíl calorimétrico del almidón
65
VII
CONCLUSIONES
69
VIII
PERSPECTIVAS
70
IX
BIBLIOGRAFÍA
71
Lista de cuadros
LISTA DE CUADROS
No.
Pág.
1
Características de los gránulos del almidón de diferentes fuentes botánicas.
2
Porcentaje de cristalinidad en almidones de diferentes fuentes botánicas,
utilizando difracción de rayos-X.
3
7
16
Aplicaciones de cromatografía de permeación por geles (CPG) y
cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por tamaño
(CLARET) para estudios estructurales del almidón.
27
4
Composición química de los almidones de fuentes no convencionales.
46
5
Masa molar (MM) y radio de giro (RG) de almidones de fuentes no
6
convencionales.
55
Dimensiones de fractales (df y d´f) para los almidones de fuentes no
61
convencionales
7
Propiedades térmicas de almidones de fuentes no convencionales.
67
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
No.
1
2
Pág.
Estructura química de los componentes del almidón.
9
Diagrama de la estructura molecular de la amilopectina propuesto por (1)
Haworth, (2) Staudinger, (3) Meyer y (4) Robin.
12
3
Estructura del gránulo de almidón a diferentes niveles de organización.
13
4
5
Patrones de difracción rayos-X de almidones tipo -A, -B y -C.
Representación esquemática del diagrama de Zimm.
17
6
Celda de muestreo de espectroscopía de infrarrojo.
29
23
Diagrama esquemático, mostrando el origen del: a) patrón de difracción de
7
rayos-X obtenido para muestras amorfas b) el pico obtenido para muestras
31
cristalinas.
8
9
10
11
12
13
14
15
Difractograma de rayos-X para almidón de trigo, mostrando la difracción
cristalina de la muestra (color blanco) y la región amorfa (sombreado).
32
Representación esquemática de un sistema de calorimetría diferencial de
barrido (CDB).
34
Microscopía electrónica de barrido: a) Almidón de plátano; b) Almidón de
mango; c) Almidón de okenia.
48
Microscopía de luz polarizada: a) Almidón de plátano; b) Almidón de
mango; c) Almidón de okenia.
50
Espectros en el infrarrojo medio después de la deconvulación para
almidones de fuentes no convencionales.
51
Difractogramas de los almidones de fuentes no convencionales.
53
Diagrama de Zimm del almidón de plátano con un tiempo de calentamiento
de 40 s.
56
Diagrama de Zimm del almidón de mango con un tiempo de calentamiento
de 40 s.
57
Lista de figuras
16
Diagrama de Zimm del almidón de okenia con un tiempo de calentamiento 58
de 40 s.
17
18
19
20
Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de okenia
disuelto a diferentes tiempos.
62
Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de mango
disuelto a diferentes tiempos.
63
Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de plátano
disuelto a diferentes tiempos.
64
Gráfica doble logarítmica del factor de la partícula dispersada vs. el vector
dispersado normalizado del almidón de mango disuelto a 60 s.
66
Abreviaturas
ABREVIATURAS
Å
amstrom
CDB
calorimetría diferencial de barrido
cm
centímetro
CLARET
cromatografía de líquido de alta resolución por exclusión de tamaño
CPG
cromatografía de permeación por geles
°C
grado centígrado
Da
dalton
df
dimensión fractal
DMSO
dimetilsulfóxido
DLE
detector de dispersión de luz en forma estática
∆H
entalpía
h
hora
g
gramo
GP
grado de polimerización
g/mol
gramo por mol
gn
gravedad
J/g
joule por gramo
KV
kilovolt
MM
masa molar
M
molaridad
mA
miliamper
µm
micra
mg
miligramo
mL
mililitro
µL
microlitro
min
minuto
nm
nanómetro
α
nivel de significancía
Abreviaturas
RG
radio de giro
r.p.m
revoluciones por minuto
s
Segundo
pH
potencial de hidrogeno
Tp
temperatura de pico ó gelatinización
v/v
volumen/volumen
W
watt
Resumen
RESUMEN
El almidón es un carbohidrato importante a nivel mundial, debido a que en los últimos años ha
cobrado gran interés por su amplio uso en la industria de alimentos, agroquímica y farmacéutica,
entre otras. Actualmente existe la necesidad de buscar fuentes alternativas (plátano, mango y okenia)
para la obtención de dicho polisacárido. Es importante conocer las características estructurales y
moleculares, ya que esto servirá para sugerir las posibles aplicaciones. El objetivo del presente
trabajo fue determinar las características moleculares y estructurales del almidón de plátano (Musa
paradisiaca), mango (Mangifera indica L.) y okenia (Okenia hypogaea). Se realizó la
caracterización química, microscópica, estructural, molecular, así como también su perfil
calorimétrico. En la composición química, los almidones de fuentes no convencionales presentaron
valores altos de proteínas y lípidos al compararlos con el de maíz, reportado en otro estudio, estas
diferencias posiblemente se debieron al origen botánico y al método de aislamiento utilizado. En lo
que respecta a la microscopía electrónica de barrido, los almidones de plátano, mango y okenia
mostraron formas ovoides como el almidón de plátano y esféricas que es el caso de los almidones de
mango y okenia, el almidón de plátano presentó un tamaño de gránulo en un intervalo de 10-40 µm,
mango de 5-10 µm y en okenia de 1-3 µm. En cuanto a los estudios de microscopía de luz
polarizada, en los tres almidones se observó la cruz de malta, lo que indica una organización
estructural de los componentes del almidón dentro del gránulo. Con respecto a los estudios de
difracción de rayos-X, los almidones de mango y okenia presentaron un patrón tipo -A y el almidón
de plátano un patrón tipo -C. En los estudios de espectroscopía de infrarrojo, los almidones
presentaron un alto nivel de organización de la región cristalina dentro del gránulo relacionándolo
con la posible resistencia a un ataque enzimático. En los estudios estructurales de los almidones
(plátano, mango y okenia), se utilizó un sistema por lote y fueron disueltos en agua a diferentes
tiempos de calentamiento (40, 50, 60 y 70 s) en un horno de microondas, la masa molar (MM) y radio
de giro (RG) disminuyeron cuando incrementó el tiempo de calentamiento.
1
Resumen
Haciendo un análisis con la teoría
de
fractales, se encontró que los almidones presentaron
estructuras ramificadas al azar (almidón de okenia y mango) y globulares (almidón de plátano), esto
demuestra diferencias estructurales en los almidones. El almidón de plátano presentó una
temperatura de gelatinización más alta que los almidones de mango y okenia, esto puede ser
atribuido al tamaño de gránulo así como también a la longitud de las cadenas de la molécula de
amilopectina. En el caso de la entalpía, los almidones de plátano y mango presentaron valores más
altos (23.43 y 21.19 J/g, respectivamente) comparados con el almidón de okenia (15.02 J/g). Los
estudios moleculares y estructurales mostraron diferencias entre los almidones de diferentes fuentes
botánicas, lo cual puede repercutir en sus propiedades funcionales.
2
Abstract
Abstract
Starch is a world-wide important carbohydrate, because in the last years, its use has been extended
in diverse industries such as foods, agrochemicals and pharmaceuticals, etc. Nowadays, it is
necessary to look for alternative sources (e.g. banana, mango, okenia) for obtaining this
polysaccharide. It is very important to know the structural and molecular characteristics of
starches, since this will help to suggest its possible applications. The objective of this work was to
determine the molecular and structural characteristics of banana (Musa paradisiaca), mango
(Mangifera indica L.) and okenia (Okenia hypogaea) starches. The chemical, microscopic,
structural and molecular characterization was performed along with its calorimetric profile. In the
chemical composition, the starches from non-conventional sources presented high values of
proteins and lipids when comparing them with that of corn, reported in a previous study, these
differences were possibly due to the botanical origin and the isolation method. Scanning electron
microscopy of banana, mango and okenia starches, showed ovoid and spherical forms, banana
starch presented a granule size in an interval of 10-40 µm, mango starch of 5-10 µm and okenia
starch of 1-3 µm. Respect to the study of polarized light microscopy in the three starches, the
maltese cross was observed, indicating that the starch isolation method used, produced intact
granules. Mango and okenia starches presented an A-type X-ray diffraction pattern and the
banana starch a C-type X-ray diffraction pattern. In the studies of infrared spectroscopy, the
starches presented a high level of organization of the crystalline region inside the starch granule,
related with the possible resistance to enzymatic hydrolysis. Static light scattering was used for
the structural study of the starches (banana, mango and okenia).The samples were dissolved in
water at different heating times (40, 50, 60 and 70 s) in a microwave oven, the molar mass (MM)
and radii of gyration (RG), decreased as the heating time increased. Making a fractal theory (df)
analysis, it was found that the studied starches showed characteristics of globular structures
(mango and okenia starches) and branching structure (banana starch), this suggest structural
differences among the three starches.
3
Abstract
The banana starch showed a higher gelatinización temperature, than those of mango and okenia
starches, this can be related with its X-ray diffraction pattern (type -C), since it has been reported
that the crystallinity levels and the diffraction pattern, are attributed to the granule size, as well as
the chain lengths in thfe amylopectin molecule. In the case of the gelatinization enthalpy, the
banana and mango starches presented higher values (23.43 and 21.19 J/g, respectively) than
okenia starch (15.02 J/g). The molecular and structural studies, showed differences among the
starches from different botanical sources, which can affect their functional properties.
4
I. Introducción
I. INTRODUCCIÓN
El almidón es el principal carbohidrato de reserva sintetizado por las plantas superiores,
constituyendo una fuente de energía para muchos organismos, principalmente el hombre
(Buleon y col., 1998). Químicamente, el almidón consiste de dos polímeros la amilosa y la
amilopectina, la organización física de estos dos polímeros dentro de la estructura granular,
influye en las propiedades fisicoquímicas y funcionales de los almidones (Bello-Pérez y col.,
2002). Es muy importante conocer las características estructurales de los almidones, con la
finalidad de dar alguna aplicación a estos polímeros en diversos sistemas.
Las características estructurales (masa molar, tamaño de la partícula, grado de
ramificación, entre otras) influyen en las propiedades funcionales de los almidones, como fue
demostrado en geles (Clark y col., 1989) y pastas de almidón (Doublier y col., 1986). Hay por
lo tanto una necesidad de tener una técnica reproducible para medir estas características.
Recientes avances en instrumentación, han inspirado numerosos reportes acerca de la
estructura y propiedades de los almidones nativos, sin degradación de sus componentes, lo cual
ha sido estudiado por cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por tamaño
(CLARET) (Takeda y col., 1993), acoplado a un detector de múltiples ángulos y un detector de
índice de refracción (Fishman y col., 1996; Bello-Pérez y col., 1998a; Yoo y Jane, 2002;
Rolland-Sabaté y col., 2003). Un pre-requisito para determinar la distribución de masa molar de
amilosa y amilopectina por estas técnicas, es una completa disolución de la muestra de almidón
en un disolvente apropiado, sin degradación de la macromolécula.
Técnicas como la difracción de rayos-X, permiten conocer los niveles de cristalinidad
de los almidones por el orden de las cadenas de la amilopectina. La espectroscopía de infrarrojo,
es utilizada para poder conocer el orden estructural en su región externa, para así saber el grado
de organización en el gránulo y explicar su resistencia a los ataques enzimáticos. Técnicas
destructivas como la calorimetría diferencial de barrido (CDB), se utilizan para conocer las
transiciones de fase que se llevan a cabo en un material después de haberse sometido a un
calentamiento programado.
5
II. Antecedentes
II. ANTECEDENTES
2.1 ALMIDÓN
El almidón representa una fracción importante en un gran número de productos agrícolas
como los cereales (maíz, trigo, arroz) cuyo contenido va del 30 a 80%, las leguminosas (fríjol,
chícharo, haba) con un 25 a 50% y los tubérculos (papa, yuca) en los que representa un 60 a
90% de la materia seca (Guilbot y Mercier, 1985).
El almidón esta organizado en partículas discretas conocidas como gránulos, cuya
morfología, composición química y estructura supermolecular (arreglo relativo de las
macromoléculas en el estado sólido), son características en cada especie. Los gránulos de
almidón pueden reconocerse por su forma, posición del hilio (punto a partir del cual ocurre el
crecimiento del gránulo) y tamaño, el cual varía en un 0.5 y 100 µm, dependiendo de la fuente
botánica (Cuadro 1) (Guilbot y Mercier, 1985).
Los gránulos de almidón cuando se extraen y se secan, tienen la apariencia de un polvo
blanco y son insolubles en agua fría. En forma general, presentan una composición química con
0.045-0.06% de proteína, 0.05-0.8% de lípidos y 0.07-1.4% de cenizas (Guilbot y Mercier,
1985). Estos constituyentes en muchas ocasiones juegan un papel importante en las propiedades
funcionales del almidón.
6
II. Antecedentes
Cuadro 1. Características de los gránulos de almidón de diferentes fuentes botánicas.
Fuentes
Tipo
Forma
Distribución
Tamaño (µm)
Cebada
Cereal
Lenticular
Bimodal
5-15
Maíz (ceroso y
Cereal
Esférica/poliédrica
Unimodal
2-30
Amilomaiz
Cereal
Irregular
Unimodal
2-30
Avena
Cereal
Poliédrica
Unimodal
3-10
Arroz
Cereal
Poliédrica
Unimodal
3-8
Centeno
Cereal
Lenticular/esférica
Bimodal
10-40
Sorgo
Cereal
Esférica
Unimodal
5-20
Trigo
Cereal
Lenticular
Bimodal
15-35
Chícharo
Leguminosa
Rentiforme
Unimodal
5-10
Papa
Tubérculo
Lenticular
Unimodal
5-100
normal)
Fuente: Tester y Karkalas, 2002.
7
II. Antecedentes
2.1.1 Composición química del almidón
Químicamente el almidón consiste de dos polímeros de diferente estructura, amilosa y
amilopectina. Las cantidades relativas de estos dos polímeros y su organización física dentro de
la estructura granular, le confieren propiedades fisicoquímicas y funcionales características de
los almidones (Bello-Pérez, 1995).
2.1.1.1 Amilosa
La amilosa es un polímero esencialmente lineal, formado por unidades de D-glucosa
unidos por enlaces α(1-4); sin embargo, se ha demostrado la presencia de algunas
ramificaciones las cuales estas unidas por enlaces α(1-6) (Thomas y Atwell, 1999). Dichas
ramificaciones se encuentran de manera espaciada e infrecuente, lo que permite observar que se
comporte como un polímero lineal (Lineback y Rasper, 1988) (Figura 1). Esta molécula toma
forma de hélice o de tubo con seis moléculas de glucosa por giro. La hélice tiene dimensiones
ideales para aceptar una molécula de yodo y esta interacción es responsable de la coloración
azul (Stick, 2001).
La amilosa tiene una masa molar aproximadamente de 1 x 105–1 x 106 Da con un
promedio de 500 a 6000 unidades de D-glucosa, repartidas en un número de cadenas que va de
1 a 20. Cada cadena presenta un grado de polimerización (GP) promedio de 500 (GP numero de
unidades de glucosa que se encuentran unidas en una cadena) (MacAllister, 1979).
2.1.1.2 Amilopectina
La amilopectina es el componente ramificado del almidón, esta formado por cadenas de
residuos α-D-glucopiranósidos (entre 17 y 23 unidades) unidos por enlaces α(1-4), y presenta
enlaces α(1-6) en los puntos de ramificación (Figura 1) (MacAllister, 1979).
8
II. Antecedentes
Amilosa
Amilopectina
Figura 1. Estructura química de los componentes del almidón.
Fuente: Tester y Karkalas, 2002.
9
II. Antecedentes
Se encuentra en una proporción de 70-80%, en ciertos casos alcanza niveles de hasta un
98-99% en los almidones tipo ceroso o “waxy”, todo va a depender de la fuente botánica de
almidón (Zobel, 1988); su estructura, composición y proporción en el almidón, contribuyen
notablemente en las propiedades funcionales del almidón, por esta razón, ha sido estudiada
ampliamente en términos de su tamaño molecular, ramificación y longitud de las cadenas
internas y externas (Bello-Pérez y col., 2002). La masa molar de la amilopectina varia entre 1 x
106 y 1 x 108 Da, estas variaciones dependen del origen botánico del almidón, de las
condiciones de separación de la amilosa y la amilopectina y del método usado para determinar
la masa molar (Bello-Pérez y col., 2002).
2.1.1.2.1 Modelos estructurales
El conocimiento de la estructura de la amilopectina ha progresado ampliamente, como lo
citan Guilbot y Mercier, (1985): en 1937, Haworth y col., propusieron la estructura laminada; en
el mismo año, Staundinger y Husmean, sugirieron una estructura tipo espiga, en la cual una
cadena principal contenía todas las ramificaciones, posteriormente, Meyer y Bernfeld en 1940,
propusieron un modelo con ramificaciones al azar. Todos estos modelos se basaron en análisis
químicos bien fundamentados. Myback y Sillen (1949), enfatizaron en que estos modelos
contenían diferentes arreglos de las mismas cadenas; este concepto fue desarrollado después por
Peat y col. (1952), introduciendo la terminología A, B y C, para diferenciar las cadenas.
Esta nomenclatura fue propuesta para facilitar la comparación de los modelos de la
amilopectina cuando la longitud de cada tipo de cadena se desconoce. No obstante que la
terminología de cadenas A, B y C se utiliza ampliamente, la definición de cadenas A y B es aun
inconsistente, ocasionando confusiones en la interpretación de los resultados de los análisis de
la estructura de la amilopectina. La cadena A se enlaza al resto de la molécula a través de un
extremo reductor, la cadena B esta enlazada con una cadena A pero transporta otras cadenas A
y/o B en uno o más de los grupos hidróxilos primarios; la cadena C no esta sustituida
10
II. Antecedentes
en el grupo o extremo reductor y solo existe una cadena de este tipo por molécula (Bello-Pérez
y col., 2002).
Se ha obtenido información mas detallada de la estructura de la amilopectina usando
enzimas desramificantes (pululanasa o isoamilasa), para hidrolizar selectivamente los enlaces
glucosídicos α(1-6) en los puntos de ramificación y β–amilasa combinada con pululanasa, para
obtener dextrinas β–límite. En base a este tipo de estudios, Robin y col. (1974), propusieron un
modelo para la amilopectina, basado en la estructura de racimo o grupo (“cluster”). En este
modelo (Figura 2), las cadenas A y B son lineales y tienen un GP de 15 y 45, respectivamente.
Cada racimo contiene de dos a cuatro cadenas A estrechamente asociadas, donde los racimos de
las cadenas A, son responsables de las regiones cristalinas dentro del gránulo. Las áreas
intercristalinas (amorfas) se presentan a intervalos de 0.6-0.7 nm y contienen la mayor cantidad
de enlaces α(1-6), siendo relativamente susceptibles a los agentes hidrolíticos (ácidos y
enzimas). En general, la molécula de amilopectina es de 1.0 a 1.5 nm de diámetro y de 12 a 40
nm en longitud.
2.1.1.3 Amilosa y amilopectina en el gránulo
Los gránulos de almidón están formados por regiones cristalinas y amorfas, mostrando
una “Cruz de Malta” cuando son observados bajo luz polarizada (Katz y col., 1993). Este
fenómeno es conocido como birrefringencia, el cual indica que existe un alto grado de
orientación molecular dentro del gránulo, sin referencia a ninguna forma cristalina
La región cristalina está formada por cadenas de racimos de la amilopectina mientras
que la región amorfa esta formada por puntos ramificados de la amilopectina y por la amilosa
(Zobel, 1988). La región cristalina ha sido la más estudiada y es consecuentemente la más
entendida. La estructura del gránulo del almidón y el arreglo de sus componentes en diferentes
niveles de organización (Figura 3), permite explicar las propiedades fisicoquímicas y
funcionales, así como la digestibilidad de los diferentes almidones.
11
II. Antecedentes
(1)
(2)
(3)
(4)
C
Reductor
Racimo
Enlace
α (1-6)
Figura 2. Diagrama de la estructura molecular de la amilopectina por (1) Haworth, (2)
Staundinger, (3) Meyer y (4) Robin.
Fuente: Buleon y col., 1998
12
II. Antecedentes
a)
b)
c)
d)
e)
13
II. Antecedentes
Figura 3. Estructura del gránulo de almidón a diferentes niveles de organización.
a) El gránulo de almidón muestra la alternancia cristalina y amorfa. El centro es el hilio y
las capas son hacia el exterior del gránulo.
b) Dentro de las cubiertas cristalinas y amorfas, la estructura esta asociada con canales
amorfos. La cubierta amorfa contiene compartimientos con tamaños más pequeños que
en la cubierta cristalina.
c) Diversas lamelas cristalinas y amorfas son encontradas en un bloque y la amilopectina es
mostradas en las lamelas.
d) La organización del racimo de la amilopectina con amilosa y amilosa-lípido
e) Estructura cristalina del almidón (patrones de difracción de rayos-X tipo -A y -B).
Fuente: Taewee, 2001.
14
II. Antecedentes
2.2 CRISTALINIDAD DEL ALMIDÓN
El almidón es biosintetizado como gránulo semicristalino, con variaciones de tipo
polimórficos y grados de cristalinidad (la cristalinidad de los gránulos de almidón se atribuye a
las cadenas lineales de la amilopectina conformadas en dobles hélices). El grado de cristalinidad
dentro de los gránulos de almidón se ha reportado por diversos autores, en el Cuadro 2, se
presentan las variaciones en la cristalinidad de diferentes fuentes de almidón, utilizando la
técnica de difracción de rayos-X.
Los patrones de difracción del almidón nativo son difíciles de interpretar porque
presentan cristalinidad y estructura molecular compleja; muchos modelos estructurales de
almidón fueron establecidos para amilosa recristalizada.
El almidón (principalmente las cadenas externas de la amilopectina) forma dobles
hélices, las cuales forman modelos de estructura ordenada que son entidades cristalinas,
presentando dos tipos de patrones de difracción de rayos-X: el tipo -A, tiene picos de mayor
intensidad de difracción para los ángulos 2θ = 15, y 23, este es típico de los almidones de
cereales. El tipo -B, tiene picos de mayor intensidad de difracción para los ángulos 2θ = 5.6, 15
y 24, se ha encontrado en almidones de tubérculos y altos en amilosa. Actualmente se considera
un tercer tipo (-C), que es una mezcla de los tipos -A y -B pero con más inclinación a la del tipo
-A (Figura 4) (Tester y Karkalas, 2004).
El arreglo de estas dobles hélices dentro de la estructura polimorfica tipo -A es
relativamente compacta con un bajo contenido de agua (4-6 moléculas de agua por hélice), el
polimorfismo tipo -B tiene su estructura mas abierta, por lo tanto hay mayor contenido de agua
haciéndola una hélice hidratada (36 moléculas de agua por hélice) (Pérez e Imberty, 2000).
15
II. Antecedentes
Cuadro 2. Porcentaje de cristalinidad en almidones de diferentes fuentes botánicas,
utilizando difracción de rayos-X.
Fuente
Cristalinidad
Referencia
(%)
Cheetham y Tao, 1998
Maíz
0% amilosa
42
“
28% amilosa
30
“
56% amilosa
20
“
84% amilosa
17
“
Maíz normal
43
Maíz ceroso
37-43
Paris y col., 1999
Tapioca
44
“
Papa
26
Yusuph y col., 2003
Trigo
36
“
Arroz
47-51
“
Avena
28-37
“
Lentejas
17-22
“
Chícharos
20
“
Cebada normal
20-24
Tang y col., 2002
Cebada cerosa
33-37
“
Cooke y Gidley, 1992
16
II. Antecedentes
2θ
Angulo de difracción
Figura 4. Patrones de difracción de rayos-X de almidones tipo -A, -B y -C.
Fuente: Hizukuri, 1986.
17
II. Antecedentes
2.3 RELACIÓN ESTRUCTURA-FUNCIÓN DEL ALMIDÓN
El estudio del almidón ha evolucionado, en los años 60´s se reportó que la forma y
tamaño de sus gránulos tenían un papel importante en sus propiedades funcionales; en la década
de los 70´s, se reportó que la relación amilosa/amilopectina era importante para determinar las
propiedades funcionales de los almidones, a finales de los 80´s e inicio de los 90´s, los estudios
ya estaban enfocados a conocer la longitud promedio de las cadenas de la amilopectina, la
relación de cadenas cortas/largas, el grado de ramificación, así como también se reportó que la
masa molar del almidón y de sus componentes, influyen en las propiedades funcionales (BelloPérez y col., 2002).
El modelo de grupos de la estructura de la amilopectina propuesto por Robin y col.
(1974), ha sido apoyado con estudios estructurales realizados por Hizukuri (1986); este autor
encontró que las características de distribución de las longitudes de cadenas son inconsistentes
con los modelos estructurales de Haworth, Staudinger o Meyer, pero consistente con el modelo
de grupos. La relación de cadenas A:B cuyo intervalo es de 2.6:1.0 ó 1.0:1.0, ha sido usada
como patrón para verificar o rechazar diferentes modelos estructurales de la molécula de
amilopectina (Eliasson y col., 1987).
También los estudios de difracción de rayos-X se han utilizado para conformar el
modelo de grupos y el papel de la amilopectina en la cristalinidad del almidón. El tipo de cristal
de la amilopectina depende de la masa molar promedio y la longitud de cadena: los patrones
tipo –A presentan, cadenas cortas (GP 26), largas para los tipo –B (GP 36) e intermedias (GP
28) para los tipo -C (Zobel, 1988; Biliaderis, 1991).
En otro estudio se concluyó que la longitud promedio de las cadenas de amilopectina,
depende principalmente de la longitud de la cadena del componente mayoritario, el cual
probablemente comprende cadenas tipo -B. Esos cambios regulares que se presentan en la
distribución de las longitudes de las cadenas, sugieren que un mecanismo de control fino, el cual
difiere ligeramente con las especies estudiadas, esta involucrado en la biosíntesis de la
amilopectina. Puede además concluirse que la longitud de las cadenas de la amilopectina es un
factor intrínsico que determina la estructura cristalina de los gránulos de almidón.
18
II. Antecedentes
Esta variación regular de la estructura molecular de la amilopectina, es de interés para
entender las propiedades funcionales de los almidones. (Bello-Pérez, 1995).
Estudios realizados por Yuan y col. (1993) con amilopectinas provenientes de diferentes
genotipos de maíz ceroso, encontraron que las amilopectinas que presentaban una mayor
proporción de cadenas largas, tenían mayor tendencia a retrogradar que aquellas que mostraron
una mayor proporción de cadenas cortas.
Uno de los métodos más utilizados para el estudio de la amilopectina es la filtración en
gel (Biliaderis y col., 1979) (Schweizer y col., 1986; Yin y Stack, 1988). MacGregor y Morgan
(1984) realizaron estudios estructurales de amilopectina de gránulos pequeños y grandes a partir
de cebada cerosa y cebada normal, encontrando que las amilopectinas separadas de estos
almidones, tienen estructuras diferentes. Sin embargo, los estudios estructurales de almidones
utilizando filtración en gel son lentos, por ello se han propuesto alternativas de análisis como los
que reportan Kobayashi y col. (1986), donde realizaron estudios estructurales de la amilopectina
de diferentes variedades de trigo, utilizando un sistema de cromatografía de líquidos de alta
resolución por exclusión de tamaño (CLARET), el método es efectivo porque utiliza cantidades
pequeñas de muestra, además, puede realizar los análisis en un tiempo corto.
Fishman y Hoagland (1994), propusieron un método para la preparación de los
almidones, este consiste en un calentamiento por un horno de microondas y la inyección a
través de un sistema en serie conocido como CLARET, con un detector de viscosidad y un
detector de índice de refracción; más tarde, Bello-Pérez y col. (1998a) modificaron este
procedimiento, pero ahora utilizando un sistema de CLARET con un detector de dispersión de
luz y un detector de índice de refracción, conectados en serie.
Por otro lado, Radosta y col. (2001), reportaron estudios estructurales de almidón de
papa y amilosa sintética, utilizando una solubilización en dimetilsulfóxido, encontrando
diferencias de longitud de cadena entre la amilosa de papa y la amilosa sintética. Sang-Ho y
Jay-Lin (2002), realizaron estudios estructurales de amilopectinas de maíz normal y maíz
ceroso, reportando diferencias de masa molar y radio de giro entre ellas, debido a las estructuras
ramificadas y a la longitud de las cadenas.
19
II. Antecedentes
En los últimos años, se ha podido determinar con buena aproximación la estructura
interna de los componentes del almidón por medio de la teoría de fractales, de tal manera que
dependiendo de la degradación de los componentes del almidón se ha establecido que la
amilopectina puede tener en solución desde una forma esférica hasta la conformación de
cadenas enrolladas al azar (Bello-Pérez y col., 1998b).
2.4
SOLUBILIZACIÓN: UNA MEDIDA IMPORTANTE PARA LA
CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS ALMIDONES
El primer paso para determinar la estructura molecular del almidón por alguna técnica,
es la disolución de la muestra en un disolvente apropiado, sin una degradación significativa de
sus componentes. Diversos disolventes han sido propuestos para almidones como: NaOH 1M
(Hizukuri, 1981), KOH 0.1M (Roger y Colonna, 1993), DMAc/LiCl (Politz y col., 1994) y
DMSO (Hizukuri, 1985; Bello-Pérez y col., 1998 a, b).
El dimetilsulfóxido (DMSO): (CH3-SO-CH3) Es el disolvente más utilizado para
solubilizar los almidones. Leach y Schoch (1962) estudiaron la solubilidad del gránulo de
almidón en DMSO, la cual fue determinada por medidas de pesos de almidón precipitado por
etanol, para obtener un sobrenadante después de centrifugar.
Los almidones presentan diferencias en la velocidad de solubilización en DMSO,
reflejando diferentes enlazamientos moleculares dentro del gránulo. Sahai y Jackson (1996)
estudiaron la estructura y propiedades químicas de almidones nativos usando DMSO al 90%
como disolvente. La “solubilidad aparente” de los almidones fue medida como el área bajo el
pico del cromatograma de la amilosa y la amilopectina, y se obtuvo la relación de amilosa y
amilopectina. Ellos reportaron que el tamaño del gránulo no influye en la solubilidad del
almidón en DMSO. French (1984) concluyó que DMSO solubiliza al almidón por ser un buen
aceptor de enlaces de hidrógeno, rompiendo los enlaces de hidrógeno almidón-almidón y aguaalmidón.
20
II. Antecedentes
El DMSO es un disolvente eficiente para la amilosa y puede enlazarse perfectamente a la
amilosa en el gránulo de almidón. La amilosa que rodea al gránulo formando un complejo
amilosa-DMSO que obstruye la superficie del gránulo contra la penetración del DMSO al
gránulo. Por lo tanto, es importante mezclar el DMSO después de agregarlo, para producir una
rápida dispersión y el transporte de amilosa solubilizada a la superficie del gránulo y
consecuentemente, solubilizar el gránulo de almidón (Sahai y Jackson, 1996).
El DMSO es ampliamente usado como el disolvente del almidón para estudios
moleculares; sin embargo en sistemas de alimentos el DMSO es tóxico, por lo tanto algunos
autores han desarrollado métodos para solubilizar el almidón en agua. (Jackson y col., 1989;
Jackson, 1991; Fishman y Hoagland, 1994; Bello-Pérez y col., 1998b).
Fishman y Hoagland (1994) propusieron procedimiento para la caracterización de los
almidones, el cual consiste en un calentamiento en un horno de microondas por 90s, ellos
reportaron variaciones en los parámetros de masa molar y radio de giro, dependiendo del
contenido de amilosa y amilopectina. Posteriormente Bello-Pérez y col. (1998a), modificaron
este procedimiento, donde se utiliza un pretratamiento con DMSO en los almidones,
posteriormente un calentamiento en un horno de microondas, reportando, que para un almidón
de maíz con alto contenido de amilosa calentado por 35s, se lograba una solubilización del 98%.
21
II. Antecedentes
2.5
SISTEMAS
UTILIZADOS
PARA
LA
CARACTERIZACIÓN
ESTRUCTURAL DE LOS ALMIDONES
2.5.1 Cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por tamaño
(CLARET)
En el sistema CLARET, la solución de la muestra es llevada a través de una columna
(fase estacionaria) por una fase móvil, a diferentes velocidades y con volumen de separación por
la columna. Las moléculas grandes son eluidas más rápidamente que las moléculas pequeñas
porque estas tienen menos penetración dentro de los poros de las columnas (Yau y col., 1979).
2.5.2 Detector de dispersión de luz en forma estática (DLE)
En el pasado, la investigación sobre los carbohidratos se enfocó principalmente a la
determinación de la composición química, estableciendo métodos para modificar química y
enzimaticamente o a estudiar la estructura y función de las enzimas involucradas en este campo.
El interés se dirigió también a la estructura química de los polisacáridos, lo cual provee
información acerca de las interacciones específicas entre la enzima y el polisacárido o el
polisacárido y una superficie especifica. El uso actual que se le da a los polisacáridos, requiere
estudiar el comportamiento de esas macromoléculas en el espacio tridimensional. Se ha
mostrado que en las cadenas flexibles no-polares de los polisacáridos, la naturaleza química
juega un papel irrelevante y las propiedades topológicas gobiernan el comportamiento global
cuando la cadena es lo suficientemente larga. Los parámetros topológicos típicos son la longitud
de la cadena, ángulo de enlace, los puntos de ramificación, las secciones de la cadena entre los
puntos de ramificación, el volumen que es ocupado por una macromolécula y el radio de giro
(Bello-Pérez, 1995).
22
II. Antecedentes
En cualquier instante las partículas suspendidas tendrán una serie particular de
posiciones dentro del volumen de desvío. Las partículas desvían la radiación del detector, las
fases relativas de ondas desviadas cambian debido a que las fases incidentes difieren en esas
posiciones y también a las distancias partícula-detector (Bello-Pérez, 1995). DLE permite
obtener la masa molar (MM) y radio de giro (RG), el cual es la raíz cuadrada de la distancia
media de los diferentes elementos desviados a partir del centro de la masa.
2.5.2.1 Modo por lote (Obtención de diagramas de Zimm)
Es un método utilizado para obtener gráficas de Zimm de una solución polidispersa, ésta
es preparada en diferentes concentraciones y son inyectadas a través del sistema, este método no
realiza ningún tipo de separación, de esta forma se obtiene información de la masa molar y del
radio de giro promedio de la macromolécula.
Otro parámetro que es obtenido a partir de este sistema, es el segundo coeficiente virial
(A2) (la interacción que hay entre el soluto y el disolvente). El RG siempre se obtendrá de la
dependencia angular de la luz dispersada. Esto se calcula a partir de la pendiente angular
después de extrapolar a la concentración cero. El segundo coeficiente virial se obtiene de la
concentración dependiente de la dispersión. Esto es calculado de la pendiente de la
concentración después de extrapolar a ángulo cero (Wyatt, 1993) (Figura 5).
2.5.3 Detector de índice de refracción (IR)
Entre más grande es la polaridad de la macromolécula, mayor es la intensidad de la luz
dispersada. Por lo tanto, para caracterizar la dispersión de la solución de una macromolécula, es
necesario conocer su polaridad; esta se obtiene midiendo el cambio dn, del índice de refracción
de la solución n con el cambio de concentración molecular dc, para medir el dn/dc.
El detector de índice de refracción, es un instrumento capaz de medir las diferencias en
índice de refracción entre el disolvente y la solución directamente, debido que el índice de
refracción de una solución cambia a medida que la concentración de una sustancia disuelta
cambia.
23
II. Antecedentes
Proyección a
Rθ
Proyección a C - C
Figura 5. Representación esquemática del diagrama de Zimm.
Fuente: Waytt Technology Corporation, 1994.
24
II. Antecedentes
En principio, para medir el cambio de índice de refracción de una solución, uno puede
deducir el cambio de concentración de un soluto diluido. De esta manera se puede conocer el
incremento de índice de refracción dn/dc (Wyatt, 1993).
2.5.4 Combinación de cromatografía (CLARET) con los detectores de dispersión de luz
en forma estática (DLE) e índice de refracción (IR)
El sistema CLARET-IR y DLE ha sido conocido y aplicado por más de 20 años, es un
método de separación de moléculas tomando en cuenta su conformación. Por esta razón, la
separación en una columna con un gel toma lugar de acuerdo al principal volumen
hidrodinámico y no a la masa molar de la molécula, aunque con la utilización de estándares de
masa molar se puede calcular con exactitud este parámetro, ya que no es necesario el uso de una
curva de calibración. Actualmente, CLARET-dispersión de luz-índice de refracción (CLARETDLE-IR) pueden ser combinados y formar un solo sistema. Los cromatogramas consisten de dos
partes, cada una representando uno de los detectores. El tiempo de retardo de la fracción hacia
los detectores es ajustado, la intensidad de dispersión corresponde a la concentración de la
muestra (Taewee, 2001).
2.5.4.1 Aplicaciones de cromatografía de permeación por geles (CPG) y
cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por tamaño
(CLARET) en almidones
Las técnicas CLARET y CLARET-DLE han sido ampliamente usadas para la
investigación de la estructura de polímeros sintéticos y también para biopolímeros. El almidón
es una de las materias primas más populares en la industria de alimentos y en otras áreas, el cual
ha sido estudiado por estas técnicas.
Trabajos hechos usando esta técnica pueden ser clasificados como: i) usando CPG
convencional sin algún detector (se necesita colectar fracciones, además son muy lentos para la
colección de los datos) ii) usando CLARET con detector de IR (se necesita curva de
25
II. Antecedentes
calibración) iii) usando CLARET con los detectores DLE y IR. Diferentes aspectos estructurales
del almidón han sido investigados usando el sistema CLARET-IR-DLE: (i) fracciones
individuales de amilosa y amilopectina (Roger y col., 1996; Bello-Pérez y col., 1998a,b; You y
col., 1999); (ii) almidones y amilopectinas desramificados (You y col., 1999; Ong y Blanshard
1995; Ramesh y col., 1999), y (iii) almidones enteros (Fishman y col., 1996; Chen y col., 1997;
Bello-Pérez y col., 1998a,b) (Cuadro 3).
2.6
TÉCNICAS
UTILIZADAS
PARA
LA
CARACTERIZACIÓN
MOLECULAR DE LOS ALMIDONES
Diferentes técnicas son utilizadas para estudiar la estructura del almidón, sin embargo, la
información que estas proporcionan varían en una escala de nanoestructura, microestructura o
macroestructura, es necesario entender los principios básicos usados en las técnicas, los cuales
serán explicado en esta sección.
2.6.1 Espectroscopía de infrarrojo
Esta técnica es sensible a cambios en la estructura a un nivel molecular (orden de rango
corto), ya que el rayo infrarrojo penetra dentro de los primeros micrómetros de los gránulos de
almidón (~2); para determinar las vibraciones de los enlaces presentes en el material al aplicarle
energía, en el caso del almidón son los enlaces: C-O, O-H y C-C, los cuales se encuentran en las
regiones amorfas y cristalinas. Cuando las radiaciones infrarrojas policromáticas interactúan con
un material, algunas longitudes de onda son absorbidas mientras otras son transmitidas dando
como resultado un espectro, que proporciona una información completa sobre la estructura
química y física de la muestra y se puede usar tanto análisis cuantitativo como cualitativo. El
espectro infrarrojo es convencionalmente dividido en tres regiones, separadas de acuerdo a sus
intervalos de longitud de onda: infrarroja cercana (>4000 cm-1), media (650-4000 cm-1) y
lejana (<650 cm-1). Para este estudio la región media fue la de interés (Ottenhof, 2003).
26
II. Antecedentes
Cuadro 3. Aplicaciones de cromatografía de permeación por geles (CPG) y cromatografía
de líquidos de alta resolución de exclusión por tamaño (CLARET) para estudios
estructurales del almidón.
Técnica
CPG: columna Sephadex G-75
Muestra
Almidón de maíz
Referencia
Ikawa y col., 1981
desramificado
CPG: columna Biogel-P6
Amilopectina de cebada
MacGregor y Morgan, 1984
CPG: columna Sepharose CL-2B
Almidón de arroz
Reddy y col., 1993
CLARET con detector IR
Almidón de avena
Wang y White, 1994
CLARET: columnas PL-gel mezcladas Amilosa de maíz
Cheetham y Tao, 1998
B, detector IR
CLARET: columnas de silica, detectores Amilosa de chícharo y
IR, DEL
Chen y col., 1997
almidones ricos en amilosa
CLARET: columnas TSK gel 3000PW, Almidones desramificados
Ong, 1994
4000PW y 500PW, detectores DLE -IR
CLARET: columnas TSK gel 3000PW, Amilopectina de trigo
You y col., 1999
4000PW y 5000PW, detectores de DLEIR
CLARET: columnas TSK gel G400SWXL Almidón de amaranto
Bello-Pérez y col., 1998b
y G3000 SWXL detectores DLE-IR
CLARET: columnas KB-806 y KB-804, Amilopectinas de diferentes Sang-Ho y Jay-Lin, 2002
detectores DLE- IR
almidones
CLARET: columnas TSK gel G200 Almidón de camote
Rolland-Sabaté y col., 2003
SWXL, detectores DLE-IR
27
II. Antecedentes
2.6.1.1 Uso de espectroscopia de infrarrojo
En este método se utiliza una celda conocida como reflactancia total atenuada (RTA)
(Figura 6). El principio se basa en el fenómeno de reflexión total interna y la transmisión de la
luz a través de un cristal, el cual presenta un índice de refracción alto. El material absorbente
(muestra) recibe la energía emitida por el cristal, provocando las vibraciones moleculares, las
cuales se representan en los espectrogramas.
2.6.2 Difracción de rayos-X
En 1928 Katz, usando un difractor de rayos-X demostró que el pan se endurecía, debido a
la recristalización del almidón durante su almacenamiento (Hizukuri, 1961). La difracción de
rayos-X ha llegado a ser una técnica bien establecida para estudiar la cristalinidad de los
polímeros (orden de largo rango) y puede dar la información de su estructura, también ha sido
utilizada como una herramienta para medir el grado de gelatinización (Ottenhof, 2003).
El patrón de difracción de rayos-X, es usado para diferenciar entre almidones de cereales
y de tubérculos (Zobel, 1988) y para detectar cambios en la cristalinidad de la amilopectina,
causados por tratamientos físicos y químicos de los gránulos de almidón.
En principio existen dos métodos para medir el patrón en una unidad de difracción de
rayos-X: a) el método difractométrico, en el que los rayos desviados de la muestra se reciben en
un tubo contador Geiger-Muller en donde la señal se amplifica y se grafica b) el método
fotográfico, en el cual el patrón se mide en una película fotográfica. Los rayos-X son una forma
de radiación electromagnética con una longitud de onda típica entre 0.1 y 1.0 nm, que es
comparable al espacio molecular en un cristal. Cuando el destello del rayo-X choca con un
cristal colocado en una superficie especial, permite que el cristal sea rotado con respecto al
destello incidente y la difracción ocurre. La difracción es el fenómeno que se presenta cuando
una onda en movimiento interactúa con un obstáculo.
28
II. Antecedentes
Muestra
Placa de moldeo
Diamante
Sello del anillo
Elementos de
calentamiento
Incidencia del láser IR
Prisma
Termopar
Láser del detector IR
Figura 6. Celda de muestreo de espectroscopía de infrarrojo.
Fuente: Martinet, 2001.
29
II. Antecedentes
El destello difractado es una medida para obtener información de la estructura del cristal
y las moléculas que lo forman (Bello-Pérez, 1995).
Sin embargo, la mayoría de los polímeros tienen material amorfo y cristalino, como es el
caso de los almidones nativos, el difractograma de rayos-X, es la superposición de dos tipos de
difractogramas (amorfos y cristalinos) (Figura 7).
2.6.2.1 Método de Hermans y Weidinger (Cálculo para obtener el porcentaje de
cristalinidad)
En 1948, Hermans y Weidinger, establecieron un método para cuantificar la
cristalinidad, el cual ha sido ampliamente utilizado, en él propusieron una integración que
involucra la relación del área del pico cristalino a partir del área total de la muestra (regiones
cristalinas + amorfas) (Ottenhof, 2003).
Área dispersada cristalina
% cristalinidad =
x 100 %
Área total dispersada
Para definir el enlazamiento entre regiones cristalinas y amorfas, se obtuvo el
difractograma de la muestra completamente amorfa a un mismo contenido de humedad, y su
respuesta es comparada con el difractograma de la muestra semicristalina. En la Figura 8, el
área de la difracción cristalina se muestra en color blanco y la amorfa sombreada. Este método
debe ser hecho, tomando en cuenta en el difractograma amorfo el contenido de agua (Farhat y
Blanshard, 1997)
La ventaja de usar este método, es que el porcentaje de cristalinidad se obtiene
directamente del difractograma de rayos-X. La desventaja de usar esta técnica, es que algunas
veces es difícil obtener una muestra completamente amorfa, la cual puede usarse para separar la
dispersión cristalina y amorfa en una muestra semicristalina.
30
II. Antecedentes
Figura 7. Diagrama esquemático, mostrando el origen del: a) patrón de difracción de
rayos-X obtenido para muestras amorfas y b) pico obtenido para muestras
cristalinas.
Fuente: Farhat y Blanshard, 1997.
31
II. Antecedentes
Figura 8. Difractograma de rayos-X para almidón de trigo, mostrando la difracción
cristalina de la muestra (color blanco) y la región amorfa (sombreado).
Fuente: Farhat y Blanshard, 1997.
32
II. Antecedentes
2.7
MÉTODO TÉRMICO: CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE
BARRIDO
Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría, pero se hinchan cuando se
calientan en un medio acuoso. Inicialmente, el hinchamiento es reversible y las propiedades
ópticas del gránulo no se pierden; sin embargo, cuando se alcanza una cierta temperatura, el
hinchamiento llega a ser irreversible y la estructura del gránulo se altera significativamente. Este
proceso es conocido como gelatinización y la temperatura a la cual ocurre este fenómeno se le
conoce como temperatura de gelatinización. La gelatinización es un fenómeno endotérmico al
cual se le ha aplicado algunos métodos de análisis térmicos para medir los fenómenos
involucrados en ellos (Donovan, 1979).
Dentro del análisis térmico se encuentra la calorimetría diferencial de barrido (CDB), la
cual se usa en diferentes áreas de investigación, desarrollo e inspección de calidad (Höhne y
col., 1996); en ella, la medición principal es la comparación de la velocidad del flujo de calor
para la muestra y la referencia, las cuales son calentadas o enfriadas a la misma velocidad, es
decir, la energía absorbida dentro de una sustancia y un material de referencia están sujetos a un
programa de temperatura controlada (Figura 9) (McKenzei, 1970). En el caso particular de los
alimentos, algunos investigadores han utilizado esta técnica para determinar la influencia del
contenido de humedad sobre el fenómeno de gelatinización, utilizando condiciones de exceso de
agua (>80% de humedad) y un contenido de agua limitado (< 70% de humedad), donde
obtuvieron una nueva endoterma a temperaturas superiores, esto ha sido atribuido a la fusión
verdadera de los cristales de amilopectina presentes en el gránulo del almidón (Biliaderis y col.,
1980). La variación en el contenido de humedad influye principalmente en la temperatura de
gelatinización, ya que cuando el contenido de agua disminuye (para una relación agua/almidón
inferior a 1, la temperatura de gelatinización aumenta de manera exponencial y alcanza un valor
cerca de 170 °C para un almidón seco (Colonna y Mercier, 1985). Otros factores que afectan
esta temperatura son la velocidad de calentamiento, los tratamientos hidrotérmicos, las
modificaciones químicas, las interacciones con lípidos, con proteínas, así como también las
interacciones en complejos amilosa-lípido y los efectos de solutos iónicos y no iónicos (Takaya
y col., 2000; Gómez-Aldapa, 2001; Svegmark y col., 2002).
33
II. Antecedentes
Figura 9. Representación esquemática de un sistema de calorimetría diferencial de
barrido (CDB).
Fuente: McNaughton y Mortimer, 1975.
34
III. Justificación
III. JUSTIFICACIÓN
En el mercado existen fuentes de almidón como son maíz, papa y tapioca, siendo
algunas de ellas fundamentales para la alimentación humana. Se ha considerado buscar fuentes
no convencionales de almidón como son mango, plátano y okenia, con nuevas propiedades
funcionales y aplicaciones.
Bello-Pérez y col. (1999) han reportado las características fisicoquímicas de los
almidones de plátano, Aparicio-Saguilán (2001) para mango y Sánchez-Hernández y col. (2002)
para okenia, donde se ha manifestado que estos almidones podrían tener aplicación a nivel
industrial.
En los últimos años ha cobrado gran interés el estudio de la relación estructura-función,
para poder explicar como la estructura repercute en las propiedades funcionales de los
almidones y con esto, buscar las mejores aplicaciones y el desarrollo de nuevos productos. Por
otro lado, conociendo la relación entre estructura-función posiblemente se pudiera manipular la
biosíntesis y obtener almidones con propiedades especificas.
.
35
IV. Objetivos
IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Determinar las características moleculares y estructurales del almidón de mango
(Mangifera indica L.), plátano (Musa paradisiaca) y okenia (Okenia hypogaea), utilizando
diferentes técnicas.
4.2 Objetivos Específicos
1. Aislar los almidones (mango, plátano y okenia) y determinar su composición química.
2. Realizar los estudios de la morfología del gránulo de almidón mediante microscopía
electrónica de barrido y microscopía de luz polarizada.
3. Estudiar el orden de rango corto de los almidones por espectroscopía de infrarrojo.
4. Conocer el patrón de difracción rayos-X y el porcentaje de cristalinidad de los
almidones.
5. Obtener la masa molar y radio de giro promedio de los almidones usando el detector de
dispersión de luz en forma estática.
6. Determinar la temperatura y entalpía de gelatinización de los almidones.
36
V. Materiales y Métodos
V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Materiales
5.1.1 Materia prima
Se utilizaron semillas de okenia (Okenia hypogaea) que fueron recolectadas en el campo
experimental Emiliano Zapata del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, ubicado en
Yautepec, Morelos; plátanos (Musa paradisiaca) var. Macho, en estado verde que fueron
adquiridos en la central de abasto de Cuautla, Morelos; mangos (Mangifera indica L.) var.
Tommy Atkins, en estado verde proporcionados por el Consejo Estatal de mango ubicado en
Iguala, Guerrero.
5.1.2 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico de las marcas Sigma, Merck
(Darmstadt, Alemania) y Baker (México, DF)
5.2 Métodos
5.2.1 Aislamiento del almidón de mango y plátano
Para el aislamiento de los almidones, se utilizó el método propuesto por FloresGorosquieta (2003). Se colectó el fruto en su estado verde, se eliminó la cáscara
cuidadosamente y se pesaron 500 g del fruto. Posteriormente, se colocó dentro de un vaso de
licuadora conteniendo una solución de ácido cítrico (3.00 g/1000 mL de agua destilada)
37
V. Materiales y Métodos
y
se licuó a velocidad máxima por 2 min, posteriormente el fruto molido se cribó
sucesivamente en malla 50 y 100 (US). En cada malla se lavó el residuo hasta que el líquido de
salida se viera transparente y ya no presentara aparentemente residuos de almidón. La
suspensión obtenida se centrifugó a 1700 gn por 30 min, y se descartó el sobrenadante. El
precipitado se colocó en cajas de petri de vidrio para posteriormente secarlo en estufa a 40 °C,
se molió y se cribó en malla 100 (US) obteniendo un polvo de tamaño de partícula homogénea,
el cual se almacenó.
5.2.2 Aislamiento del almidón de okenia
Se utilizó el método propuesto por Sánchez-Hernández y col. (2002). Las semillas se
lavaron con agua destilada para eliminar el polvo y otras sustancias adheridas. Posteriormente se
dejo en remojo en una solución reguladora de acetato de sodio 0.02 M (pH 6.5), conteniendo
cloruro de mercurio 0.01 M. La mezcla se mantuvo a 5 °C, en agitación por 24 h. Las semillas
suavizadas se drenaron y se cribaron a través de las mallas 40, 100, 250, 325 (US),
sucesivamente. En cada malla el residuo se lavó con agua destilada; la suspensión almidonosa
obtenida se centrifugó a 6500 gn por 30 min y se descartó el sobrenadante. El residuo blanco se
volvió a suspender y se homogeneizó en una solución de NaCl 0.1 M: tolueno (7:1 v/v) y se
mantuvo en agitación (5 °C) durante toda la noche. La suspensión se centrifugó a 6500 gn por
30 min, donde se formaron dos fases, en el sobrenadante se encontraban las proteínas, grasa y
pequeños gránulos que no fueron separados por centrifugación y en el precipitado estaba una
fracción rica en almidón. Posteriormente se dejó secar a 45 °C por 24 h en una estufa, se molió,
tamizó y se almacenó.
38
V. Materiales y Métodos
5.2.3 Composición química
1) Humedad (método 14.004, AOAC, 1980). Se utilizaron 2 g de muestra a una temperatura de
130 ± 3 °C por 1 h en una estufa.
2) Cenizas (método 32.10, AACC, 1984). Se determinó utilizando la pérdida en peso de 3 g de
muestra después de incineración a 600 °C durante 3 h en una mufla.
3) Lípidos (método 7.056, AOAC, 1980). Se determinó utilizando un sistema de extracción
soxhlet. Se pesaron 3 g de muestra empleando hexano como disolvente.
4) Proteína (método 2.057 y 14.026, AOAC, 1980). Para la determinación de nitrógeno, se
utilizó el método de Kjeldahl, con un factor de conversión de 5.85.
5.2.4 ESTUDIOS MICROSCÓPICOS DEL ALMIDÓN
5.2.4.1 Microscopía electrónica de barrido
Las muestras de almidón se espolvorearon sobre una cinta conductora de cobre de doble
adhesión, la cual se fijó previamente en un soporte de aluminio del microscopio electrónico de
barrido JEOL (modelo JSEM 35CX; Japan Electronic Optical Limited, Japón). Las muestras se
cubrieron con una capa de carbón de 30 nm de espesor depositada al vacío (10-5 Torr) en una
evaporadora JEOL. La evaporadora estaba dotada de un adaptador rotatorio de ángulo variable
con objeto de asegurar una capa uniforme en toda la superficie de la muestra. Las muestras
recubiertas con carbón se colocaron en el ionizador de metales JEOL, y se recubrieron con una
capa de oro de 60 nm. Las muestras fueron observadas en el microscopio electrónico de barrido
a un voltaje de 8 KV y se tomaron las fotografías.
39
V. Materiales y Métodos
5.2.4.2 Microscopía de luz polarizada
Se realizó con un microscopio de luz polarizada (Leitz, Wetzlar, Alemania) con un
objetivo de 40X, equipado con una cámara digital. Las muestras de almidón se espolvorearon en
un portaobjetos y se agregó una gota de agua destilada, se mezcló con una espátula para
posteriormente colocar un cubreobjeto. Los gránulos de almidón se seleccionaron al azar y
fueron observados.
5.2.5 ESTUDIOS MOLECULARES DEL ALMIDÓN
5.2.5.1 Espectroscopía de infrarrojo
Los espectros de infrarrojo fueron obtenidos con un espectrofotómetro de infrarrojo
(Bruker, UK), el cual cuenta con una celda térmica de simple reflactancia con un diamante
(Graseby-specac Ltd., UK). Se utilizó una cubierta sellada de zafiro con un anillo de goma, con
la finalidad de minimizar las perdidas de humedad durante las mediciones. Para cada muestra se
colectaron 32 barridos con una resolución de 4 cm-1 y fueron agrupados. Todas las muestras
fueron registradas a una temperatura de 25 °C. El análisis de datos se llevo a cabo usando el
programa OPUS 3.0 (Bruker, UK). Para el análisis de la región de carbohidratos del espectro
(1200-800 cm-1), se hizo una corrección de la línea base usando un solo punto a 1900 cm-1. El
espectro fue deconvulado (Kauppinen y col., 1981) en la región mencionada, donde la forma de
la línea asumida fue tipo Lorentz con un factor de deconvulación de 750 y un factor de
reducción de ruido de 0.2.
40
V. Materiales y Métodos
5.2.5.2 Difracción de rayos-X
Las muestras se colocaron sobre el portamuestra del difractómetro de rayos-X (Bruker
D5005) de ángulo ancho, equipado con una fuente de cobre operado a 40 KV y 30 mA,
produciendo una radiación de CuKα con una longitud de onda de 1.54 Å. Los datos fueron
colectados en un intervalo de 4-38° cada 0.1°, con una velocidad de barrido de 60s/°. La línea
base del difractograma fue corregida en el intervalo de barrido y el vector fue normalizado
utilizando el programa OPUS 3.0 (Bruker, UK) antes de calcular el índice de cristalinidad, el
cual se determinó por el método propuesto por Hermnas y Weidinger (1948).
5.2.6 ESTUDIOS ESTRUCTURALES DEL ALMIDÓN
5.2.6.1 Tratamiento con dimetilsulfóxido
Se utilizó el método propuesto por Bello-Pérez y col. (1998a). Se pesó 1 g de muestra de
almidón y se disolvió en 20 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) al 95%, dejando en agitación
durante 3 días a 25 ºC. La muestra fue precipitada con 60 mL de etanol y almacenada toda la
noche a 4 ºC. El precipitado se filtró y posteriormente se realizó un lavado con 10 mL de
acetona y 10 mL de éter dietílico. El precipitado fue secado a temperatura ambiente, para
eliminar los restos de disolventes y finalmente se dejo secar en una estufa a 45 ºC por 18 a 20 h.
5.2.6.2 Solubilización en agua
Se utilizó el método propuesto por Bello-Pérez y col. (1998a). Donde se pesaron 10 mg
de muestra de almidón dentro de una de copa de teflón para microondas modelo 4782 (Parr
Instrument Co., Moline, IL, USA), se le agregaron 20 mL de agua que fue previamente filtrada
41
V. Materiales y Métodos
a través de 0.1 µm. La muestra se mantuvo sobre flujo de nitrógeno por 20 min. La copa de
teflón fue colocada dentro de una bomba policarbonatada. La muestra fue calentada por 40, 50,
60 y 70 s a 900 W en un horno de microondas. Posteriormente, la bomba se enfrió colocándola
en un baño de hielo por 30 min, la muestra fue centrifugada a 15000 r.p.m por 10 min a 15 ºC.
La solución sobrenadante fue pasada por un filtro de 5 µm. Se determino la concentración de
las muestras después de ser filtrada, a través de carbohidratos totales (Dubois y col., 1956).
5.2.6.3 Determinación de carbohidratos totales
Los carbohidratos totales se determinaron de la siguiente manera: se preparó una curva
estándar con una solución de glucosa de 0.01 g/100 mL. En 7 tubos se colocaron 100, 200, 300,
400, 500, 600 y 700 µL de esa solución completando con agua a un volumen de 1 mL. A cada
tubo se le añadió 1 mL de fenol al 5 % y lentamente se le adicionaron 5 mL de ácido sulfúrico
concentrado directamente al centro de la muestra. Se dejaron reposar por 10 min, se agitaron y
se dejaron reposar 10 min más antes de leer a 490 nm en el espectrofotómetro Genesys 5. Se
tomaron alícuotas de 100 µL de las muestras de almidón adicionando 900 µL de agua destilada
y se sometieron al mismo procedimiento.
5.2.6.4 Determinación de masa molar y radio de giro promedio (Detector de
dispersión de luz en forma estática (DLE))
Para la preparación de las muestras se utilizó el método propuesto por Bello-Pérez y col.
(1998a). Se prepararon 5 concentraciones diferentes de las muestras y cada concentración fue
colocada en jeringas de plástico. Las jeringas fueron colocadas, cada una a través de una bomba,
que estaba conectada directamente al detector de dispersión de luz. La masa molar (MM) y el
radio de giro promedio (RG) fueron determinados usando el método Berry-Plot de segundo
42
V. Materiales y Métodos
orden y se calcularon a través del programa del detector de dispersión de luz conocido
comercialmente como ASTRA versión 4.90.08 (Waytt Technology Corporation, 1994). El
alineamiento de los diferentes detectores de Dawn fueron observados sobre intervalos usando
tolueno filtrado (0.1 µm) (Bello-Pérez y col., 1998a, b).
5.2.7 Calorimetría diferencial de barrido (CDB)
La temperatura y entalpía de gelatinización de los almidones fueron estudiadas usando
un equipo de calorimetría diferencial de barrido CDB 7 (Perkin Elmer, UK), previamente
calibrado con Indio. Las muestras fueron pesadas (entre 9-11 mg de muestra en base seca) en
una charola de aluminio y se les agregó agua destilada. Las charolas fueron selladas
herméticamente y se dejaron toda la noche en un mezclador de rodillo, antes de realizar los
análisis. Se utilizó una charola de aluminio vacía, como referencia.
Las muestras fueron
sometidas a un programa de calentamiento sobre un intervalo de temperaturas de 0 a 130 °C y
una velocidad de calentamiento de 10 ºC/min. La temperatura gelatinización o temperatura de
pico (Tp) y la entalpía de gelatinización (∆H) fueron obtenidas directamente usando el programa
del equipo.
43
V. Materiales y Métodos
5.3
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para determinar las diferencias estadísticas de la composición química y de las
propiedades térmicas del proceso de gelatinización (Tp y ∆H) debidas a la variación en
la fuente botánica, se aplicó un análisis de varianza de una sola vía.
El nivel de significancía utilizado en todos los análisis fue del 5% (α = 0.05). Cuando se
encontraron diferencias significativas en las variables medidas, se aplicó la prueba de
comparación múltiple de Tukey (Walpole y col., 1999).
44
VI. Resultados y discusión
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Composición química
La composición química de los almidones de mango, plátano y okenia se presenta en el
Cuadro 4. Los almidones de fuentes no convencionales (plátano, mango y okenia) presentaron
diferencias significativas (α = 0.05) en su composición química, esto demuestra que la fuente de
obtención de almidón fue un factor importante. En el contenido de humedad, los almidones
presentaron diferencias significativas, los valores para plátano mango y okenia fueron de 16.52,
7.71 y 10.66 %, respectivamente. El contenido de proteínas para los almidones de plátano,
mango y okenia fue de 1.62, 0.35 y 0.30 %, respectivamente. Pérez-Sira (1997), reportó un
valor de proteína de plátano de 0.62 %. Recientemente, Sánchez-Hernández y col. (2002),
reportaron un valor de proteínas de 0.18 % para okenia.
Los almidones de plátano, mango y okenia presentaron valores de lípidos de 0.29, 3.34 y
0.33 %, respectivamente. Diversos contenidos de lípidos han sido encontrados para almidones
de plátano: Kayisu y col. (1981), reportaron 0.2 % y Bello-Pérez y col. (1999) reportaron
valores de 2.46 %. En el caso del almidón de mango este presentó un contenido mas alto (3.34
%), que los estudios reportados en otras fuentes de almidones con valores de 0.2-0.3 %, esto
puede deberse a la presencia de algunos pigmentos que no fueron eliminados en el proceso de
aislamiento.
El contenido de cenizas de los almidones fue de 0.44, 0.66 y 0.38 %, para plátano,
mango y okenia, respectivamente. Los niveles de cenizas pueden ser importantes para las
propiedades funcionales de estos almidones, como se ha reportado en el caso del almidón de
papa, donde los geles que se obtienen tienen mayor claridad, debido al contenido de grupos
fosfatos.
45
VI. Resultados y discusión
Cuadro 4. Composición química de los almidones de fuentes no convencionales1.
Humedad
Proteínas2,3
Lípidos2
Cenizas2
(%)
(%)
(%)
(%)
Plátano
16.52 ± 0.28a
1.62 ± 0.01b
0.29 ± 0.10b
0.44 ± 0.09b
Mango
7.71 ± 0.22c
0.35 ± 0.03a
3.34 ± 0.31a
0.61 ± 0.04a
Okenia
10.66 ± 0.18b
0.30 ± 0.14a
0.33 ± 0.43a
0.38 ± 0.01b
Muestra
1. Media de tres determinaciones, ± error estándar
2. Base seca
3. N x 5.85
Valores con las mismas letras dentro de cada columna no son diferentes significativamente (α =0.05)
46
VI. Resultados y discusión
Sánchez-Hernández y col. (2002) reportaron valores de cenizas de 0.52 % esto puede ser
debido a que la semilla de okenia almacena algunos minerales. Otros autores reportan diferentes
contenidos de cenizas de almidones como es el caso de amaranto (0.12 %) con distinto método
de aislamiento.
6.2 ESTUDIOS MICROSCOPICOS DEL ALMIDÓN
6.2.1 Microscopía electrónica de barrido
En la Figura 10, se muestran las fotomicrografías de los almidones de plátano, mango y
okenia. Los almidones de mango y okenia presentaron forma esférica, mientras que el almidón
de plátano presentó forma ovoide. Lindeboom y col. (2004), realizaron una clasificación de los
almidones en base al tamaño del gránulo: gránulo grande como es el almidón de plátano que
presentó un tamaño entre 10-40 µm, gránulo pequeño como el almidón de mango de 5-10 µm y
gránulo muy pequeño, como el almidón de okenia entre 1-3 µm. Se ha reportado que los
gránulos muy pequeños pueden absorber una mayor cantidad de agua que los gránulos grandes,
debido a la mayor área de contacto (Paredes-López y col., 1989). Por lo cual, el almidón de
okenia presenta ventajas debido a que hay pocos almidones estudiados que presentan tamaños
de gránulos muy pequeños como es el caso de amaranto y arroz, que pueden ser utilizados en la
elaboración de cosméticos y como encapsulante de compuestos (Zhao y Whistler, 1994).
47
VI. Resultados y discusión
a)
40 μm
b)
c)
Figura 10. Microscopía electrónica de barrido: a) Almidón de plátano; b) Almidón de
mango; c) Almidón de okenia.
48
VI. Resultados y discusión
6.2.2 Microscopía de luz polarizada
En la Figura 11, se muestran las fotomicrografías de luz polarizada de los almidones de
plátano (a), mango (b) y okenia (c). Los tres almidones presentaron birrefringencia cuando
fueron observados bajo luz polarizada, es decir, presentaron la “Cruz de Malta”. Tester y
Karkalas (2004), reportaron, que la “Cruz de Malta” indica que los componentes del almidón
(amilosa y amilopectina) se encuentran organizados estructuralmente dentro del gránulo. La
prueba de birrefringencia también indicó que el método que se utilizó para el aislamiento del
almidón no daño los gránulos de los almidones.
6.3 ESTUDIOS MOLECULARES DEL ALMIDÓN
6.3.1 Espectroscopía de infrarrojo
Es importante conocer la cantidad de regiones amorfas y cristalinas de los almidones, y
poder entender los cambios de la estructura a nivel molecular (conformación de las cadenas y
cristalinidad) cuando son procesados por tratamientos de calentamiento, o predecir las
características de los productos que contiene almidón, cuando son almacenados.
En la técnica de espectroscopía de infrarrojo, el rayo infrarrojo penetra
aproximadamente los primeros 2 µm de la muestra. Esta penetración es a escala pequeña del
tamaño de gránulo de almidón, para poder medir la información del crecimiento del gránulo
(Sevenou y col., 2002). La Figura 12, muestra los espectros infrarrojos para las muestras de
almidón de fuentes no convencionales. Las bandas a 1045 y 1022 cm-1 fueron asociadas al
orden de la estructura cristalina y amorfa del almidón, respectivamente. La relación de estas, fue
utilizada para cuantificar el orden de corto rango en la molécula de almidón.
49
VI. Resultados y discusión
a)
b)
c)
Figura 11. Microscopía de luz polarizada: a) Almidón de plátano; b) Almidón de mango;
c) Almidón de okenia.
50
VI. Resultados y discusión
Figura 12. Espectros en el infrarrojo medio después de la deconvulación para almidones
de fuentes no convencionales.
51
VI. Resultados y discusión
Smits y col. (1998) reportaron, que la relación de las absorbancias a partir de las
longitudes de onda de 1045 y 1022 cm-1 con un valor menor de 1, implica una mayor cantidad
de material amorfo, y cuando el valor es mayor de 1 existe mas cantidad de material cristalino,
siendo un almidón mas organizado. Para los almidones de plátano, mango y okenia la relación
fue de 1.319, 1.151 y 1.352, respectivamente, por lo cual estos almidones presentan una mayor
cantidad de material cristalino; en el caso del almidón de mango la cristalinidad fue menor lo
cual podría influir en su funcionalidad.
Sevenou y col. (2002) encontraron, que los almidones que presentaban mayor nivel de
organización en la región cristalina, tienen alta resistencia a ataques enzimáticos, influyendo en
su digestibilidad, así como también, para la obtención de productos donde es necesaria la
hidrólisis de los almidones como obtención de maltodextrinas y jarabes de glucosa.
6.3.2 Difracción de rayos-X
Los almidones de mango y okenia presentaron un patrón de difracción de rayos-X tipo –
A, que es comúnmente encontrado en los almidones de cereales, en el caso del almidón de
plátano presentó un patrón de difracción tipo –C, que es una mezcla de cristalinidad dentro del
gránulo del patrón tipo -A y tipo -B (Figura 13). San-Ho y Jay-Lin (2002), reportaron que las
diferencias en los patrones de difracción de rayos-X se deben a la estructura de la amilopectina.
Los almidones que tuvieron patrones difracción tipo -A presentaron un alto grado de
ramificación y longitud de cadenas cortas, comparado con los patrones de difracción tipo -B que
presentan mayor longitud de cadena, mientras que los patrones tipo -C presentan una mezcla de
longitud de cadenas cortas y largas.
En los últimos años, el grado de cristalinidad ha sido medido a través de difracción de
rayos-X, Van Soest y col. (1994) reportaron valores de cristalinidad entre 15-45 %, los cuales
fueron obtenidos para almidones de diversas fuentes. Los almidones de mango, plátano y
okenia, tuvieron niveles de cristalinidad de 35.97, 34.83 y 34.61 %, respectivamente.
52
VI. Resultados y discusión
Figura 13. Difractogramas de los almidones de fuentes no convencionales.
53
VI. Resultados y discusión
Para almidones de trigo de diferentes variedades, se han reportado valores de 13-18 %
(Yoo y Jane, 2002). Otros autores reportaron un patrón tipo -B para el almidón de plátano
utilizando la variedad Musa acuminata (Lii y col., 1982; Faisant y col., 1995). Sin embargo, en
este estudio se utilizó la Musa paradisiaca, considerando que la variedad es un factor
importante para las diferencias estructurales de los almidones.
6.4 ESTUDIOS ESTRUCTURALES DEL ALMIDÓN
6.4.1
Determinación de masa molar y radio de giro promedio (Detector de
dispersión de luz en forma estática (DLE))
La técnica de DLE se emplea para determinar los parámetros relacionados al tamaño de la
partícula, lo cual es importante para conocer la conformación de la molécula. Para obtener los
resultados es necesario introducir diferentes concentraciones de la muestra dentro del DLE y
medir así la luz dispersada como una función del ángulo de cada detector para cada
concentración, obteniendo así los diagramas de Zimm.
Se utilizaron diferentes tiempo de calentamiento 40, 50, 60 y 70 s para la solubilización
de los almidones, se observó que al aumentar el tiempo de calentamiento disminuyó la MM y el
RG, debido a la degradación de la molécula (Cuadro 5).
En las Figuras 14-16, se presentan los diagramas de Zimm para los almidones de
plátano, mango y okenia, respectivamente a un tiempo de calentamiento de 40 s, ya que a este
tiempo se obtuvieron valores de MM y RG más altos comparados con los otros tiempos
utilizados. El almidón de mango presentó valores de MM y RG más altos, comparados con los
almidones de plátano y okenia. El RG da la información del tamaño de la partícula, siendo este
dato importante para hacer la relación de MM y RG, y se puede conocer si la molécula es lineal o
ramificada y si es ramificada determinar su grado de ramificación (Wyatt, 1993).
Utilizando el sistema por lote, You y col. (1999), realizaron estudios de amilopectinas de
trigo de diferentes variedades, mostrando valores de MM entre 29 x 106 - 349 x 106 g/mol, con
un RG de 122-340 nm.
54
VI. Resultados y discusión
Cuadro 5.
Masa molar (MM) y radio de giro (RG) de almidones de fuentes no
convencionales.
Almidón
Tiempo de
MM (x10-6)
RG
calentamiento (s)
(g/mol)
(nm)
40
50
60
70
13.9
17.8
3.9
1.3
145
147
95
60
40
50
60
70
25.4
9.6
7.0
2.1
186
128
112
67
40
50
60
70
6.7
3.4
1.9
0.2
106
92
76
73
Plátano
Mango
Okenia
55
VI. Resultados y discusión
Figura 14. Diagrama de Zimm del almidón de plátano con un tiempo de calentamiento de
40 s.
56
VI. Resultados y discusión
Figura 15. Diagrama de Zimm del almidón de mango con un tiempo de calentamiento de
40 s.
57
VI. Resultados y discusión
Figura 16. Diagrama de Zimm del almidón de okenia con un tiempo de calentamiento de
40 s.
58
VI. Resultados y discusión
Diversos autores han utilizado otros métodos para el estudio estructural de los almidones
como es el caso de: Millard y col. (1997), donde realizaron estudios de almidones de maíz
ceroso solubilizados a través de un calentamiento por un horno de microondas por 90 s,
reportando valores de MM de 586 x 106 g/mol y RG de 376 nm; posteriormente Bello-Pérez y
col. (1998a) propusieron un método, el cual consiste en un pretratamiento en DMSO al 90 %,
probaron diferentes tiempos de 35-90 s para determinar el tiempo adecuado para la
solubilización en agua a través de un calentamiento por un horno de microondas, ellos
reportaron para maíz normal, valores de MM entre 19 x 107 g/mol para 35 s de calentamiento y
RG de 250 nm y a 90 s de calentamiento, MM 2.7 x 107 g/mol y RG 100 nm, concluyendo que a
35 s se obtuvo una mayor solubilización de los almidones, así como también una buena
separación de amilosa y amilopectina.
En este estudio de la misma manera se probaron diferentes tiempos de calentamiento
para la solubilización de los almidones, donde se observó el mismo comportamiento al
aumentar el tiempo de calentamiento, disminuyó la MM y el RG, debido a la degradación de la
molécula por la temperatura que se alcanza a tiempos largos de calentamiento. Rolland-Sabaté y
col. (2003), utilizando almidones de camote de diferentes variedades y el método propuesto por
Bello-Pérez y col. (1998a), reportaron valores de MM y RG de 0.75-3.41 x 108 g/mol y 170-396
nm, respectivamente. Las diferencias, con los resultados de otros autores son debido al método
utilizado desde la preparación de los almidones y el sistema para obtener estos parámetros. Por
lo tanto es necesario tener un procedimiento óptimo para el estudio estructural de los almidones.
6.4.1.1 Teoría de fractales
El estudio de la geometría de fractales ha permitido, descubrir formas geométricas que
antes no era posible hacerlo y con esto explicar fenómenos naturales. El concepto principal de
esta nueva geometría es la dimensión fractal (df), que es una propiedad del objeto, la cual indica
que tanto ocupa el espacio que lo contiene, y así adquirir valores en el espacio de los nuevos
fractales de 0 y 3 (Yano, 1996). En este estudio la determinación de la estructura de las
muestras (almidones) se realizó por el análisis de la partícula dispersada, esto permite extraer la
59
VI. Resultados y discusión
información de las propiedades estructurales de los almidones como una función de su masa
molar. En este estudio se utilizaron los parámetros:
df, el cual esta relacionado a la estructura global, a partir de la dependencia de la
masa molar con el radio de giro, dentro de los límites experimentales de error, la
relación MM y RG muestra una línea recta en una grafica doble logarítmica
descrito por la ley de RG = K` MMV por Hanselman y col. (1996):
M= K’ RG1/V = K’ RGdf
Donde: MM = masa molar, K` = constante, RG = radio de giro y v = 1/df. Esta relación puede ser
considerada con una definición de una dimensión fractal. Por ejemplo df = 3.0 definiría una
estructura homogéneamente globular, df = 2.0 definiría una estructura plana y df = 1.0 una
estructura lineal.
d’f , esta enfocado en la estructura interna de la molécula, mediante el factor de la
luz dispersada (Hanselmann y col., 1996). La información acerca de la estructura
de los polímeros, puede ser obtenida de P(q), la cual describe la distribución
angular de la luz dispersada y q es un vector de dispersión (Brown y Nicolai,
1993).
Dependencia de la masa molar con el radio de giro (df). En el Cuadro 6, se observan los valores
de df, para los almidones de plátano, mango y okenia de 2.81, 2.42 y 3.74 en el mismo orden,
por lo tanto los tres almidones presentaron una estructura homogéneamente globular. BelloPérez y col. (1998 b) encontraron valores de df = 2.77 y 2.70 para amilopectinas de maíz y maíz
normal, respectivamente y para almidón de amaranto de 2.56. Las Figuras 17-19, muestran la
dependencia de la MM con el RG, para los almidones de okenia, mango y plátano,
respectivamente.
60
VI. Resultados y discusión
Cuadro 6. Dimensiones de fractales (df y d’f) para los almidones de fuentes no
convencionales.
Almidón
Tiempo de
df
d’f
40
50
60
70
2.81
2.17
1.95
1.27
0.82
40
50
60
70
2.42
2.29
1.87
1.91
0.89
40
50
60
70
3.74
1.25
1.27
1.32
1.16
calentamiento (s)
Plátano
Mango
Okenia
61
VI. Resultados y discusión
Figura 17. Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de okenia
disuelto a diferentes tiempos.
62
VI. Resultados y discusión
Figura 18. Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de mango
disuelto a diferentes tiempos.
63
VI. Resultados y discusión
Figura 19. Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de plátano
disuelto a diferentes tiempos.
64
VI. Resultados y discusión
Factor de la partícula dispersada (d’f). En la Figura 20, muestra el factor de dispersión de la
partícula P(q), del almidón de mango calentado por 60 s, es graficado contra los parámetros
dimensionales (qRG) (grafica representativa, debido a que en todos los tiempos de calentamiento
se observo el mismo comportamiento así como para los diferentes almidones). La teoría de
fractales relaciona estas graficas asintóticas a una dimensión fractal (Stauffer, 1979). Los
valores de las muestras estudiadas son aproximados a los valores característicos de una partícula
que
tiene
una
estructura
completamente
ramificada
al
azar
en
un
disolvente
termodinámicamente estable (d’f = 2.0) (Hanselman y col., 1996) (Cuadro 6). Los almidones
estudiados presentaron un comportamiento similar, ya que al aumentar el tiempo de
calentamiento disminuyó el valor de d’f, por lo cual, se llevo acabo un rompimiento en la
estructura esto es reflejado en los valores ≅ 1, indicando una estructura lineal esto es por la
degradación de la molécula. Bello-Pérez y col. (1998b) presentaron el mismo comportamiento,
con valores de d’f de 2.44, 2.18, 1.50 y 1.30 para almidones de amaranto calentados por 35, 50,
70 y 90 s, respectivamente.
6.5 Perfil calorimétrico del almidón
La calorimetría diferencial de barrido (CDB) fue usada para estudiar las transiciones de
fase de los almidones de plátano, mango y okenia (Cuadro 7). El almidón de okenia presentó
una temperatura de gelatinización más baja comparada con el almidón de plátano. En el caso de
la entalpía, los almidones de plátano y mango presentaron valores altos (23.43 y 21.19 J/g,
respectivamente) pero sin diferencias estadísticas entre si (α=0.05). El almidón de okenia
presentó valores más bajos de entalpía (15.02 J/g). Esta transición corresponde a la disociación
de las moléculas de amilosa y amilopectina dentro del gránulo de almidón y la salida de amilosa
a la fase continua (Fujita y Lida, 1992; Liu y col., 1991; Russel y Juliano, 1983). La temperatura
de gelatinización mas alta del almidón de plátano puede estar relacionada con su longitud de las
cadenas en la molécula de amilopectina (Hizukuri, 1985).
65
VI. Resultados y discusión
0.00
Log (p(q))
-0.10
-0.20
-0.30
-0.40
-0.50
-0.60
-0.70
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Log (qRg)
Figura 20. Gráfica doble logarítmica del factor de la partícula dispersada vs. el vector
dispersado normalizado del almidón de mango disuelto a 60 s.
66
VI. Resultados y discusión
Cuadro 7. Propiedades térmicas de los almidones de fuentes no convencionales a.
Almidones
Temperatura de
Entalpía de gelatinización
gelatinización (ºC)
(∆H) (J/g)
Plátano
77.58 ± 0.35ª
23.43 ± 1.34ª
Mango
73.75 ± 0.11b
21.19 ± 1.02ª
Okenia
71.17 ± 0.94 b
15.02 ± 0.94 b
a. Media de tres determinaciones, ± Error estándar
Valores con la misma letra dentro de cada columna no son diferentes significativamente (α = 0.05)
67
VI. Resultados y discusión
Yuan y col. (1993) reportaron que los almidones que tienen amilopectina con cadenas
largas, tienen temperaturas de gelatinización más altas que las amilopectinas con cadenas cortas.
Otros factores que se consideran que influyen en la temperatura de gelatinización son: tamaño
del gránulo, organización cristalina, proporción y la organización estructural (amilosa y
amilopectina) dentro del gránulo (Chiotelli y Le Meste, 2002). Por lo cual, en los almidones de
fuentes no convencionales presentaron una relación de tamaño de gránulos con las propiedades
térmicas, ya que el almidón de plátano presentó el tamaño de granulo grande (10-40 µm) con
valores de temperatura y entalpía de gelatinización altos, en forma contraria con los almidones
de mango (5-10 µm) y okenia (1-3 µm).
Faisant y col. (1995), reportaron usando CDB para almidón de plátano en estado verde,
una temperatura de gelatinización del gránulo del almidón de 76.4 ºC y un valor de entalpía de
17.1 J/g, ambos valores son bajos comparados con los obtenidos en este estudio. También
Bello-Pérez y col. (1999), reportaron temperaturas de gelatinización de 74.5 y 75.0 ºC para
almidones de dos variedades de plátano, pero los valores de entalpía fueron más bajos (13.0 y
14.8 J/g). González-Reyes y col. (2003) reportaron en almidón de okenia una temperatura de
gelatinización de 71.0 ºC y un valor de entalpía 11.9 J/g, este valor de temperatura es similar al
determinado en este trabajo, pero el valor de entalpía es más bajo. En el caso del almidón de
mango, Kaur y col. (2004), reportaron una temperatura de gelatinización de 73.4 ºC y valores
de entalpía de gelatinización de 12.8 J/g.
68
VII. Conclusiones
VII. CONCLUSIONES
1. En los estudios de microscopia de electrónica de barrido, los almidones presentaron tamaño
de gránulos grande (almidón de plátano), pequeño (almidón de mango) y muy pequeño
(almidón de okenia), con formas ovoides y esféricas.
2. En microscopia de luz polarizada, se observó la cruz de malta en los almidones estudiados,
lo que indica una organización estructural de los componentes del almidón dentro del
gránulo.
3. Los almidones estudiados presentaron diferencias con respecto a los niveles de
organización de rango corto y largo, esto puede influir en algunas de sus propiedades
funcionales y de digestibilidad.
4. Los estudios de dispersión de luz en forma estática y el análisis por la fractales mostraron
diferencias estructurales en los almidones.
5. El contenido de amilosa, la cristalinidad y los parámetros moleculares (MM y RG), tuvieron
efectos sobre la temperatura y entalpía de gelatinización de los almidones.
6. La información obtenida para los diferentes almidones estudiados, puede ser importante
para sugerir algunas aplicaciones específicas con la finalidad de desarrollar nuevos
productos.
69
VIII. Perspectivas
VIII. PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este trabajo de investigación, muestran evidencias de que
existen diferentes niveles de organización (morfológicos, estructurales y moleculares) de los
almidones de fuentes no convencionales. Así mismo sería conveniente complementar los
resultados obtenidos de masa molar y radio de giro de este trabajo, con otro sistema como es
cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por tamaño acoplado a detector de
dispersión de luz e índice de refracción.
Debido a que la amilopectina se encuentra en mayor cantidad en el gránulo del almidón,
sería recomendable, separar la amilosa y amilopectina, para realizar estudios estructurales de la
amilopectina y conocer la conformación de la molécula y su grado de ramificación. Para ello
sería pertinente desramificar la amilopectina para saber su longitud de cadena y grado de
polimerización, todo estos estudios a través de los sistemas de cromatografía de líquidos de alta
resolución de exclusión por tamaño y por cromatografía de líquidos de alta resolución de
intercambio aniónico (CLARIA) con un detector amperométrico de pulsos (DAP).
Mediante estos resultados, entender mejor la influencia que tiene la estructura en las
propiedades funcionales de los almidones. Esta información es una herramienta importante, para
modificar las rutas metabólicas de la biosíntesis del almidón, a través de técnicas de biología
molecular y se puedan producir almidones con determinado contenido de amilosa y
amilopectina o más allá almidones con cierta estructura molecular, los cuales deben presentar
mejores propiedades funcionales, y por lo tanto nuevas aplicaciones.
70
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