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UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA
(Creada por la ley Nº 25265)
DIRECCION UNIVERSITARIA DE INVESTIGACION
FONDO DE DESARROLLO SOCIO ECONOMICO DEL PROYECTO CAMISEA (FOCAM)
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN - FOCAM
“OPTIMIZACION DE LA FECUNDACION IN VITRO PARA LA
CONSERVACION DEL MATERIAL GENETICO DE LAS
ALPACAS (Vicugna pacos) DE LA COMUNIDAD
CAMPESINA DE CARHUANCHO DISTRITO DE PILPICHACA
PROVINCIA DE HUAYTARA REGION HUANCAVELICA”
Línea de Investigación: Preservación de la biodiversidad y el ecosistema de la zona
de influencia del proyecto Camisea.
INVESTIGADORES
Responsable
: Dr. Jaime Ruiz Béjar
Miembro
: Ing. Marino Artica Félix
FECHA DE REGISTRO:
Fecha de Inicio: Junio del 2014
Fecha de término: Julio del 2016
HUANCAVELICA, MARZO DEL 2014
2
ÍNDICE
“OPTIMIZACION DE LA FECUNDACION IN VITRO PARA LA CONSERVACION DEL MATERIAL
GENETICO DE LAS ALPACAS (Vicugna pacos) DE LA COMUNIDAD CAMPESINA DE
CARHUANCHO DISTRITO DE PILPICHACA PROVINCIA DE HUAYTARA REGION
HUANCAVELICA”
Número
1.1
1.2
1.3
1.4
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
A
B
C
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
a
b
c
CAPÍTULO I: DESCRIPCION DEL PROBLEMA
DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
OBJETIVOS GENERAL Y ESPECÍFICOS
JUSTIFICACIÓN
CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO
DELIMITACIONES
BASES TEÓRICAS Y CONCEPTUALES
HIPÓTESIS
DEFINICIÓN DE TÉRMINOS.
IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
DEFINICIÓN OPERATIVA DE LAS VARIABLES E INDICADORES
CAPÍTULO III: METODOLÓGIA DE LA INVESTIGACION
TIPO DE INVESTIGACIÓN
NIVEL DE INVESTIGACIÓN
MÉTODO DE INVESTIGACIÓN
DISEÑO DE INVESTIGACIÓN
EXPERIMENTO 1: OPTIMIZANDO EL TIEMPO DE MADURACIÓN DE
OVOCITOS DE ALPACA.
EXPERIMENTO 2: OPTIMIZANDO EL MEDIO DE CULTIVO DE
EMBRIONES
EXPERIMENTO 3: EVALUACIÓN DEL MÉTODO DE RECUPERACIÓN
DE OVOCITOS.
POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO
TÉCNICAS E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS
PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS
TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS
ÁMBITO DE ESTUDIO
CAPÍTULO IV: ASPECTOS ADMINISTRATIVOS
POTENCIAL HUMANO
RECURSOS MATERIALES
PRESUPUESTO DE BIENES
PRESUPUESTO DE INSUMOS
MATERIALES
REACTIVOS
COMBUSTIBLE PARA EL LABORATORIO
PRESUPUESTO DE VESTUARIO
PRESUPUESTO DE MATERIALES DE ESCRITORIO
PRESUPUESTO DE COMBUSTIBLE
PRESUPUESTO DE SERVICIOS
PUBLICACIÓN
PASANTÍA
OTROS SERVICIOS
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5
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46
47
48
48
48
48
49
49
3
d
e
f
4.3
4.4
4.5
4.5.1
CAPACITACIÓN
ASISTENTES DE INVESTIGACIÓN
CONSULTORÍA
PRESUPUESTO (CADENA DE GASTO MENSUALIZADO)
FINANCIAMIENTO
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
DE ACTIVIDADES EXPERIMENTALES
REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS
ANEXO
MATRIZ DE CONSISTENCIA
PROPUESTA DE INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS
49
49
49
50
50
50
50
51
4
CAPÍTULO I: DESCRIPCION DEL PROBLEMA
1.1 DESCRIPCION DEL PROBLEMA
En la región Huancavelica existen más de 225,000 alpacas (MINAG 2005), las que constituyen
alrededor del 7% de la población total nacional y de las cuales el 90% es de raza Huacaya
(Quispe et al., 2008). La crianza de alpacas es una importante actividad económica en las 60
comunidades alpaqueras existentes en la región y que agrupan a 3300 familias
aproximadamente, las cuales están organizadas en comunidades de pastores bajo un sistema
de crianza de rebaño mixto familiar (alpacas, llamas y ovinos). Estos rebaños se caracterizan
por carecer de sistemas de crianza adecuados y con escasos criterios de mejoramiento
genético (Quispe et al., 2008).
La Comunidad Indígena de Carhuancho se encuentra ubicada en la región altoandina
denominada Janca o Cordillera, entre los 3,500 a 5,000 msnm, en la jurisdicción del distrito de
Pilpichaca, provincia de Huaytará, departamento de Huancavelica. Colinda con las
comunidades campesinas de Choclococha, Santa Inés, Llillinta, Ingahuasi, y Carhuapata. En la
actualidad hay más de 390 comuneros empadronados en esta Comunidad Indígena y una
población de 2340 personas que dependen de la ganadería como actividad económica
principal, consistente en el pastoreo de camélidos sudamericanos (alpacas y llamas), ovinos y
esquila de vicuñas. Esta comunidad es la primera productora de alpacas en calidad y cantidad,
para el año 2005 según fuentes de la Dirección Regional de Agricultura - Huancavelica registró
26,520 cabezas de alpacas, 9,600 llamas y 19,500 ovejas; quedando demostrado que en el
ámbito de la región de Huancavelica representa Carhuancho el polo de desarrollo económico
en la actividad alpaquera (CEPES, 2009).
Por otro lado, en la actualidad los porcentajes de natalidad anual en la mayoría de
explotaciones alpaqueras es del orden del 50% (Fernández Baca, 1993), con índices de
fertilidad (Apaza et al., 1998) y de preñez (Apaza et al., 2001) que no superan el 65% y 60%
respectivamente. Esto se deriva de un reemplazo inadecuado para la reproducción,
desconocimiento de la fisiología reproductiva y un inadecuado empleo de reproductores en el
apareamiento (Apaza et al., 1998). La aplicación de biotecnologías reproductivas puede
contribuir a superar estos bajos índices y aportar al mejoramiento genético en estas especies,
sobretodo en la multiplicación de animales de alto valor productivo mantenidos en núcleos
genéticos y estos se convertirían en reproductores para los criadores de alpacas y de esta
manera contribuir al mejoramiento de los ingresos de los criadores de alpacas de esta región
del país (Ruiz, 2011).
La transferencia de embriones puede constituir un método valioso para acelerar los programas
de mejoramiento genético en camélidos sudamericanos (Franco et al., 1999). Sin embargo
hasta 1996 solamente 11 crías de camélidos sudamericanos habían nacido en el Mundo
utilizando esta técnica (Del Campo, 1997). En el Perú, Sumar y Franco (1974) lograron la
primera cría viva de alpaca obtenida por transferencia quirúrgica de embriones. En Estados
Unidos, Wiepz y Chapman (1985) lograron el primer nacimiento de una llama por transferencia
de embriones no quirúrgica. Posteriormente, en Perú nacieron 2 crías de alpaca (Palomino et
al., 1987); 7 crías de llama nacieron en el Reino Unido entre 1992 y 1995 (Bourke et al., 1992;
5
Bourke et al., 1995a,b); y en Chile nació una cría de llama después de 2 transferencias no
quirúrgica (Gatica et al., 1994).
En los últimos años se han mejorado estos resultados empleando la transferencia de
embriones no quirúrgica (Taylor et al., 2000; Von Baer et al., 2003a). En Estados Unidos
durante 10 años de trabajo (Taylor, 2003) se logró el nacimiento de 250 crías llamas,
mejorando significativamente el último año ya que hasta el año 2002 solamente 40 crías habían
nacido vivas. En Chile Von Baer et al., (2003b) lograron transferir embriones de alpaca en
llamas receptoras logrando tasas de preñez a los 30 y 90 días de 55,2% y 51,7%
respectivamente. En Argentina, Aller et al., (2002) lograron 50% (2/4) de preñez utilizando
embriones vitrificados de llama.
En Perú, Palomino (2000) reportó el nacimiento de 19 crías luego de superovular 8 hembras
donantes con un tratamiento combinado de FSHp/eCG, los embriones recuperados se
transfirieron a 30 alpacas receptoras de las cuales 23 quedaron preñadas. Por otro lado,
Huanca et al., (2006a) obtuvieron 4 y 23 crías de alpacas y llamas respectivamente, luego de
transferir embriones en 10 alpacas y 32 llamas receptoras. Obtuvieron una tasa de colección
de embriones de 1,6 ± 0,1 en alpacas y 4,8 ± 0,9 en llamas, una tasa de preñez al día 90 del
40,0% (4/10) y 71,8% (23/32) en alpacas y llamas respectivamente.
Sin embargo todos estos resultados han sido obtenidos utilizando la transferencia de embriones
tradicional, es decir luego de realizar el lavado uterino de una hembra donadora superovulada e
inseminada y transfiriendo los embriones en receptoras sincronizadas, lográndose obtener
crías.
Por otro lado se han producido embriones in vitro en camélidos sudamericanos (Del Campo et
al., 1994; Del Campo et al., 1995; Gómez et al., 2002; Conde et al., 2006; Ratto et al., 2007;
Conde et al., 2008; Mendoza et al., 2008; Gamarra et al., 2008a; Machicado et al., 2009;
Huanca et al., 2009; Huanca et al., 2010; Huamán et al., 2011; Berland et al., 2011 y Santayana
2012). Sin embargo hasta la fecha no ha nacido en el mundo cría alguna de camélidos
sudamericanos con la aplicación de esta tecnología. Es necesario entonces mayores estudios,
que nos permitan obtener embriones in vitro de alpaca de mayor calidad genética para que
puedan ser transferidos satisfactoriamente en hembras receptoras y lograr gestaciones por
primera vez en camélidos sudamericanos. Para ello se piensa obtener ovocitos de alpacas de la
Comunidad Indígena de Carhuancho que cuenta con los mejores animales de la región
Huancavelica y transferirlos en alpacas de los mismos productores de la Comunidad.
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Muy pocos estudios han sido conducidos sobre la maduración in vitro de ovocitos (Del Campo
et al., 1992, 1994; Sansinema et al., 2003, 2006; Chaves et al., 2003; Miragaya et al., 2002;
Ratto et al., 1999, 2005, 2006; Ruiz y Correa 2007; Huanca et al., 2009; Santayana 2012) en
camélidos sudamericanos. La maduración in vitro simula el tiempo transcurrido y sobretodo los
procesos metabólicos que en forma natural ocurren en el ovocito contenido en el folículo
dominante, entre el pico preovulatorio de LH hasta que se produce la ovulación (Ruiz, 2011).
6
En alpacas, el tiempo mínimo de ovulación fue estimado 26 horas después de la monta natural
y 24 horas después del tratamiento con hCG (San Martín et al., 1968). Los primeros reportes de
maduración in vitro (MIV) en alpacas (Gómez et al., 2002; Ratto et al., 2007) se han realizado
utilizando un tiempo de 26 horas. Asimismo existen reportes que indican el uso de 22 – 25
horas de tiempo de maduración (Ruiz et al., 2007; Mendoza et al., 2008; Sacha y Rojas 2009;
Taipe et al., 2010; Taipe et al., 2011; Ruiz et al., 2011; Huamán et al., 2011) de los Cúmulo
Oóforo Compactos de alpacas con buenas tasas de segmentación y de desarrollo hasta
blastocisto. Por otro lado, Park et al., (2005) han encontrado en bovinos, mayores tasas de
segmentación y de blastocistos utilizando 18 horas de Maduración in vitro (MIV) de ovocitos que
con 20, 22 y 24 horas; en las vacas la ovulación se produce 22-24 horas después del pico de
LH. Estos resultados nos llevan a pensar que es probable que el tiempo óptimo de maduración
requerido para ovocitos de alpaca sea menor a 26 horas.
Sin embargo, Gamarra et al., (2008a) han utilizado 30 horas de maduración in vitro de ovocitos
de alpaca y Huanca et al., (2009) recomiendan 38 horas o más como tiempo óptimo para la
maduración de ovocitos de alpaca y Santayana (2012) encontró mayor cantidad de ovocitos
maduros con 34 horas comparado con 30 y 26 horas de maduración.
Por otro lado, la utilización de la fecundación in vitro (FIV) en camélidos sudamericanos podría
ser una alternativa para el mejoramiento genético de camélidos domésticos y para la
preservación de los camélidos silvestres (Ruiz 2011). Sin embargo existen pocos reportes de
FIV en camélidos sudamericanos: Del Campo et al., (1994); Del Campo et al., (1995); Gómez et
al., (2002); Conde et al., (2006); Ratto et al., (2007); Conde et al., (2008); Gamarra et al.,
(2008a); Mendoza et al., (2008); Machicado et al., (2009); Huanca et al., (2009); Huanca et al.,
(2010); Huamán et al., (2011); Berland et al., (2011) y Santayana (2012) y hasta la fecha no se
ha logrado producir gestaciones ni ha nacido cría alguna con la aplicación de esta técnica.
El embrión producido in vitro no está en su ambiente natural que es el útero materno. Es por
este motivo que en mamíferos se han evaluado diferentes medios para el cultivo de embriones
mamíferos como son: KSOM, CR1aa, CR2, TCM-199, CZB, SOF, USU, Ham F-10, Menezo B,
SOF-IVC etc. (Marquant-Leguienne y Humblot, 1998). En camélidos sudamericanos se han
utilizado diferentes medios para el cultivo de embriones como son: SOF + 0,6% BSA
(Machicado et al., 2009; Berland et al., 2011), SOF-IVC (Mendoza et al., 2008; Huamán et al.,
2011; Santayana 2012), SOFaa (Gamarra et al., 2008a; Conde et al., 2008), TCM-199 (Del
Campo et al., 1994; Gómez et al., 2002; Ratto et al., 2007; Huanca et al., 2009), KSOM (Condori
et al., 2010; Huanca et al., 2010), sin embargo no se ha comparado cuál de estos podría dar
mejores resultados para el cultivo de embriones en alpacas.
Del Campo et al., (1994) han utilizado PHE (Penicilamina, Hipotaurina, epinefrina) y heparina
para la capacitación de espermatozoides de llama, igualmente lo hicieron Gamarra et al.,
(2008a) para capacitar espermatozoides de alpaca. Por otro lado, Ratto et al., (2007) y Berland
et al., (2011) han utilizado sólo heparina como agente capacitante de espermatozoides de llama
antes de la fecundación in vitro. Existen otros trabajos de investigación (Mendoza et al., 2008;
Huanca et al., 2009; Condori et al., 2010; Huamán et al., 2011; Santayana 2012) en los cuales
no han utilizado ningún agente capacitante para la fecundación in vitro de ovocitos de alpaca.
7
Por otro lado, Conde et al., (2008) no encontraron diferencias estadísticas en las tasas de
segmentación y de blastocistos, con o sin el uso de agentes capacitantes para los
espermatozoides de llama. Los agentes capacitantes utilizados fueron penicilamina, hipotaurina
y heparina. Estos resultados estarían indicando que no sería necesaria la capacitación
espermática para la Fecundación in vitro en camélidos sudamericanos, sin embargo es
necesario más trabajos de investigación para confirmar esta hipótesis.
Para mejorar las condiciones del cultivo de embriones se ha utilizado diferentes tipos celulares:
células de la granulosa, células epiteliales de oviducto de bovino (BOEC, por sus siglas en
inglés), y líneas celulares establecidas (células Vero), etc. (Marquant-Leguienne y Humblot,
1998). Con la adición de monocapas de células somáticas al medio de cultivo (Gordon y Lu,
1990) se han mejorado las tasas de desarrollo embrionario en bovinos. Asimismo, el empleo de
BOEC como co-cultivo propicia un buen ambiente para el desarrollo final del embrión (Eyestone
et al., 1987), pero la utilización de células de la granulosa ha dado mejores resultados
(Mochizuki et al., 1991), mientras que la utilización de células de hígado de rata, búfalo o de la
teca interna, han dado resultados variables (Gordon, 1994). En camélidos sudamericanos
existen pocos reportes del co-cultivo de embriones con células. Del Campo et al., (1994)
utilizaron células de oviducto de llama para el co-cultivo de embriones de llama. Ratto et al.,
(2007) co-cultivaron los embriones híbridos de llama x alpaca con células epiteliales del
oviducto de bovino. Por otro lado Berland et al., (2011) utilizaron células del cúmulus para el cocultivo de embriones de llama producidos por fecundación in vitro. En ninguno de los casos
reportan algún efecto benéfico del co-cultivo de los embriones con estos tipos celulares, por lo
que en este punto también hay un vacío de conocimiento necesario cubrir mediante un trabajo
de investigación.
Se ha investigado también en el uso de técnicas para la recuperación de COCs en hembras
vivas en estas especies. Estas técnicas se presentan como una excelente alternativa para la
producción in vitro de embriones ya que permiten disponer de una buena cantidad de
COCs/hembra. La fecundación exitosa de estos COCs permitiría obtener más crías/año de la
misma donante al transferir los embriones producidos in vitro en receptoras sincronizadas, y así
superar el límite fisiológico de una cría/año en las hembras de los camélidos sudamericanos
(Ruiz, 2011). En esta perspectiva, se han recuperado con éxito COCs con procedimientos
menos invasivos y que no requieren de una cirugía, utilizando la aspiración folicular transvaginal
(Brogliatti et al., 2000; Ratto et al., 2005; Huanca et al., 2006b; Sansinema et al., 2007; Gamarra
et al., 2008b y Berland et al., 2011) y la laparoscopia (Ruiz y Correa, 2007). Sin embargo en la
mayoría de estos estudios no se ha utilizado los ovocitos recuperados para la fecundación in
vitro. En otro estudio, Berland et al., (2011) fertilizaron ovocitos de llama recuperados por
aspiración transvaginal y lograron altas tasas de desarrollo embrionario (segmentación: 65,3%
vs 63,1%; y blastocistos: 23,1 % vs 20,5 %, para los tratamientos superovulatorios con FSH y
eCG respectivamente).
Como mencionamos anteriormente, no se ha reportado hasta la fecha el nacimiento de cría
alguna a partir de un embrión producido in vitro en camélidos sudamericanos. Conde et al.,
(2006) fueron los únicos que transfirieron embriones de llama producidos por FIV e ICSI y no
lograron gestaciones. Por otro lado Aller et al., (2002) lograron gestaciones con embriones
8
vitrificados de llama, los embriones fueron recuperados por lavado uterino de llamas donantes.
Estos resultados sugieren que se requiere mayor investigación para establecer un protocolo de
sincronización de hembras receptoras de embriones frescos y criopreservados.
La Comunidad de Carhuancho tiene un enorme potencial como productora de alpacas de
calidad, se calcula que la cantidad de fibra por cada alpaca es de 5.00 libras promedio,
pudiendo alcanzar hasta 8 libras (CEPES 2009). Se han identificado también alpacas adultas
con 16 – 18 micras de promedio, cuando el promedio regional es de 24 – 25 micras de finura de
fibra (Quispe et al., 2008). Sin duda las alpacas de Carhuancho pueden ser utilizadas para
mejorar el diámetro de fibra y el peso de vellón en toda la región de Huancavelica, ya que en
vacunos se han reportado hasta 80 crías/año por vaca donante de ovocitos (Ruiz 2011), y
sabemos que una alpaca tiene menos de 6 crías en toda su vida reproductiva. Asimismo, la
tecnología de FIV puede ser utilizada para la conservación de este valioso material genético que
representan las alpacas de la Comunidad de Carhuancho, sin embargo para poder aplicar la
FIV y lograr gestaciones en alpacas aplicando esta técnica son necesarios mayores estudios los
cuales se han puesto en evidencia en esta sección.
Ante todos estos aspectos, se presenta la siguiente interrogante la cual se pretende responder
en la presente investigación:
Problema General:
Luego de obtener el tiempo óptimo de maduración de ovocitos, identificar el medio adecuado de
cultivo de embriones, reconocer el método de recuperación de ovocitos más adecuado en
alpacas donantes y el método adecuado de sincronización de las receptoras ¿Es posible lograr
preñeces con embriones producidos por fecundación in vitro para la conservación del material
genético de las alpacas de la Comunidad Campesina de Carhuancho?
Problemas específicos:
¿Cuál es el tiempo óptimo de maduración in vitro de ovocitos de alpaca?
¿Cuál es el medio adecuado para el cultivo de embriones producidos por fecundación in vitro?
¿Son necesarios los agentes capacitantes de espermatozoides para mejorar las tasas de
desarrollo embrionario in vitro?
¿Es necesario el co-cultivo de células con embriones de alpaca producidos por fecundación in
vitro?
¿Cuál es la técnica adecuada para la recuperación de ovocitos en alpacas?
¿Cuál es el método adecuado de superovulación de las hembras donantes de ovocitos?
¿Cuál es el método adecuado de sincronización de las hembras receptoras de embriones por
fecundación in vitro?
¿Cuáles son las tasas de desarrollo embrionario (segmentación, mórulas y blastocistos que se
obtienen luego de optimizar el protocolo de fecundación in vitro?
¿Cuáles son las tasas de preñez que se obtienen luego de optimizar el protocolo de
fecundación in vitro?
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 OBJETIVO GENERAL
 Optimizar la técnica de fecundación in vitro con gametos de alpacas para producir
embriones de calidad que luego de ser transferidos en alpacas sincronizadas puedan
9
producir gestaciones que permitan contribuir a la conservación del material genético de las
mejores alpacas de los productores de la Comunidad de Carhuancho en Pilpichaca
Huancavelica.
1.3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
EXPERIMENTO 1: Optimizando el tiempo de maduración de ovocitos de alpaca.
 Encontrar el tiempo óptimo para la maduración in vitro de ovocitos de alpaca.
 Identificar los estados de maduración nuclear de ovocitos de alpaca madurados in vitro.
 Evaluar las tasas de segmentación, mórulas y de blastocistos en embriones de alpaca
producidos por FIV en diferentes tiempos de maduración de ovocitos.








EXPERIMENTO 2: Optimizando el medio de cultivo de embriones
Identificar el medio adecuado para el cultivo de embriones de alpaca producidos por
fecundación in vitro.
Evaluar diferentes agentes para la capacitación de espermatozoides de alpaca en la
producción de embriones por fecundación in vitro.
Evaluar el co-cultivo de células de oviducto, células de la granulosa y fibroblastos con
embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro.
Evaluar las tasas de segmentación, mórulas y de blastocistos en embriones de alpaca
producidos por fecundación in vitro en las diferentes condiciones de cultivo.
EXPERIMENTO 3: Evaluación del método de recuperación de ovocitos
Identificar la técnica adecuada para la recuperación de COCs en alpacas donantes de
ovocitos superovuladas.
Encontrar el método adecuado de superovulación de las hembras donantes de ovocitos.
Encontrar el método adecuado de sincronización de las hembras receptoras de embriones
de alpaca.
Evaluar las tasas de segmentación, mórulas y de blastocistos en embriones de alpaca
producidos por FIV.
1.4 JUSTIFICACIÓN
La Comunidad indígena de Carhuancho tradicionalmente se ha dedicado a la crianza de
alpacas y es reconocida como líder en la región Huancavelica en la producción de alpacas de
calidad, tanto en cantidad como en calidad de vellón. Se han identificado alpacas con una
finura de fibra envidiable (16 – 18 micras) y con peso de vellón que puede llegar a 8 libras,
superando largamente los índices productivos de muchas comunidades de la región
Huancavelica (24-25 micras de finura y 3-4 libras de peso de vellón). La tecnología de la
fecundación in vitro permitiría la conservación de este importante germoplasma y multiplicar
dentro de la misma Comunidad de Carhuancho las alpacas de mayor finura de fibra y peso de
vellón. Asimismo, esta calidad genética de las alpacas de la Comunidad de Carhuancho se
puede aprovechar para contribuir al mejoramiento genético de las otras comunidades de
Huancavelica a través del uso de las biotecnologías reproductivas en este caso la fecundación
in vitro.
10
La fecundación in vitro maximiza el uso de los gametos de animales de calidad genética
superior. Una alpaca hembra con empadre natural puede tener sólo una cría al año, sin
embargo es posible recuperar de 10 a 15 ovocitos/sesión en alpacas vivas a través de la
aspiración transvaginal guiada por ultrasonografía o a través de aspiración laparoscópica y
repetir la aspiración al menos 4 veces al mes. Esto nos permitiría tener hasta 60 ovocitos al
mes los cuales pueden ser fertilizados y tener de 10 a 15 embriones transferibles por mes y al
año 120 a 180 embriones transferibles los cuales pueden perfectamente producir 50 a 60
gestaciones al año al transferir estos embriones en alpacas receptoras de la Comunidad de
Carhuancho o de otras comunidades de Huancavelica. Con respecto a la alpaca macho,
debido a su pequeño testículo y su escasa producción de espermatozoides, este sólo puede
hacer de 2 a 3 servicios por día los cuales muchas veces pueden ser realizados en alpacas
receptivas pero que aún no tienen un folículo dominante con un tamaño mínimo de 7 mm y por
lo tanto no ovulan y no quedan preñadas desperdiciándose los espermatozoides del eyaculado.
Utilizando un eyaculado de alpaca macho se pueden fertilizar in vitro hasta 300 ovocitos
recuperados en un día de diferentes alpacas.
El éxito de la fecundación in vitro en alpacas que es un camélido doméstico podría aplicarse
para la producción de embriones de animales en peligro de extinción como la vicuña y el
guanaco, lo que permitiría contribuir al incremento poblacional de ambas especies silvestres
que se encuentran en peligro de extinción siendo más crítica la situación del guanaco de los
cuales sólo existen alrededor de 4000 animales en todo el Perú. La fisiología reproductiva de la
alpaca y la llama es similar a la de la vicuña y el guanaco. Se podría recuperar ovocitos de
vicuñas y guanacos hembras sin la necesidad de matarlas y sin poner en riesgo su
supervivencia. Los espermatozoides de vicuñas y guanacos macho igualmente se pueden
recuperar por electroeyaculación y con estos se pueden fertilizar ovocitos de su misma
especie. Los embriones de guanaco y vicuña producidos en el laboratorio por fecundación in
vitro pueden ser transferidos a alpacas y llamas receptoras y como son especies domésticas
en los primeros meses de vida se puede controlar y cuidar a las crías guanacos y vicuñas de
los depredadores y las inclemencias del tiempo para que cuando llegadas a adultas puedan ser
liberadas a su medio de vida natural y de esta manera contribuir a la conservación de estas
especies amenazadas. Sin embargo es necesario investigar en la optimización de la
fecundación in vitro, en las técnicas de recuperación de ovocitos y la mejor forma de
sincronizar a las receptoras de embriones.
Si en este proyecto de investigación logramos identificar el tiempo óptimo de maduración de
ovocitos y el medio adecuado de cultivo de embriones, y producto de ello logramos obtener
gestaciones en alpacas con embriones producidos por fecundación in vitro, estos resultados
serán de gran aporte para la comunidad científica nacional e internacional representando la
originalidad del trabajo y colocando a la Universidad Nacional de Huancavelica como líder en la
investigación en biotecnologías reproductivas aplicadas en camélidos sudamericanos.
Hasta la fecha no se ha producido ninguna cría ni se ha reportado alguna gestación con la
transferencia de embriones producidos por fecundación in vitro en camélidos sudamericanos.
En bovinos se han logrado hasta 90 crías al año por vaca donante de ovocitos en países como
Japón y Australia en programas de transferencia de embriones producidos por fecundación in
11
vitro. El éxito de la transferencia de embriones de alpaca producidos por fecundación in vitro
permitiría tener más de una cría al año de una alpaca hembra sobresaliente en el hato. Si
además sabemos que las alpacas hembras tienen la limitante de producir menos de 6 crías
durante toda su vida reproductiva, podríamos en el futuro obtener más crías por alpaca hembra
donante de ovocitos y de esta manera maximizar el número de crías por alpaca reproductora, y
de esta manera contribuir al mejoramiento genético en esta especie.
Desde el punto de vista social, obtener mayor número de crías de una alpaca donante de
ovocitos, generará mayores ingresos a los productores alpaqueros de Huancavelica y del Perú.
Por todos estos motivos se justifica la realización de este trabajo de investigación, en el que se
pretende poner a punto la producción de embriones in vitro para luego recuperar ovocitos de
hembras vivas de calidad genética superior, fertilizarlos y transferirlos a receptoras
sincronizadas adecuadamente y lograr las primeras gestaciones en alpacas con embriones
producidos por fecundación in vitro.
CAPITULO II: MARCO TEÓRICO
2.1 DELIMITACIONES
Del Campo et al., (1994) lograron recuperar 27 COCs por llama, desmenuzando los ovarios con
ayuda de una hoja de afeitar descartando 26% de los 1324 COCs recuperados. También se han
recuperado COCs de llama (Del Campo et al., 1992; Ratto et al., 1999 y Ratto et al., 2005) y
alpaca (Ruiz et al., 2007; Mendoza et al., 2008; Gamarra et al., 2008a; Fernández y Esteban
2009; Ruiz et al., 2009a; Ruiz et al., 2009b; Sacha y Rojas, 2009) puncionando folículos de
ovarios recuperados en el camal con ayuda de una jeringa manual. Con esta metodología Del
Campo et al., (1992) recuperaron 6,4 ovocitos por llama y Ratto et al., (1999) recuperaron 2,2
COCs/ovario con 95% (308/324) seleccionados como aptos para el cultivo in vitro en medio de
maduración. Ruiz et al., (2007), utilizando ovarios procedentes del Camal Municipal de
Huancavelica aspiraron folículos con agujas 21g y jeringas estériles de 5cc en el Laboratorio de
Biotecnología Reproductiva de la Universidad Nacional de Huancavelica. Recuperaron 2,2
COCs/ovario de llama y 3,5 COCs/ovario de alpaca con 66% y 69% COCs de llama y alpaca
respectivamente seleccionados como aptos para la maduración in vitro. Esta fue la metodología
de trabajo aplicada por primera vez en el Perú, utilizándose los ovocitos en la producción in vitro
de embriones tanto de alpaca como de llama.
Se han recuperado COCs vía laparotomía lateral (Miragaya et al., 2002; Sansinema et al., 2007;
Conde et al., 2008) en llamas; vía laparotomía ventral en vicuñas (Chaves et al., 2003) y en
alpacas (Gómez et al., 2002; Ratto et al., 2007; Gamarra et al., 2008b). Miragaya et al., (2002)
aspiraron los folículos ováricos utilizando una aguja 21g conectada a una jeringa manual y
obtuvieron 87% y 59% COCs recuperados en hembras superovuladas y no superovuladas
respectivamente. La superovulación de hembras donantes permite una mayor presencia de
folículos en la superficie ovárica y de esta manera recuperar una mayor cantidad de ovocitos.
Con la misma técnica quirúrgica, Sansinema et al., (2007) aspiraron folículos utilizando una
aguja 21g conectada a una bomba de vacío. La aspiración se hizo con una presión negativa de
10 – 20 mm Hg recuperando 94% de COCs en llamas superovuladas. Asimismo Conde et al.,
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(2008), recuperaron 86,5% COCs en llamas superovuladas, los COCs recuperados fueron
utilizados para la producción de embriones por fecundación in vitro y por inyección
intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
En vicuñas superovuladas, Chaves et al., (2003) exteriorizaron los ovarios por laparotomía
ventral y puncionaron los folículos con una aguja 21g conectada a una jeringa manual de 10cc
logrando recuperar 55,4% COCs. En alpacas superovuladas con FSH, el porcentaje de
recuperación de COCs con la misma técnica fue de 82% (Gómez et al., 2002); mientras que en
alpacas superovuladas con FSH y eCG, Ratto et al., (2007) recuperaron 89% y 87% para FSH y
eCG respectivamente, asimismo los tratamientos de superovulación con FSH o eCG no fueron
diferentes con respecto al número de folículos mayores a 6mm presentes al momento de la
colección de los COCs. En Perú, Gamarra et al., (2008b) también han evaluado la utilización de
laparotomía ventral para la recuperación de COCs en alpacas. Lograron recuperar 7,6
COCs/hembra con 81% COCs de buena calidad cuando utilizaron como tratamiento de
sincronización y estimulación ovárica dispositivos intravaginales con 0,78 mg de Progesterona
combinada con 1 mg im de estradiol (Día = 0) y 700 UI de eCG al momento del retiro de los
dispositivos intravaginales (Día = 7). Asimismo recolectaron 7,0 COCs/alpaca con 79,5% COCs
de buena calidad cuando el tratamiento de sincronización y estimulación ovárica se hizo
aplicando i.m. 3,1 mg LH (Día = 0) más 700 UI de eCG (Día = 2). Demostrando que sin el uso
de un dispositivo vaginal con progesterona se colecta una misma cantidad y calidad de COCs
en alpacas. Si bien estos autores en la mayoría de los casos lograron altas tasas de
recuperación de COCs, la técnica de laparotomía es invasiva y útil solamente para aplicarla a
manera de investigación, ya que limitaría la repetición de las sesiones de recuperación de
COCs. Por otro lado, se ha reportado (Sansinema et al., 2003) la aspiración de folículos en
ovarios extirpados (ovariectomía) de llamas superovuladas con FSH antes de la cirugía. Se
logró recuperar 97% de COCs. Sin embargo esta técnica también es útil sólo para fines de
investigación y utilizando hembras de descarte, ya que si se utiliza hembras selectas estas
quedarían infértiles definitivamente.
También se han recuperado con éxito COCs con procedimientos menos invasivos y que no
requieren de una cirugía, utilizando la aspiración folicular transvaginal (Brogliatti et al., 2000;
Ratto et al., 2005; Huanca et al., 2006b; Sansinema et al., 2007; Gamarra et al., 2008b, Berland
et al., 2011) y la laparoscopia (Ruiz y Correa, 2007). Mediante la aspiración folicular
transvaginal guiada por ultrasonografía, Brogliatti et al., (2000) alcanzaron una tasa de colección
de COCs de 65% en llamas no estimuladas frente a un 52% en llamas estimuladas
hormonalmente para la superovulación. Sin embargo en las llamas superestimuladas se
recuperó un mayor número de ovocitos (9,0 vs 3,1) y de mayor diámetro (7,7mm vs 4,5mm).
Posteriormente estos resultados han sido mejorados por Ratto et al., (2005) quienes trabajaron
con llamas del Centro de Investigación y Producción Quimsachata de la Estación Experimental
ILLPA – INIA – Puno. Lograron recuperar 71% y 74% de COCs con 10,7 ± 2,1 y 11,2 ± 2,3 en
llamas superovuladas con FSH y eCG respectivamente. En Argentina, Sansinema et al., (2007)
obtuvieron una tasa relativamente menor recuperando 61% de COCs en llamas superovuladas
con FSH y los COCs recuperados por esta técnica de aspiración transvaginal fueron de menor
calidad a los colectados por laparotomía lateral. En el Perú también se ha utilizado la técnica de
aspiración folicular guiada por ultrasonido para recuperar COCs en alpacas. Gamarra et al.,
13
(2008b) lograron recuperar en promedio 6 COCs/alpaca cuando el tratamiento para la
sincronización y superovulación se hizo con 0,78 mg de progesterona + estradiol (Día = 0) y una
dosis de 700 UI de eCG al momento del retiro de las esponjas con progesterona (Día = 7) y
recuperaron 6,0 COCs en promedio por alpaca y cuando aplicaron otro tratamiento con LH (Día
= 0) y eCG (Día = 2) recuperaron 6,1 COCs/alpaca. Los COCs de buena calidad fueron 7,4% y
64,9% con dispositivo intravaginal y sin este respectivamente. Otro grupo de investigación en el
Perú, encontraron resultados un tanto diferentes (Huanca et al., 2006b) con un promedio de 4,5
folículos ováricos mayores a 6 mm y una tasa de recuperación de 55,5% COCs en alpacas
superovuladas con un tratamiento consistente de 200 mg de FSH dividido en una aplicación dos
veces/día por 4 días consecutivos realizándose la aspiración de los folículos el sexto día. Por
otro lado Ruiz y Correa (2007) recuperaron COCs de alpaca y llama utilizando un laparoscopio
con 30° de ángulo de cámara y con una fuente de luz tipo 488B. Introdujeron 3 trócares a la
cavidad abdominal a unos 6-10 cm craneales a la glándula mamaria. El primero 2 cm a la
izquierda de la línea media, el segundo sobre la línea media y el tercero 4 a 6 cm a la derecha
de la línea media. Por la incisión de la izquierda se introdujo un trócar de 7 mm de diámetro a
través del cual pasó el laparoscopio conectado a una fuente de luz fría. Ubicado el ovario, se
introdujo por la incisión de la derecha un forceps atraumático con el cual se manipuló y sujetó el
ovario. Seguidamente se introdujo por el trócar del centro una aguja conectada a una bomba de
vacío con 40 mm de Hg de presión negativa con la que se aspiró el fluido folicular con los
COCs. Con esta técnica se recuperaron 57% y 60% de COCs en llamas y alpacas
respectivamente sin tratamientos para la superovulación.
COCs de llama fueron madurados in vitro (MIV) por primera vez por Del Campo et al., (1992),
utilizando un tiempo de 36 horas de maduración en medio TCM-199 suplementado con suero
fetal bovino, piruvato de Na, FSH, estradiol y sulfato de gentamicina, obtuvieron 62% de
ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II. En otro experimento, Del Campo et al.,
(1994) obtuvieron 30% de ovocitos en metafase II luego de 30 horas de MIV. Distintos
protocolos de recuperación de COCs se utilizaron en ambos experimentos lo que podría
explicar los diferentes resultados. En el primer caso se aspiraron los folículos ováricos con
ayuda de una jeringa manual mientras que en el segundo caso los ovarios fueron seccionados
con ayuda de una hoja de afeitar recuperando una población muy heterogénea de ovocitos
desde folículos preantrales y antrales en todos los estados de desarrollo (Hyttel et al., 1997).
Asimismo, Ratto et al., (1999) utilizando un protocolo similar de MIV mejoraron sustantivamente
los resultados anteriores. En este trabajo evaluaron 26, 30 y 36 horas de maduración in vitro de
COCs de llama y obtuvieron 58%, 73% y 75% de ovocitos que alcanzaron la metafase II con
extrusión del primer corpúsculo polar sin diferencias estadísticas. Por otro lado, Miragaya et al.,
(2002) utilizaron un tiempo de 27-30 horas para la maduración de COCs utilizando un medio
diferente a los casos anteriores, el cual estaba compuesto por TCM 199 con bicarbonato, 10%
de suero fetal bovino y glutamina; obtuvieron 62% y 74% de ovocitos en metafase II en llamas
en las cuales se recuperó los COCs sin superovulación y con superovulación respectivamente.
En otro estudio, Ratto et al., (2005), utilizando un medio de maduración consistente de TCM-199
suplementado con piruvato de Na 0,2 mM, sulfato de gentamicina 25 µg/ml, FSH 0,5 µg/ml,
estradiol 17-β 1µg/ml y suero fetal bovino al 10%, encontraron 77,7%, 80,6% y 80,4% de COCs
maduros cuando utilizaron 28, 30 y 36 horas para la MIV de COCs de llama sin diferencias
estadísticas entre los 3 tiempos evaluados. Por otro lado, Sansinema et al., (2003) para la MIV
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de COCs de llama introdujeron LH en su protocolo de maduración, así el medio de maduración
estuvo compuesto por TCM-199, 5 μg/ml de FSH, 10 μg/ml de LH, 1 mg/ml de estradiol 17b y
10% de suero fetal bovino, y obtuvieron 52% de ovocitos maduros. Posteriormente el mismo
grupo de investigación (Sansinema et al., 2007) utilizó un medio diferente para la MIV de
ovocitos de llama consistente de TCM-199, 5 μg/ml de FSH, 10 μg/ml de LH, 10 ng/ml de EGF,
10 ng/ml de IGF-1 y 1μg/ml de estradiol 17b y 10% de suero fetal bovino, mejorando su anterior
resultado con 74% de ovocitos en metafase II luego de 30 horas de MIV.
También se han madurado con éxito ovocitos de vicuña y alpaca. Chaves et al., (2003),
reportaron la única MIV de ovocitos de vicuña. Maduraron utilizando un tiempo de 27 horas en
un medio similar al utilizado por Miragaya et al., (2002) consistente de TCM 199 con
bicarbonato, 10% de suero fetal bovino y glutamina; obtuvieron 41% de maduración nuclear con
extrusión del primer cuerpo polar y la totalidad de los ovocitos presentó maduración
citoplasmática finalizado el tiempo de cultivo en el medio de maduración. En alpacas, Gómez et
al., (2002) y Ratto et al., (2007) han utilizado 26 horas para la MIV de COCs recuperados por
laparotomía ventral. Gómez et al., (2002) obtuvo 46% y 40% de ovocitos en metafase II en
alpacas donantes superovuladas con FSH y eCG respectivamente. Ratto et al., (2007) mejoró
los resultados obtenidos por Gómez et al., (2002) alcanzando 82% y 64% de ovocitos en
metafase II para los mismos tratamientos superovulatorios. Por otro lado, Ruiz y Correa (2007)
maduraron ovocitos de alpaca y llama durante 27 y 30 horas respectivamente en un medio
compuesto por TCM-199 suplementado con piruvato de Na 0,2 mM, sulfato de gentamicina 50
µg/ml, FSH 0,02 unidades/ml, estradiol 17-β 1µg/ml y suero fetal bovino al 10%. Con este
medio obtuvieron tasas de 75% y 100% de ovocitos maduros de llama y alpaca
respectivamente. Sin embargo es necesario repetir la experiencia con una mayor cantidad de
ovocitos de alpaca para confirmar la alta tasa obtenida de ovocitos en metafase II.
Del Campo et al., (1994) separaron epidídimos de testículos de llama macho y obtuvieron
espermatozoides por centrifugación en gradiente de Percoll, los cuales fueron utilizados para
fecundar ovocitos madurados in vitro logrando por primera vez el desarrollo de embriones
producidos por FIV. En este trabajo recolectaron 1324 COCs de 98 ovarios de llamas
beneficiadas, permitiéndoles disponer de gran cantidad de ovocitos para realizar diferentes
tratamientos para la FIV, fijar ovocitos para evaluar el estado de maduración nuclear y describir
el desarrollo embrionario producido después de la FIV. 234 ovocitos inseminados fueron cocultivados con células epiteliales de oviducto de llama (LLOEC) previamente preparadas, 32%
dividieron (embriones de 2 células) a las 48 horas de evaluación y a los 9 días de evaluación
15,8% detuvo su desarrollo entre 2-16 células, 5,6% desarrollaron hasta mórula, 6,0% entre
blastocistos tempranos y expandidos y 4,7% de blastocistos eclosionados.
Conde et al., (2006) utilizaron un sistema similar para FIV en llamas, la diferencia con Del
Campo et al., (1994) fue que recuperaron los gametos de animales vivos, ya que es de esta
manera en que la producción de embriones por FIV puede contribuir al mejoramiento genético si
se logra recuperar gametos de animales de comprobada calidad genética. Los ovocitos se
recuperaron por punción folicular de ovarios expuestos por laparotomía lateral en hembras
superovuladas y los espermatozoides fueron recuperados por electroeyaculación. El semen fue
tratado con colagenasa para reducir su viscosidad. Las tasas de división (formación de cigotos)
15
a las 48 horas de la fecundación fueron 56% y 50% con y sin agentes capacitantes (heparina,
penicilamina e hipotaurina). En otro trabajo, los mismos autores ) reportaron 40,8% y 42,2% de
división a los dos días y 35% y 47% de blastocistos a los 8 días con y sin agentes capacitantes.
Demostrando que la colagenasa no afecta la capacidad fecundante del semen y que es posible
producir embriones de llama por FIV con semen fresco (Conde et al., 2008).
Gómez et al., (2002) fecundaron ovocitos de alpaca con semen epididimario de llamas
beneficiadas. Los ovocitos de alpaca fueron recuperados por punción de los folículos ováricos
expuestos por laparotomía ventral en hembras superovuladas. Los 5 COCs que fueron
fecundados y cultivados in vitro desarrollaron hasta mórula a los 6 días de evaluación, ninguno
continuó el desarrollo hasta el estadío de blastocisto. Este sería el primer reporte de la
producción de embriones híbridos de alpaca-llama después de una fecundación in vitro
heteróloga, experiencia que también fue reportada por Ratto et al., (2007). Sin embargo, Del
Campo et al., (1995) indican que recuperaron ovocitos de alpacas superovuladas los cuales
fueron fecundados con semen de llama y los embriones producidos desarrollaron hasta el
estadío de blastocisto expandido.
En Perú, también existen reportes sobre fecundación in vitro en alpacas (Gamarra et al., 2008a;
Mendoza et al., 2008). Gamarra et al., (2008a) congelaron espermatozoides epididimarios
previamente diluídos en una solución de TRIS-Fructosa con 10% de glicerol. Los pellets
conteniendo los espermatozoides fueron descongelados y centrifugados en una gradiente de
Percoll y resuspendidos en medio FERT-TALP suplementado con penicilamina, hipotaurina,
epinefrina y heparina. Los ovocitos madurados in vitro fueron inseminados con una
concentración de 10 x 106 espermatozides/gota de 100 ml de FERT-TALP. Obtuvieron 27,1%
de segmentación a las 72 horas, a los 5 días 8,0% de mórulas y blastocistos y a los 7 días de
cultivo embrionario 3% de blastocistos eclosionados. Por otro lado (Mendoza et al., 2008)
compararon los métodos de gradiente de Percoll y Swim up para la recuperación de
espermatozoides epididimarios para utilizarlos en la fecundación in vitro de ovocitos de alpaca
aspirados de ovarios obtenidos en el camal. Los epidídimos fueron separados de los testículos y
ordeñados sobre SPERM-TALP. Posteriormente fueron centrifugados en SPERM-TALP y
finalmente sometidos a uno de los dos tratamientos siguientes: centrifugados en una gradiente
de Percoll o colocados en la estufa por 45-60 minutos con una inclinación de 45°. Los ovocitos
previamente colocados en FERT-TALP fueron inseminados con una concentración final
aproximada de 2.5 – 3.5 x 106 espermatozoides/ml. Los resultados que obtuvieron fueron 36,0%
y 43,9% de segmentación, y 6,3% y 6,9% de blastocistos para Percoll y Swim up
respectivamente, demostrando que es posible utilizar el método de swin up en la FIV de
ovocitos de alpacas.
En Bolivia, Machicado et al., (2009) recuperaron COCs por laparotomía en llamas
superovuladas con eCG, los COCs fueron madurados in vitro en TCM-.199 con Albúmina de
suero bovino (BSA). Posteriormente, los ovocitos fueron inseminados con semen fresco tratado
con proteasa. Obtuvieron 60% de ovocitos fertilizados. Al sexto día se obtuvo 29,4% de mórulas
tempranas con un promedio de 8 blastómeros, 23,8% de mórulas con membrana irregular y 16
blastómeros, 29,4% de blastocistos tempranos provistos de zona pelúcida regular y delgada con
16
numerosos blastómeros y 17,4% de blastocistos de forma circular, membrana regular con
blastómeros difíciles de contar y sin espacios entre células.
En Chile, Berland et al., (2011), recuperaron COCs en llamas superovuladas con eCG y FSH.
Los COCs expandidos colectados con ambos tratamientos fueron fecundados in vitro usando
espermatozoides epididimarios. Los gametos fueron co-incubados a 38,5°C con 5% CO2 por 18
horas. Después de la FIV, los presuntos cigotos fueron incubados en medio Fluido de oviducto
sintético (SOF) suplementado con 0,6% de BSA con células de la granulosa de llama a 39°C,
5% CO2, 5% O2, 90% N2 por 7 días. El porcentaje de presumibles cigotos tratados con FSH y
eCG que desarrollaron a 2-8 células en el día 2 (65,3 vs 63,1%), mórulas en el día 5 (46,2 vs
42,5%) y estado de blastocistos en el día 7 (23,1 vs 20,5%) no fue diferente (P>0.05) entre las
llamas tratadas con FSH y eCG respectivamente. Concluyendo que los COCs expandidos
recuperados con FSH o eCG pueden ser utilizados directamente para la fecundación in vitro.
2.2 BASES TEÓRICAS Y CONCEPTUALES
Distintas metodologías se han evaluado para la recuperación de COCs (Complejos ovocitocúmulo) en camélidos sudamericanos. Ovarios de alpacas y llamas obtenidos de hembras
beneficiadas en el camal son una fuente adecuada para la recuperación de COCs, facilitando
gran disponibilidad de ovocitos para la investigación en la estandarización de protocolos de
maduración y/o fecundación in vitro; y para su utilización como receptores de núcleo de células
donadoras en un programa de clonación por transferencia nuclear (Ruiz, 2011).
Se ha investigado en el uso de técnicas para la recuperación de COCs en hembras vivas en
camélidos sudamericanos. Estas técnicas se presentan como una excelente alternativa para la
producción in vitro de embriones ya que permiten disponer de una buena cantidad de
COCs/hembra. La fecundación exitosa de estos COCs permitiría obtener más crías/año de la
misma donante al transferir los embriones producidos in vitro en receptoras sincronizadas, y así
superar el límite fisiológico de una cría/año en las hembras de estas especies (Ruiz, 2011).
Los COCs recuperados requieren de un proceso de maduración artificial en el laboratorio antes
de utilizarlos en la producción in vitro de embriones. La maduración in vitro simula el tiempo
transcurrido y sobretodo los procesos metabólicos que en forma natural ocurren en el ovocito
contenido en el folículo dominante, entre el pico preovulatorio de LH hasta que se produce la
ovulación. En este proceso se reactiva la división meiótica desde el diploteno de la profase I de
la primera división hasta alcanzar la metafase II de la segunda división meiótica, momento en
que el ovocito ovula en forma natural. El ovocito se mantiene en este estado hasta que es
fecundado por un espermatozoide o activado artificialmente para producir embriones por
partenogénesis, por ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides), por clonación o
por transgénesis. Para la MIV de ovocitos, se utilizan medios de cultivo clasificados por Gordon
(1994) en medios simples y medios complejos. Un medio simple es aquel que contiene una
solución salina fisiológica bufferada usualmente con bicarbonato y adicionada de piruvato,
lactato y glucosa. Un medio de maduración complejo contiene, además de los constituyentes de
un medio simple, aminoácidos, vitaminas, purinas y otras sustancias encontradas asociadas al
suero. En bovinos el medio tradicional y exitosamente usado es el Tissue Culture Medium 199
(TCM – 199), medio complejo, compuesto por sales Earle`s con HEPES y bicarbonato, como
17
estabilizadores de pH y suplementado con piruvato, lactato, vitaminas, aminoácidos, purinas y
proteína como suero fetal bovino o albúmina sérica bovina (Rath, 2001). En camélidos
sudamericanos se ha utilizado principalmente medios de maduración similares a los utilizados
en bovinos.
In vivo, la maduración de COCs de alpaca y llama se ha estimado calculando el tiempo que
transcurre desde la cópula hasta la ovulación. Así, en alpacas el tiempo mínimo de ovulación
fue estimado 26 horas después de la monta natural y 24 horas después del tratamiento con
hCG (San Martín et al., 1968). En llamas, usando la técnica de ultrasonografía la ovulación fue
detectada en promedio 2 días después de la monta (Adams et al., 1989, 1990). Muy pocos
estudios han sido conducidos sobre la maduración in vitro de ovocitos (Del Campo et al., 1992,
1994; Sansinema et al., 2003, 2007; Miragaya et al., 2002; Chaves et al., 2003; Ratto et al.,
1999, 2005, 2007; Ruiz y Correa 2007) en camélidos sudamericanos.
La FIV es el procedimiento por medio del cual los ovocitos maduros son cultivados junto con
espermatozoides y de esta forma fecundados, para esto los espermatozoides deben ser
sometidos previamente a un proceso de preparación in vitro con el objetivo de iniciar su
capacitación y desencadenar la reacción acrosómica (Palma, 2001). La utilización de la
fecundación in vitro en camélidos sudamericanos podría ser una alternativa para el
mejoramiento genético de camélidos domésticos y para la preservación de los camélidos
silvestres. Sin embargo existen pocos reportes de FIV en estas especies: Del Campo et al.,
(1994); Del Campo et al., (1995); Gómez et al., (2002); Conde et al., (2006); Ratto et al., (2007);
Conde et al., (2008), Gamarra et al., (2008a), Mendoza et al., (2008), Machicado et al., (2009) y
Berland et al., (2011); y hasta la fecha no se han logrado preñeces con la aplicación de esta
técnica.
2.3 HIPÓTESIS
2.3.1 HIPÓTESIS GENERAL
Si logramos optimizar la técnica de fecundación in vitro entonces luego de transferir los
embriones en alpacas sincronizadas lograrán producir gestaciones que permitirán
contribuir a la conservación del material genético de las mejores alpacas de los
productores de la Comunidad de Carhuancho en Pilpichaca Huancavelica.
2.3.2 HIPÓTESIS ESPECÍFICAS
EXPERIMENTO 1: Optimizando el tiempo de maduración de ovocitos de alpaca.
 Si logramos encontrar el tiempo óptimo para la maduración in vitro de ovocitos de
alpaca entonces se lograrán mejores tasas de desarrollo embrionario.
 No existen diferencias significativas entre los estados de maduración nuclear de
ovocitos de alpaca madurados in vitro.
 No existen diferencias significativas en las tasas de segmentación, mórulas y
blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV en diferentes tiempos de
maduración de ovocitos.
18
EXPERIMENTO 2: Optimizando el medio de cultivo de embriones
 Si logramos identificar el medio adecuado para el cultivo de embriones de alpaca
producidos por fecundación in vitro entonces se lograrán mejores tasas de
desarrollo embrionario.
 Si logramos identificar el agente adecuado para la capacitación de espermatozoides
de alpaca para la producción de embriones por FIV entonces se lograrán mejores
tasas de desarrollo embrionario.
 Si logramos encontrar el tipo celular adecuado para co-cultivo con embriones de
alpaca producidos por FIV entonces se lograrán mejores tasas de desarrollo
embrionario.
 No existen diferencias significativas en las tasas de segmentación, mórulas y
blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV en las diferentes
condiciones de cultivo.
EXPERIMENTO 3: Evaluación del método de recuperación de ovocitos
 Si logramos identificar la mejor técnica para la recuperación de COCs en alpacas
donantes superovuladas entonces se lograrán recuperar mayor número de COCs
por hembra donante para la FIV.
 Si logramos encontrar el método adecuado de superovulación de las hembras
donantes de ovocitos entonces se logrará recuperar mayor número de COCs por
hembra donante para la FIV.
 Si logramos encontrar el método adecuado de sincronización de las hembras
receptoras de embriones de alpaca entonces se logrará mejores tasas de preñez.
 No existen diferencias significativas en las tasas de segmentación, mórulas y
blastocistos en embriones de alpaca producidos por FIV en los diferentes métodos
de recuperación de COCs y en los diferentes métodos de superovulación de la
hembras donantes de COCs.
2.4 DEFINICIÓN DE TÉRMINOS
Ovocitos: Los ovocitos u óvulos son las células sexuales femeninas y se localizan dentro de los
ovarios, en unos folículos de aproximadamente 2 cm. de diámetro en la hembra.
Maduración in vitro: La maduración del ovocito ocurre dentro del folículo, artificialmente se
utilizan hormonas, Piruvato de Na, antibióticos diluídos en un medio de cultivo de tejidos (TCM)
y se coloca en una estufa de CO2 a 38,5 ºC por un tiempo determinado de acuerdo a la especie.
En este proceso se produce la reactivación de la división meiótica hasta alcanzar la metafase de
la segunda división meiótica, momento en que el ovocito, retorna al arresto meiótico, hasta que
sea fecundado o activado artificialmente para producir embriones partenogenéticos.
Segmentación: División de la célula embrionaria en dos blastomeras, formándose el cigoto.
Mórula: Etapa temprana del embrión, que durante el período de segmentación tiene el aspecto
de una mora, las blastómeras son difíciles de discernir una de otra, la masa de células
(embrión) ocupa casi todo el espacio perivitelino dentro de la zona pelúcida, edad estimada 2
días.
19
Blastocisto: Embrión en estadío avanzado compuesto por las células que darán forma al feto.
Etapa del embrión en la cual presenta diferenciación clara entre el trofoblasto externo y el MCI.
El embrión tiene apariencia de anillo y ocupa el 90 % del espacio dentro de la zona pelúcida,
edad estimada 5 días.
CR1aa: Es un medio definido de composición química simple, que se utiliza durante el cultivo
de los embriones, su patente pertenece al laboratorio Infigen de los Estados Unidos de América.
CR2: Medio de cultivo de embriones medio.
CZB: Medio de cultivo de embriones preparado de acuerdo a la fórmula de Chatot-ZiomekBavister.
FIV: Fecundación in vitro.
FIV-TALP: Es un medio que se utiliza durante la preparación de los ovocitos y
espermatozoides, para la fertilización in vitro.
HAM F-10: Nutriente para el cultivo de embriones. Es una mezcla de sales enriquecida con
aminoácidos, vitaminas y otros componentes esenciales para el crecimiento celular.
HEPES: Es un reactivo que se utiliza para regular el pH de los medios de cultivo de embriones.
Su fórmula química es N-(2-hidroxietil) piperazina - N’ -2- ácido etanolsulfónico.
HEPES-TALP: Medio utilizado para el lavado de ovocitos y embriones.
KSOM: Es un medio definido de composición química compleja, se utiliza
durante el cultivo de los embriones.
Menezo B: Combinación definida de aminoácidos, además de utilizar albúmina sérica como
fuente de macromoléculas. Fue preparado por primera vez por Menezo en 1984 de allí su
nombre.
MIV: Maduración in vitro.
PHE: Penicilamina-Hipotaurina-Epinefrina. Es una mezcla estimulante de la
motilidad espermática.
SP –TALP: Se utiliza durante la purificación del semen.
TALP: Medio Tyrode’s Albúmina-Lactato-Piruvato. Es un medio que sirve para preparar las
soluciones: Sp -TALP, FIV -TALP y HEPES –TALP.
TCM-199: Las siglas significan tissue culture medium. Es un medio que se utiliza para la
maduración de ovocitos. Satisface las necesidades de las células durante prolongados
periodos de cultivo.
SOF: Las siglas significan Sinthetic oviduct fluid. Es un medio para el cultivo de embriones
después del proceso de fecundación in vitro.
SOF-IVC: Fluido de oviducto sintético para el cultivo in vitro.
USU: Medio de cultivo de embriones.
2.5 IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
2.5.1. VARIABLES INDEPENDIENTES:
Experimento 1: - Tiempo de maduración de ovocitos.
Experimento 2: - Medio de cultivo de embriones.
- Tipo de agente para la capacitación espermática.
- Tipo de células usadas para el co-cultivo.
Experimento 3: - Método de recuperación de ovocitos.
-Tratamiento de superovulación de las donantes.
20
-Tratamiento de sincronización de las receptoras.
2.5.2. VARIABLES DEPENDIENTES:
Experimento 1:
- Estados de maduración nuclear de los ovocitos.
-Tasas de segmentación, de mórulas y de blastocistos.
Experimento 2:
-Tasas de segmentación, de mórulas y de blastocistos
de
ovocitos de alpaca fecundados in vitro.
Experimento 3: -Tasas de segmentación, de mórulas y de blastocistos de ovocitos de
alpaca fecundados in vitro.
- Tasas de presentación de ovulación, número de folículos, tamaño
de folículos, de hembras receptivas y de preñez de alpacas
receptoras de embriones.
INDICADORES
De las variables independientes:
Experimento 1
a. 1000 ovocitos madurados in vitro a diferentes tiempos. Los ovocitos serán recuperados de
ovarios de hembras beneficiadas en el camal.
Experimento 2
a. 600 embriones cultivados en diferentes medios de cultivo. Los gametos para producir los
embriones in vitro serán recuperados de testículos y ovocitos de alpacas beneficiadas en el
camal.
b. 500 ovocitos fertilizados con espermatozoides tratados con diferentes agentes capacitantes.
. Los gametos para producir los embriones in vitro serán recuperados de testículos y
ovocitos de alpacas beneficiadas en el camal.
c. 400 embriones cultivados con diferentes células para el co-cultivo. Los gametos para
producir los embriones in vitro serán recuperados de testículos y ovocitos de alpacas
beneficiadas en el camal.
Experimento 3
a. 400 ovocitos aspirados de alpacas superovuladas. Alpacas con peso vivo promedio de 45
kilos y de buena condición corporal.
b. 20 hembras donantes superovuladas. Alpacas con peso vivo promedio de 45 kilos y de
buena condición corporal.
c. 45 hembras receptoras sincronizadas. Para transferirles los embriones producidos con los
gametos aspirados en la sección a y b. Alpacas con peso vivo promedio de 45 kilos y de
buena condición corporal.
De las variables dependientes:
Experimento 1
a. 200 ovocitos en vesícula germinal, 200 ovocitos en vesicula germinal rota, 200 ovocitos en
metafase I y 200 ovocitos en metafase II.
b. 70% de segmentación, 50% de mórulas y 25% de blastocistos.
Experimento 2
21
a. 70% de segmentación, 50% de mórulas y 25% de blastocistos.
Experimento 3
a. 70% de segmentación, 50% de mórulas y 25% de blastocistos.
b. 90% de hembras ovulan, 80% de hembras entran en celo y 60% de hembras quedan
preñadas después de la transferencia de embriones.
2.6 DEFINICIÓN OPERATIVA DE VARIABLES E INDICADORES
VARIABLES
DIMENSIÓN
INDICADORES
ESCALA
VARIABLES INDEPENDIENTES
Experimento 1
Tiempo de maduración de
ovocitos.
Duración de la
vitro en horas.
Experimento 2
Medio
de
cultivo
embriones.
de
Diferentes medios para el cultivo
de embriones.
600 embriones cultivados en
diferentes medios de cultivo.
Tipo de agente para la
capacitación espermática.
Diferentes agentes capacitantes
de espermios.
Tipo de células usadas para
el co-cultivo.
Diferentes tipos de células para el
co-cultivo.
500 embriones producidos con
diferentes
agentes
capacitantes.
400 embriones cultivados con
diferentes células para el cocultivo.
Experimento 3
Método de recuperación de
ovocitos.
Tratamiento
de
superovulación
de
las
donantes.
Tratamiento de sincronización
de las receptoras.
maduración in
1000 ovocitos madurados in 26 horas
vitro a diferentes tiempos.
30 horas
34 horas
38 horas
42 horas
TCM-199
KSOM
SOFaas
SOF-IVC
PHE
Heparina
Cafeína
Granulosa
Oviducto
Fibroblastos
Aspiración
laparóscopica
o
transvaginal.
Aspiración con jeringa en el
grupo control.
Con FSH y eCG.
400 ovocitos aspirados de
alpacas superovuladas.
100 ovocitos aspirados de
ovarios de camal (control)
20
hembras
donantes
superovuladas.
LOPU
OPU
Con esponjas o CDIR, o sólo con
GnRH
45
hembras
sincronizadas.
Medroxi-P4
CDIR
GnRH
Diferentes estados meióticos
50 ovocitos en vesícula
germinal.
100 ovocitos en vesicula
germinal rota.
150 ovocitos en metafase I 200
ovocito en metafase II
% segmentación
% mórulas
% blastocistos
5%
receptoras
200 mg FSH
1000 UI eCG
VARIABLES DEPENDIENTES
Experimento 1
Estados de maduración
nuclear de los ovocitos.
15%
20%
60%
70%
50%
20%
Tasas de segmentación, de
mórulas y de blastocistos.
Producción de cigotos, mórulas y
de blastocistos.
Experimento 2
Tasas de segmentación, de
mórulas y de blastocistos.
Producción de cigotos, mórulas y
de blastocistos
% segmentación
% mórulas
% blastocistos
70%
50%
20%
Experimento 3
Tasas de segmentación, de
mórulas y de blastocistos.
Producción de cigotos, mórulas y
de blastocistos.
Folículos dominantes. Tasas
de presentación de ovulación,
N° y tamaño de folículo.
Presentación de ovulaciones, de
% de segmentación,
% de mórulas
% de blastocistos.
N° de folículos
Tamaño del folículo
70%
50%
20%
12
7.3 mm
22
de receptividad y de preñez
en receptoras.
receptividad y de preñeces.
% de hembras ovulan,
% de hembras receptivas
% de hembras que preñan
90%
80%
50%
CAPITULO III: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN: Aplicada
3.2 NIVEL DE INVESTIGACIÓN: Tecnológico
3.3 MÉTODO DE INVESTIGACIÓN: Inductivo-Deductivo
3.4 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN: Experimental
EXPERIMENTO 1: Optimizando el tiempo de maduración de ovocitos de alpaca.
Los primeros reportes de maduración in vitro (MIV) de COCs de alpacas (Gómez et al., 2002;
Ratto et al., 2007) se realizaron utilizando 26 horas. Posteriormente, Mendoza et al., 2008; Ruiz
et al., 2009; Ruiz et al., 2010; Huamán et al., 2011; han utilizado entre 24 y 25 horas de
maduración in vitro. Sin embargo Huanca et al., (2009) indican que son necesarias más de 38
horas para la maduración in vitro de ovocitos de alpaca. Es por ello que para cumplir con el
objetivo de obtener el tiempo óptimo de maduración de ovocitos de alpaca, se ha dividido en 2
fases esta sección:
a. Fijación de los ovocitos con etanol y ácido acético para observar los estados de maduración
nuclear y ver cuáles llegaron a Metafase II.
Tiempo de
maduración
(horas)
26
30
34
38
42
N° de
ovocitos
Vesícula
germinal
Vesícula
germinal
quebrada
Metafase I
Metafase II
Degenerados
100
100
100
100
100
b. Producción in vitro de embriones de alpaca a diferentes tiempos de maduración in vitro.
Tiempo de
maduración de
los ovocitos
(horas)
26
30
34
38
42
N° de
ovocitos
fecundados
División
3d
Mórula
5d
Blastocisto
Temprano
>6d
Blastocisto
Blastocisto
eclosionado
Total
Blastocistos
100
100
100
100
100
EXPERIMENTO 2: Optimizando el medio de cultivo de embriones
En camélidos sudamericanos se han utilizado diferentes medios para el cultivo de embriones
como son: SOF + 0.6% BSA (Machicado et al., 2009; Berland et al., 2011), SOF-IVC (Mendoza
et al., 2008; Huamán et al., 2011; Santayana, 2012), SOFaa (Gamarra et al., 2008a; Conde et
al., 2008), TCM-199 (Del Campo et al., 1994; Gómez et al., 2002; Ratto et al., 2007; Huanca et
23
al., 2009), KSOM (Condori et al., 2010; Huanca et al., 2010), sin embargo no se ha comparado
cuál de estos podría dar mejores resultados para el cultivo de embriones en alpacas.
a. Cultivo de los embriones producidos por fecundación in vitro en diferentes medios de
cultivo.
Medio de cultivo
de embriones
TCM-199
SOFaas
SOF + 0.6%BSA
KSOM
KSOM + SOF
SOF-IVC
N° de
ovocitos
fecundado
100
100
100
100
100
100
División
3d
Mórula
5d
Blastocisto
Temprano
>6d
Blastocisto
Blastocisto
eclosionado
Total
Blastocistos
Por otro lado se han evaluado diferentes agentes capacitantes en camélidos sudamericanos,
Del Campo et al., (1994) han utilizado PHE (Penicilamina, Hipotaurina, Epinefrina) y heparina
para la capacitación de espermatozoides de llama, igualmente lo hicieron Gamarra et al.,
(2008a) para capacitar espermatozoides de alpaca. Por otro lado, Ratto et al., (2007) y Berland
et al., (2011) han utilizado sólo heparina como agente capacitante de espermatozoides de
llama. Por tales motivos son necesarios más estudios para confirmar que agentes capacitantes
son necesarios para espermatozoides de alpaca.
b. Capacitación de los espermatozoides con diferentes agentes y luego fertilización de
ovocitos de alpaca.
Efecto de los
agentes
capacitantes
Heparina
PHE
PHE + Heparina
Cafeína
Sin agente
N° de
ovocitos
fecundado
100
100
100
100
100
División
3d
Mórula
5d
Blastocisto
Temprano
>6d
Blastocisto
Blastocisto
eclosionado
Total
Blastocisto
En camélidos sudamericanos existen pocos reportes del co-cultivo de embriones con células.
Del Campo et al., (1994) utilizaron células de oviducto de llama para el co-cultivo de embriones
de llama. Ratto et al., (2007) co-cultivaron los embriones híbridos de llama x alpaca con células
epiteliales del oviducto de bovino. Berland et al., (2011) utilizaron células del cúmulus para el
co-cultivo de embriones de llama producidos por fecundación in vitro. Para dilucidar cuál es el
tipo de célula adecuado para el co-cultivo diseñamos el siguiente experimento:
c. Cultivo de embriones de alpaca con diferentes tipos celulares.
Efecto del co-cultivo
Con células de la
granulosa
Con células oviductales
Con fibroblastos
Sin co-cultivo
N° de
ovocitos
Fecundado
100
División
3d
Mórula
5d
Blastocisto
Temprano
>6d
Blastocisto
Blastocisto
eclosionado
Total
Blastocisto
100
100
100
EXPERIMENTO 3: Evaluación del método de recuperación de ovocitos
24
A partir de este experimento se trabajarán con ovocitos recuperados de animales vivos, porque
hasta el experimento anterior se han utilizado ovocitos provenientes de ovarios de animales
beneficiados en el Camal. Para que la fecundación in vitro tenga un real impacto en la mejora
genética se deben fertilizar los ovocitos de las mejores alpacas hembras con semen de los
mejores reproductores macho. Para ello, las alpacas donantes de ovocitos serán seleccionadas
de acuerdo a su mejor finura de fibra y densidad de vellón. Es por ello que es necesario saber
con qué método: laparoscópico (LOPU) o aspiración transvaginal (OPU) se pueden recuperar
más ovocitos. Además para recuperar ovocitos hay que superovular a las donantes y existen 2
métodos (superovulación con FSH y superovulación con eCG) de superovulación los cuales
deben ser estudiados en esta investigación. De acuerdo al siguiente esquema:
a. Evaluación de la aspiración laparoscópica y transvaginal con 2 tratamientos superovulatorios
de las donantes de ovocitos.
Método
de
recuperación
de
ovocitos
LOPU + FSH
LOPU + eCG
OPU + FSH
OPU + eCG
Aspiración de ovarios
de camal (Control)
N° de
ovocitos
fecundados
100
100
100
100
100
División
3d
Mórula
5d
Blastocisto
Temprano
>6d
Blastocisto
Blastocisto
eclosionado
Blastocisto
Total
Es necesario evaluar diferentes protocolos de sincronización de las alpacas hembras receptoras
de embriones, para de este modo tratar de optimizar un mayor número de hembras preñadas
con embriones producidos por fecundación in vitro.
b. Evaluación de protocolos de sincronización de las alpacas receptoras de embriones.
Método de
sincronización de
receptoras de
embriones
CDIR + GnRh
ESPONJAS + GnRH
GnRH
N°
de
hembras
Número de
folículos
Diámetro
promedio
de
folículos
%
ovulación
%
Hembras
receptivas
%
preñez
15
15
15
3.5 POBLACIÓN, MUESTRA, MUESTREO
Población: Se benefician en promedio 60 alpacas hembra por semana en el Camal Municipal
de Huancavelica dando un total de 120 ovarios de los cuales se pueden aspirar 360 ovocitos
por semana dando 1440 ovocitos al mes.
Muestra: Se requieren 3200 ovocitos de alpaca de categoría 1 y 2 en los 3 experimentos,
como también se recuperarán ovocitos de categoría 3 y 4 en total se necesitan 5000 ovocitos
los cuales serán aspirados de ovarios recuperados en el Camal Municipal de Huancavelica.
Muestreo: Se recuperarán ovarios de alpacas 2 veces a la semana haciendo un total de 40
ovarios y recuperándose 120 ovocitos por semana. Como se requieren 5000 ovocitos como
mínimo, el trabajo de muestreo se realizará en por lo menos 42 semanas.
3.6 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS
Recuperación y Selección de Ovocitos: COCs de alpacas de ovarios procedentes del camal
Municipal de Huancavelica serán recuperados con una aguja de 21 G y una jeringa de 10 ml.
El procedimiento se realizará dentro de las 4 horas siguientes al sacrificio de los animales. El
25
líquido folicular con los COCs recuperados serán depositados en un tubo graduado de 15 cc
(Falcon) que reposará en un baño María a 37º C donde se dejará decantar por 20 minutos.
Luego el sedimento será aspirado con una pipeta Pasteur y será depositado sobre placas Petri
para ser diluído en solución SOF-HEPES. La selección de los COC`s (Cuadro 1) se realizará
con una pipeta Pasteur bajo una lupa estereoscópica con aumento de 30x, solamente los
COC`s de categoría 1 y 2 serán madurados in vitro.
Cuadro 1. Clasificación de complejos cúmulo-ovocito (COC´s) de alpacas
Categorías
Características por Categoría
1
COCs con cúmulos de capas múltiples (>5 capas), compacto, claro y
transparente y citoplasma con granulación fina y homogénea.
2
COCs parcialmente rodeados por células del cúmulo (entre 2-5
capas), con cúmulos algo más oscuros y menos transparentes y con
citoplasma de granulación más gruesa y más oscura que en la
categoría 1.
3
COCs con cúmulo menos compacto y más oscuro que en la
categoría 1 ó 2 y citoplasma con manchas oscuras.
4
Incluye a los ovocitos con cúmulo expandido, parcialmente desnudos
o totalmente desnudos.
Referencia: De Loose et al., 1989.
Maduración in vitro de ovocitos: COCs de alpacas serán seleccionados y lavados 2 veces
en medio de maduración (TCM -199 modificado con Hepes) compuesto por sales Earle`s y
suplementado con piruvato de Na en una concentración de 0,2 mM, sulfato de gentamicina
(Sigma) 50 µg/ml, FSH (Sigma) 0,02 unidades/ml, estradiol 17-β (sigma) 1µg/ml y suero fetal
bovino al 10%. Posteriormente serán transferidos a una placa Petri (Falcon 1008) que
contendrá gotas de 50 µl de solución TCM-199 de maduración y recubiertas de aceite mineral
(Sigma). Los COCs serán cultivados a 38,5 ºC por el tiempo que se requiera en cada
experimento (entre 26 y 42 horas), en estufa de cultivo con atmósfera húmeda de 5% CO 2 al
aire. Después del período de maduración, los ovocitos serán pipeteados ligeramente para
separar y aflojar las células del cúmulo y serán colocados en gotas con 45 µl con solución
FERT-TALP, al menos 2 horas antes de recibir la inseminación.
Evaluación del estado nuclear de los ovocitos: El estado nuclear de los ovocitos tras la
maduración in vitro se evaluará mediante la fijación y tinción con una solución de giemsa al 5%,
de acuerdo a la técnica descrita por Tarkowski (1966) modificado (Santaló, 1985). Los ovocitos
serán incubados en un medio hipotónico (KCl 75mM), durante 10 minutos, a temperatura
ambiente. A continuación serán fijados en un portaobjetos, previamente desengrasado con una
solución éter:alcohol (1:1), transfiriéndolos al portaobjetos mediante una pipeta Pasteur, en la
menor cantidad de medio hipotónico posible, pero evitando la evaporación. Para la fijación se
utilizará fijador Carnoy (metanol:ácido acético, 3:1), vertiendo el fijador gota a gota, y soplando
suavemente para evaporarlo hasta observar la ruptura de la membrana del ovocito, controlando
en todo momento bajo el estereoscopio la posición de la muestra en el portaobjetos. Una vez
fijado, se marcará la ubicación del ovocito en una plantilla preparada. Las preparaciones se
secaran al aire. La tinción de las extensiones cromosómicas se realizará con el colorante
giemsa (5%), sumergiendo los portaobjetos en el colorante durante 10 minutos a temperatura
26
ambiente. A continuación se lavará con agua corriente y se dejará secar al aire. Las
preparaciones se observarán al microscopio, con un objetivo de inmersión a 100X de aumento.
Los ovocitos se clasificarán en 4 categorías en función del estado nuclear:
 VG: Se observará la presencia del núcleo rodeado por una membrana nuclear y cromatina
laxa. Los oocitos no han reiniciado la meiosis.
 VGBD (Rotura de Vesícula Germinal): Desaparece la membrana nuclear. Se ha reanudado
la meiosis.
 M I (Metafase I): Cromosomas bivalentes condensados al máximo en el ecuador del huso
acromático.
 M II (Metafase II). Cromosomas condensados en metafase y extrusión del primer corpúsculo
polar.
Se considerará un ovocito maduro nuclearmente cuando alcancen el estadio de metafase II.
Fertilización in vitro: Testículos de alpaca serán recolectados en el Camal Municipal de
Huancavelica y trasladados en hielo en un cooler hasta el Laboratorio de Biotecnología
Reproductiva de la Universidad Nacional de Huancavelica. Inmediatamente los testículos serán
lavados con una solución salina y los epidídimos serán separados de los testículos con ayuda
de pinzas y una tijera. Posteriormente y a temperatura ambiente (15 - 20º C), por presión y
sobre una placa petri con SPERM-TALP se ordeñarán los epidídimos para la recuperación de
los espermatozoides. A los espermatozoides recuperados se les agregará 3 ml de SPERMTALP + 1 mg/ml de albúmina y se centrifugará a 1800 rpm por 5 minutos, se descartará el
sobrenadante y se le agregará 2 ml de SPERM-TALP y se centrifugará nuevamente a 1800
rpm por 5 minutos, se agregará sobre el pellet 1 ml de FERT-TALP y se dejará en la estufa de
CO2 por 45 minutos con una inclinación de los tubos de 45º, luego se recuperarán los
espermatozoides del sobrenadante y se resuspenderán en FERT-TALP a una concentración
aproximada entre 40-50 x 106 espermatozoides/ml. Para la inseminación de los ovocitos se
tomará 3 µl de la suspensión de FERT-TALP con 40-50 x 106 espermatozoides/ml FERT-TALP
y se agregará a las gotas de 45 µl con solución FERT-TALP que contienen los ovocitos
haciendo una concentración final aproximada de 2.5 – 3.5 x 106 espermatozoides/ml. Después
de 18 horas de co-cultivo de los espermatozoides y los ovocitos, para eliminar las células de la
granulosa y los espermatozoides accesorios que aún rodean a los ovocitos, se procederá a una
agitación en vórtex de los posibles cigotos por 2 minutos. Luego los posibles cigotos se lavarán
hasta 3 veces en solución de TALP-HEPES para finalmente ser cultivados por 8 días en
incubadora con 5% CO2 en gotas con 40 µl mSOF-IVC suplementado con 3 mg/ml de
albúmina de suero bovino libre de grasa.
Superovulación de las alpacas donantes de ovocitos: Para sincronizar la emergencia de
una nueva onda folicular, las donantes de ovocitos recibirán anestecia epidural (2,5 ml de
lidocaína al 2%). Todos los folículos ováricos mayores a 5 mm serán eliminados por ablación
usando la aspiración transvaginal guiada por ultrasonografía. Después de 48 horas de la
ablación de los folículos se iniciará los tratamientos superovulatorios dividiendo a las donantes
de ovocitos en dos grupos: 1) 25 mg de FSH (Folltropin) i.m. dos veces al día durante 4 días ó
2) 1000 UI de eCG (Folligon) im en una única dosis. 6 días después del inicio del tratamiento
superovulatorio se aplicará GnRH (conceptal) para inducir ovulación, 24 horas después de la
inducción de la ovulación se evaluará la respuesta ovárica mediante ecografía transrectal
27
usando un transductor de 7,5 MHz e inmediatamente después se procederá a la colección de
los COCs.
Aspiración Laparoscópica de ovocitos: Se aspirarán ovocitos utilizando un laparoscopio con
30° de ángulo de cámara y con fuente de luz tipo 488B. Los animales serán dejados en ayuno
durante 24 horas previo a la laparoscopía. Se utilizará Acepromazina maleato 1% en dosis de
0,3 ml/10 kg de peso vivo como tranquilizante. El animal será colocado decúbito dorsal sobre
una camilla operatoria. La región medio ventral será razurada, lavada y desinfectada. La
camilla se inclinará hasta un ángulo de 45° quedando el animal con la cabeza hacia abajo. Se
inducirá neumoperitoneo por insuflación de aire comprimido con ayuda de una aguja verres de
13 cm por 2 mm de diámetro. Se introducirán 3 trócares a la cavidad abdominal a unos 6 a 10
cm craneales a la glándula mamaria. El primero 2 cm a la izquierda de la línea media, el
segundo sobre la línea media y el tercero entre 4 a 6 cm a la derecha de la línea media. A
través de la incisión de la izquierda se introducirá un trócar de 7 mm de diámetro a través del
cual pasará el laparoscopio conectado a una fuente de luz fría. Ubicado el ovario, se introducirá
por la incisión de la derecha un forceps atraumático con el cual se manipulará y sujetará el
ovario. Seguidamente se introducirá por el trócar del centro una aguja conectada a una bomba
de vacío con 40 mm de Hg de presión negativa con la que se aspirará el fluido folicular con los
COCs (Complejos cúmulo-ovocito) en medio Dulbecco con suero fetal bovino al 1% y heparina.
Aspirados los COCs serán colocados en atmósfera húmeda a 38,5 ºC y 5% CO2 en medio de
maduración TCM-199 (con Hepes) suplementado con piruvato de Na 0,2 mM, sulfato de
gentamicina 50 µg/ml, FSH 0,02 unidades/ml, estradiol 17-β 1µg/ml y suero fetal bovino al
10%.
Aspiración transvaginal de ovocitos: Los Complejos ovocito-cúmulo (COCs) serán
recolectados usando un equipo de aspiración transvaginal guiado por ultrasonografía.
Previamente las alpacas serán anesteciadas epiduralmente con 2,5 ml de lidocaína al 2%,
asimismo la región perianal será lavada con jabón carbólico. Una aguja N° 19 con 55 mm de
lumen será colocada en la guía de aguja del transductor del ecógrafo y se introducirá por la
vagina atravesando la cérvix y colocando la punta de la aguja muy cerca al ovario para aspirar
el fluido folicular. Los contenidos de los folículos serán aspirados usando una bomba de
aspiración con una presión negativa de 22 ml/min. El contenido folicular de los folículos mayores
a 6 mm será aspirado dentro de un tubo Falcon de 50 ml conteniendo Fosfato Buffer salino
(PBS) con 0.3% de Albúmina de suero bovino (BSA), heparina (10,000 UI/L PBS) y gentamicina
(50 g/L PBS). El líquido aspirado se transferirá a placas Petri y usando un estereomicroscopio
se evaluarán los COCs aspirados y se clasificarán como expandidos, compactos ( 2 o más
capas de células de la granulosa), denudados o degenerados (células de la granulosa
picnóticas y ooplasma vacuolado).
Sincronización de receptoras de embriones: Durante 7 días se colocarán dispositivos
intravaginales a alpacas hembras las cuales serán receptoras de embriones producidos por
fecundación in vitro. Los dispositivos serán de 2 tipos: esponjas impregnadas con 60 mg de
acetato de medroxiprogesterona y CDIR que contiene incorporado 1,9 g de progesterona
natural micronizada. Al quinto día del retiro de las esponjas se inducirá ovulación con la
aplicación de GnRH (conceptal) y 7 días después el útero de las alpacas está apto
28
fisiológicamente para recibir embriones. También se sincronizará otro grupo de receptoras de la
siguiente manera: las alpacas hembras que aceptan la cópula con el macho detector de
receptividad serán inducidas a ovular con la aplicación de GnRH (conceptal) y 7 días después
están en condiciones de recibir un embrión.
3.7 PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS
En el experimento 1 el estado de maduración nuclear se evaluará 24 horas después de
concluido el secado de las muestras fijadas. En la segunda parte de este experimento se
evaluará las tasas de segmentación a los 3 días, las de mórulas a los 5 días y de blastocistos a
partir del sexto día de los ovocitos fertilizados luego de diferentes tiempos de maduración in
vitro. En el experimento 2 también se evaluarán las tasas de segmentación, mórulas y
blastocistos a los 3, 5 y 6 días respectivamente. En el experimento 3 después de la
recuperación laparoscópica y transvaginal los ovocitos culminarán su proceso de maduración in
vitro por espacio de 8-10 horas, luego de los cuales serán fertilizados, igualmente que en los
experimentos anteriores se evaluará la segmentación, mórulas y blastocistos a las 3, 5 y 6 días
después de la fertilización. La presentación de ovulación de las receptoras de embriones se
evaluará ecográficamente a las 30 horas después de la inducción de la ovulación. El
diagnóstico de gestación se realizará ecográficamente a los 30 y 90 días después de la
transferencia embrionaria.
3.8 TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS
Todos los experimentos serán repetidos 8 veces o de lo contrario hasta alcanzar un mínimo de
100 ovocitos por tratamiento. Las diferencias estadísticas entre los tratamientos serán
comparados utilizando análisis de varianza (ANOVA) después de la transformación arcsen de
los datos. Se utilizará la prueba de Duncan para contrastar la diferencia entre promedios. El
modelo estadístico a utilizar para describir una observación será:
Yij = μ + Ti + eij
Los componentes del modelo son:
Yij = observaciones (segmentación, mórulas y blastocistos).
μ = media general.
Ti = efecto de los tratamientos (tiempo de maduración, medios de cultivo, agentes capacitantes,
tipo de células de co-cultivo).
eij = error asociado a cada observación.
En el tercer experimento para el caso de determinar la tasa de ovulación y de preñez de las
hembras sincronizadas se utilizará la prueba de chi – cuadrado para identificar diferencias entre
los tratamientos.
3.9 ÁMBITO DE ESTUDIO
El estudio se realizará en el Laboratorio de Biotecnologías Reproductivas de la Universidad
Nacional de Huancavelica ubicado en el Campus Universitario de Paturpampa, del distrito,
provincia y departamento de Huancavelica, a una altura aproximada de 3670 m.s.n.m., ubicado
29
a 74° 98´ longitud oeste y 12° 78´ latitud sur. El clima es frío, siendo la temperatura media anual
que varía entre 5 a 8°C y una precipitación pluvial anual de 829,6 mm. (INEI, 2008), mientras
que los ovarios para la recuperación de ovocitos fueron recolectados en el Camal Municipal de
Huancavelica. La aspiración folicular de las donantes y la transferencia de embriones de las
receptoras se realizará en el CIPS Lachocc de la UNH.
30
CAPITULO IV: ASPECTOS ADMINISTRATIVOS
4.1. POTENCIAL HUMANO
EQUIPO INVESTIGADOR
Investigador Responsable:
Jaime Antonio Ruiz Béjar: Ing. Zootecnista. Magíster en Producción Animal y Doctor en
Ciencias Veterinarias. Profesor Principal del Departamento Académico de Zootecnia de la
UNH.
Miembro del grupo de Investigación:
Marino Artica Félix. Ing. Zootecnista. Profesor Asociado del Departamento Académico de
Zootecnia de la UNH.
ASISTENTES DE INVESTIGACIÓN
-Ing. Zootecnista por definir
-Ing. Zootecnista por definir
-Bachiller o tesista por definir
-Bachiller o tesista por definir
-Secretaria por definir
4.2. RECURSOS MATERIALES
4.2.1 PRESUPUESTO
4.2.1.1. EQUIPOS
Item
Descripción
Cantidad
Precio
Unitario
Precio
Total
(n.s.)
(n.s.)
Plato térmico para calentar placas
Unidad
2
7500.00
15000.00
Estereomicroscopio
Unidad
3
3280.00
9840.00
Platina atemperada para microscopio
Unidad
3
1800.00
5400.00
1
75000.00
75000.00
1
138400.00
138400.00
Laparoscopio con bomba de aspiración de
Unidad
ovocitos
Ecógrafo con guía de punción para aspiración
Unidad
transvaginal de ovocitos.
Cámara de electrofusión
Unidad
1
40000.00
40000.00
Electrofusores
Juegos
4
2000.00
8000.00
Refrigeradora de uso farmaceutico
Unidad
1
9740.00
9740.00
Refrigeradora convencional
Unidad
1
1000.00
1000.00
Baño maría (5 lts)
Unidad
1
3350.00
3350.00
Autoclave vertical electrónico digital
Unidad
1
8200.00
8200.00
31
Electroeyaculador para rumiantes menores o
Unidad
camélidos
1
11000.00
11000.00
Laptop
Unidad
2
3200.00
6400.00
Incubadora de embriones portátil
Unidad
2
2650.00
5300.00
Destilador digital para agua ultra pura
Unidad
1
18500.00
18500.00
Tanque de nitrógeno líquido de 33.5 litros
Unidad
2
5750.00
11500.00
Tanque de nitrógeno líquido de 20 litros
Unidad
1
3800.00
3800.00
Tanque de nitrógeno líquido de 3.6 litros
Unidad
2
3600.00
7200.00
Vortex agitador de tubos
Unidad
2
1950.00
3900.00
Micropipeta 0.5 – 10 μL
Unidad
2
900.00
1800.00
Micropipeta 20 - 100 μL
Unidad
2
750.00
1500.00
Steripette 55 mm para manipular embriones /
(minitube 19025/0055) x 50
Paquete
1
510.00
510.00
Micropipeta 100 - 1000 μL
Unidad
2
750.00
1500.00
Soporte para micropipetas
Unidad
1
400.00
400.00
microscopio con contraste de fases + platina
termica
Unidad
1
13160.00
13160.00
Termometro com termocupla,+ sensor
Unidad
1
1400.00
1400.00
Cámara de flujo laminar
Unidad
1
19000.00
19000.00
Horno estirilizador y de secado
Unidad
1
2600.00
2600.00
Microcentrifuga digital
Unidad
1
5562.00
5562.00
Camara filmadora
Unidad
1
1200.00
1200.00
motocicleta
Unidad
1
14490.00
14490.00
generador electrico
Unidad
1
3500.00
3500.00
cilindro para mezcla de gases (MAPAX)
Unidad
1
1000.00
1000.00
cilindro para CO2
Unidad
1
1000.00
1000.00
valvula para nitrogeno
Unidad
1
400.00
400.00
TOTAL
450552.00
32
4.2.2 PRESUPUESTO DE INSUMOS
A. MATERIALES
Producto/Descripción
Unidad
Cantidad
Precio
Unitario
Precio
Total
(n.s.)
(n.s.)
Eppendorf de 600 μ
Bolsa x 500
3
50.00
150.00
Eppendorf de 1500 μl
Bolsa x 500
3
45.00
135.00
Puntillas para micropipeta de 0,5 - 10 μl
Bolsa x 1000
6
60.00
360.00
Puntillas para micropipeta de 20 – 100 μl
Bolsa x 1000
6
40.00
240.00
Puntillas para micropipeta de 100 – 1000 μl
Bolsa x 1000
6
55.00
330.00
3
850.00
2550.00
1
850.00
850.00
2
250.00
500.00
2
102.00
204.00
2
30.00
60.00
2
40.00
80.00
3
70.00
210.00
10
70.00
700.00
3
70.00
210.00
3
70.00
210.00
144
5.00
720.00
3
450.00
1350.00
10
15.00
150.00
10
15.00
150.00
18
55.00
990.00
18
45.00
810.00
Placa petri 35 x 10 mm para cultivo de embriones
Placa Petri 35 x 10 mm para cultivo celular
Placa petri 90 x 15 mm
Viales criogénicos
Agujas de 18 g
Agujas de 21 g
Jeringas de 1 ml
Jeringas de 5 ml
Jeringas de 10 ml
Jeringa de 20 ml
Papel toalla
Filtro 25mm p/jeringa 0.2 μm.
Guantes quirúrgicos Talla N°6
Guantes quirúrgicos Talla N°8
Tubo Falcon graduado 15ml
Tubo Falcon graduado 50ml
Caja x 25
paquetes
Caja x 25
paquetes
Cajas x 20
paquetes
Bolsa x 50
unid.
Caja x 100
unid.
Caja x 100
unid.
Caja x 100
unid.
Caja x 100
unid.
Caja x 100
unid.
caja x 100
unid.
Paquete x 3
unidades
Caja x 50
unid.
Caja x 100
unid.
Caja x 100
unid.
Bolsa x 50
unid.
Bolsa x 25
unid.
Lámina porta objeto 25 x 75 mm
Paquete x 50
unidades
5
4.00
20.00
Lámina cubre objeto 22 x 20 mm
paquete x
100 unidades
5
4.00
20.00
Frasco graduado de vidrio x 100 ml
Unidad
8
13.00
104.00
Matraz erlenmeyer cuello ancho graduado 250 ml
Matraz erlenmeyer cuello ancho graduado 500 ml
Unidad
4
9.00
36.00
Unidad
4
12.00
48.00
Papel parafilm
Papel aluminio
Paquete
3
150.00
450.00
Paquete
10
40.00
400.00
33
Papel Kraft
Extensión eléctrica de 5 mts
Pliegos
100
1.00
100.00
Unidad
5
30.00
150.00
Termometro digital tipo lapicero
Unidad
1
110.00
110.00
Funda para pistola de embriones bolsa x 5 unidades MASED
Camiseta Sanitaria- rollo de 100 unidades - MASED
Unidad
50
55.50
2775.00
Unidad
5
70.00
350.00
Guantes tacto sensible para palpación x 100 unidades
Caja
10
52.00
520.00
Proctoscopio descartable X 25 unidades
Bolsa
1
955.00
955.00
Frascos graduados de vidrio de 50 ml
Unidad
8
40.00
320.00
Filtros hepa para cabinas de flujo laminar
Unidad
4
1,200.00
4800.00
Pajillas irradiadas de 0.25 cc x 50 unidades - MASED
Bolsa
10
55.00
550.00
Pajillas para embriones de 0.5 cc x 100 u
Bolsa
5
60.00
300.00
catéter de Silicona 16FR 30CC
Unidad
10
50.00
500.00
catéter de Silicona 18FR 30CC
Unidad
10
50.00
500.00
Medio catéter IVF para FIV Paq de 5 Jeringaas y 50
Ceteteres
Tuberia en Y para colección de embriones
bolsa
5
140.00
700.00
Unidad
15
30.00
450.00
Em Con Filter
Unidad
15
73.00
1095.00
Dilatador Cervical
Unidad
1
400.00
400.00
Mandril para sondas de lavado
Unidad
1
400.00
400.00
RACK para tips blancos hasta 10 ul
Unidad
1
50.00
50.00
RACK para tips Amarillos hasta 100 ul
Unidad
1
50.00
50.00
Rack para tips Azules hasta 1000 ul
Unidad
1
50.00
50.00
Abocat Marca Nipro
Unidad
15
2.50
37.50
Unidad
12
2.50
30.00
Unidad
15
4.40
66.00
15
4.40
66.00
Cámara de Newbauer
Unidad
Unidad
2
250.00
500.00
Adaptador eléctrico de plástico 3 enchufes
Unidad
10
3.00
30.00
Lockers metálicos (de 6 casilleros)
Unidad
2
900.00
1800.00
Sonda Introvenosa (Equipo de venoclisis) Marca
VRAUN
Hilo Seda Negra x 150 CTM. Marca Cirugia Peruana.
Catgut 2 ceros Marca Cirugía Peruana
TOTAL
29691.50
B. REACTIVOS
Reactivo (código sigma)
CIDR (implantes hormonales) x 10 unidades
Medio de lavado de embriones x 1 litro
Medio de mantenimiento de embriones x 200 ml
Medio de congelacion de embriones vigro con
etilenglicol mas sucrosa
Folligon (eCG) caja x 5 viales de 1000 UI
Folltropin V (FSH) x 400 mg NIH
Conceptal (GnRH) x 100 ml
ILLIREN (Prostaglandina 2 alfa) x 100 ml
ESTROVET (Benzoato de estradiol) x 50 ml
Pregnil (HCG)x 1500UI
10
25
10
10
Precio
Unitario
(n.s.)
680.00
125.00
60.00
78.00
Precio
Total
(n.s.)
6800.00
3125.00
600.00
780.00
20
20
8
5
6
10
300.00
600.00
80.00
180.00
50.00
60.00
6000.00
12000.00
640.00
900.00
300.00
600.00
Unidad
Cantidad
Bolsa
Bolsa
Cojin
sachet
Unidad
Vial
Frasco
Caja
Frasco
Caja
34
Manitol (Sigma M-9546) x 100 mg
PVA (Sigma P-8136) x 50 mg
PHA. (Sigma L 8754) x 10 gr
Lutropin – V (LH) (25mg)
Pronasa (Sigma P 8811) x 100 mg
Halatal x 50 ml
TCM-199 polvo (M-2520)
Suero fetal bovino (F-6178)
FSH (F-8174)
Piruvato de Na (P-5280)
Gentamicina (G-3632)
Estradiol 17-β (E-8875)
NaHCO3 (S-8875)
Hialuronidasa (H-3506)
L-glutamina (G-8540)
Glucosa (G-7021)
Glicina (G-8790)
Taurina (T-8691)
Lactato de Na (L-4263)
BME (B-6766)
MEM (M-7145)
Insulina (I-4011)
Albumina de Suero bovino (A6003)
Albumina de Suero bovino (A8022)
NaCl (S-5886)
KCl (P-3911)
NaH2PO4 (2H2O) (S-5011)
CaCl2 (2H2O) (C-7902)
MgCl2 (6H2O) (M-0205)
KH2PO4 (P-5655)
Rojo fenol (0,5%) (P-0290)
Dimetilsulfoxido (DMSO)
6-DMAP (D-2629)
Citocalacina- β (C-6762)
Ionomicina (I-0634)
Aceite Mineral (M3516)
Trehalosa (T-0167)
Agua q.p. (W3500)
Etilenglicol
Polivinilpirrolidona (PVP40)
Alcohol
Detergente enzimático
Gel Lubricante (minitube 17116/7010) x 4 galones
Detergente neutro
TRIS
Cicloheximide x 100 mg
Hoechst 33342 x 100 mg
Fructosa
Ácido cítrico
Citrato de Na
Penicilamina
Heparina
Frasco
Frasco
Frasco
Caja
Frasco
Frasco
Vial 10x1 litro
Frasco x 1/2 litro
Vial
Frasco x 25 gr.
Frasco x 1gr.
Frasco x 25 mg
Frasco x 500 gr.
Frasco x 100 mg
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 ml
Frasco x 100 ml
Frasco x 100 ml
Frasco x 50 mg
Frasco x 10 gr.
Frasco x 10 gr
Frasco x 500 gr.
Frasco x 500 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 500 gr.
Frasco x 500 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 ml
Frasco x 1 litro
Frasco x 100 mg
Frasco x 1 mg
Frasco x 1 mg
Frasco x 1 Litro
Frasco x 25 gr
Frasco x 1 litro
Frasco x 1 litro
Frasco x 50 gr
Frasco x 1 litro
Galon
Caja
Caja x 4 galones
Frasco x 250 gr.
Frasco
Frasco
Frasco x 100 gr.
Frasco x 250 gr.
Frasco x 250 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 250 gr.
2
2
2
10
1
3
1
2
2
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
8
1
12
1
1
5
1
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
280.00
350.00
630.00
330.00
630.00
30.00
483.00
1700.00
2600.00
290.00
444.00
125.00
272.00
278.00
410.00
225.00
251.00
495.00
195.00
319.00
182.00
1132.00
525.00
500.00
140.00
195.00
153.90
210.00
179.00
120.80
93.90
224.00
266.00
670.00
640.00
292.00
441.00
235.00
256.00
220.00
10.00
120.00
180.00
190.00
420.00
430.00
440.00
180.00
320.00
250.00
320.00
180.00
560.00
700.00
1260.00
3300.00
630.00
90.00
483.00
3400.00
5200.00
580.00
444.00
125.00
272.00
556.00
410.00
225.00
251.00
495.00
195.00
319.00
182.00
2264.00
1050.00
1000.00
140.00
195.00
153.90
210.00
179.00
120.80
93.90
224.00
532.00
670.00
1280.00
2336.00
441.00
2820.00
256.00
220.00
50.00
120.00
180.00
190.00
420.00
860.00
880.00
180.00
320.00
250.00
320.00
180.00
35
Hipotaurina
Epinefrina
Metabisulfito de Na
DMEM-F12
Ácido bórico
EDTA
Colcemid
Acetato de medroxiprogesterona 1 Kg
Kit de Lipofección
TOTAL
1
1
1
1
1
1
1
1
2
Frasco x 250 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 gr
Frasco x 100gr.
Frasco x 100 gr.
Frasco x 100 ml
Frasco
Frasco x 50 ml
315.00
400.00
350.00
300.00
280.00
350.00
320.00
1200.00
1000.00
315.00
400.00
350.00
300.00
280.00
350.00
320.00
1200.00
2000.00
75072.60
C. COMBUSTIBLE PARA EL LABORATORIO
Item/Descripción
Unidad
Precio
Unitario
(n.s.)
Cantidad
Precio
Total
(n.s.)
Gas licuado x 30 kg
Llenado de balón
2
35.00
70.00
/
CO2
Llenado de balón
3
140.00
420.00
Llenado de balón
2
450.00
900.00
310
13.00
4030.00
5420.00
Llenado balón 35 kg.
Mezcla de gases (CO2 + N2+ O2)
8 m3
Nitrógeno líquido
TOTAL
kilos
4.2.3 PRESUPUESTO DE VESTUARIO
Item
Descripción
Cantidad
Mandil blanco con logotipo
Diferentes tallas
Mameluco con logotipo
De manga larga.
Diferentes tallas.
Zapatos para laboratorio
Diferentes tallas.
Gorras descartables
Caja x 100
Gorras de tela
Unidad.
Autoclavables.
Mascarillas descartables
Caja x 100
Mascarillas de tela
Unidad.
autoclavables
Guantes palpación rectal.
Caja
x
unidades
Casaca térmica con logo
Diferentes tallas
Botas de jebe
Para trabajo
campo
Bolsas de dormir
Unidad
Tienda de campaña
Unidad
TOTAL
15
15
15
5
15
5
15
100
6
15
en
15
5
1
Precio
Unitario
Precio
Total
(n.s.)
(n.s.)
45.00
675.00
90.00
1350.00
55.00
825.00
50.00
250.00
15.00
225.00
50.00
250.00
15.00
225.00
55.00
330.00
80.00
1200.00
30.00
450.00
100.00
500.00
1500.00
1500.00
7780.00
36
4.2.4 PRESUPUESTO DE MATERIALES DE ESCRITORIO
Item
Descripción
Precio
Unitario
(n.s.)
Cantidad
Precio Total
(n.s.)
Papel Bond A4
Millar
80
32.00
2560.00
Papel Bond A3
Millar
40
45.00
1800.00
Master duplo
Paquete
10
60.00
600.00
Tinta para impresora
Cartucho
color negro
5
200.00
1000.00
Folder de manila
Con Fastener
50
0.50
25.00
Folder con diseño
Plastificado
1000
1.00
1000.00
Micas plastificadas
Para pioner
500
0.50
250.00
Afiches
60 x 40 cm
1000
0.50
500.00
1000
0.40
400.00
1000
0.40
400.00
10
1.50
15.00
para
Plastificado con
diseño
Plastificado con
diseño
Para
pizarra
acrílica
Tríptico
Díptico
Plumones
Plumones
Para papelote
10
2.00
20.00
Papelotes
Unidad
50
2.00
100.00
600
1.00
600.00
600
2.50
1500.00
10
2.00
20.00
Con
logo
laboratorio.
Con
logo
laboratorio
Lapiceros
Llaveros
del
del
Liquid paper
Unidad
Pasta A4
Plastificado
500
1.00
500.00
Pasta 22x 15cm
Plastificado
500
1.00
500.00
USB
8 GB
3
100.00
300.00
Engrapador
Metálico
2
40.00
80.00
Perforador
Metálico
2
40.00
80.00
Calculadoras científicas
Unidad
2
60.00
120.00
TOTAL
12370.00
4.2.5 PRESUPUESTO DE COMBUSTIBLE
Item
Gasolina x 90 octanos
TOTAL
Descripción
Galón
Cantidad
1587.5
Precio
Unitario
(n.s.)
16.00
Precio Total
(n.s.)
25400.00
25400.00
37
PRESUPUESTO FINAL DE BIENES
Precio
Item/Descripción
(n.s.)
EQUIPAMIENTO
450552.00
INSUMOS
110184.10
VESTUARIOS
7780.00
MATERIAL DE ESCRITORIO
12370.00
COMBUSTIBLE
25400.00
TOTAL
606286.10
4.2.6 PRESUPUESTO DE SERVICIOS
A. PUBLICACIÓN
Item/Descripción
Unidad
Cantidad
Precio
Unitario
Precio Total
(n.s.)
(n.s.)
Revista científica indexada
Global
2
1200.00
2400.00
gigantografías
Unidad
8
150.00
1200.00
Afiches
60 x 40 cm
500
1.50
750.00
Tríptico
Plastificado
con diseño
500
1.50
750.00
Díptico
Plastificado
con diseño
500
1.50
750.00
Unidad
10
20.00
200.00
Empastado
TOTAL
6050.00
B. PASANTIA
Item/Descripción
Unidad
Precio
Unitario
Cantidad
(n.s.)
Precio
Total
(n.s.)
Pasantía en aspiración folicular. Chile, Argentina u otro
país.
Global
1 11000.00
11000.00
Pasantía en Transferencia de embriones. Argentina,
Colombia u otro país
Global
1 11000.00
11000.00
Pasantía en biotecnologías
BARILOCHE Argentina.
Global
1 11000.00
11000.00
Global
1 11000.00
11000.00
reproductivas.
INTA
Pasantía en micromanipulación de embriones. Colombia,
Brasil u otro país.
TOTAL
44000.00
38
C. OTROS SERVICIOS
Item/Descripción
Unidad
Cantidad
Precio
Unitario
Precio
Total
(n.s.)
(n.s.)
Viáticos
Unidad
18
180.00
3240.00
Pasajes terrestres
Unidad
14
120.00
1680.00
Pasajes aéreos
Unidad
2
450.00
900.00
Mantenimiento de camioneta
Global
2
3000.00
6000.00
Servicio de Pagina web x año
Unidad
3
900.00
2700.00
Consultor. Biólogo con maestría o
doctorado, especialista en reproducción
animal. Especialista en manejo de
laboratorio y preparación de reactivos.
Unidad
3
10000.00
30000.00
TOTAL
44520.00
D. CAPACITACIÓN.
Item/Descripción
Congreso Mundial
Francia. 2016
de
Unidad
Reproducción.
Cantidad
Precio
Unitario
Precio
Total
(n.s.)
(n.s.)
Global
1
11000.00
11000.00
Congreso
de
la
Asociación
Latinoamericana de Especialistas en
Pequeños Rumiantes y Camélidos
Sudamericanos. ALEPRyCS. 2015
Global
1
3000.00
3000.00
Congreso de la Sociedad Internacional
de Transferencia de Embriones. (IETS).
2015 y 2016
Global
2
11000.00
22000.00
TOTAL
36000.00
E. ASISTENTES DE INVESTIGACIÓN
Item/Descripción
Unidad
Cantidad
Precio
Unitario
Precio
Total
(n.s.)
(n.s.)
Ing. Zootecnista
Meses
26
2200
57200
Ing. Zootecnista
Meses
26
2200
57200
Bachiller o tesista
Meses
26
1500
39000
Bachiller o tesista
Meses
26
1500
39000
Secretaria
Meses
26
1000
26000
TOTAL
218400
39
F. CONSULTORIA
Item/Descripción
Unidad
Cantidad
Precio
Unitario
Precio
Total
(n.s.)
(n.s.)
Evaluación del proyecto
Global
1
10,500.00
10,500.00
Monitoreo del proyecto
Evaluación del informe
final
TOTAL
Global
1
10,500.00
10,500.00
Global
1
10,500.00
10,500.00
31,500.00
G. APOYO A LA DUI
Item/Descripción
Unidad
Apoyo administrativo
Viáticos para supervisión de
proyecto
Pasajes para la supervisión
de proyecto
TOTAL
Cantidad
Precio
Unitario
(n.s.)
Precio Total
(n.s.)
Unidad
17
400.00
6800.00
Unidad
10
180.00
1800.00
Unidad
14
100.00
1400.00
10000.00
H. IMPREVISTOS
Item/Descripción
Unidad
Precio Total
(n.s.)
IMPREVISTOS
GLOBAL
3243.90
PRESUPUESTO TOTAL DE SERVICIOS
Item/Descripción
Precio
(n.s.)
Pasantías
6050.00
44000.00
otros servicios
44520.00
Apoyo a la DUI
10000.00
Capacitación
36000.00
Publicaciones
Asistentes de investigación
218400.00
Consultoría
31500.00
Imprevisto
3243.90
TOTAL
393713.90
40
4.3 PRESUPUESTO
El presupuesto total requerido para realizar el presente trabajo de investigación se resume a
continuación
Precio
Item/Descripción
(n.s.)
Presupuesto de bienes
606,286.10
Presupuesto de servicios
393,713.90
PRESUPUESTO FINAL
1000000.00
4.4. FINANCIAMIENTO
El presente trabajo de investigación será financiado por la Dirección Universitaria de
Investigación a través de los fondos del canon gasífero- Huancavelica FOCAM.
4.5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
4.5.1De actividades experimentales
Actividades
Preparación del Proyecto
Presentación del proyecto
Evaluación y aprobación del proyecto
Implementación de laboratorio
Compra de equipos
Primera compra de materiales e insumos
Estandarizar protocolos de maduración y
fecundación in vitro.
Preparación de stocks de los diferentes reactivos a
congelar.
Experimento 1a
Experimento 1b
Segunda compra de materiales e insumos
Experimento 2a
Experimento 2b
Experimento 2c
Experimento 3a
Experimento 3b
Redacción del informe final
Presentación y sustentación del informe final
2014
Ene-Feb
Feb-Mar
Mar-Abr
Abr-May
Jun-jul
Jun-Jul
Jun-Jul
2015
2016
Jun-Jul
Ago-Oct
Oct-Dic
Nov-Dic
Ene-Mar
Abr-Jun
Jul-Sep
Oct-Dic
Ene-Abr
May-Jun
Jul
4.5.2. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DEL PROYECTO
41
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