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Facultat de Ciències
Memòria del Treball de Fi de Grau
Química de coordinación de iones metálicos y
componentes de ácidos nucleicos.
Blas Moreno Vachiano
Grau de Química
Any acadèmic 2014-15
DNI de l’alumne: 43157864C
Treball tutelat per Àngel Terrón Homar
Departament de Química Inorgànica
X
S'autoritza la Universitat a incloure el meu treball en el Repositori Institucional per a la
seva consulta en accés obert i difusió en línea, amb finalitats exclusivament acadèmiques
i d'investigació
Paraules clau del treball:
Guanina, adenina, citosina, timina, uracil, parell de bases, Au(III), Hg(II), Ag(I), Pt(II).
1
2
Índice
Abreviaturas...................................................................................................................... 4
Motivación del tema ......................................................................................................... 4
1.
Introducción .............................................................................................................. 4
1.1 Pares de bases ......................................................................................................... 5
1.2 Incorporación de metal de transición entre pares de bases compuestos por
pirimidinas. ................................................................................................................... 8
1.3 Incorporación de metal de transición entre pares de bases compuestos por purinas
y pirimidinas. .............................................................................................................. 15
1.4 Recopilación de las estructuras de rayos X conocidas entre pares de bases en los
que haya una base pirimidínica. ................................................................................. 17
2.
Parte experimental .................................................................................................. 18
2.1 Procedimientos experimentales realizados con el ion metálico Hg+2................... 18
2.2 Procedimientos experimentales realizados con el ion metálico Ag+. ................... 21
2.3 Procedimientos experimentales realizados con el ion metálico Pt+2. ................... 22
2.4 Procedimientos experimentales realizados con el ion metálico Au+3................... 26
2.5 Materiales y métodos. ........................................................................................... 28
3 Resultados y discusión. ............................................................................................... 30
3
Abreviaturas más utilizadas:
Guanosina-5-monofosfato
Citidina-5-monofosfato
Guanina
Adenina
Citosina
Timina
Uracilo
5-Fluorouracilo
GMP
CMP
G
A
C
T
C
5F
U
Motivación del tema
Atendiendo al interés de la formación de pares de bases análogos a los que se forman en
el reconocimiento de las cadenas de ADN o ARN (en los que un ion metálico sustituye
a un protón implicado en un enlace de hidrógeno) se ha realizado un estudio
bibliográfico exhaustivo de los pocos ejemplos descritos por difracción de rayos X en
los que al menos contenga una base pirimidínica.
Utilizando sales de Hg+2, Pt+2, Ag+ y Au+3, y una serie de bases púricas y pirimidínicas
se ha realizado un estudio de exploración de posibles rutas sintéticas para aislar los
compuestos deseados bien caracterizados. En la parte práctica se han ido modificando
las condiciones de síntesis con el fin de obtener nuevos compuestos y, especialmente,
cristales adecuados para ser determinados por medio de la difracción de rayos X.
1. Introduccion
Desde 1950 se ha intentado incorporar metales de transición a los estudios con pares de
bases para conocer los cambios que podrían producirse entre dichos pares de bases. Se
descubrió que había diferencias significativas con los contraiones naturales de los pares
de bases contenidos en el ADN y ARN intracelular (alcalinos y alcalinotérreos). Los
iones alcalinos y alcalinotérreos naturales eran atraídos por medio de cargas
electrostáticas, por los grupos fosfatos, con lo cual dichos cationes se disponían en la
periferia de la estructura del ADN y ARN. No hay que olvidar también las interacciones
del ion potasio con varios restos guanina en los telómeros del ADN y los tetrámeros de
uracilo con sodio en los ARN. En contraposición, los metales de transición forman un
enlace de coordinación con las nucleobases dando lugar a enlaces más fuertes a los
anteriormente mencionados generando cinéticas de coordinación más lentas, lo cual
provoca variaciones en la temperatura de fusión de los ácidos nucleicos, desplazamiento
4
de protones y preferencias específicas de los iones metálicos por las diferentes
nucleobases.1
En el presente trabajo el interés principal es establecer la posibilidad de incorporar un
metal de transición entre un par de bases de ADN y también interacciones similares en
el ARN que puedan explicar sus plegamientos (ej. Mg+2).2 Y en concreto revisar la
bibliografía de compuestos modelos sobre el tema; y en la parte experimental avanzar
en la síntesis y caracterización de modelos de la interacción del metal con los pares de
bases seleccionadas en función de factores de solubilidad.3
1.1 Pares de bases
El enlace de hidrógeno lleva a cabo un papel importante en el ensamblaje de los pares
de bases, controlando uno de los procesos biológicos necesarios para el reconocimiento
selectivo entre las dos cadenas del ADN helicoidal. Dicha interacción no covalente es la
responsable de la autorreplicación en el ADN y de la transmisión de información de una
célula madre a una célula hija.4
Se conocen diferentes formas de unión entre los pares de bases, de hecho hay 28
reconocimientos posibles que incluyen como mínimo dos enlaces de hidrógeno.5
Comentaremos las más importantes, especialmente aquellas que tienen significado
biológico.
1. Watson-Crick. Las nucleobases del ADN interaccionan por medio de enlaces
de hidrógeno uniendo una base pirimidínica y una base púrica a la vez, por
complementariedad en tamaño, forma y número de puntos de unión. De esta
forma la timina y la adenina son reconocidas por tener dos puntos de unión
característicos (el N3 de la timina con el N1 de la adenina y el O4 de la timina
con el N6 de la adenina), mientras que la citosina y la guanina son reconocidas
por tener tres puntos de unión característicos (el O2 de la citosina con el N2 de la
guanina, el N3 de la citosina con el N1 de la guanina y el N4 de la citosina con el
O6 de la guanina). Los pares de bases Watson-Crick son, con diferencia, los más
abundantes en el ADN y el ARN. A continuación se puede observar en la
ilustración Figura 1 dichas interacciones indicando todos sus enlaces de
hidrógeno:
1
B. Lippert en Nucleic Acid-Metal Ion Interactions, N. V. Hud (ed), Royal Society of Chemistry, Oxford
(2009), pp 39-74.
2
D. A. Megger, N. Megger, J. Müller, Met. Ions in Life Science, 10 (2012) 295-317.
3
A. Ono, H. Torigoe, Y. Tanaka, I. Okamoto, Chem. Soc. Rev., 40 (2011) 5855-5866.
4
W. Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York (1984).
5
I. Tinoko Jr en RNA World, R. F. Gesteland, J. F. Atkins (ed), Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1993), Apéndice 1 pp 603-607.
5
Figura 1. Pares de bases Watson-Crick.
2. Hoogsteen. Es una variación de los pares de bases habituales nombrados
anteriormente. Se sabe que ocurre en el par de bases A-T y se deduce que
también puede ocurrir en el par de bases G-C por medio de la protonación del N3
en la citosina. En el par de bases A-T se lleva a cabo un cambio en las
posiciones enlazantes del enlace de hidrógeno, dicha modificación es el N3 de la
timina y el N1 de la adenina por el N3 de la timina y el N7 de la adenina
(producido por un giro de 180º por parte de la adenina). El cambio de
conformación de los pares de bases varía considerablemente las propiedades
comparando con los pares de bases Watson-Crick. El ángulo entre los dos
enlaces glucosídicos pasa a ser mayor (80º) al mismo tiempo que la distancia se
hace menor. Las técnicas de RMN en ADN libre no identifican la presencia de
pares de bases Hoogsteen en la estructura, dando a entender que la cantidad de
dichos pares de bases se encuentran en una proporción muy reducida comparada
con los pares de bases Watson-Crick. Sin embargo se sabe que están presentes
en diferentes zonas del ADN, ya que provoca una distorsión significativa en la
doble cadena de ADN6. En la imagen siguiente (Figura 2) podemos observar la
diferencia entre los pares de bases Watson-Crick y Hoogsteen:
Figura 2. Diferencia entre pares de bases Watson-Crick y Hoogsteen7.
6
J. Aishima, R. K. Gitti, J. E. Noah, H. H. Gan, T. Schlick, C. Wolberger, Nucleic Acids Research, 30
(2002) 5244-5252.
7
E. N. Nikolova, E. Kim, A. A. Wise, P. J. O’Brien, I. Andricioaei, H. M. Al-Hashimi, Nature, 470
(2011), 498-502.
6
3. Haschemeyer-Sobell (o Hoogsteen inverso) es la unión por enlace de hidrógeno
en el aducto timina-adenina.
Figura 3. Estructura de los pares de bases Haschemeyer-Sobell.
Las diferentes nucleobases poseen características ácido-base, eso quiere decir que
dependiendo del pH en el que se encuentren pueden actuar como ácido o como base.
Cada una de las nucleobases posee un intervalo propio de pH diferente entre ellas, como
se puede observar en la siguiente Figura 4:
Figura 4. Intervalos de pH para las diferentes nucleobases.
Los rangos de pH que aparecen en la Figura 4 son orientativos, ya que esos valores
fluctúan dependiendo del tipo de sustituyente que contenga en una posición concreta.
En el caso del uracilo cambiando el sustituyente en la posición 5 obtenemos los
diferentes valores de pKa observados a continuación:2
Figura 5. Diferentes valores de pKa para los diferentes derivados de uracilo para la protonación del grupo
amino desprotegido.
7
Cuando un metal de transición relativamente polarizante (como es el caso del Hg+2,
Pt+2, etc.) interacciona con las nucleobases provoca una reordenación de la distribución
electrónica que en algunos casos facilita la desprotonación del grupo amino (por
ejemplo de la adenina). Podríamos decir que actúa como un grupo sustituyente análogo
al metilo, fluoruro o ciano que hemos representado en la Figura 5. También cabe la
posibilidad que el metal de transición se encuentre unido a un coligando o incluso al
disolvente, capaz de ceder H, disminuyendo aún más el valor del pKa del grupo amino,
obteniendo valores similares al rango fisiológico, como se indica en la Figura 6.8
Figura 6. Variación del pKa del grupo amino en función del ión metal (Pt +2)8.
1.2 Incorporación de metal de transición entre pares de
bases compuestos por pirimidinas.
La interacción de un ion metálico entre pares de bases de un ácido nucleico es un tema
de gran interés. En estos casos se desearía que el metal sustituyera a unos de los
hidrógenos del enlace entre las bases. La selectividad y la variación de las propiedades
de los ácidos nucleicos podría ser objeto de diferentes aplicaciones.2
A continuación se irán refiriendo los datos de la bibliografía existente.
1.2.1 Hg +2 incorporado entre pares de bases no estándar T:T.
En el año 1952, se observó una disminución de la viscosidad y un aumento de la
turbidez en el ADN al añadir HgCl2. Las primeras explicaciones de la reducción de
tamaño y aumento en el peso molecular del ADN era que el Hg+2 interaccionaba con los
grupos fosfato disminuyendo la repulsión entre ellos favoreciendo dicha compactación
al mismo tiempo que parte del Hg+2 era agregado al ADN. Más adelante mediante la
medida en el índice de refracción (obteniendo valores similares al ADN libre) y gracias
al espectro de absorción UV (obteniendo variaciones considerables al ADN libre) se
dedujo que el Hg+2 se encontraba interaccionando directamente con los pares de bases.9
8
M. Garijo, M. Sven, M. Roitzsch, M. Morell, P. Lax, G. Kampf, H. Sigel, B. Lippert, Chem. Eur. J., 10
(2004) 106.
9
C. A. Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76 (1954) 6032-6034.
8
La formación del complejo propuesto por Katz10 contenía una composición 2:1,
compuesto por 2 nucleobases de timina desprotonadas unidas con el ion metálico Hg+2.
El complejo resultante, con una carga igual a 0, se encuentra en una conformación
cisoide mostrada en la Figura 7.3
Figura 7. Representación de los pares de bases no estándar T:T y la formación del complejo T-Hg-T. 11
La estabilidad del compuesto de Hg(II) con dos hebras de ADN es tal que su
temperatura de fusión aumenta considerablemente cerca de 10ºC (de 37 a 47ºC). Dicha
estabilización es mayor que la presentada por el par de bases A:T llegando a un valor de
temperatura de fusión de 44ºC. Por lo tanto, la formación del complejo T-Hg-T de dos
restos timina de un ADN es, además de favorable, selectivo; revelando una constante de
unión para la formación de este complejo con un valor de 106 M-1. 11
Los estudios llevados a cabo para la determinación de este complejo se describen a
continuación:
-Estudiando el 1H-RMN para el par de bases T:T y para la formación del complejo THg-T, se observa en los pares de bases T:T las banda características de los protones del
grupo imino (N3) de las timinas, este espectro comparado con el obtenido a
continuación para la formación del complejo T-Hg-T, indica como dichas bandas van
desapareciendo a medida que va aumentando la concentración de Hg+2 en el medio,
deduciéndose que el ion metálico Hg+2 va sustituyendo los protones del átomo N3 de las
timinas formando el complejo T-Hg-T.
-El marcado isotópico con N15 para el grupo imino situado en el átomo N3 de cada una
de las timinas detectado mediante 15N-RMN, proporcionó la primera prueba sobre la
formación de este complejo dentro de la doble hélice de ADN. A medida que
aumentaba la cantidad de Hg+2 en el medio, la señal del 15N era desplazada hasta un
valor igual a 30 ppm.12
Se han descrito también dos estructuras cristalinas. La primera con la base 1-metiltimina
que se observa en la siguiente Figura 8.13 Los grupos 1-metil de la timina están en trans
(configuración transoide).
10
S. Katz, Biochim. Biophys. Acta, 68 (1963) 240-253.
H. Torigoe, A. Ono, T. Kozasa, Chem. Eur. J., 16 (2010) 13218-13225.
12
Y. Tanaka, S. Oda, H. Yamaguchi, Y. Kondo, C. Kojima, A. Ono, J. Am. Chem. Soc., 129 (2007) 244245.
13
L. D. Kosturko, C. Folzer, R. F. Stewart, Biochemistry, 13 (1974) 3949-3952.
11
9
Figura 8. Estructura molecular del complejo T-Hg-T usando como nucleobase la 1-metiltimina que presenta la
disposición transoide.2
La segunda estructura de rayos X corresponde a un dúplex artificial complementario,
salvo en varias posiciones que enfrentan bases de timina. Esta estructura ha sido
obtenida muy recientemente, y en ella podemos observar que los restos de ribosa están
en posición cisoide como en el ADN (Figura 9).14
Figura 9. Estructura de rayos X para el complejo T-Hg-T, a) indica el fragmento de la imagen b) para
observar la formación del complejo T-Hg-T en posición cisoide, b) representa la localización del complejo THg-T en el dodecámero con polinucleótidos complementarios en posición cisoide.14
La formación de esta interacción T-Hg-T con ADN ha sido utilizada ampliamente en
forma de sensor para la detección de Hg+2 (contaminante tóxico para el medio
ambiente) en disolución acuosa. El motivo principal para ese uso es la atenuación que
provoca en la fluorescencia la presencia de Hg+2 en los oligonucleótidos (elegidos
estratégicamente) dispuestos en forma de cadena lineal. Al incorporar Hg+2 modifica su
estructura en forma de horquilla. Ningún otro catión contiene tan alta especificidad ni
tan alta influencia en el espectro de fluorescencia, por ello, con este método se obtienen
límites de detección considerablemente bajos.2
1.2.2 Hg +2 incorporado entre pares de bases no estándar U:U .
De forma análoga al caso anterior, los pares de bases no estándar U:U sustituyen a los
pares de bases T:T en el ARN. La única diferencia entre la nucleobase timina y el
uracilo es el grupo metilo en la posición del carbono 5. Por ese motivo, es comprensible
14
J. Kondo, T. Yamada, C. Hirose, I. Okamoto, Y. Tanaka, A. Ono, , Angew. Chem. Int. Ed., 53 (2014)
2385-2388.
10
la formación del complejo U-Hg-U análogo al caso anterior, pero relacionado con
interacciones en el ARN.
Cabe mencionar que el grupo de Bioinorgánica de la UIB ha proporcionado,
previamente a la estructura de Ono,14 los mejores ejemplos que existen en la bibliografía
para las interacciones entre uracilos U-Hg-U.15 Se utilizó, en un caso, como nucleobase
el N1-hexil-5-fluorouracilo, obteniendo como resultado el complejo [Hg(N1-hexil-5fluorouracilato)2]4·6H2O que podemos observar en la Figura 10.
Figura 10. Estructura determinada para [Hg(N1-hexil-5-fluorouracilato)2]4·6H2O donde las cadenas alifáticas
de cada uracilo han sido omitidas.
En la Figura 10, se observa como el Hg+2 se enlaza al N3 del fluorouracilo además de
interaccionar con los oxígenos colindantes generando una estructura similar a las palas
de una hélice con ángulos de 32,95º [Hg (1)] y 68,10º [Hg (2)] entre los planos del
anillo de cada uracilo del par formado. Dicha torsión es observada en muchas
estructuras de ADN mejorando el apilamiento de las bases en las hebras.15
También cabe mencionar la estructura obtenida con el ligando N1-(3-hidroxipropil)-5fluorouracilo con el Hg+2 detallada por el grupo de Bioinorgánica de la UIB por medio
de difracción de rayos X. Se presenta como un complejo en el que hay dímeros U-Hg-U
con un enlace esencialmente en línea. En estado sólido se observa que el Hg se enlaza,
además del N3 de los ligandos, a los grupos hidroxilos O (10) para formar planos. Dicha
estructura se ilustra en la siguiente Figura 11.16
Figura 11. Estructura lineal del complejo [Hg(N1-(3-hidroxipropil)-5-fluorouracilato)2].16
15
M. Barceló-Oliver, B. A. Baquero, A. Bauzá, A. García-Raso, R. Vic, I. Mata, E. Molins, A. Terrón, A.
Frontera, Dalton Trans, 42 (2013) 7631-7642.
16
A. Bauza, A. Terrón, M. Barceló-Oliver, A. Garcia-Raso, A. Frontera, Inorg. Chem. Acta, aceptado
para su publicación DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.ica.2015.04.028 .
11
De esta forma permite extender la estructura en dos dimensiones, generando la siguiente
formación de capas en el compuesto.
Figura 12. Formación de capas a partir de las cadenas del complejo.16
Las capas se apilan entre sí gracias a una novedosa interacción C-F···O=C y enlaces de
hidrógeno dando lugar a la estructura tridimensional.
1.2. 3 Ag + incorporado entre pares de bases no estándar U:U.
Se ha observado que el ion Ag+ es capaz de interaccionar con los pares de bases U:U, de
forma similar al Hg+2, sustituyendo los protones situados en el N3 de ambos uracilos.
Existen diferencias significativas entre los complejos U-Hg-U y U-Ag-U, ya que el ion
Ag+ además de enlazarse con los N3 de los uracilos es capaz de interaccionar con los
oxígenos colindantes de las nucleobases, formando una cadena 1D infinita y
estabilizando la formación del complejo. Dichas interacciones pueden observarse en la
Figura 10.15
Figura 13. Estructura de la unidad asimétrica del compuesto polimérico (Ag+)·[Ag(N1-hexil-5fluorouracilato)2]-.
12
En la Figura 10 se observa como el segundo ion Ag+ se encuentra coordinado a través
de otros cuatro átomos de oxígeno en un ambiente tetraédrico distorsionado. Estos iones
alinean las distintas unidades monoméricas.
1.2.4 Ag + incorporado entre pares de bases no estándar C:C.
La citosina es también una nucleobase natural con la cual se han llevado a cabo
múltiples experimentos con diferentes iones metálicos de transición. Se ha descrito por
diferentes autores la formación de un par de bases citosina-citosinio (citosina protonada
en el N3).17 Al parecer, el ion metálico capaz de estabilizar considerablemente este par
de bases no estándares C-C de una manera selectiva es la Ag+.18
El complejo C-Ag-C se formaría mediante la sustitución del protón situado en el N3 de
una de las citosinas por el ion Ag+. Dicho complejo es estabilizado por medio de una
conformación transoide, ya que posibilita la formación de enlaces de hidrógeno entre
los pares de bases estabilizando la formación del complejo. Dicha conformación
haciendo uso de una citosina y una 5-metilcitosina aumenta el punto de fusión
aproximadamente 18,9ºC en comparación con el par de bases C:C. En cambio para dos
citosinas la conformación cisoide solo consigue aumentar la temperatura del punto de
fusión 4,8ºC.19 La constante de unión específica entre la Ag+ y los pares de bases C:C
en el dúplex de ADN se encuentra en el rango de 10-5M-1.20
Figura 14. Representación de las diferentes conformaciones para el complejo C-Ag-C. En el a) podemos
observarla conformación cisoide, en el b) podemos observar la conformación transoide y en el c) podemos
observar la conformación transoide de la citosina y la 5-metilcitosina.19
De forma similar al sensor de Hg+2, al introducir una cadena de oligonucleótidos
produce una disminución de la fluorescencia al haber en la disolución cierta cantidad de
Ag+, ya que produce la formación del complejo C-Ag-C generando un cambio de
conformación en la cadena de oligonucleótidos, obteniendo límites de detección en el
rango de nanomolar.21
1.2.5 Diferente grado de interacción entre metales de transición y
derivados pirimidínicos variando las condiciones del medio.
17
M. Barceló-Oliver, B. A. Baquero, A. Bauzá, A. García-Raso, A. Terrón, I. Mata, E. Molins, A.
Frontera, CrysEngComm, 14 (2012) 5777-5784.
18
T. Yamane, N. Davidson, Biochim. Biophys. Acta, 55 (1962) 609-621.
19
T. Ono, K. Yoshida, Y. Saotome, R. Sakabe, I. Okamoto, A. Ono, Chem. Commun., 47 (2011) 15421544.
20
H. Torigoe, Y. Miyakawa. A. Ono, T. Kozasa, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 30 (2011) 149167.
21
Y. Wen, F. Xing, S. Song, L. Wang, Y. Long, D. Li, C. Fan, Chem. Commun., 46 (2010) 2596-2598.
13
En la Figura 5 se observa como una misma nucleobase presenta diferente pKa
dependiendo del sustituyente en la posición 5, de igual forma, el cambio en el pKa de
los derivados pirimidínicos está íntimamente relacionada con el carácter nucleofílico del
ligando variando así la afinidad de los diferentes metales de transición como es el caso
de la Ag+ y del Hg+2. En el caso del ligando 5-fluorouracilo contiene un pKa de 7,7, el
ion Hg+2 genera mayor estabilidad con el ligando que el ion Ag+, aumentando la
temperatura de fusión, tanto en pH ligeramente ácido como neutro, con un valor de
7ºC.22
Sin embargo en unas condiciones de pH ligeramente básicas ocurre todo lo contrario, el
ion Ag+ es capaz de generar mayor estabilización con el ligando que el ion Hg+2,
aumentando la temperatura de fusión 14ºC mientras que el ion Hg+2 sólo consigue
aumentarla 6ºC. Como modelo de esta interacción existe un monocristal del complejo
[Ag2(1-metiluracilato)2] que fue estudiado por difracción de rayos X obteniendo la
siguiente estructura (Figura 15).23
Figura 15. Estructura del complejo [Ag2(1-metiluracilato)2].23
1.3 Incorporación de metal de transición entre pares de
bases compuestos por purinas y pirimidinas.
En la actualidad se dispone de pocas estructuras en los que un metal de transición es
incorporado entre pares de bases complementarias (Watson-Crick) obteniendo como
resultado monocristales para llevar a cabo un análisis de rayos X. Los metales de
transición que han hecho posible la obtención de resultados óptimos de los cuales se han
conseguido determinar las estructuras de dichos monocristales han sido Au+3 y Pt+2.
En el caso del ion metálico Au+3, se ha obtenido un monocristal con los pares de bases
C:G formando un complejo C-Au-G.24 Dicho complejo monocristalino se obtuvo
mediante la dispersión de una disolución de Au+3 sobre un cristal de ARN obteniendo
diferentes señales de absorción para el cristal de ARN antes y después de ponerlo en
contacto con dicha disolución. Dichas señales anómalas se encontraban relacionadas
22
I. Okamoto, K. Iwamoto, Y. Watanabe, Y. Miyake, A. Ono, Angew. Chem. Int. Ed., 48 (2009) 16481651.
23
K. Aoki, W. Saenger, Acta Cryst., C40 (1984) 775-778.
24
E. Ennifar, P. Walter, P. Dumas, Nucl. Acid. Res., 31 (2003) 2671-2682.
14
con el ion Au+3 que se había incorporado en la estructura del cristal de ARN indicando
la desprotonación del N1 de la guanina e incorporándose dentro del par de bases (similar
a la incorporación de Hg+2 entre los pares de bases T-T, que necesita la previa
desprotonación para incorporarse en la estructura). La incorporación del ion Au+3 genera
una distorsión que favorece la geometría de plano cuadrado propia de este tipo de ion
metálico de transición y parece indicar la desprotonación del N1 de la guanina. En la
Figura 16 se puede observar dicha estructura geométrica de plano cuadrado para el
complejo.
Figura 16. Representación de la estructura del complejo C-Au-G en un ARN.24
Sería conveniente disponer de una estructura cristalina con bases modelos que
permitiera una mayor precisión en la determinación, ya que esta se refiere a una
macromolécula de ARN.
Para el caso del ion metálico Pt+2, se han obtenido dos estructuras monocristalinas, en
una utilizando el par de bases C:G, y en otra haciendo uso del par de bases A:T.
En el primer caso, a partir del transplatino ([PtCl2(NH3)2]), se obtuvo un monocristal
cuya estructura fue determinada mediante rayos X sobre el complejo C-Pt-G (Figura 17)
en el que el complejo de partida ha sustituido los dos cloruros. En dicha figura se
observa cómo el transplatino se une a la guanina por el N7, en vez de por el N1,
generando pares de bases Hoogsteen con el transplatino intermedio, diferente al habitual
que sería por medio de pares de bases Watson-Crick.25
Figura 17. Estructura del transplatino incorporado entre el par de bases G:C.
25
A. Erxleben, S. Metzger, J. F. Britten, C. J. L. Lock, A. Albinati, B. Lippert, Inorg. Chim. Acta, 339
(2002) 461.
15
Esta coordinación del Pt(II) con el N7 de la guanina de un ADN altera su estructura y
provoca que la célula reconozca como dañada la misma. Al no poder reparar el error
genético la célula genera una serie de reacciones en cadena que finaliza con la muerte
celular por apoptosis, por ese motivo se utiliza el cisplatino como medicamente
anticancerígeno.26
El siguiente complejo fue formado a partir de dos bases, 9-etiladenina y 1-metiluracilo,
y el complejo metálico trans-[PtCl2(NH2-CH3)2] en el que se conservan los ligandos
metilammino y se sustituyen los dos grupos cloruro por las bases mencionadas. Resulta
ser un complejo cuaternario, sintetizado a partir de una extrema acidificación con
posterior formación de monocristales, dichos monocristales están compuestos por dos 9etiladenina, y dos 1-metiluracilatos unidos a través de tres transplatinos. Entre los pares
de bases, el trans-[Pt(NH2-CH3)2]+2 se encuentra unido al N3 del 1-metiluracilato y al N1
de la 9-etiladenina mientras que uniendo los dos pares de bases por el N7 de ambas 9etiladeninas se encuentra el trans-[Pt(NH3)2]+2.27 Por medio de la difracción de rayos X
se obtiene dicha estructura del complejo cuaternario que resulta ser perfectamente
planar y se puede observar en la siguiente Figura 18.
Figura 18 Estructura del complejo cuaternario.
También se obtuvo la estructura relacionada del complejo (1,3-dimetiluraciloC5)Hg(9metiladenina)NO3·H2O en la que el metal enlaza al N6 de la adenina y el C5 del uracilo
(Figura 19).28
26
K. R. Barnes, S. J. Lippard, “Cisplatin and Related Anticancer Drugs: Recent Advances and Insights”
en A. Sigel, H. Sigel (eds), Met. Ions Biol. System., 42 (2004) 143-177.
27
M. S. Luth, M. Willermann, B. Lippert, Chem. Commun., (2001) 2058-2059.
28
F. Zamora, M. Kunsman, M. Sabat, B. Lippert, Inorg. Chem. 36 (1977) 1583-87.
16
Figura 19: Ejemplo de complejo organometálico caracterizado mediante rayos X. Estructura del complejo
[(1,3-dimetiluracilo-C5)Hg(9-metiladenina)]NO3·H2O.
1.4 Recopilación de las estructuras de rayos X conocidas
entre pares de bases en los que haya una base
pirimidínica.
Para finalizar esta introducción se hace una lista de todas las estructuras conocidas de
metales con pares de bases en las que haya alguna base pirimidínica (Tabla 1). Hay que
resaltar el muy escaso número de estructuras resueltas. Esta escasez, a pesar de su
enorme importancia en conocimiento básico y posibles aplicaciones, resalta
enormemente el interés del tema y su dificultad ya que son muchos los laboratorios a lo
largo de los años los que han trabajado en el tema.
Tabla 1.
Metal
Ag
Compuesto
Con 1-metiluracilo obteniendo U-Ag-U.
Figura
15
Referencia (año)
23 (1984)
Con citosina obteniendo C-Ag-C.
14
21 (2010)
Cadena 1D infinita con N1-hexil-5-fluorouracilo
obteniendo 5FU-Ag-5FU.
Dúplex de dodecámeros en presencia de enlaces THg-T.
13
15 (2013)
9
14 (2014)
Con 1-metiltimina obteniendo T-Hg-T.
8
13 (1974)
Con N1-hexil-5-fluorouracilo obteniendo 5FU-Hg5F
U.
10
15 (2013)
Con N1-hidroxipropil-5-fluorouracilo obteniendo
5F
U-Hg-5FU.
12
16 (en vías de
publicación)
19
28 (1977)
Pt
Con el 1,3-dimetiluracilo y la 9-metiladenina
obteniendo U-Hg-A.
El transplatino con C:G se obtiene C-Pt-G.
17
25 (2002)
Au
El transplatino con A:U se obtiene un complejo
cuaternario A-Pt-U-Pt-U-Pt-A.
ARN con presencia de interacción G-Au-C.
18
16
27 (2001)
24 (2003)
Hg
17
2. Parte experimental
Las horas de trabajo realizadas en el laboratorio de este Trabajo de Fin de Grado han
sido realizadas en este cuatrimestre. Cabe mencionar que recibí una beca de
colaboración para trabajar en esta área, que permitió familiarizarme con la temática de
la investigación.
Se han utilizado Ag+ y Au+3 y dos iones divalentes Pt+2 y Hg+2. Todos estos iones
metálicos se han escogidos por la facilidad con la que forman enlaces con las diferentes
nucleobases, y por referencias bibliográficas anteriores como se ha indicado en el
apartado anterior (Tabla 1).
Como ligandos se han utilizado diferentes combinaciones de bases púricas y
pirimidínicas, como algunos nucleósidos o nucleótidos semejantes. Se ha atendido a
criterios de solubilidad según el disolvente empleado y las particularidades red-ox de
cada metal.
La motivación final es obtener estructuras cristalinas bien definidas.
2.1 Procedimientos experimentales realizados con el ion
metálico Hg +2 .
En el trabajo realizado en el laboratorio se ha utilizado, entre otros, el ion metálico Hg+2
para la obtención de complejos con pares de bases en forma de monocristales.
Se ha utilizado la N1-hexiltimina, una timina con una cadena alifática de seis carbonos
en la posición N1 sintetizada por el grupo de Bioinorgánica de la UIB.17 En otro intento
de síntesis se utilizó como pares de bases la citidina-5-monofosfato (CMP) y la
guanosina-5-monofosfato (GMP). En el último intento de síntesis, similar al anterior, se
hizo uso de los pares de bases formados por guanosina y citidina.
2.1.1 Procedimiento experimental para la formación del
complejo T-Hg-T usando como nucleobase N 1 -hexiltimina.
Se disuelve en un vaso de precipitados 1 mmol de N1-hexiltimina en 15 ml de
acetonitrilo obteniendo una disolución de color amarillo. Se le añade 0,5 mmol de
acetato de mercurio hasta un volumen total de 25 ml, al observar que no se disuelve por
completo se le añaden 10 ml de acetonitrilo y se agita durante 1 hora. Una vez obtenida
la disolución homogénea se filtra por gravedad para luego sellarlo con parafilm al cual
se le hacen unos agujeros para la evaporación lenta del disolvente. Con el paso del
tiempo se van formando gran cantidad de núcleos de cristalización por lo que se vuelve
a filtrar por gravedad. Al evaporarse todo el disolvente se observa la formación de
18
cristales que observados a través del microscopio nos indican que no son de buena
calidad.
Se observa como un líquido oleoso de color amarillo se queda impregnado en el fondo
del vaso de precipitados parcialmente unido a los cristales obtenidos, por ese motivo
redisolvemos los cristales en acetona con el fin de separar esa impureza de los cristales.
Para sorpresa nuestra, dicha impureza también es soluble con acetona, pero al filtrar de
nuevo por gravedad parte de la impureza queda retenido en el filtro.
Se lleva a cabo un espectro IR de la impureza para determinar su procedencia, dando
como resultado un producto de hidrólisis del 1-bromo-hexano, reactivo que se utiliza en
la síntesis de la N1-hexiltimina. Se logra separar la impureza por medio de una
disolución que contiene una mezcla de agua-acetona. Al evaporarse la acetona, la N1hexiltimina va cristalizando en superficie al ser menos soluble en agua que la impureza,
de esa forma se consigue una buena separación de ambos compuestos.
Al obtener la N1-hexiltimina pura, se repite el experimento añadiendo esta vez en un
vaso de precipitados 0,25 mmol de acetato de mercurio en 27 ml de acetona obteniendo
una coloración amarilla, luego se añade la N1-hexiltimina en un volumen total de 60 ml
del disolvente. Se agita la mezcla durante 1 hora generando una disolución totalmente
transparente. Una vez evaporado todo el disolvente, se disuelve todo en 10 ml de
acetona y 5 de agua MilliQ. Se observa la formación de cristales en el fondo del vaso de
precipitados de color blanco con forma de bastones y placas (mezcla). Se filtran por
gravedad y una vez secos se observan a través del microscopio, por el aspecto resultante
de los cristales obtenidos resultar ser de N1-hexiltimina, la nucleobase inicial.
Figura 20. Representación de la N1-hexiltimina.
El compuesto obtenido en acetonitrilo que deseamos cristalizar corresponde al
sintetizado previamente en metanol, por el alumno de la UIB Francisco Pérez (incluido
en su Trabajo Final de Grado), es el Hg(N1-hexiltiminato)2.
Fórmula: C22H34HgN4O4 que correspondiente a Hg(N1-hexiltimina)2.
Análisis elemental: C: 41,68 (calculado), 41,98 (experimental); H: 5,54 (cal), 5,62
(exp) y N: 9,05 (cal), 8,85 (exp).
19
IR(cm-1): 449w (weak), 501w, 590w, 663w, 726w, 769w, 927w, 1047w,
1104w,1159w, 1184w, 1216w, 1265w, 1294w, 1351m (media), 1383m, 1437m, 1591s
(strong), 1655s, 2857m, 2929m, 2955m, 3060m, 3451m.
1
H RMN (DMSO-d6): δ (ppm) 7.48[d,1H,C(6)-H], 3.62[t,2H,C(7)-H,J=7.05 Hz],
1.76[s,3H,C(13)-H], 1.55[t,2H], 1.23[m,6H], 0.83[t,3H,J=6,60 Hz].
También se intentó obtener cristales del compuesto por medio de otros disolventes y
otras sales de mercurio (nitrato, cloruro, etc.) variando así las condiciones del medio
para intentar optimizar su posterior cristalización. Se obtuvo en todos los casos el
mismo compuesto en fases microcristalinas o cristalinas, pero en ningún caso con la
calidad suficiente para poder hacer un estudio de difracción de rayos X a partir de un
monocristal.
2.1.2 Procedimiento experimental para la formación del
complejo C-Hg-G usando nucleobases CMP y GMP.
Se disuelve en 20 ml de agua MilliQ 0,5 mmol de CMP en forma ácida y se mezclan
con 10 ml de agua MilliQ que contiene 0,5 mmol de GMP en forma de sal en un vaso
de precipitados. Se agita durante media hora para homogeneizar la mezcla y favorecer la
formación de pares de bases CMP-GMP. Se prepara una disolución de 60 ml de agua
MilliQ que contiene 0,5 mmol de nitrato de mercurio. A la disolución que contiene los
pares de bases (30 ml de agua MilliQ) se le añade gota a gota la disolución de nitrato de
mercurio (un volumen igual a 10 ml). El aspecto turbio de la disolución indica que hay
posibilidad de formar un gel, para reducirlo calentamos a 50ºC durante 1 hora,
introducimos un volumen de 25 ml de agua MilliQ y acidificamos hasta un pH = 1,
llegando a un volumen final de 70 ml de la disolución transparente. Una vez se ha
evaporado parte del agua genera la formación de un gel, dicha formación complica el
estudio del complejo. Hasta que no es evaporado totalmente el gel no se obtiene ningún
precipitado por lo que no es posible realizar un estudio espectroscópico. Al evaporarse
completamente a sequedad nos queda en el fondo un precipitado que presenta la
formación de dendrímeros que fueron observados a través del microscopio.
La formación de dendrímeros indica que dichas nucleobases se han ido uniendo unas
con otras generando la formación de polímeros, dando a entender que es la estructura
más estable en estas condiciones.
2.1.3 Procedimiento experimental para la formación del
complejo C-Hg-G usando como nucleobases guanosina y
citidina.
Se disuelve en un vaso de precipitados una cantidad de 5/12 mmol de citidina en 5 ml
de agua MilliQ. Se le añade a esta disolución una cantidad de 5/12 mmol de guanosina
quedando en suspensión, ya que es muy poco soluble. La formación del par de bases
guanosina-citidina hace posible que la guanosina, insoluble en agua, se vuelva
parcialmente soluble. Se le añaden 50 ml de agua MilliQ para mejorar la solubilidad del
20
par de bases. La disolución se calienta y se pone en agitación durante 1 hora
favoreciendo la formación del par de bases, este hecho se deduce porque la disolución
se vuelve transparente. Se dispone posteriormente a filtrar la disolución para eliminar
restos de guanosina no formando par de bases con la citidina que pudieran interferir con
el mercurio. A la disolución que contiene el par de bases se le añade cuidadosamente,
gota a gota, una disolución de 50 ml en un vaso de precipitados que contiene 5/12 mmol
de nitrato de mercurio observando la formación de burbujas provocadas posiblemente
por la presencia de guanosina ya que contiene una parte hidrófoba y una parte hidrófila,
similar a un agente surfactante o tensoactivo. Al final de la adición se dispone a medir el
pH de la disolución observando un valor igual a 4. Esta disminución del pH indica que
posiblemente el Hg+2 ha reaccionado con el par de bases generando la formación del
complejo C-Hg-G. Se filtra de nuevo la disolución para eliminar posibles impurezas de
los reactivos.
Con el paso del tiempo la disolución se evapora considerablemente, tan rápido que al
evaporarse por completo no se obtiene un sistema cristalino, por ese motivo, se
redisuelve todo en agua MilliQ y se vuelve a calentar para mejorar su redisolución. Se
deja reposar tapado con parafilm para evaporarse más lentamente. Dando lugar a un
precipitado de naturaleza polimérica, sin que aparezcan cristales adecuados, que era
nuestro objetivo.
2.2 Procedimientos experimentales realizados con el ion
metálico Ag + .
Como en el caso del ion metálico Hg+2, también se ha utilizado el Ag+, para la
obtención de complejos con pares de bases con la intención de obtener monocristales de
los derivados sintetizados.
En el primer caso, haciendo uso de la N1-hexiltimina,17 para formar el complejo T-AgT. También se intentó llevar a cabo el experimento haciendo uso de la nucleobase N1hexilcitosina para la formación del complejo C-Ag-C, dicha síntesis ha sido realizada
con anterioridad, pero los resultados aún no han sido publicados.
2.2.1 Procedimiento experimental para la formación del
complejo T-Ag-T usando como nucleobase N 1 -hexiltimina.
Se disuelven 0,5 mmol de N1-hexiltimina y 0,5 mmol de nitrato de plata todo disuelto
en 50 ml de acetona, la mezcla se trata a reflujo durante 1 hora, se disuelven totalmente
los reactivos y la disolución queda totalmente transparente. Se filtra en caliente con
papel de filtro para eliminar posibles impurezas. Al día siguiente se observa un
precipitado, posiblemente impurezas, por ese motivo se filtra de nuevo por gravedad, el
volumen se ha reducido hasta llegar a 20 ml aproximadamente, se cubre con parafilm
para evitar la pérdida excesivamente rápida de disolvente y se protege de la exposición
de la luz (el ion metálico Ag+ presenta sensibilidad a la radiación lumínica). Al cabo del
tiempo se evapora por completo la disolución obteniendo la formación de una capa
resplandeciente sin llegar a formar cristales útiles, por ese motivo se redisolvió con
21
metanol y posteriormente se filtró. Al evaporarse por completo el metanol, se observó el
precipitado mediante un microscopio, el resultado fue negativo ya que el precipitado no
contenía cristales útiles para realizar la difracción de rayos X.
2.2.2 Procedimiento experimental para la formación del
complejo C-Ag-C usando como nucleobase N 1 hexilcitosina.
La primera síntesis del compuesto C-Ag-C se llevó a cabo mediante 0,25 mmol de
nitrato de plata y 0,25 mmol de N1-hexilcitosina disuelto todo en 10 ml de metanol. Se
calienta a reflujo durante 2 horas, se filtra y se deja cristalizar a temperatura ambiente,
al cabo de 2 días salieron cristales puros.
Fórmula: AgC20H34N7O5 que corresponde a Ag(N1-hexilcitosina)2(NO3).
Análisis elemental: C: 42,87 (calculado), 42.90 (experimental); H: 6.12 (cal.), 6.24
(exp.); N: 17.50 (cal.), 17.66 (exp.).
IR (cm-1): 415vw, 446vw, 583w, 627w 725vw, 775m, 795w, 825vw, 1115w, 1198m,
1269m, 1375s, 1438w, 1459w, 1512s, 1626vs, 1668vs, 2857m, 2927w, 2957w, 3201m,
3351s.
1
H RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 7.71 [d, 1H, H(6), J=7.2 Hz], 7.55 [br, s, 2H, N(4)H2], 5.78 [d, 1H, H(5), J = 6.9 Hz], 3.66 [t, 2H, H(7), J= 7.2 Hz], 1.54 [br, m, 2H,
H(8)], 1.22 [br s, 6H, H(9,10,11)], 0.82 [t, 3H, H(12), J=6.6 Hz].
Por consiguiente, se llevó a cabo otra preparación en la proporción 2 mmol de ligando
por uno de sal del metal (en vez de 1:1 como en el caso anterior) metal-ligando, todo
disuelto en 60 ml de metanol. Se mantuvo la disolución en reflujo durante
aproximadamente 2 horas. Se le adicionó 1 mmol de NaSbF6 (P. M. 258,7) disuelto en
20 ml de metanol. Se dejó reposar con evaporación lenta. Al cabo de aproximadamente
2 semanas aparecieron cristales (cuando la disolución estaba en 50 ml de metanol. Se
han seleccionado algunos cristales que se enviaron al cristalógrafo ya que parecían ser
adecuados mediante la observación al microscopio (27 de abril de 2015). Los cristales
son blancos pero sensibles a la luz. En el momento de finalizar esta memoria el
cristalógrafo está adquiriendo reflexiones en el espectrofotómetro, y ha podido
determinar la celda unidad. Por tanto está pendiente de la resolución de la estructura que
puede ser compleja.
El producto parece ser el mismo que en el caso inicial solo modificamos el anión, pero
para corroborar nuestra deducción optamos por realizar otro análisis IR, RMN y enviar
el producto a análisis elemental.
2.3 Procedimientos experimentales realizados con el ion
metálico Pt +2 .
22
En los procedimientos experimentales realizados con el ion metálico Pt+2, en dos de
ellos hemos utilizado como sal del metal el tetracloruroplatinato dipotásico
(K2(PtCl4) )y en el último intento de síntesis con este metal se ha utilizado el transdiamminodicloruroplatinato(II) (trans-Pt(NH3)2Cl2). Los dos compuestos que contienen
dicho metal de transición actúan de diferente forma y se obtienen resultados totalmente
diferentes.
En el primer caso, se utiliza la nucleobase 9-butiladenina en proporción estequiométrica
con el metal complejante. En el otro caso en el que utilizamos, como en el caso anterior,
el K2(PtCl4) junto con la nucleobase sintetizada por el grupo de Bioinorgánica de la
UIB, la N1-hexiltimina. Por último para el compuesto trans-Pt(NH3)2Cl2 se pone en
contacto con el par de bases N1-hexiltimina y 9-butiladenina (T-A) para intentar formar
el complejo T-Pt-A.
2.3.1 Procedimiento experimental para la formación del
complejo A-Pt-A usando como nucleobase 9-butiladenina.
Se añaden 0,5 mmol de 9-butiladenina en un vaso de precipitados que contiene 25 ml de
agua MiliQ, la nucleobase utilizada no parece ser muy soluble por lo que se adiciona 10
gotas de una disolución de HCl 0,1 N hasta llegar a pH=2,5 con el fin de protonar la
nucleobase (pK aproximadamente 3,5) y de esa forma disolverla completamente. Se
calienta la disolución para mejorar la solubilidad de la nucleobase. Se le añade 0,5
mmol de la sal del metal en 15 ml de agua MilliQ, al parecer la disolución se aproxima
a la saturación y con una textura gelatinosa.
Al añadir la sal del metal sobre la nucleobase presenta un cambio de coloración
significativa, la disolución de la sal del metal pasa de un color naranja a un color
naranja amarillento. Se pone en agitación durante 6 horas y en este tiempo se aprecia
cómo va apareciendo un precipitado amarillo que parece ser no cristalino, esperamos al
día siguiente para filtrar. El precipitado obtenido al día siguiente paso de ser amarillo a
ser verde oscuro posiblemente por reacciones de reducción y oxidación provocadas por
el ion metálico Pt+2. La coloración verde puede ser debido a una combinación de
colores, amarillo y negro. En la disolución resultante parece que aún pueda haber
producto por lo que aislamos la disolución con parafilm y dejamos evaporar lentamente.
A medida que pasan los días va precipitando producto del mismo color, posiblemente se
trate del mismo producto. Dicho producto es filtrado en una placa filtrante, al filtrar
aparece una especie de espuma posiblemente generada por la combinación entre el
ligando y los iones cloruro de la disolución formando un tensoactivo.
El filtrado es utilizado para realizar la formación de pastillas que posteriormente fueron
llevados al espectrómetro de IR, dicho espectro se hace a partir del segundo filtrado que
aparenta ser más verde que el primero. El IR obtenido a partir de la pastilla nos indica la
presencia de 9-butiladenina.
Posteriormente se pretende hacer un 1H-RMN del mismo precipitado, por lo que se
llevan a cabo pruebas de solubilidad para determinar cuál es el disolvente apropiado
para llevar a cabo el espectro del 1H-RMN. Se observa que con dimetilsulfóxido
23
(DMSO) es totalmente soluble, en cambio con agua MilliQ presenta una ligera
solubilidad, por este motivo se utiliza el DMSO deuterado para llevar a cabo el espectro
de 1H-RMN. El espectro de 1H-RMN obtenido indica que hay 9-butiladedina ya que se
observan bandas características de dicha nucleobase, sin embargo la presencia de agua
dificulta la identificación completa del complejo. Se repite el espectro de 1H-RMN y
sigue indicando la presencia de agua en dicho espectro, la cual cosa hace pensar que el
producto contiene en su interior agua coordinada.
Fórmula: C9H19Cl3KN5O3Pt que corresponde a [K(PtCl3)(9-butiladenina)·3H2O]
Análisis elemental: C: 18,45 (calculado), 18,48 (experimental); H: 3,27 (cal.), 2,61
(exp.); N: 11,95 (cal.), 11,41 (exp.).
IR (cm-1) del compuesto: 642vw, 772vw, 1114vw, 1205m, 1235w, 1347m, 1433m,
1502m, 1527m, 1652vs, 2871m, 2931m, 2958m, 3114m, 3259s, 3386s, 3508s.
IR (cm-1) del ligando 9-butiladenina: 433vw, 539m, 667s, 719s, 767m, 798m, 844w,
902w, 946w, 1009s, 1071s, 1106m, 1202s, 1236vs, 1308vs (br), 1361s, 1415vs, 1481vs
(br), 1517m, 1604vs (br), 1675vs, 2681m, 2740m, 2856vs, 2825vs (br), 3122vs, 3272vs,
3418m, 3577m.
Al comparar los dos espectros de IR se observa el desplazamiento de bandas, la unión
de bandas e incluso la desaparición de otras bandas propias del ligando, indicando de
esa forma la coordinación con el ion metálico. Especialmente se observa el
desplazamiento de las bandas de anillo de 1675 y 1604 cm-1 en el ligando, a 1652 cm-1
en el complejo, lo que parece indicar la coordinación del ion metálico al anillo.29, 30
El espectro de RMN no se resuelve bien del todo por la poca solubilidad del complejo.
Aun así son visibles algunas señales características del ligando.
1
H RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 8,51 [s, 1H, H(2)], 8,44 [s, 1H, H(8)], 1,72 [m, 2H,
H(11)], 1,20 [m, 2H, H(12)], 0,85 [t, 3H, H(13)].
2.3.2 Procedimiento experimental para la formación del
complejo T-Pt-T usando como nucleobase N 1 -hexiltimina.
Se añaden 0,5 mmol de K2(PtCl4) en un vaso de precipitados que contiene un volumen
de 20 ml de agua MilliQ disolviendo toda la sal del metal y obteniendo un pH=5. A esta
disolución se le añade 0,5 mmol de N1-hexiltimina en estado sólido, posteriormente se
le añade un volumen de 15 ml de agua MilliQ para dispersar la timina sólida llegando a
29
P. O. P. Ts’o, Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry, Volumen I, Academia Press, New York
(1974).
30
J. Dúchesne (ed), Physico-chemical Properties of Nucleic Acids, volumen 2, Academia Press, London
(1973).
24
un volumen total de 35 ml. Para aumentar la solubilidad de la N1-hexiltimina por efecto
de la formación del complejo se pone en agitación sin calentar hasta el día siguiente y
protegido de la luz mediante papel de aluminio. Al día siguiente se observa que la
reacción no se ha llevado a cabo completamente por ese motivo procedemos a calentar
al baño maría a 70ºC durante 2 horas. Luego filtramos en caliente la disolución para
eliminar impurezas ya que se observa un precipitado de color violeta, la disolución
resultante presenta una coloración marrón.
Al cabo de unos días se procede al filtrado obteniendo un precipitado de color azul
pálido, una vez seco se dispone a hacer un espectro IR, un espectro 1H-RMN y un
análisis elemental. Pasados unos días se vuelve a observar la presencia de más
precipitado, por lo que esta vez el filtrado se llevará a cabo en una placa filtrante. Una
vez terminado el filtrado se observa la posible formación de cristales sobre la placa
filtrante.
Fórmula: C44H72ClKN8O8 que corresponde a K(N1-hexiltimina)4(Cl)
Análisis elemental: C: 58,05 (calculado), 57,72 (experimental); H: 8,08 (cal.), 7,93
(exp.); N: 12,39(cal.), 12,24(exp.).
IR (cm-1): 418vw, 440vw, 549vw, 685w, 766w, 892w, 946w, 1006vw, 1050vw, 1102w,
1144w, 1219m, 1256m, 1361m (br), 1479s, 1506s, 1670vs (br), 2857m, 2926s (br),
3031m, 3156m.
1
H RMN (DMSO-d6) δ (ppm): 11,15 [s, 1H, H(3)], 7,49 [s, 1H, H(6)], 3,56 [t, 2H,
H(7)], 1,71 [s, 3H, H(5)], 1,50 [m, 2H, H(8)], 1,22 [m, 6H, H(9,10,11)], 0,82 [t, 3H,
H(12)].
Tanto los datos de IR como los de RMN son espectros muy parecidos a los de la N1hexiltimina, sugiriendo que el platino(II) se ha coordinado en poca proporción.
Para concretar si el complejo formado es realmente el supuesto o si había presentes
trazas del ion platino, procedemos a hacer un MALDI/ELSI, la técnica se llevó a cabo
utilizando como disolvente acetona ya que se sabe que el precipitado es totalmente
soluble con este disolvente. Los datos, no del todo concluyentes, nos permitieron
identificar dos picos que podríamos asignar tentativamente como C44H68ClN8O8Pt2+
(masa exacta teórica 1226,45; masa experimental estimada 1026,41) y C44H71ClN8O8Pt+
(masa exacta teórica 1069,47; masa experimental estimada 1069,29) con la presencia de
4 ligandos timina en los dos casos y la presencia de dos átomos de platino en el primer
caso y de uno en el segundo. Sin embargo a pesar que el perfil isotópico es muy
parecido, al repetir el espectro con referencias internas, para hacer un cálculo riguroso
de la masa exacta, no fue posible hallar una buena correlación. Tal vez la interferencia
con estos compuestos utilizados como referencia interna. Por lo que, sin poder afirmarlo
de una manera concluyente, parece que parte del platino sí que interacciona con la
timina, sin que hayamos obtenido las condiciones adecuadas para aislar el compuesto
minoritario responsable del color del compuesto. Hay que mencionar que la primera
fórmula contiene cierta similitud con un compuesto bien caracterizado por otros autores
en los que cada ligando N1-metiltimina se encuentra unido a dos iones metálicos trans25
[Pt(NH3)2]+2 y generando un enlace Pt-Pt.31 También cabe mencionar que la segunda
fórmula tiene mucha relación con el compuesto obtenido a partir del 1-metiluracilo y el
ion metálico paladio, bien caracterizado por otros autores.32
Se volvió a repetir el experimento pero esta vez utilizando como disolvente una mezcla
de acetona-agua (1:1), el resultado concluyó con la presencia de cristales planos
correspondientes al ligando N1-hexiltimina.
2.3.3 Procedimiento experimental para la formación del
complejo T-Pt-A usando como pares de bases la N 1 hexiltimina y la 9-butiladenina.
Se disuelve 0,5 mmol de N1-hexiltimina y 0,5 mmol de 9-butiladenina en un vaso de
precipitados que contiene un volumen total de 30 ml de acetona. Se pone en agitación
durante 1 hora para disolver completamente dichas nucleobases, posteriormente se filtra
para eliminar impurezas sólidas que puedan quedar en la disolución o que no han
reaccionado con su base complementaria (Watson-Crick). En otro vaso de precipitados
se disuelve 0,5 mmol del compuesto trans-Pt(NH3)2Cl2 en 20 ml de agua MilliQ al cual
se le añade 1 mmol de nitrato de plata para eliminar los cloruro de la sal del metal
dejando en disolución el complejo [trans-Pt(NH3)2]+2, filtramos para eliminar el AgCl
formado en la disolución. En la disolución de los pares de bases se le añade
cuidadosamente y en agitación continua la disolución resultante del complejo metálico
para llevar a cabo la posible formación del complejo T-Pt-A. Una vez terminada la
adición se mantiene en agitación durante 1 hora para completar al máximo dicha
reacción. Posteriormente la disolución es filtrada de nuevo para eliminar posibles
impurezas existentes que puedan interferir en la cristalización del complejo deseado.
Al cabo de unos días, se observa la presencia de cristales planos y romboédricos, y otros
en forma de aguja, son estructuras cristalinas de la N1-hexiltiminan de forma casi
cuantitativa. No se ha obtenido más cristales del resto de la disolución amarilla.
2.4 Procedimientos experimentales realizados con el ion
metálico Au +3 .
Como se puede observar en la Tabla 1, la presencia de compuestos de metales con pares
de bases en los que interviene el ion metálico Au+3 son escasos, solo se ha conseguido
obtener un cristal del complejo mediante el uso de un cristal de ARN sumergido en una
disolución que contiene el ion metálico Au+3.
Se han llevado a cabo procedimientos experimentales con dicho ion metálico en los que
se ha utilizado como pares de bases guanosina-citidina y GMP-CMP con la intención de
obtener un compuesto similar al obtenido mediante el cristal de ARN pero en
31
O. Renn, B. Lippert, A. Albinati, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 29 (1990) 84.
M. Mizutani, S. Miwa, N. Fukushima, Y. Funahashi, T. Ozawa, K. Jitsukawa, H. Masuda, Inorg. Chim
Acta, 339 (2002) 543.
32
26
condiciones diferentes, haciendo uso de la formación de los pares de bases en disolución
añadiendo posteriormente el ion metálico.
2.4.1 Procedimiento experimental para la formación del
complejo G-Au-C usando como pares de bases la
guanosina y la citidina.
Se disuelven 0,5 mmol de guanosina y 0,5 mmol de citidina en 50 ml de agua MilliQ, la
formación de los pares de bases hace posible la solubilidad de la guanosina en agua, ya
que es prácticamente insoluble. La disolución de los pares de bases se pone en agitación
mientras se añade cuidadosamente gota a gota la disolución de la sal del metal que
contiene 0,5 mmol de Na(AuCl4) en aproximadamente 5 ml. Se observa cómo se
produce un cambio de coloración provocado por la adición de la sal del metal. La
disolución pasa a ser de color marrón, como posiblemente pueda ser fotosensible se le
aísla de la luz mediante papel de aluminio. Al poco tiempo se observa un precipitado
casi instantáneo por ese motivo se filtra con una placa filtrante y puesto previamente en
un vaso con agua-hielo, el precipitado resulta tener un color burdeos, dicho precipitado
es redisuelto completamente con una disolución de HCl 1N hasta pH=1. Al día
siguiente se observa más precipitado, aproximadamente la misma cantidad, se filtra de
nuevo para llevar a cabo un espectro de IR y un RMN cuando se encuentre una vez
seco.
Fórmula: C19H24Au2Cl4N8O10 que corresponde a (AuCl2)2(guanosina
desprotonada)(citidina desprotonada).
Figura 21. Representación del posible compuesto obtenido (AuCl2)2(guanosina desprotonada)(citidina
desprotonada).
Análisis elemental: C: 21,53 (calculado), 21,18 (experimental); H: 2,28 (cal.),
2,47(exp.); N: 13,38(cal.), 11,56(exp.).
27
IR (cm-1) del compuesto: 619w, 772w, 861w, 1053s, 1177m, 1278m, 1347s, 1411s,
1503vs, 1639vs, 2930s, 3338vs.
IR (cm-1) del ligando guanosina: 420w, 547m, 606s, 688vs, 748m, 775s, 822m, 881m,
918s, 1000m, 1049s, 1082vs, 1130vs, 1179s, 1223m, 1337s, 1395vs, 1425s, 1487vs,
1537vs, 1569s, 1624vs, 1692vs, 1733vs, 2731vs, 2896vs, 3208vs, 3571vs.
IR (cm-1) del ligando citidina: 435w, 554s, 598s, 620s, 714vs, 790vs, 816s, 854m,
871m, 942s, 983s, 1054vs, 1101vs, 1135s, 1212s, 1247m, 1290vs, 1402s, 1431s,
1499vs, 1530vs, 1620vs, 1961w, 2919s, 3086vs, 3230vs, 3349vs, 3447vs.
Al comparar los espectros de IR del compuesto y de los ligandos se observa la
desaparición de bandas y el desplazamiento de otras, propias de la coordinación de los
ligandos con el ion metálico. También se puede observar como las bandas propias del
anillo de la guanosina (1733vs, 1692vs, 1624vs cm-1) 29, 30 disminuyen su frecuencia en
el espectro de IR del compuesto (1639vs, 1503vs cm-1), indicando que se lleva a cabo la
coordinación con el Au(III).
1
H RMN (DMSO-d6) δ (ppm): No se ha obtenido un espectro de 1H-RMN nítido, ya
que el compuesto formado es insoluble en la gran mayoría de disolventes. Presenta
mayor solubilidad en DMSO, e incluso en este caso la concentración disuelta no es
suficiente para llevar a cabo un espectro de 1H-RMN nítido.
2.4.2 Procedimiento experimental para la formación del
complejo G-Au-C usando como pares de bases la
guanosina-5-monofosfato y la citidina-5-monofosfato.
Este procedimiento experimental se lleva a cabo para obtener un espectro de 1H-RMN
aceptable y en continuo para averiguar lo que ocurre realmente durante el proceso de
precipitación, ya que el obtenido en el procedimiento anterior no ha dado resultados
concluyentes.
Se disuelven 0,1 mmol de CMP y GMP en 10 ml de agua MilliQ se agita durante 1 hora
y se observa la formación de un gel producto de la formación del par de bases GMPCMP. Al añadir 0,1 mmol de la sal del metal se observa cómo se va deshaciendo el gel,
producido probablemente por la interacción del metal con el par de bases. El resultado
final es que se mantiene todo en disolución, contrariamente al procedimiento
experimental anterior. Al cabo de varios días aún se sigue manteniendo en disolución.
En el momento de redactar esta memoria todavía no ha aparecido precipitado que se
pueda analizar.
2.5 Materiales y métodos.
28
Todos los reactivos, tanto orgánicos como inorgánicos, fueron adquiridos de SigmaAldrich, de calidad pro análisis y han sido usados sin purificación previa. Las bases
sustituidas de cadena larga fueron sintetizadas de acuerdo con la bibliografía.17, 33, 34, 35,
36
En el caso de la N1-hexiltimina se realizó un tratamiento para mayor purificación con
base para formar el anión que se disuelve en agua y separarla de las impurezas de las
timinas disustituidas en las posiciones N1 y N3.
Los análisis elementales se llevaron a cabo en micro-analizadores Carlo Erba, modelo
EA 1108, y Thermo Finnigan, modelo Flash EA 1112, por el servicio de microanálisis
del instituto de química avanzada de Cataluña (IQAC) en Pedralbes Barcelona.
Los espectros de infrarrojo (IR) se tomaron en estado sólido (pastillas de KBr) y se
midieron en el espectrómetro de la casa Broker Tensor 27, en un rango de número de
onda de 4000 a 400 cm-1.
Los espectros de resonancia magnética nuclear (NMR) de 1H se tomaron en el
espectrómetro Bruker AMX300 a temperatura ambiente, empleando como disolventes
dimetilsulfoxido deuterado (DMSO-d6) y agua, usando sus correspondientes señales
residuales como referencia. El desplazamiento químico de referencia para ambos es 1HNMR residual es δDMSO = 2.47 ppm y δD2O= 4.79 ppm.
MALDI: Las mediciones de los espectros de masas se realizaron en un espectrómetro de
masas Autoflex III MALDI-TOF/TOF (Bruker Daltonics, Leipzig, Alemania) equipado
con un láser de 200 Hz Smartbeam. Los espectros se registraron mediante el modo de
reflexión positiva dentro del rango de masas de 60 a 1000 Da. La tensión IS1 era de 19
kV, la tensión del IS2 se mantuvo en 16.70 kV, la tensión de la lente era 8,10 kV,
Reflector = 21.00 kV, Reflector 2 = 9,60 kV y el tiempo de retraso de extracción fue de
40 ns. La matriz empleada es trans-2-[3-(4-tert-Butilfenil)-2-methil-2propenilidina]malononitrilo DCTB. En una proporción 50:10 matriz:muestra. Se
depositaron 0.5 microlitros en una placa de maldi bruker (ground steel). Se realizaron
un total de 500 disparos en tandas de 100 en 5 posiciones distintas de la placa. Se
calibró internamente con PEG (polietilenglicol).
3 Resultados y discusión.
El objetivo esencial era obtener cristales de compuestos metálicos con pares de bases
púricas y pirimidínicas atendiendo al escaso número de estructuras hasta ahora
conocidas (Tabla 1). Este objetivo, pendiente de la valoración de un cristal enviado al
33
M. Barceló-Oliver, C. Estarellas, A. García-Raso, A. Terrón, A. Frontera, D. Quiñonero, E. Molins, P.
M. Deyà, CrystEngComm, 12 (2010) 362-365.
34
M. Barceló-Oliver, C. Estarellas, A. García-Raso, A. Terrón, A. Frontera, D. Quiñonero, I. Mata, E.
Molins, P. M. Deyà, CrystEngComm, 12 (2010) 3758-3767.
35
M. Barceló-Oliver, A. Bauzá , B. A. Baquero, A. García-Raso, A. Terrón, E. Molins , A. Frontera,
Tetrahedron Letters, 54 (2013) 5355-5360.
36
M. Barceló Oliver, Tesis Doctoral: Interaccions entre Ions Metàl·lics i Compostos d’ Interès Biològic
(Halouracils i derivats sintètics, Hipurats i Aciclovir), Universitat de les Illes Balears (2009).
29
cristalógrafo de Ag(I) con N1-hexilcitosina, no se ha logrado. Cabe resaltar la dificultad
del tema.
Se han obtenido sin embargo compuestos claramente caracterizados y cristalinos, sin
que ningún monocristal tuviera la calidad suficiente.
En concreto Hg(N1-hexiltiminato)2 , en el que el ligando pierde el protón del N3 por
acción del metal. Este compuesto se ha intentado recristalizar y obtener con diversos
disolventes (metanol, acetonitrilo, acetona, acetona-agua y otros) y diversas sales
(acetato, nitrato, cloruro); siempre se han obtenido precipitados cristalinos o
microcristalinos pero ninguno adecuado para su estudio de difracción de rayos X. A
partir de los datos espectroscópicos se confirma por 1H-RMN la desprotonación del N3
y la presencia de las otras señales características del ligando con ligeros
desplazamientos. Estos ligeros desplazamientos son propios de este tipo de ligandos
pirimidínicos.
Figura 22. Estructura molecular del compuesto Hg(N1-hexiltiminato)2
Lo mismo ocurre con el complejo catiónico de plata Ag(N1-hexilcitosina)2(NO3). En el
que el catión plata enlaza posiblemente con el N3. En este caso se ha intentado también
cambiar de anión, en concreto se ha utilizado el anión [SbF6]- . La razón de escoger este
agente precipitante no es tanto por la disminución del producto de solubilidad que se
podría producir sino por las posibles interacciones anión-π que podrían tal vez obtenerse
con los fluoruros terminales y la bases pirimidínica.21 De hecho se obtuvo un
precipitado cristalino sin que se hubiera evaporado gran parte del disolvente metanol.
En este tipo de compuestos se suele producir la formación de cristales cuando el
disolvente ha casi desaparecido. Estas interacciones débiles pueden favorecer la
nucleación del cristal como en casos anteriores.
En el caso de los pares de bases púrica-pirimidínica se han seguido dos estrategias: a)
sintetizar primero el derivado con una base (como por ejemplo el compuesto
[K(PtCl3)(9-butiladenina)·3H2O] ) y poder proceder luego a la reacción con la segunda
base; b) formación del par de bases en solución y hacerlo interaccionar con la sal
metálica.
30
En el procedimiento a) hemos encontrado diversas dificultades. Por ejemplo la
insolubilidad del complejo caracterizado [K(PtCl3)(9-butiladenina)·3H2O] que ha
imposibilitado el segundo paso. En la reacción de compuestos con timina se nos han
presentado fenómenos como la poca reactividad de la timina sin desprotonar y las
reacciones red-ox secundarias de esta, especialmente si se desprotonaba en medio
acuoso (pK=9,8).
En el caso del procedimiento b) nos hemos encontrado con situaciones diferentes. El ion
Hg(II) ha dado lugar a dendrímeros y fases no totalmente definidas o homogéneas. En el
caso del ion Pt(II) se ha producido la interacción preferentemente con una de las bases
liberando la N1-hexiltimina (altamente insoluble en medio acuoso) sin que el deseado
complejo ternario haya podido ser aislado.
Finalmente con el ion Au(III) del que se conoce una interacción entre bases guanina y
citosina en ARN24 la situación ha sido distinta y prometedora. Si bien en el caso de la
utilización de bases como 9-etilguanina y citosina se produce un precipitado marrón
insoluble en medio acuoso, otra perspectiva es posible utilizando nucleósidos o
nucleótidos. En concreto, formando el par de bases utilizando guanosina y citidina se
obtiene la disolución de éste (cabe recalcar que la guanosina es muy poco soluble en
agua. Y se obtiene su disolución en este caso por la formación de los enlaces de
hidrógeno Watson y Crick posiblemente). En este sistema Au-Guanosina-Citosina se
consigue un precipitado definido, insoluble en agua y muy ligeramente soluble en
DMSO. El análisis elemental y los espectros infrarrojos son concordantes con la
fórmula propuesta en la Figura 20 sobre el compuesto (AuCl2)2(guanosina
desprotonada)(citidina desprotonada).
En ella se supone la desprotonación del N1 del resto guanina, cosa que es factible, y la
coordinación con el N3 de la citosina. La coordinación de un metal a una base baja
dramáticamente los pK de la base coordinada permitiendo la deprotonación de grupos
amino, como indicó en muchos ejemplos Lippert,1,8,25,27,31 que permite el enlace con un
segundo ion metálico. Obviamente el no poder realizar un estudio de RMN en solución
lastra el ejemplo. Con Au(III) se conocen algunos complejos aislados y cristalizados
con bases, no con pares de bases. En concreto cabe señalar el complejo tricloruro(1metilcitosinato)aurato(III) en el que el ion metálico se enlaza al N3.37 También se ha
descrito el tricloruro(1,9-dimetilguanina)aurato(III) en el que el Au se enlaza al N7 de la
base.38 En este artículo también se indica la presencia de una cierta actividad red-ox del
Au que afecta a la degradación de la guanina y la formación de especies de Au(0) y
Au(I) de forma parcial a lo largo de semanas o meses.
Sin embargo, utilizando los mononucleótidos GMP y CMP se consiguen fases
relativamente estables en medio acuoso, sin que haya hasta el momento sido posible
aislarlas, que en futuros experimentos pueden ser estudiados.
37
38
M. S. Holowaczak, M. D. Stancl, G. B. Wong, J. Am. Chem. Soc., 107 (1985) 5789-90.
A. Shimanski, E. Fresissinger, A. Erxleben, B. Lippert, Inorg. Chim. Acta, 283 (1998) 223-32.
31