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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA YEMA DE HUEVO DE CODORNIZ, PATA
Y GALLINA SOBRE LAS MORFOANOMALÍAS DE SEMEN BOVINO ANTES Y
DESPUÉS DE SER CRIOPRESERVADO
CATALINA ESCOBAR ECHEVERRI
DANIELA CASTAÑO CASTAÑO
CORPORACIÓN UNIVERSITARIA DE SANTA ROSA DE CABAL, UNISARC
FACULTAD DE CIENCIAS PECUARIAS
PROGRAMA DE ZOOTECNIA
SANTA ROSA DE CABAL
2014
1
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA YEMA DE HUEVO DE CODORNIZ, PATA
Y GALLINA SOBRE LAS MORFOANOMALÍAS DE SEMEN BOVINO ANTES Y
DESPUÉS DE SER CRIOPRESERVADO
CATALINA ESCOBAR ECHEVERRI
DANIELA CASTAÑO CASTAÑO
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de
Zootecnista
Directora
LIBIA INÉS MARÍN AGUILAR
M.V.Z., Esp., MSc
CORPORACIÓN UNIVERSITARIA DE SANTA ROSA DE CABAL, UNISARC
FACULTAD DE CIENCIAS PECUARIAS
PROGRAMA DE ZOOTECNIA
SANTA ROSA DE CABAL
2014
2
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1.
1.1
1.2
1.3
1.3.1
1.3.2
2.
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.3
2.3.1
2.3.1.1
2.3.1.2
2.3.2
2.3.2.1
2.3.2.2
2.3.2.3
2.3.2.4
2.3.2.5
2.3.2.6
2.3.2.7
2.3.2.8
2.4
2.4.1
2.4.1.1
2.4.1.2
2.4.1.3
2.4.1.4
2.4.1.5
2.4.2
2.4.2.1
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIÓN
PRECISIONES CONCEPTUALES
ÁREA PROBLEMA
JUSTIFICACIÓN
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos específicos
MARCO TEÓRICO
CRIOPRESERVACIÓN
DILUYENTES DE SEMEN
Requisitos para un buen diluyente
Los principales ingredientes contenidos en los diluyentes y sus
funciones
Acción de los componentes del diluyente
FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA CALIDAD SEMINAL
Factores infecciosos
Factores infecciosos virales
Factores infecciosos no virales
Factores no infecciosos
Factores medioambientales
Razas
Genes recesivos
Edad
Los factores nutricionales
El estrés
Alteraciones técnicas o defectos del manejo de semen
Malformaciones congénitas
VALORACIÓN DE LA CALIDAD SEMINAL
Examen macroscópico del semen
Volumen
Aspecto o consistencia
Color
Olor
pH
Examen microscópico del semen
Motilidad
5
12
13
14
15
17
18
20
21
22
23
24
25
26
27
2.4.2.2
2.4.2.3
2.4.2.4
2.4.2.5
2.4.2.6
2.4.2.7
2.4.2.8
2.4.2.9
2.4.2.10
3.
3.1
3.2
3.3
3.4
4.
5.
5.1
5.2
5.3
6.
Motilidad masal
Motilidad individual
Viabilidad
Concentración espermática
Estado del acromosoma
Morfología
Anormalidades primarias
Anormalidades secundarias
Otras células
MATERIALES Y MÉTODOS
MARCO GEOGRÁFICO
MARCO DEMOGRÁFICO
MATERIALES
MÉTODOS
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
MORFOANOMALÍAS PRE-CONGELACIÓN
MORFOANOMALÍAS POST-CONGELACIÓN
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
6
28
29
31
33
34
39
41
42
43
44
45
48
49
51
53
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura
Figura
Figura
Figura
1
2
3
4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Esquema del aparato reproductor de un toro
Colocación de gota de semen en el portaobjetos
Observación microscópica (100X)
Evaluación de la motilidad individual: Colocación de gota de semen
diluido en el portaobjetos
Evaluación de la motilidad individual: Observación microscópica
(100X)
Espermatozoides teñidos con ioduro de propidio y diacetato de
carboxifluoresceína
Cámara de Neubauer utilizada para determinar el número de
espermatozoide por ml3
Cámara de conteo para la determinación de la concentración de
espermatozoides por mililitro (número de espermatozoides por
mililitro)
Izquierda, espermatozoide con acrosoma intacto. Derecha,
espermatozoide con acrosoma dañado (1000x)
Cabeza desprendida de un espermatozoide, junto a otro normal
(400x)
Esquema de un espermatozoide
Evaluación microscópica de la morfología espermática (400X)
Método de coloración de una muestra de semen usando eosina
nigrosina
Vitalidad, vivos y muertos
Formas de observar lo espermatozoides en el microscopio
Alteraciones morfológicas del acrosoma
Alteraciones morfológicas de la cabeza
Alteraciones morfológicas de la pieza intermedia
Alteraciones morfológicas de la cola
Otras células
Reproductor de la raza Holstein
Electroeyaculador
Materiales
7
15
28
29
29
30
31
32
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34
35
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38
38
39
39
40
40
41
42
43
43
44
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1
Tabla
Tabla
Tabla
Tabla
Tabla
Tabla
Tabla
Tabla
2
3
4
5
6
7
8
9
Densidad macroscópica con base en el número de espermatozoides
por mililitro (ml)
Escala basada en el porcentaje de células móviles y criterio evaluativo
Escala basada en el porcentaje de células móviles
Escala basada en la velocidad de movimiento de las células móviles
Funciones de las partes de un espermatozoide
Porcentaje de morfoanomalías pre-congelación entre tratamientos
Porcentaje de morfoanomalías post-congelación entre tratamientos
Porcentaje de morfoanomalías pre y post-congelación gallina-codorniz
Porcentaje de morfoanomalías pre y post-congelación gallina-pata
8
27
28
30
30
36
49
49
50
51
RESUMEN
La criopreservación es el método donde se utilizan bajas temperaturas con el fin
de preservar las estructuras intactas de las células vivas. Las células se
criopreservan para evitar pérdidas por contaminación, para minimizar cambios
genéticos en líneas continuas y evitar la transformación en líneas finitas. Una
criopreservación exitosa de células requiere seguir protocolos estandarizados y
reproducibles, aunque cada protocolo puede requerir modificaciones según el tipo
celular o línea a usar, para lograr la máxima viabilidad después del
descongelamiento. El objetivo de este estudio fue evaluar las morfoanomalías pre
y post-congelación de los espermatozoides, después de haber adicionado yema
de huevo de gallina, yema de huevo de codorniz y yema de huevo de pata al
diluyente Triladyl®. La preparación del diluyente se realizó 1:1:3, una parte de
Triladyl®, una parte de yema de huevo y tres partes de agua destilada, esta
mezcla se homogenizó y se llevó a 38ºC. Luego se le incorporó en relación 1:1
semen bovino, se evaluó y se llevó a periodo de equilibrio 5ºC, durante dos horas.
Se empacaron las pajillas de 0,5 ml y posteriormente se expusieron las pajillas a
vapor de nitrógeno líquido – 96°C, durante 15 minutos, luego se realizó el proceso
de congelación en nitrógeno líquido. Después se descongelaron y se analizaron
las variables microscópicas del eyaculado enfatizando en las morfoanomalías
post- congelación. Esta investigación se realizó en Santa Rosa de Cabal, con dos
toros de la raza Holstein, que actualmente se encuentran en una edad promedio
de 5 años, en pastoreo rotacional y suplementados con sal mineralizada al 8% y
agua a voluntad. Para poder obtener el semen se realizó colecta con electro
eyaculador. Al analizar las variables microscópicas post-congelación y obtener los
resultados en porcentajes, se promedió y se estandarizó mediante modelo
estadístico análisis de varianza (ANAVA). De esta forma se determinó que no
hubo diferencias significativas entre tratamientos (p>0.05). Las morfoanomalías
fueron similares en pre y post-congelación. Por lo tanto cabe destacar que el uso
de cualquiera de las yemas de huevo como adicionante al diluyente crioprotector
mantienen y protegen los espermatozoides, lo cual no afectaría la capacidad
fecundante para la inseminación artificial.
Palabras claves: criopreservación, protocolo, espermatozoides, crioprotector,
yemas de huevo
9
ABSTRACT
The cryopreservation is the method where low temperatures are used in order to
preserve the structure intact living cells. Cells were cryopreserved to avoid losses
from pollution, to minimize genetic changes in solid lines and prevent
transformation in finite lines. A successful cryopreservation of cells required to
follow standardized and reproducible protocols, although each protocol may
require modification depending on the cell type or line to use, for maximum viability
after thawing. The aim of this study was to evaluate the morphological
abnormalities pre and post- freezing sperm, having added, chicken egg yolk, egg
yolk and egg yolk quail leg to Triladyl ® diluent. The preparation was made 1:1:3
diluent , a portion of Triladyl ® , one part egg yolk and three parts of distilled water ,
and this mixture was homogenized at 38° C. Then they incorporate part of bovine
semen was equilibration period 5°C for two hours. 0.5 ml straws were packed and
then the freezing process was performed in liquid nitrogen. Then thawed and
microscopic variables ejaculate emphasizing the morphological abnormalities postfreezing was analyzed. This research was conducted in Santa Rosa de Cabal, two
Holstein bulls, which are currently at an average age of 5 years, rotational grazing,
and continuous reproductive activity and supplemented with 8% mineralized salt
and water ad libitum. To obtain semen collection was made with electro
ejaculation.By analyzing the microscopic variables after freezing and get the
results in percentages are averaged and standardized by statistical model analysis
of variance (ANOVA). Thus it was determined that there were no significant
differences between treatments (p> 0.05). The morphological abnormalities were
similar in pre-and post- freezing. Therefore it should be noted that the use of any of
the egg yolks as diluent adding to cryoprotector, maintain and protect the sperm,
which would not affect the fertilizing capacity for artificial insemination.
Key words: cryopreservation, protocol, sperm, cryoprotector, yolks of egg
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