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Mini-Reseña
Diagnóstico Molecular de la Distrofia Muscular Duchenne:
Pasado, Presente y Futuro en Relación con la Aplicación de
Terapias
* Nigel G Laing (1), Mark R Davis (2), Klair Bayley (1), Sue Fletcher (3), Steve D Wilton (3)
(1) Centro para la Investigación Médica, Universidad de Australia Occidental M519, Instituto Australiano
Occidental de Investigación Médica, Centro Médico QEII, Nedlands, WA 6009
(2) Departamento de Anatomía Patológica, del Hospital Royal Perth, Perth, WA 6000
(3) Centro de trastornos neuromusculares y neurológicos de la Universidad de Australia Occidental, Centro
Médico QEII , Nedlands, WA 6009, Australia.
* Para correspondencia: Profesor Nigel Laing, [email protected]
Resumen
La distrofia muscular Duchenne (DMD) es la más común y más conocida de las distrofias musculares. Al ser un
trastorno ligado al cromosoma X, afecta principalmente a varones. El gen de la enfermedad fue identificado en
1987, con la mayoría de las mutaciones demostradas que eran deleciones a gran escala. Las actuales mejores
prácticas de diagnóstico molecular incluyen la amplificación de sonda dependiente de ligado múltiplex (MLPA),
seguido de secuenciación directa de todos los exones a nivel genómico o del ADNc, con el fin de detectar otras
mutaciones puntuales y pequeñas. La diferencia entre la DMD y la alélica distrofia muscular Becker (DMB) es
que la mutación exacta en el gen es una mutación nula o resulta en una proteína modificada todavía
parcialmente funcional. En los últimos años, importantes avances se han hecho moviendo terapias
experimentales a ensayos clínicos, con una de las posibles terapias más prometedoras siendo el salto de exón
inducido por oligonucleótido, lo que convierte a la DMD en DMB. Con el fin de maximizar los beneficios de las
futuras terapias, será necesario comenzar a administrar los tratamientos lo más temprano posible en la vida de
los niños afectados, antes de pérdida muscular significativa. Para ello será necesario un diagnóstico temprano, la
evidencia sugiere que se logra mejor mediante un tamizado de la población. El tamizado de la población también
permite evitar múltiples varones afectados en familias sin antecedentes familiares.
Introducción
La distrofia muscular Duchenne (DMD, OMIM
310200) es uno de los trastornos genéticos más
comunes y conocidos, que afectan a uno de cada
3,500 varones nacidos vivos. Es la más común y
más importante de las distrofias musculares. La
enfermedad lleva el nombre de Duchenne de
Boulogne, que describió la enfermedad en una serie
de documentos en la década de 1860, aunque la
enfermedad se describió antes por Meryon en
Inglaterra y otros lugares, incluyendo tal vez los
antiguos Egipcios (1). La DMD es una enfermedad
recesiva ligada al cromosoma X, lo que significa que
afecta principalmente a varones. La enfermedad,
como todas las distrofias musculares, resulta de la
degeneración y pérdida de fibras musculares. La
historia natural de la DMD incluye que los niños
afectados suelen quedar obligado a silla de ruedas
por los 12 años de edad, aunque la llegada de la
terapia con corticoesteroides (2-4) y soporte
avanzado ventilatorio (5) ha cambiado esta
situación, mejorando significativamente la calidad de
vida y esperanza de vida de los niños afectados.
El gen de la DMD (DMD) fue el primer mayor
descubrimiento de un gen de una enfermedad con la
"nueva genética" (6), que resultó ser el más grande
de genes humanos, en torno a 2,5 Mbp. Una vez
que se identificó el gen, se estableció que los niños
afectados eran carentes de distrofina, la proteína
producto del gen (7). La diferencia entre la severa
DMD y la alélica, más leve distrofia muscular Becker
(DMB), se encuentra en el efecto de diferentes
mutaciones en el gen, con la DMD causada
principalmente por deleciones fuera del marco de
lectura o duplicaciones que conducen a la pérdida
completa de la proteína, mientras que la DMB se
debe principalmente a deleciones dentro del marco
o duplicaciones que conducen a un tamaño
alterado, pero todavía funcional de la proteína (8).
La distrofina, la proteína producto del gen, es una
gran proteína estructural que une el citoesqueleto
interno de actina de la fibra muscular a una serie de
proteínas asociadas a la distrofina en la membrana
1
muscular (9). La ausencia de la proteína distrofina
en la DMD o la función anormal de la distrofina en la
DMB conduce a anormalidades en la membrana
muscular, que a su vez da lugar a daños y
finalmente la muerte de la fibra muscular (9, 10).
Diagnóstico molecular actual de la DMD/DMB
El defecto molecular más común en el gen DMD,
que representa aproximadamente el 65% de los
casos de DMD (y el 85% de los casos de DMB), es
la deleción (supresión) de uno o varios exones. La
duplicación de uno o más exones representa otro 610% de los casos tanto de la DMD y DMB, mientras
que la mayoría de los casos restantes se deben a
mutaciones puntuales, pequeñas
inserciones/deleciones o cambios en el sitio de
empalme. Cambios de reordenamientos complejos y
profundos intrónicos representan aproximadamente
el 2% de los casos de DMD (11-13).
El nivel mínimo de pruebas de diagnóstico que debe
llevarse a cabo es un tamiz que detecta la mayoría
de las deleciones exonicas. El método más básico
aún en uso regular implica PCR multiplex de los
exones que se sabe más comúnmente están
delecionados (13). Este método fue publicado por
primera vez por Chamberlain et al. en 1988 (14) y,
posteriormente, desarrollado por una serie de
grupos hasta el punto en el que dos juegos multiplex
que cubren los dos puntos calientes de mutación
podían detectar el ~ 98% de todas las deleciones
(15). La ventaja de este método es su relativa
sencillez, sin embargo no detecta duplicaciones, no
caracteriza a todos los puntos de interrupción de
deleción, y no puede ser utilizado para la prueba de
mujeres portadoras.
Los nuevos métodos que implican el análisis
cuantitativo de todos los exones del gen han dado
lugar a una mejora en la tasa de detección de
mutaciones, ya que detectará todas las deleciones a
escala de exón, así como duplicaciones. También
totalmente delinea las fronteras del exón para
mutaciones detectadas, y son capaces de detectar
las mutaciones en las mujeres portadoras. De los
métodos cuantitativos disponibles, amplificación de
sonda dependiente de ligado múltiplex (MLPA - un
kit comercial desarrollado por MRC-Holland) (16) es
ahora el que más se usa (13). Un punto importante a
destacar es que con los dos métodos descritos
hasta ahora, cualquier mutación aparente indicada
por una lectura anormal de una sola sonda debe ser
confirmada por un método alternativo, para dar
cuenta de la posibilidad de un polimorfismo de
nucleótido único (SNP) bajo una sonda o en el sitio
de unión del cebador.
Un desarrollo más reciente en el análisis cuantitativo
es el uso de oligonucleótidos basado en serie de
hibridación genómica comparativa (array-CGH) (12).
Este método analiza la copia en el número de
variación a través del gen entero, incluyendo
regiones intrónicas y flanqueantes 3 'y 5', que tiene
la ventaja añadida de detectar reordenamientos
complejos y alteraciones intrónicas de gran escala y
delinear puntos de ruptura de mutación mucho más
de cerca. La alta densidad de sondas (sonda a
intervalos que están en el orden de 144 pb en el gen
entero) también significa que la mayoría de las
mutaciones serán detectadas por las sondas
múltiples, controlando así la posibilidad de falsos
positivos debido a SNPs (12).
Si no se detecta deleción o duplicación, entonces,
en el caso de los pacientes con DMD, análisis de la
secuencia completa debe llevarse a cabo. La
secuenciación se puede realizar en cualquier ADN
genómico o ADNc derivado de músculo. El análisis
de ADN genómico tiene la ventaja de que no
requiere que el paciente se someta a una biopsia
muscular, sin embargo debido al gran número de
ampliaciones por separado para cubrir todos los 79
exones requiere un alto nivel de automatización en
el laboratorio para ser viable, aunque estos métodos
se han descrito desde algún tiempo (17). Análisis de
ADN genómico no detectaría mutaciones en el 2%
de los casos con reordenamientos complejos o
profundos cambios intrónicos. El análisis de ARN del
músculo por lo tanto, tiene una sensibilidad
ligeramente superior, y es más accesible para los
laboratorios con menos automatización, debido a la
cantidad mucho más manejable de los fragmentos
(~ 24), sin embargo la necesidad de una biopsia
muscular es una desventaja.
Debe tenerse en cuenta que el análisis de la
secuencia en pacientes con DMB tiene un valor
limitado, por lo menos a partir de ADN genómico. En
un estudio, de 23 pacientes sin deleción/duplicación,
sólo tres tenían variantes, las cuales fueron de
incertidumbre significante (11).
En resumen, la estrategia óptima para pruebas
moleculares para DMD, en la mejor practica actual,
lo que mejor equilibra los aspectos técnicos y
consideraciones del paciente es un tamiz inicial,
preferentemente cuantitativo, para detectar las
deleciones/duplicaciones, seguido por análisis de la
secuencia genómica completa del ADN (13). Si esto
sigue siendo negativo, una biopsia muscular se
debe realizar para permitir que los estudios de
proteínas y el análisis de DNAc, si se justifica. De la
DMB, si el tamiz de deleción/duplicación es
negativo, el siguiente paso es la biopsia muscular.
A través de Australia, la Red Neuromuscular de
Australasia (ANN) (http://www.ann.org.au) ha sido
establecida para proveer diagnóstico coordinado
molecular y anatomopatológico de la DMD, junto con
todos los trastornos neuromusculares.
2
Tratamientos Experimentales Siendo
Investigados para DMD
El tamaño y la distribución de la expresión del gen
de la distrofina ha planteado desafíos para el
desarrollo de terapias para DMD. Los estudios de
sustitución celular parecían tan prometedores en
modelos de ratón, pero resultó un fracaso
decepcionante cuando se aplico a los niños con
Duchenne (18). El estudio más reciente de
reemplazo de genes, utilizando un rAAV entregando
un transgén de la distrofina, se tradujo en bajo nivel,
de expresión de distrofina transitoria y respuesta
inmune mediada por células inmunes (19).
La falta de éxito en el reemplazo del gen de la
distrofina en la DMD ha solicitado la investigación
de intervenciones listas para el uso e indirectas que:
a) promuevan la regeneración muscular (20-24), b)
proteger los músculos del daño oxidativo (25-27), c)
la reparación o protección de las membranas (2830); d) modificar la producción de proteínas (31), e)
suprimir las vías de la inflamación (32, 33), y f)
suprimir las vías de la atrofia (34). Sin embargo,
aparte de los corticoides (35), ningunos otros
tratamientos farmacológicos validados para la DMD
han estado disponibles, y ninguna de estas
estrategias experimentales frente a la etiología
primaria de la DMD: la ausencia de distrofina
funcional. A pesar de esta limitación, los
tratamientos que otorguen beneficios en la DMD,
dado el carácter inexorablemente progresivo de la
enfermedad, es mejor que no hacer nada, y pueden
tener una utilidad adicional en combinación con la
terapéutica "molecular" que restauren el complejo
asociado a la distrofina y un grado de la integridad
del sarcolema.
A pesar que la restauración de la distrofina en el
músculo con DMD ha sido el objetivo principal, la
aplicación de pequeñas moléculas para aumentar la
homóloga de la distrofina, la utrofina, ha despertado
el interés sobre todo porque a diferencia de otras
terapias moleculares en fase de desarrollo, este
enfoque no está limitado por la naturaleza del
defecto en el gen de la distrofina causante de la
enfermedad. Sin embargo, estudios de fase 1 con
BMN-195 mediando la regulación de la utrofina se
suspendieron debido a los desafíos de farmacéutica
y farmacocinética. Además, la sobre-expresión
utrofina fallo en proteger el musculo del ratón
distrófico (mdx) de daño asociado al ejercicio, y los
datos sugieren que la utrofina de largo completo no
puede anclar al nNOS al sarcolema (36).
los mejores resultados para los pacientes con DMD
es probable que resulten de la aplicación temprana
de tratamientos que restauren la expresión de
diversas isoformas de la distrofina en tejidos
específicos, bajo control endógeno apropiado. Hasta
la fecha, tanto en la lectura a través de una
mutación sin sentido (codón de parada prematuro),
como el salto de exón inducido, han demostrado
potencial para ofrecer este resultado. Las
mutaciones sin sentido causan alrededor del 1015% de los casos de DMD. Las terapias que
inducen lectura ribosomal a través de los codones
de terminación prematuros permiten la producción
de una proteína funcional de largo completo, y tanto
los aminoglucósidos como el Ataluren (PTC124) han
sido sometidos a evaluación clínica (37). El ensayo
con Ataluren no cumplió con los objetivos primarios
y secundarios, pero los datos son objeto de reevaluación. Tratamiento con aminoglucósidos ha
resultado en la expresión de distrofina funcional y
algunas mejoras (38).
Uno de los enfoques más prometedores para el
tratamiento de la DMD es el salto de exón inducido
con oligonucleótidos en antisentido, donde la
maquinaria celular es engañada para saltar (u omitir)
un exón que contiene una mutación causante de la
enfermedad o alterar una deleción o duplicación, de
manera que una mutación nula ya no se genera y la
DMD se convierte en un moderado fenotipo DMB
(39, 40). Teóricamente, el 83% de los pacientes con
Duchenne podrían ser tratados con oligonucleótidos
en anti-sentido (41). Expresión inequívoca,
localizada de distrofina en el músculo de pacientes
con DMD fue inducida por la eliminación del exón
51, mediado por la inyección intramuscular directa
de oligómeros en antisentido: PRO051 (bases 2'-Ometilo modificadas en un esqueleto fosforotioato)
(42) y AVI-4658 (oligómero fosforodiamido
morfolino) (43). El primer informe de la
administración sistémica del PRO051 ha mostrado,
niveles de baja expresión muy extendida de
distrofina, con efectos secundarios limitados (44).
Si bien los resultados de estos ensayos son
ciertamente alentadores, debemos seguir siendo
conscientes de los muchos obstáculos por delante, y
que para muchas familias, la aplicación oportuna de
estas terapias es un imperativo. El salto de exón
inducido por oligómero en antisentido demanda
terapias a medida para diferentes mutaciones. Esto
se basa en un diagnóstico genético preciso de los
pacientes jóvenes en una etapa temprana de la
enfermedad, ya que el beneficio será mayor antes
de perdida muscular importante (45). Es necesario
que se considere el desarrollo preclínico de muchos
diferentes compuestos terapéuticos para la DMD, y
administrar el salto de exón como una medicina
genética personalizada. El desarrollo clínico de un
compuesto que sólo beneficiará a un pequeño
subgrupo de población (en algunos casos una sola
persona) requiere cambios fundamentales en la
fabricación de medicamentos, evaluación,
validación, aprobación y suministro.
3
Tamizado Poblacional de la DMD
Como se mencionó anteriormente, la mejor terapia
practicada para DMD requerirá la identificación
temprana de los niños afectados, para permitir la
aplicación de tratamiento antes de que el tejido
muscular se pierda irrevocablemente. Esto también
puede incluir terapia con corticoesteroides de los
que existe alguna evidencia de que la intervención
temprana produce resultados muy beneficioso (46,
47).
Uno de los problemas en la detección de niños con
DMD es que debido a la matemática de la genética
ligada al cromosoma X (48, 49) muchos no tienen
antecedentes familiares y por lo tanto, aparecen
como casos esporádicos sin previo aviso (33% de
los niños afectados y el 33% de las madres tienen
mutaciones de novo) (49). Muchas sugerencias se
han hecho en cuanto a la forma de desarrollar
métodos de identificación temprana de los niños
afectados, incluyendo tamiz de niños con retraso en
el desarrollo (50). Sin embargo, todos estos intentos
no han logrado desplazar el momento del
diagnóstico anterior, con una edad promedio de
diagnóstico, en uno de los pocos estudios
publicados, siendo 4 años y 10 meses con un rango
de 1 año y 4 meses a 8 años y 3 meses (51). La
experiencia de otros países es similar, incluyendo la
experiencia actual en el oeste de Australia (datos no
publicados). La conclusión de los trabajos
publicados es que la única manera de identificar con
éxito los pacientes con DMD temprana es a través
de tamizado de la población (51, 52). Tamizado de
la población en la actualidad sólo se realiza en unos
pocos lugares en el mundo. Uno de los mejores
programas publicados, es en el País de Gales, que
ha estado funcionando con éxito durante 20 años y
se realiza por análisis de recién nacidos de
Duchenne, con niveles séricos elevados de creatina
kinasa, como herramienta de proyección (53, 54).
Tamiz neonatal detecta el primer niño nacido
afectado en una familia poco después de nacer. Se
podría argumentar en cuanto a si esto es demasiado
precoz y el tamizado de la población se debe ofrecer
a una edad un poco más tarde, pero de recién
nacidos parece funcionar (54), y se está
investigando, junto con programas destinados a
mayores etapas, en más y más jurisdicciones, por
ejemplo, partes de EUA (55, 56). Implementación de
programas de tamiz poblacional de DMD podría
cambiar el panorama de mejores prácticas de
diagnóstico, pero todavía basado en las mismas
herramientas de diagnóstico y permitir la
intervención temprana con terapia.
Otro efecto importante de la detección temprana de
Duchenne es que puede permitir asesoramiento
genético temprano y la oportunidad de evitar casos
secundarios en un hermano o la familia extendida y
ofrece la posibilidad de prevención de un porcentaje
significativo de los casos de DMD (50, 54), mientras
que esto no es posible cuando la detección
temprana no se da en el lugar, con el resultado de
varios niños afectados en las familias que carecen
de historia familiar anterior (51).
También se ha sugerido durante muchos años, que
el diagnóstico de DMD debe centrarse en el
diagnóstico de las mujeres que son portadoras de
DMD, antes de que sean identificadas a través de
tener niños afectados (45, 57, 58). Esto sería un
cambio radical de las prácticas actuales de tamizado
poblacional para la DMD, pero está más en línea
con la práctica actual de la detección de portadores
de otras enfermedades comunes, tales como fibrosis
cística recesiva (59, 60).
Conclusión
El diagnóstico molecular para la DMD es complicado
por el gran tamaño del gen y la de varios tipos
diferentes de mutación. Sin embargo, una estrategia
óptima de las pruebas moleculares y directrices de
mejores prácticas han sido establecidas. El interés
actual mayor en la DMD es que finalmente, después
de más de 20 años desde que el gen DMD fue
identificado, los tratamientos experimentales se ven
más prometedores, con múltiples tratamientos
experimentales recientemente o actualmente en
ensayos clínicos. Uno de los más prometedores
parece ser el salto de exón inducido por
oligonucleótidos en antisentido. Si alguno de los
tratamientos en ensayos clínicos prueba es eficaz, el
pensamiento actual es que el máximo beneficio para
el paciente se obtendrá a partir de empezar
tratamientos temprano, antes de que significativa
patología muscular se desarrolle. La intervención
temprana requiere un diagnóstico precoz y el
diagnóstico precoz más eficaz parece ser algún tipo
de tamizado de la población, ya sea recién nacido, o
de detección a una edad un poco más tarde. Para
aquellos que han trabajado con DMD durante un
período prolongado, este es otro momento
emocionante para estar involucrado con la
enfermedad.
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Traducción al español: Ricardo Rojas Caballero
[email protected]
http://www.distrofia-mexico.org
Para Upa! Cura Duchenne
http://upaduchenne.org
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