Proteinasas con actividad de quimotripsina y colagenasa
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR AREA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MARINA Proteinasas en con actividad de quimotripsina y Pleurocondes langostilla Tesis que como parte de los B IO L O G O colagenasa planipes Decapoda requisitos para M A R I N O obtener el t tulo de presenta MARTHA PATRICIA HERNANDEZ CORTES C S MEXICO Octubre de 1993 e J C 30 28775 I DANZaN DEDICADO Don Juan porque nos Va por mis la deb amos amigos pasados presentes y futuros y a Joshua que ya le espero Me estremeci en el tiempo y los mir la mujer que de la harina y endurecerse Me estremeci pari un once kilo de pan criando a sus porque Romana hijos es hijos mi abuela ademÆs A mi amante siempre exige A quien mas mas cruel indiferente y de mi y da tan poco a cambio invariablemente perdono siempre ego sta Aunque te abandone vuelvo a ti Valle del AnÆhuac Bueno observ Alicia todav a pa s generalmente muy se va a durante rÆpidamente jadeando un en poco si alguna parte largo tiempo nuestro se corre nosotras hemos como corrido j Un que pa s correr mismo muy atrasado lo mas lugar menos a Si respondi aprisa quieres que ir a la reina puedas para alguna parte o Pero aqu tienes mantenerte en el debes correr por lo doble velocidad de la que hemos corrido She is running to stand still Paul Hewson Plus a change plus e est la mŒme ehose Cuanto mas cambian las cosas mas siguen siendo las mismas A MODO DE PREFACIO En el buen agradecer voy al turno al incluir a quienes me ayudaron y aprecio Aunque el esfuerzo de llegar a este peldaæo fue individual estuvieron involucradas en esta labor otras personas desde el inicio de mi carrera y mas allÆ Gracias a todos aquellos que ejercicio de que lo culminara pero ante todo a los mexicanos an nimos posibilidad de los estudios de nuestra gente permitieron dan la trabajo La direcci n de mi tesis estuvo la de concluir oportunidad carrilla y por las que vienen Mi y darme todo y Carreæo Fer por por tu constante Norman F Haard por haberme permitido trabajar en su en el Instituto de Recursos Marinos del de facilidades tipo do Ciencia Departamento a gracias al Dr agradecimiento laboratorio cargo del Dr Fernando Luis Garc a trabajo que hab a quedado pendiente con un con su que Tecnologia de los Alimentos en Universidad de California la Davis A la gente del IMR Roberts y 3am Matoba por su Leonora Dimes Jesse Chung Mar a La Dra Rosalba Encarnaci n Dimayuga fue mi directora por parte cuan importante es hacerse entender Al Dr HØctor Nolasco Soria le El apoyo usar su cosas e algo mas log stico que tinta agradezco su interØs roja en el papel estuvo a cargo de en VÆzquez Morquecho siempre algœn estropicio en esa maquinita La burocracia fue inevitable Reyna hicieron que yo no pude Para entre otras efectuar una a Peter en mi de la UABCS tuvo Palafox Uribe que hacer desorden de nuevo a que las trabajo procurando Margarita para intentar explicar lo que hice su vida una de cal por las que van de Ernesto de cometer me dej con sus arena tuvo la amabilidad de rescatarme varias Guillermo Juan FernÆndez Aceves y Gabriela veces Anaya que la carga fuera menos pesada al agilizar varios trÆmites ambos les debo mas de una por lo oficial y las aæadiduras cosas segunda opini n Bonilla para revisar el manuscrito e Consuelo computadora intervenir Pulido ayuda y compaæia bien orientarme y hacerme notar revisiones fueran Izquierdo recurr a Luis Manuel En deuda estoy Enr quez con vosotros Paredes y a HØctor Reyes por decirme desde siempre t s mal En el Centro de Investigaciones Biol gicas del Noroeste realicØ la parte Biolog a Experimental donde me dejaron que me peleara en los teclados y sea la que se pueda leer de Mi inevitable caracter stica de andar de la seca a la meca no hospitalidad de las familias PØrez GonzÆlez Pavia L pez Garc a Sergio Flores Ram rez y Carmen Rodriguez Medrano final hubiese sido Navarrete en el Ærea la edici n final posible sin la por H Reyes Por del destino tengo o tuve que compartir en La Paz algo mas que la renta del mes de todas mis moradas que se convirtieron a azares el pan y la sal o reticencia en mi hogar L G Anaya G Enriquez Dinorah Herrero Perezrul Johath Laudino SantillÆn Laura Susana Romero juntos M cuarto veces con Isabel Hern ndez Ram rez Palafox Ana Karina PelÆez Mendoza y E VÆz quez Castrej n por intentar aprender el arte de la convivencia Sin duda alguna vida lo que la tiempo Marcos me una canciones que Con ha dado de mis uno mejores regalos dØcada Ana Luisa ha sido mi conciencia ha enseæado los alucines las ausencias estrecheces me para transitar por la palabra impresa representa Por mÆs de este Edna SÆnchez Huacuja FernÆndez un me haz a no a una impuesto tomarme demasiado en cuadra burlarte de mis tienes un espacio œnico mas serio y a durante desesperante re rme de mi misma Por y hasta por toda la serie de mis casilleros ag ites en un grupo de revoltosos he compartido la experiencia dolores de cabeza intransigencias alegr as compartidas de los sentidos desgarros agudas cima y pozo motivos para emprender descubrimientos aliento y cr tica un reflejo de mi y la certera esperanza que los seguirØ encontrando por esos senderos vifurcados cada cual sabe lo suyo Por estricto orden cronol gico HØ tor Gaviota Rol Karina Mago Luis y Gmo introspecciones papeles viajantes cuestionamiento Desavenencias y exaltaciones aparte el Paul colabor caminos de la intemporalidad durante la Øpoca de las aulas Una dado parte l nea aparte Mis especial de s en menci n especial al clan HernÆndez CortØs mi abuela Carmen mis t os Cada conmigo uno Carmen de para sus Rodriga cruzar miembros varios me Rosa y Paco ha en Roman compadres siguen creciendo Manuel conmigo Larissa a veces mayor eres tœ Juan por tus arranques de efusividad y Eduardo por tus mØdula j venes hasta la mØdula estÆn ojos que la Lalo jHasta la pienso pero jamÆs al œltimo los irresponsables del desastre de que estØ y sea l eres una Marth despuØs de todo hice lo m o con tœ apoyo y mujer admirada y Finalmente Juan Jorge admirable Por y dejar coda Isla por estar la noci n de patria como tengo tangible que fuera y lanzarme al viento Los en ti Entre tanto amo ocre entraæablemento gris olivo azul bermejo y naranja desodio LISTA DE ABREVIATURAS 2 AA AA amimo 2 acridona enzimÆtico Extracto de de hepatoropÆncreas acocil americano APA Ala Phe 2 amino 4 metilcoumarino 7 ATNP Acetil Trp p ATEE Etil ATNA Acetil L Tyr p nitroanilida APNA ester ester de N enzoil Arg de acetil nitro p nitrofenilo L Tyr nil BTNA Benzoil Tyr p BTEE Etil CPA Carboxipeptidasa A CPB Carboxipeptidasa B EDTA Acido etilendiamintetra EGTA Etilen glicol bis nitroanilida ester de benzoil Tyr acØtico amino etil Øter N N N N Æcido tetracØtico FALGPA Ala g relativa GPNA nitroanilida LAExtracto enzimÆtico langostilla LAP peptidasa MPM Marc dores 3 2 Glu Phe Unidades acriloil furil de Leu fuerza Gly Pro centrifuga p Leucin de hepatopÆncreas amino de peso molecular PMSF Fluoruro fenilmetilsulfonilo SBTI SAPNA nitroanilida Inhibidor soya SPNA Succinil p nitroanilida SATNA nitroanilida SDS Dodccil de Succinil Succinil Ala 2 Pro Phe de Ala p tripsina de 2 Tyr p sulfato de TCA Acido TES Sulfonato de Tris TLCK Cetona de tosil TPCK Cetona Tris Tri Vmax Velocidad mÆxima Vo Velocidad ZPCK Cetona de carbobenzoxi ZAGPCK Cetona de carbobenzoxi Ala Los aminoÆcidos tres tricloro de acØtico hidroximetil metil 2 aminometano Lys clorometilo tosil Phe hidroximetil clorometilo aminometano inicial nombrados siguen letras Ala Alanina Arg Arginina Glu Acido Gly Glicina Ile Isoleucina Leu Leucina Lys Lisina Met Metionina Phe Fenilalanina Pro prolina Ser Serina Trp Tript fano Tyr Tirosina Val Valina glutÆmico Phe clorometilo Gly phe clorometilo la nomenclatura internacional de 1 IlIDICE GImERAL PÆgina Indice general Indice de 1 figuras II Indice de tablas II 1 Resumen 1 2 Abstract 2 3 Intro l ue e i 4 Justificaci 5 Antecedentes 5 3 n n 6 proteinasas 1 Clasificaci n 5 1 1 5 1 2 Sustratos 5 1 3 proteinasas 5 1 4 Relaciones 5 7 digestivas 9 filogenØticas 9 Caracter sticas 2 1 5 2 2 Distribuci 5 2 3 MØtodos generales 11 n 13 para determinar actividad quimotr ptica 16 Colagenasas 3 5 3 1 Caracter sticas 5 3 2 5 3 3 Distr ibuci 5 3 4 Sustratos MØtodos 18 generales estructura tipos y caracter sticas n para 20 22 determinar actividad colagenol tica 1 Hidroxiprol ina 23 2 23 3 viscosidad Radioactividad 4 Espectofotometr a 24 5 25 6 Fluorometr fa Sustratos sintØticos 7 Ninhidrina 25 Obj G 8 Quimotripsina 2 5 5 7 inhibidores e 24 cti vos 25 26 Materiales y MØtodos 7 1 Fuente de enzimas 7 2 React iva s 7 3 Cuantificaci6n de 27 27 prote na 28 Actividad quimotr iptica 7 4 7 5 Actividad 7 6 proteolitica 29 Electroforesis 30 3O 7 6 1 Z imogr ama s 7 6 2 7 28 Inhibici n 3O gel en Actividad colagenolitica 1 Modificaci n del mØtodo 7 7 7 7 7 de Mandl 2 MØtodos de Duhamel et al Actividad y Hyeung los extractos colagenolitica en hepatopÆncreas de langostilla 7 8 7 9 Efecto del pH sobre la hidr et al 1953 y 1981 Rak 31 1991 32 de acocil americano lisis de SAPNA y 33 colÆgeno 33 10 Termoestabilidad 7 7 11 Constantes 7 12 33 cinØticas Enriquecimiento de 34 quimotripsinas 34 Resultados 8 8 1 Actividad 8 2 8 2 1 colagenolitica Comparaci n de los mØtodos Duhame 1 8 2 2 2 3 e de Mandl et al y t al 42 Colagenolisis de 8 36 quimotr iptica Actividad langostilla Clasificaci n los extractos de por y acocil americano de las proteinasas hepatopÆncreas 44 que hidrolizan colÆgeno 45 Efecto del pH sobre la hidr a 4 Termoestabilidad 8 5 Constantes cinØticas 8 8 3 6 Enriquecimiento de lisis de SAPNA y colÆgeno 46 49 52 quimotripsinas 53 Discusi n 9 9 1 Actividad 9 2 Actividad 9 3 quimotriptica colagenolitica Caracteristicas de las quimotripsinas langostilla y acocil americano 55 60 y colagenasas de 61 10 Conclusiones 64 11 Recomendaciones 65 12 Literatura citada 66 13 ApØndice l II Amortiguador Diagramas de universal 79 flujo Actividad quimotr iptica 8O Actividad proteolitica 81 Actividad colagenolitica 82 11 IHDICB DB FIGURAS FIGURA 1 PlGlNA Desarrollo serina de la familia de zlmogenos de las proteinasas lisis de vertebrados 10 2 Hidr 3 Zimograma 4 Zimograma preincubando con PMSF 39 5 Zimograma preincubando con TLCK 40 6 Zimograma preincubando con TPCK 40 7 Zimograma preincubando con ZPCK 41 8 Efecto del colÆgeno 19 control de la 39 concentraci n SDS sobre la absorbancia del reactivo de Bradford 9 Influencia 10 Influencia 42 pH sobre la hidr lisis de SAPNA del pH sobre la hidr lisis de del 11 Termoestabilidad de LA sobre la 47 colÆgeno 48 hidr lisis del SAPNA 50 50 12 Termoestabilidad de AA sobre la hidr lisis de SAPNA 13 Termoestabilidad de LA sobre la hidr lisis de colÆgeno 51 14 Termoestabilidad de AA sobre la hidr del colÆgeno 51 15 Hidr lisis de proteina carboxipeptidasa A por lisis quimotripsina y 59 III INDICB DE TABLAS TABLA GmA P1 I Especificidad II Algunas III Caracter sticas IV Presencia de V de algunas proteasas caracter sticas de quimotripsina bovina quimotripsinas quimotripsinas cinØticas Constantes de para 12 en la de organismos 13 marinos 15 crustÆceos hidr lisis de quimotripsina bov ina 18 VI Caracter sticas VII CrustÆceos VIII Actividad IX Efecto de con de los serina tipos colÆgeno proteinasas quimotr ptica cetonas de que usando SAPNA 21 degradan colÆgeno como X Determinaci n XI Hidr XII Actividad enz del 22 sustrato de clorometilo sobre la hidr lisis SAPNA y azocase na lisis 14 36 de 37 de la actividad colagenol tica colÆgeno colagenol tica 43 44 de las preparaciones imÆ ti ca s 45 XIII Efecto de inhibidores sobre la actividad colagenol tica XIV Constantes cinØticas usando SAPNA XV Actividad enzimÆtica de fracciones de acocil americano 53 XVI Actividad enzimÆtica de fracciones de 54 como sustrato 46 langostilla 52 e 1 1 RBSUXEII Usando el nitroanilida SAPNA quimotripsina en pacifastacus y extractos astacus de tripsinas por sustratos encontr se de quimotripsinas confirm la de los de estos colagenasas de especifica extractos mayor bacterias y del quimotripsinas actividad a 0 283 roM 0 266 Y Y 0 crustÆceos tripsina 3 1 y acocil 6 Y de de P una roMjmin para las usando astacus y activaci n a a los para los P de astacus de purificaci n ligando de ce extracto cromatografia del 30 2 Se 39 821 con un las La actividad colagenasa 55 2 y crudos 6 veces su tipo mÆxima de ambos SAPNA P los en proteinasas Usando como fue planipes de factor de para langostilla un rendimiento de y y estos inhibidor con de Se respectivamente afinidad de proteinasas quimotripsinas obtuvo Se colagenasas Proteinasas 7 a enzimÆticos proteinasas tipo quimotripsinas tipo rendimiento pH Las bovina acocil americano exhiben proteinasas como Las de sensibles proteinasas planipes colagenasas Vmax de y 72 las P de langostilla de de soya un factor enzimas 271 enriquecieron serina son metalo fue pH 9 son las hepatopÆncreas el Km sustrato decÆpodos cuales catÆlisis son y exhiben extractos las no de decÆpodos inhibidores extractos los en diferencia A de quimotripsina para decÆpodos diferentes proteinasas tipo quimotripsina las que decÆpodos de tipo americano de de son p hidrolizado por es mecanismos colagenasas estudiados decÆpodos vertebrados de SAPNA crustÆceos y especificos presencia acocil y especificidad los que proteinasas tipo quimotripsinas inhibidores la en vertebrados ciertos los y extractos enzimÆticos Basados Pro Phe 2 actividad de hepatopÆncreas que Ala de presencia encontr Se succinil planipes de vertebrados quimotripsinas no la prob se Pleuroncodes langostilla pero sintØtico sustrato de purificaci n se 57 logr 66 un para 2 2 ABSTRACT Using nitroanilide in proven planipes that is SAPNA enzymatic decapod inhibition and and of extracts vertebrate and crustacean the but not chymotrypsin catalytic inhibitors specific collagenase metallo serine vertebrate like proteinases and 2 and highest activity for 77 P mM obtained were trypsin was yield of 3 and an like like activation proteinases planipes enriched inhibitor 1 with a yield 66 at 30 Km which are extracts are were a 55 respectively proteinases of Using oc and Vmax The for 39 like enrichment achieved 57 studied extracts at pH 7 and Crustacean of 2 of presence proteinases exhibited crude extracts ligando of some by 0 SAPNA 0 were 266 and 0 langostilla purification 271 like chymotrypsin purification as 283 mM by using affinity chromatography as on planipes chymotrypsin enzymes collagenases respectively astacus chymotrypsin with exhibited min for P proteinases soybean 6 pH chymotrypsin substrate and 9 at decapods of P astacus P affected The collagenase hepatopancreas than and mechanisms collagenases these crayfish chymotrypsin and extracts of Specific activity higher times 6 Langostilla both bacterial and was Based extracts of the enzyrnatic proteinases collagenases proteinases not were chymotrypsin confirmed in the was Unlike decapods bovine of It found to be different were Decapod chymotrypsin like proteinases was chymotrypsins trypsins by p langostilla decapods vertebrate by specificity substrate Phe pro 2 Pacifastacus astacus crayfish hydrolyzed Ala chymotrypsin like activity extracts hepatopancreas succinil substrate the presence of SAPNA Pleuroncodes found synthetic the with factor Crayfish factor of 821 3 3 XJlTRODUCCIOIII todas casi las estudios Los encaminados reacciones han permitido clasificarlas y tomar la n ventaja dietas de de peces enzimas las como sido ha cultivados 1975 Stroud estas regulan se de caracterlsticas sus estÆn organismos los propiedades las hidrolasas de de comprender a conocer sobre investigaci n formulaci catallticas protelnas controladas por qulmicas reacciones las enzimas por ejemplo aprovechada Divakaran la para ostrowski y 1990 La estudio de evoluci la conexiones entre particular el es secuencia de establecer relaciones œtiles en de catalizar o reacciones concentraciones m nimas ha sido 3 y pueden llevado El uso reducir los procesos a de las recuperar compuestos Tawiah y 2 no inactivadas despuØs Haard y redunda en operaci n de agregado 1987 caso Al especies como Cano t se xicas a ser fuente capaces bajas muy son deseado 1987 hacer prÆcticas eficientes Boyce Simpson et al Pueden algunos 1986 alimenticios productos y carotenoprote nas Lopez de indeseables evaporadores de permiten que el efecto ventajas al les activas son secundarias propiedades funcionales Haard El 1984 provienen 1 reacciones tales n Lehninger sustancias espec ficas limpieza valor modificar Manu de enzima una entre diferentes son son Simpson enzimas la el ser cabo costos como incrementar las y posibles las cuesti en al filogenØticas industriales microbiana y tambiØn de atributos de las enzimas que procesos animal vegetal organismo aminoÆcidos pudieron los aminoÆcidos citocromo C del la de analizan se de del comparar Algunos contribuido ha orgÆnica sistemÆtica estudiado mejor n secuencia la la y enzimas sobre investigaci n 1987 Haard de 1987 al o crustÆceos 4 enzimas Las utilizan se del sabor compuestos responsables alimento especial de de hidrolizados leche para becerros particulares de controlada y limitada la modificaci el rompimiento dichas de extremos tasa a glic lisis hidr en la la rÆpida de captura de el cual suma de la recuperaci n del de enzimas manejo de sabores que de la Carreæo Reece y el 75 por la en dicha de cambios actividad n de fase n como mortem enzimas end genas del la la carne post con los 1984 provoca la Haard que de 1992a tecnolog as 1988 pØrdida Haard utilicen los Existen de desechos de las en inclusi reacci una pescado exceso Nissen enzimÆtica en en el la lisis premisa amargos y de otros crustÆceos se y 4 hidr aromÆticos Adler mœsculo representan 1991 ademÆs aminoÆcidos control Garc a 1985 enzimÆticas catalizan del krill importancia Rak el 3 sustitutos una los atributos de calidad carne œtil es los cuales Hyeung en 1988 una es necesario eliminar prote nas las Osnes pesquer as problema influir Esta alimenticios es y 1976 organolØpticas de permitir an no enzimas autolisis del la captura las que de con actividad la alimentos textura en pequeæos casos 1982 resultado como de como y se que pept dica desventajas puede lisis aspecto la da pescado funcionales reacciones cadena preparaci n 1991 Nissen por ingredientes algunos indeseables Es la pØptidos como En altera de Estas prote nas la proteica propiedades presencia La Adler de et al Haj s de necesario es extracci n Yamashita et al prote na et al Baca prote nas n de 2 1992a esenciales propiedades obtener Para Haard la 1 en para fenilcetonœricos de aminoÆcidos enriquecimiento elaboraci n tambiØn otro es potencial 1993 desperdicios de las volumen total alternativas podr an de la como solucionar el 5 El de grupo proteinasas 1991 constituyendo bacteriano obtenci n Actualmente de proteinasas de procesos debe se El seguro que incrementan sugiere proteinasas una Østos con procesos Simpson n son realizado corno et al a la elaboraci 1989b cualquier para la cinØticas bajas n del de en viables para la convencionales de extracto usado en para de estos la probar estudios marinos obtenci alimenticia termodinÆmicas temperaturas de quesos que organismos industria y origen producto estudios candidatos potencial mÆxima no siempre requiere finales Carreæo alternativas fuentes que mayoria las son Garcia alimento para humanos tiene de de bacterias ha su fuentes por a total en son industria la en del 50 buscan parte caracteristicas eficiencia el interØs los costos 1992b que presentan uso se en elaboraci ser Haard El Østas empleado industriales proteinasas Las mÆs enzimas n corno œtil Shamsuzzaman y Haard de Estas œnicas requisito y en 1984 6 JUSTIPICACIOlf 4 winter trabajo poco comparaci n Es biomolØculas Zwilling importantes cuanto en termodinÆmicas adquiere a invertebrados crustÆceos en propiedades sus y estas De acuerdo insectos de diferencias fisicoqu micas comparaci n en de e existen que en mam feros para importancia gran existe que investigaci n comprueba catal ticas y de la que se seæalan existente sobre las enzimas 1980 Neurath y raz n invertebrados en enzimas sobre esta por 1990 Baumann y informaci n la investigaciones las 1970 reportado con bacterias a Neurath y las con de vertebrados La langostilla encuentra California con gran la en Rizo Por la 1993 D az potencial debido a su actividad Carreæo fuente para la obtenci n sin caracter sticas en embargo de Carreæo 1992a propiedades como una ademÆs de n las conocimiento langostilla catal ticas nueva caracterizaci clasificaci fuente posibles a n Carreæo la Al de las fisiolog a y se las sobre n enzimas y a cualquier prÆcticas 1993 estudiar recurso de podemos contribuir proteasas digestivas decÆpodo sus Garc a estudios espec fica de este una encuentran Haard realizar actividad implicaciones propiedades entender y que caracterizaci las es de investigar existente de proponer potencial extractos et para la industria por trabajo la Spinelli langostilla proteinasas Garc a antes clasificaci de las y n los en Baja explotado no 1974 se que oeste de recurso proteinasas sobre decÆpodo costa la queda El un Kato recomienda caracterizar 1986 Boyce las y de de las versa un 1992a langostilla proteinasas digestivas Es aun particulares extractos la proteol tica Garc a alimenticia es abundancia hepatopÆncreas potencial planipes continental de plataforma MØxico 1974 al Pleuroncodes de al la 7 5 AllTBCEDDTBS Proteinasas 5 1 5 1 Clasificaci6n 1 enzimas Las catalizan Dixon 4 de clasificaci la sobre Bioquimica dos peptidicos hacen conoce sobre Las les se de serina Las de llama proteinasas de catÆlisis en el serina clasifican sitio surge i diferencias pueden la enzima y proteinasas digesti n y 4 2 por la tanto del Xa y su 4 3 el grupo 21 24 de Existen enlaces lo que œltimas estas les se mientras que a las 1986 Barrett de acuerdo al mecanismo vez proteinasas poseen un residuo factor para a por estructura varios por el y et al como 1975 la diversidad sustratos los de Las del sitio activo de primaria procesos de la sangre 3 vulo todas arreglo espacial su quimotripsina Zwilling lXa tanto enzimas incluyen elastasa y el mismo al en coagulaci n n A 3 peptidasas especificidad participan fertilizaci ii de vertebrados es deberse lo a Enzimas que hidrolizan 18 y o tripsina e factor en 11 en que Internacional de proteinasas o las serina proteinasas trombina 3 que activo El mecanismo de catÆlisis enzimas 4 exopeptidasas se origen pancreÆtico hepÆtico 3 terminales ejemplo por Uni n la Clasificaci n endopeptidasas como de n hidrolasas son codificadas peptidicos internos enlaces tambiØn primeras i proteasas aminoÆcidos en enzimas reacci la a proteasas lo que estÆn por de n acuerdo Las Nomenclatura y de subgrupos 1979 peptidicos rompen enlaces 3 Webb y de clasifican se Las serina fisiol gicos reacciones espermatozoide 1 inmunol gicas stroud 1975 8 5 1 2 Sustratos La inhibidores e capacidad determinada desnaturalizadas Las para los Lehninger n pept dico enlace aparici n del compuesto Uno de los proteinasa reducci n la que de la actividad de lisis clasificaci n las enzimas acuerdo bajo irreversiblemente o a con residuo un los inhibidores naturales de de las veces consideran ciertos las en iones metalo prop sitos esta que Sin prÆcticos la Salvensen y Nagase de la los dos para de n en 1989 es tipos de aminoÆcido se Los el embargo determinaci n de 1989 del sitio quelantes son De de 1 se unen activo comportan de sobre inhibidores que la La sustrato activo y de Un tasa la actœan como trabajo Østos de espec ficos inhibidores como clase travØs a enzima el sitio que la Neurath forma complejos esenciales para proteinasas la fluoromØtricos disminuye que sustratos clasificaci son enzima proteasas pseudo como uni n medido directa determinar sustrato depende espec ficos simulando esta ser inhibidores un existen 1989 peso molecular hidroliza para una sobre los sustratos formados por cromogØnico grupo para 1984 usando de inhibidores Neurath a un aquel compuesto es la pequeæas usados estÆn espectrofotomØtricos pertenece enzima una a proteinasas principales a enzimÆtico inhibidor hidr mØtodos son propiedades y sintØticos desprende puede se Fritz et al electroqu micos sustrato por enzima la mØtodos empleados o importante ventaja una sustratos unido que ser nativas hidrolizar de concede actividad de Cuando indirectamente por o Los el cual estÆ aminoÆcido comœnmente especificidad de la puede prote nas de capacidad hecho 1984 proteinasas las polipØptidos la este de estudios la cuantificaci un tienen sintØticas cinØticas un varios y proteinasas molØculas de sustratos Algunos case na lisis degradaci n la por hemoglobina hidr de 2 la mayor se no solo eliminan de catÆlisis empleados clases de para proteinasas 9 5 proteinasas 3 1 enz imas Las ingesti n la suministro fica hÆbi tat bacalaos los 5 difieren enzimas 15 oC Simpson tropicales peces el En proceso combinados efectos hepatopÆncreas proteasas 5 1 es tubo al Relaciones 4 De Haºn tripsina et rgano especulan 1975 las secuencias tridimensionales los evoluci animales clase de inferior i e los ancestro al 1975 la n de ej emplo los entre la de se encuentran algunos El 1982 secreci n la de 1979 La en zim genos en las una se el y de y tard a se de el curso proteinasas desarrollo proteinasas proelastasa propiedades durante ni veles de un estructuras sus diversas al de las similitudes en serina las gracias serina etapa basa proteinasas partir a sustrato organismos los quimotripsin genos tripsin geno por logr se de surgieron adquirido especializaci n superiores serina aminoÆcidos de especificidad las que suposici n esta Estas enzimas han proteasas Los dependiendo Gibson Barker elastasa y encontradas la digestivas filogen6ticas 1 de crustÆceos responsable Fig a patrones 1992 los y red la encuentra se enzimÆticos Gibson digestivo quimotripsina respecto de y ancestro comœn con Por mientras que Dittrich oC mecÆnicos al en cataliticas actividad mÆxima digesti n de enzimas Las la vida en demandan pertenecen 1989a de especie la adaptaci n 1992 que et al el es al cuya 25 a de de ademÆs estrategias propiedades sus en organismo del poseen y Dittrich especificos ambientales posici n la con intermedia entre controladas por el Son Diferentes organismo estrechamente proteoliticas del condiciones las y acci n una asimilaci n su los procesos evolutivos de y enzimas de comida del relacionadas tr digestivas desempeæan del alimento y de genØtica digestivas de en esta organizaci n de vertebrados desarrollaron de evoluci n De Haºn un et 10 Protromina Tripsin geno Ancestro proelastasa B tripsin geno Quimotripsin geno Proelastasa Desarrollo la Figura 1 proteinasas de vertebrados Zwilling terminal Ellos de de similitudes griseus winter y aislar enzimas como Neurath caracterizar las relaciones comparada directrices determinaci n invertebrados e bacterias de Astacus de 1970 de Ellos de evolutivas comœn larvas realzan en de los Phyla Estudios mÆs comparaci n moleculares pero se los dan organismos tripsinas una para y estrella no de inquirir solo por completos involucran primeros en mÆs importancia la las streptomyces sus invertebrados entre investigaci n pesos en de Estos leptodactylus entre existen que las como amino leptodactylus evolutiva y serina las 1975 secuencia la purificaron tripsina proteasas entre et al Astacus distancia gran trochelii niveles moleculares de las europeo 13 residuos de aminoÆcidos y anatom a una de zlmogenos de Haºn caracterizaron acocil vertebrados Evasterias mar hay que entre a del de Adaptado 1975 crustÆceos y tienen de 9 sobre al tripsina concluyen tripsinas de et familia A la avances sobre caracterizaci n especificidad por sustrato y 11 cinØticas propiedades posterior dado que secuencia La se requiere aminoÆcidos de de cantidades es un estudio mayores de muestra pura S 2 5 2 Quiaotripaina Propiedades generales 1 quimotripsina La proteinasa de las EC 3 formas 4 aromÆticos que Østa i I Tabla El el de se B Y C Phe Tyr ser de de la de soya Lys y Worthington y de En la la de II los de se quimotripsina enlaces que seæala carboxilo e En de algunos bovino fosforados TPCK resumen bovina 1988 por junto la Esta los enzima inhibidores naturales organo i tripsina algunas proteasas pÆncreas pesados compuestos Tabla la existencia endopeptidasa diferencia de la 1972 quimotripsina papa una Baustert et al Arg cetonas de cloro metilo 1971 importantes Se Trp inhibida por metales es serina una el extremo carboxilo de aminoÆcidos en especificidad la como reportan 1979 enzima preferentemente como muestra o clasificada Webb Esta peptidicos e manual diferentes et al Dixon y bÆsicos inhibidores puede 1 hidroliza aminoÆcidos encuentra 21 A hidroliza enlaces se las ZPCK y asi como como ZAGPCK por Segal caracteristicas mÆs 12 Tabla ESPECIFICIDAD PROTEASA CLASE I DE ALGURAS REACCION PROTBASAS QUE F pepsina AspÆrtico A CO f NHCHCO serino Quimotripsina CO CO Serino Elastasa serino CO f R R I I NHCHCO NHCHCO R R I I NHCHCO NHCHCO f A Metalo CO NHCHC02 Carboxi f peptidasa B Metalo CO R I I cisteino Hidrolasa CO Aminopeptidasa a NHCHCO NHCHCO f f NHCHCO aminoacil pro Sitio de hidr Adaptado lisis de Dixon y Webb 1979 y Phe R Arg Lys R Tyr Cheng Leu Phe Met Leu A la R Gly Trp Ser R Val Leu Ile Ala Tyr Phe R Arg Lys R Arg Lys NHCHC02 R Papaina Tyr NHCHCO NHCHCO Carboxi peptidasa R NHCHCO F Tripsina CATALIZA 1992 NHCHCO Phe R Pro 13 Tabla ALGUDS lBRISTlCAS CUAC 11 DB BOVID gUDlOTRIPSID ZIMOGENOS PROPIEDADES A Peso molecular 25 Punto isoelØctrico 9 1 a lT activadas Formas Estabilidad Activadores ptimo pH Datos tomados 5 2 000 de Wilcox 1970 Ramakrishna y 26 000 5 B 3 pH B 2 T 1T 10 4 10 Ca2 Ca2 7 7 5 et al 5 5 1987 Distribuci6n 2 los Entre quimotripsinas insectos La orientalis Vespa mØtodos de Zwilling 1990 con 1980 de estas con la del tal de la para al avispa que los mam feros aislamiento lo Aedes han sido muestran se lo por como mosquito 111 B usados quimotripsina Tabla y llegado quimotripsinas proteinasas En ha A de presencia quimotripsina los a la de bovina la Se actividad de marinos a duda de la similares son diferentes Enzimas organismos parecida es Neurath caracterizaci n existe especificidad ensayo y no y hizo Baumann aegypti reportadas algunas en sus caracter sticas A ha partir desarrollado quimotripsinas mientras que Tabla IV se primeros de los controversia una en otros muestra estudios de Gates y crustÆceos no Algunos encontraron un metodologlas empleadas resumen sobre la en 1969 presencia autores actividad de los Travis sus las de se las reportan ensayos organismos investigados En y la las 14 Tabla CUACTBlUS rZCAS DB III QUDlOTRJ PSDmS Formas Organismo ORGUlSIIOS DRDlOS Punto Peso zim genas 17 pH isoelØtrico molecular B Ba1enoptera physa1us DB tinD q 000 Ballena de aleta 5 Onchorynchus tshawytscha Salm n chinook A Metridium seni1e AnØmona 7 Squa1us acanthias 6 Tibur n Pisaster ochraceus Estrella Gadus morhua Bacalao del Datos 1987 de 22 800 26 000 6 2 5 8 de mar morada AtlÆntico Wilcox Farrand 1970 y Kolodzeiskaya Williams 1988 et al ˜sgeirsson 1988 y Ramakrishna Bjarnason 1990 et al 15 Tabla IV PRBSBBcn DB ORGANISMO Penaeus gUDlOTRJ PSJDS ACTIVIDAD REPORTADA SUSTRATO BB CRUSTACBOS INHIBIDOR REFERENCIA NO BTEE ATEE Gates Penaeus kerathurus SI SPNA Galgani Penaeus monodon SI BTEE ATEE TPCK Jiang et al 1991 SI SAPNA ZPCK TPCK ZAGPCK ZAGPCK Tasai et Tasai Tasai et et al al al 1991 1986a Penaeus setiferus Macrobrachium monoceros japonicus Euphausia superba 1969 et 1984 al 1986b SAPNA SI SAPNA ZPCK TPCK Tasai et al 1986a SI SAPNA ZPCK TPCK Tasai et al 1986a NO SI BTEE BTEE NO SI SI SI BTEE BAPNA BTEE TPCK Hemoglobina TPCK rosenbergii SPNA SPNA Chen Travis SI penicillatus Hetapenaueus Penaeus BTEE y 1991 al et al 1988 Galgani 1984 et Galgani 1985 Osnes Kimoto et al Turkiewicz et Kimoto et al 1985 al 1991 1986 Azocaseina Lithodes aequispinus Paralithodes brevipes Paralithodes multispina NO Neolithodes nipponensis Paralithodes SPNA Galgani y Nagayama 1987a camtschaticus Geryon affinis Chionoecetes japonicus NO BTEE SPNA Galgani palinurus japonicus NO BTEE SPNA Galgani Callinectes sapidus SI BTEE Homarus americanus SI Astacus Astacus fluivialis NO leptodactylus Cbz Glt 2Gly Arg 2Gly Phe TPCK Na TPCK Na TPCK Nagayama y y Nagayama 1988 1987b 1987 Dendinger Clark et al Zwilling y 1991 Neurath 1980 16 Osnes 1985 de evoluci n nivel quimotripsina de propone el en elastasa y organismos superiores Por superba hidrolizan gran nativos sustratos Existe cuanto la a organismos acti vidad de hidr lisis f rmula R como de Tyr R y furil acriloil naftil naftilamina En se 2 basa AA o 1988 en de aparici n Phe X grupo embargo sobre este y acocil en de grupo ha se TPCK Carreæo de existe luz no en emple se Garc a ser encontrado inhibidor como 1993 Haard o 1984 carbobenzoxi ser as etil como por la propone la y sintØticos sustratos puede degradaci n azocaseina Geiger benzoil X medida por la case na para diseæaron Baustert et al a Euphaus a de succcinil 3 o nitrofenil metil amino R Donde nitroanilina grupos metilcoumarino para ensayos por fluorometrla la hidr Debido los quimotripsinas tiobenziloi ester o cuando sintØticos acetil El de pept dicos langostilla tampoco hemoglobina sustratos X sin quimotriptica puede representa residuos 2 la de ensayos para proteinas un proteinasas proteinasas quimotripsina sustrato como La actividad de de caso azocase na proteinasas las sobre 1980 de quimotripsina 3 MØtodos 5 2 el las en tripsina combinadas variedad de enlaces Nerauth y ocurrencia En ejemplo serina funciones las con digestivas Las separado bibliografia numerosa enzimas encuentra se caseina como Zwilling europeo usando una han no se crustÆceos las que organismos cumplen estos los que lisis que el Øste de un producto compuesto un fluoromØtrico que peptldico unido enlace de la hidr es mØtodo lisis es parÆmetro un compuesto al fluorescente de la la actividad enzimÆtica Los mØtodos quimotripsina se mÆs basan comunes en para la hidr cuantificar lisis la actividad de sustratos ester de etilados 17 unidos aminoÆcidos a del BTEE al El 1991 ATEE 1984 Geiger continuamente et DelMar quimotripsina los que de mayor eficiencia El œnico embargo hidr no lisis La en tØrminos Km sustrato con mayor es usado pH neutro a reacci n quimotripsina es que en ocurre con Kcat la sigue se este que para sustrato es mayor eficiencia Las constantes exhiben SAPNA con una Tabla V kcat Km que SAPNA rutinarios reduce en internacional sus trato nuevo una obtenidas ensayos lo que un tradicionales y et 1991 quimotripsina bovina lisis Jiang ATEE del demostraron sustratos hidr 1959 Hummel lisis et al Ellos quimotripsina la tasa de nm sintetizaron 1979 la 256 hidr de Jiang SAPNA por catalitica tasa nm al el hidrolizado cinØticas 237 a ejemplo sustancia de referencia una es La a Por continuamente sigue se aromÆticos la hidr la por utilidad lisis el ATNP es sin limitada del sustrato del SAPNA por la siguiente la quimotripsina Suc Ala 2 Pro Phe 4Na H20 Suc Ala 4 La liberaci n continuamente de la prueba tripsina a 410 de nm grupos Geiger 1984 nitroanilidos da los 0 03 del sustrato pro Phe nitroanilina se registra limites de detecci n siendo sensible hasta 1 ng de enzima solo hidroliza 2 mientras que la 18 Tabla V I COBSTM1 BS CXBBTXCAS PARA LA Km Sus trato JaDROLISIS gUDlOTRIPSID Condiciones kcat Km kcat 1 mM POR 1 s s 1 mM del ensayo SAPNA 0 043 45 0 10 x 105 Acuoso ATNP 0 002 30 5 15 X 106 3 2 acetonitrilo ATEE 0 700 193 0 3 x 105 1 8 acetonitrilo SATNA 0 160 14 1 7 BTEE 0 500 19 BTNA 0 340 APA 8 000 6 60 40 000 30 0 88 2 600 9 1 130 0 30 2 000 1 ATNA 1 13 O 0 30 300 Acuoso GPNA 0 280 0 013 46 Acuoso SPNA 0 720 0 011 15 Acuoso Adaptado de DelMar et 3 Colagenasas 5 3 1 Caracter1sticas colagenasas nativo colÆgeno Son activo y al clasificadas un segundo activo I metal tipo Estas requieren en el de Zn2 para DMSO 4 3 4 degradan Ca natural crustÆceos En con el y un grupo colÆgeno Sakharov y en el se estÆn ha encontrado serino 1990 sitio Klimova et bacterias nativo Litvin fibras de insolubles colÆgeno vertebrados 24 son Zn2 contienen hidrolizar el de colagenasas o estado su dependientes grupo tambiØn iones en que colagenasas Las acetona enzimas capaces de solubilizar requieren calcio 1990 7 generales son tipo proteinasas metanol 1979 al 5 Las DMSO en tipo el sitio I pero no 19 De colÆgeno acuerdo por helicoidales o la a Bracho acci n triples desnaturalizadas Haard y de las llamados pueden ser 1990 colagenasas TCA y TCs atacadas hØlice al romperse la forman dos se hØlices Las por otras de productos hidrolizadas proteasas Fig 2 JI Cadena intacta Acci n hidrolitica OvWv 9v ov Colagenasa vertebrados bacterias Rompimiento de hØlice Serina Romp Serina proteinasa proteinasa verte rados intacta crustaceos iento de hØlice Cadena I Hidr6lisis y o Desnaturalizaci6n 1 Gelatinasas otras serina J proteasas Figura 2 Etherington Degradaci n 1987 f1 del colÆgeno r l f t 1 1 1 1 1 1 l Adaptado I 1 1 r 1 de Bailey y 20 Los susceptibles ciertos tanto EDTA 5 serino cationes EGTA Y 1 polipetidicas helicoidal Gly X K hn 1987 intacta forman toda doce tipos Bailey diferencias clasificar Fibroso III de 1987 en opina longitud No basÆndose Tipos fibroso de colÆgeno 1 11 y requieren como el de crustÆceos y de tienen algunas la las por PMSF de final la la VI Pericelular Tipos Tipos V VI se la primar a muestran propiedades colÆgenos macro mismas atacan secuencia Tabla colÆgenos estructura repetidas las de surgen por las helical triple regi n estructura una secuencias sus de unidades tres especificas en En tipos Los de general tambiØn molecular II Matriz el como IV Microfibrilar de agentes quelantes colagenasas que los su 1990 lo Juntas forman colÆgenos final en hidrolizado por inhibidores variaciones Las familia macromolecular uni n II una la cata11tica helicoidales al no verdaderas Las as1 no Bracho y Haard colagenasas estructura cadenas regiones triples Y y son cadenas alfa estas triple ser son tipos y caracterlsticas una llamadas triple hØlice los tiene Las puede actividad la colÆgeno pero bacterias y afectadas por son estructura colÆgeno proteasas aspÆrtico inhibidores de molØcula otras para fenantrolina 10 la vertebrados divalentes SUstratos 2 El l de naturaleza serino 3 por cisteino y principales sus de desnaturalizado colÆgeno colagenasas Las su El proteasas por rompimiento de nativa cadena terminales pØptidos V IX XI Y VII X y XI tamaæo se y su pueden 21 Tabla CARACTER STICAS VI DE LOS TIPOS DE COLAGENO ESTRUCTURA TIPO I Ir TAMA O S UPRAMOLECULAR Fibroblastos osteoblasto 300 Fibrillas Condrocitos 300 SINTESIS nm Piel bandeadas de nm Pequeæas 300 Fibroblastos Pequeæas nm 390 No nm tend6n hueso nm cart lago 67 nm humor v treo Piel fibrillas bandeadas de IV 67 fibrillas bandeadas de III LOCALIZACION mœsculo 67 nm Todas las membranas fibrilar basales Mioblastos V Pequeæas fibras La mayor a de los te jidos intersticiales CØlulas VI 150 VII 450 nm nm Microfibrillas fibrillas bandeadas La O meros Fibrillas de mayor a de los te j idos intersticiales fijaci6n Algunas cØlulas VIII endoteliales 200 IX Cart lago nm mineralizado X 300 Adaptado Se de Bailey Pequeæas nm Cart lago fibras 1987 desconoce las caracter sticas del colÆgeno tipo XI Y XII 28775 22 5 3 oistribuci6n 3 En una los acci n crustÆceos de digesti n las de mam feros que VII se se encuentran muestran las proteinasas colageno11ticas involucran mÆs que de Klimova et al 1990 principalmente algunos morfogØnesis en crustÆceos el en comparaci n Grant et al que poseen por lo 1981 hepatopÆncreas En con la Tabla colagenasas tipo serino Tabla VII l CRUS ACBOS QUE ORGANISMO Paralithodes camtschatica COK SBRXD PROTBIDSAS DBGRADAlI COLAGBIIO REFERENCIA Klimova et al 1990 1988 Sakharov et al 1990 Sakharov y Litvin Uca pugilator Panulirus Grant et al Eisen et al 1981 1973 Iida et al 1991 Erimacrus isenbeckii Iida et al 1991 Penaeus monodon Chen et al 1991 Euphausia Turkiewicz japanicus s uperba et al 1991 23 5 3 M todos para determinar 4 Cawston y acci n de la que la las de proteinasa peptidico 1981 Murphy tiene una limitado Este el en extremo amino de dejando algunos cadena Es por esta mayoria de los 1 Ile Gly o en sugiere particular ventajas provee colagenasas un rompen punto especifico tres a enlace cuartos del con rompen residuos raz n lisis del la cadena no pero ya el que deben colagenasas colÆgeno alfa del el I es en la nativo colÆgeno atacan tipo basarse colÆgeno de la para la resto usado ensayos Hidroxiprolina La detecci acci n la sistema de un ensayo ser del reacci n colÆgeno demasiado por 16 colagenolitica colÆgeno a pH es neutro determinada por y 37 a oC usado cuantitativamente por la determinaci solubles productos Macartney sencillo de debiendo largo horas en Tschesche y relativamente mØtodo es de hidroxiprolina de rompimiento ser n de la actividad rompimiento puede contenido 2 Las Esto molØcula de vertebrados colagenasas I Leu de la enzima sobre la hidr especificidad tipo la Gly un rompimiento colÆgeno del ensayos de actividad Los Las enlace para colagenolitica las tres cadenas de la hØlice fragmentos producto caracteristicos son especificidad para determinar la actividad usualmente colagenolltica establecen que los colagenasas la hØlice de actividad 1984 efectuar incubar s e de Turkiewicz et al Este n del por el A pesar el tiempo mezcla la de del de 1991 Viscosidad La disminuye longitud viscosidad hidrolizarse al de intrinseca la molØcula monitoreo directo del de Østa Este una debido fen meno rompimiento suspensi n La a la provee colÆgeno de reducci de un mezcla de reacci n de mØtodo n se la de puede 24 analizar electroforesis por identificar los terminales TCB poliacrilamida de gel amino terminales fragmentos Harris en TCA de para carboxilo o 1982 y Vater Radioactividad 3 Este se ensayo basa colÆgeno de degradaci6n la en marcado radioactivamente 14C Gly despuØs centrifuga se determinado 14C un los diseæado residuos metodolog1a colageno11tica hØlice que del pueden al se ser 4 Espectrofotometr a esterasa o marcado amidasa cuando 328 nm a al menos proporcional Sakharov y a mÆs la por por del 1990 los grupos esta ensayo ya los de de que la actividad rompimiento productos TeA SDS PAGE de la TCB y Welgus procedimientos complicados et por colÆgeno sigue se dar anÆlisis el monitoreo emplean cinco de la actividad sustratos sintØticos El de incremento minutos la concentraci6n de Litvin de Este colÆgeno verificar que el al de p nitroanilida La tasa es liquido conf iable ocurrido para procedimiento liberaci6n seguido lineal y del las liberado acetilaci6n una enzima encuentran se material de la con de vertebrados embargo requiere purificaci6n Este es lisina distinguidos Sin 1982 la de ha la en Involucra comprueba colÆgeno sobrenadante de centelleo espect6metro para colagenasas Esta el incubadas son cantidad La anhidro acØtico de NH2 en colÆgeno en y hidrolizadas cadenas e fibras de Las aumento en de la enzima ser Grant basa absorbancia la absorbancia para Se de debe es ser directamente et al 1981 25 5 Fluorometria fibrillas Las fluorescentes al fluorescamina colÆgeno de Tschesche y sustrato este marcadas son 1984 Macartney complejo no registrada de tiempo especial 6 A 1982 lisis Ile de los permitido 2 octapØptidos similares a que pero La actividad es fluorescente por unidad de requiere emisi n de la equipo fluorescente de los uso especificos I II y colagenasas puedan usarse sitios autores de con para las sintØticos secuencias de hidr Tschesche no lisis para hexa ha se u aminoÆcidos Masui Macartney y en este por derivados son de estos sustratos ya que realiza vertebrados naturales de como se Harris y Vater III compuestos compuestos dinitrofenilos de polipØptidas cadenas colÆgenos tipo Estos Algunos 1977 et 1984 comprobado que colagenasas Ninhidrina Este las 4 las cuestionan el 7 n lisis exacto mØtodo las tres enzimÆticos ensayos sean en especificidad La un determinaci la Gly enlace ha al ser acopla sintØticos hidr el enlace de pesar para Sustratos La incremento de la emisi n por el Se fluorescente es s1 la fluorescamina liberada durante la hidr molØculas con es aminas ninhidrina utilizando bacteria un mØtodo liberadas En 1953 colÆgeno Clostridium colorimØtrico durante la hidr Mandl et al nativo para que se lisis basa en que la detecci reaccionan desarrollaron este la hystoliticum detecci n de n con de la procedimiento colagenasa de la 26 6 1 de l OBJB ZVOS Diseæar ensayo proteinasas extractos 2 un con Caracterizar las del colagenasas de estos pH en velocidad proteinasas v quimotripsina y presencia colagenasa en la los en planipes y extractos de actividad crudos Pacifastacus f sicas actividad de la del astacus termoestabilidad las quimotripsinas e y extractos mÆxima g detectar la proteinasa responsable propiedades Comparar las propiedades y de permita decÆpodos de Pleurocondes Caracterizar que quimotriptica influencia Km de la clase de y hepatopÆncreas 4 actividad enzimÆticos colagenol tica 3 experimental en catal ticas los de crustÆceos de estas extractos y P vertebrados proteinasas planipes con como otras 27 7 DTBRDLBS y IIBTODOS 1 7 Fuente de enzima salm n chinooki Extractos del fueron el emple Se ciego proporcionado comprados Crayfish a California laboratorio Se parcialmente homogeneizados homogeneizador someter el a El lipidos 1 mI a 7 2 fue 70 a un centrifugada a sobrenadante segundos a Estos 2500 acuoso al fueron velocidad por baja un complet al segundos La se cinco por hielo con homogeneizaci n Polytron fueron Sacramento hepatopÆncreas La blender hepatopÆncreas preparaci n los Waring 10 americano recipientes en los por Garcia Carreæo a Association Marketing extrajo les acocil washington langostilla planipes acuerdo de vivos tshawytscha Universidad de astacus transportados y Onchorynchus la por preparados y Pacifastacus Los de de Pleuroncodes hepatopÆncreas proporcionados 1992a pil rico g por 20 minutos para fue almacenado alicuotas de en remover oC Reactivos Pharmaceuticals Inc b Inhibidores PMSF c Enzimas control pancreÆtica porcina d Amortiguadores e Reactivos f Varios albœmina TLCK a y bovina los obtenidos de tend n TPCK ZPCK EOTA colagenasa TES de aquiles 1 y de Clostridium Bio Rad ninhidrina reactivo etanol Co usados si no SOS fueron se en bovino fenantrolina tripsina bovina histolyticum CA Richmond propanol de Bradford y reactivos Chem 2 10 Richmond Bio Rad ICN Hammersten quimotripsina pancreÆtica Tris y Sigma caseina England Bucks para electroforesis TCA Todos azocaseina SAPNA Sustratos Æcido Bio y MPM clorh1drico Rad grado especifica CA anal1tico otro proveedor y 28 de 7 3 cuantiticaci6n cuantificaci La enzimÆticas Este se rojo la proporcional es a lo es que uni n la con preparaciones El un coomassie de contenido de registrado prote na 595 a El nm alto coeficiente de extinci utiliz Se 1976 Bradford del reactivo azul del color sensible muy de mØtodo prote na intensidad la las para el de color colorante tiene complejo prote na por prote na empleando cambio el en azul por a de n realiz se basa protelna albœmina bovina n como estÆndar 7 a Actividad 4 25 quimotrtptica Los ensayos de la actividad fueron realizados oC La hidr absorbancia 0 CaC12 M enzimÆtica minutos 410 a 01 7 8 SAPNA 0 le se II anexo se 490 mI registr se el de A nm pH y En lisis registr de SAPNA adicion encuentra se 0 10 absorbancia la los el como 02 mM l de triplicado por incremento de en la Tris 1 M preparac10n continuamente diagramas 0 por flujo de cinco de los experimentos porcina la langostilla El una de adicion hora como se cuales del l de despœes a y PMSF con los actividad remanente de extractos A 50 sobre l de las inhibidor se Las anteriormente solventes de se la Se hepatopÆncreas de como hidr Se determin de lisis la de mezclas fueron se incubaron los inhibidores se incubadas por usando SAPNA controles con El de de enzimas se la actividad incluyeron SAPNA metodolog a preparaciones registr preparaciones enzimÆticas destilada y control de salm n modificaci n una de lo cual describi las TLCK 1992b 5 los tripsina americano acuerdo Carreæo de bovina quimotripsina ciego pil rico y lisis acocil y efecto cuantific les hidr de actividad estÆndar como registr Garcia la ensay Se 5 en los l de agua porcentaje de considerando la actividad obtenida 29 el en ensayo control actividad residual disolvi se 0 en la y M de HCl 3 pH inhibidor del ensayo concentraci n La 1 100 como final del PMFS 20 fue de 10 mM Y TLCK fue disuelto mM la como 2 en propanol La actividad enzimÆtica especifica absorbanciajmin Se registr enzima la de anteriormente Se de extracto tienen al mM Y mM pH 7 en et usaron como en metanol y ZPCK 5 Actividad en oC 25 azocaseina TeA 20 6500 g a Y Tris Para La La los la efectuaron 50 mM un reacci reacci 60 n agregando pH mM 7 ensayo 0 a n pertenece El describi bovina quimotripsina mgjml lisis 1984 se ya estos que Kolodzeisikaya et usados fueron TPCK 5 amortiguador en 5 de fosfato 50 tipico fuÆ el TCA bovina y sustrato Garcia Carreæo 10 preparaci n por detenida por se de la la a adici 440 adici ciego pil rico Tris 0 adici la centrifug registrada antes l de amortiguador iniciada La mezcla utilizando 2 proteolitica como 240 mI de fuØ fuØ minutos absorbancia quimotripsina testigo quimotripsina 5 la que Geiger digestivo ensayos de actividad enzima fueron adicionados a 1 hidr proteolltica 1993 Haard 5 0 a como con salm n de sistema su proteinasa controles la 8 de azocaseina us Tsai proteina sobre realiz se inhibidores de Se hicieron 7 de quimotripsina n ciego pil rico Los 50 mM de inhibici quimotripsinas 1988 la clase de actividad con procedimiento y miligramo por unidades de actividad influencia de inhibidores la del SAPNA para verificar 7 como 1986a al y expres se de de por nm n n n Los 5 M 0 mI mI de 5 minutos blancos del sustrato de salm n pH 5 0 5 de 1 mg ml y a se se como 30 registr Se siguiendo de azocase1na Previo 1992b enzimÆticas 0 235 mI reacci n influencia de inhibidores sobre la al la hidr de lisis fueron incubada por 60 minutos de amortiguador de los inhibidores fue 0 de 5 5 JJ l de final Mm inhibidor la en TPCK para Carreæo preparaciones las con concentraci n La hidr6lisis descrita por Garc1a metodolog1a ensayo la y en mezcla de 0 de 1 Mm ZPCK 7 6 Electroforesis realizada Fue poliacrilamida de corrida fueron diluidas de de acuerdo al acrilamida 1 4 preparaci n de acuerdo el peso molecular en de las en cada los Fueron La electroforesis fue realizada mA 90 minutos 7 por 10 oC para las zonas a y revelado de electroforesis de la muestra de Garc1a geles en gel a de los Inhibici6n Las 5 a por en 50 condiciones Las muestras Fueron de fueron 5 JJ l colocados colocados marcadores de en los corriente constante de 15 a gel de actividad efectu DespuØs de permitir enzimÆtica la 2 que el 25 OC Tris en sustrato reducida La la procedimiento el electroforesis las fracciones activas fue a de proteo11tica siguiendo mI de case1na al oC para geles en se 1993 actividad proteico incubaci n 6 2 et al 30 minutos 5 por el Carreæo fueron inmersos sustrato 7 cada 12 ziaoqramas 6 1 El 7 usando para comparar diferentes bandas geles de geles en 1970 las y 1970 de muestra placas placa geles Bio Rad amortiguador preparaci n esta a proteasas sistema de Laemmli La en de separaci n una 50 mM se pH difunda del digesti n propiciado los por la por 90 minutos gel preparaciones electroforesis durante enzimÆticas una hora con se incubaron 5 JJ l de TPCK 5 mM antes ZPCK 0 de la 5 mM 31 10 TLCK las mue mM PMSF Y tras zimogramas 20 mM indic se como realizaron se inhibidores Los los en l de 50 a actividad de ensayos describen como aæadieron se Garc1a Carreæo Los et al 1993 DespuØs la de destilada agua sumergirlos acØtico tinci n en acØtico 7 Este mØtodo no absorbancia puede nm produce y de realiz Esto a 50S en y por de de 40 y prote1na por en un del permite en 700 tipo que nm 30 a 5 mI se la cantidad de reactivo registr triplicado la si colÆgeno no se forme de cantidad es un otro como un de de 50S de Bradford absorbancia adiciona la 50S mientras que disminuye color color prote na verde que que por del que debe se s1 mismo registrado dependiendo dos comparable de SDS aquel se de tipo de Bradford g muestra de 50S 50 El reactivo 1976 magnitud formaci n La de embargo orden de colÆgeno la 1981 cantidades pequeæas el ensayo estÆndar determinar 0 a et al sin variable y el monto mÆximo de Para muestra IJ g menos resulta SDS color varia SOSo al registrado es per odo El de metanol por Bradford colÆgeno prote1nas para de ser adicionar no con muestra que posea tanto adici n n cuantificaci n la en colÆgeno magnitud ordenes de basado implementada de aumenta detecci n todo de Duhamel reacciona muestra una en una estÆ metodolog a de Bradford Æcido 40 250 al aproximadamente despuØs soluci en una teæidos en colaqenolltica 1 Modificaci6n del medio de geles lavan se y metanol de comassie R cabo por dos horas los fijados son conten1a que geles 10 7 La a n de azul 1 lavaron se 7 Actividad la 0 fue llevado 7 a soluci una Y del sustrato los lisis inmediatamente e 10 las cuales Æcido hidr a 700 lote de que debe agregarse a una de 10 a 100 se a le 700 agreg nm El ensayo se 32 La determinaci triplicado bajo suspendieron n siguiente el 1 en de la actividad mI 25 conteniendo 0 35 mM de inici 1 la adici por mg ml reacci n n sobrenadante de l de la soluci cinco traslad se horas 4000 a g detenida al someter la mezcla de Oc fueron obtenidos por la incubaci n del tambiØn enzima se suspensi n de describi para determin l de la Bradford 7 se adicion le de los registr la describi 0 agreg mI enfri Los de a de 1 etanol soluci 5 blancos fueron suspensi n en tambiØn incub de la adici suspensi n describi al temperatura se y Hyeunq se n de para 50 a Oc 100 de las centrifug agit se y ambiente y obtenidos amortiguador y se la colÆgeno las soluci se n en de reacti vo de del de ensayo soluci La midi ninhidrina combinaron soluciones de prueba y se n la 600 La Justo enzima trataron fuØ mezcla a Se agreg se colÆgeno separados de g por cinco por cinco horas tubos como horas enfriarse se se 20 4000 Esta de se A 25 realizaron tubos a mezcla incub La 1991 vigorosamente la por de la por cinco a absorbancia la por cinco horas de despuØs y fue como incub se ninhidrina de n n 1981 a Rak colÆgeno 2 mI del sobrenadante se traslad calentada por 15 minutos mI n mI 1 700 nm del del separados se y a DespuØs de reacci la mezcla minutos y 1 lisis anteriormente incubaci n 5 1953 et de blancos Los trat n mI Posteriormente SOS agreg se absorbancia condiciones de hidr Las 2 cuales de 2 amortiguador se y prueba g 0 se soluci reacci tubos en de Duhammel 30 K6todos de Kandl et al 7 2 se por el mØtodo prote na despuØs de en n mezcla y se 7 5 pH en la La colÆgeno 1 La reacci por 15 minutos combin se soluciones las se enzima y M de enzima ensayo cinco horas por colÆgeno muestra minutos incub 1 por tipo colÆgeno cinco minutos por 100 a n realiz se incubaci n de tubos a de mg amortiguador TES O 37 Oc por 20 minutos a de 25 centrifug se 6 esquema CaCl2 de DespuØs colagenolltica en se nm la enzima antes y la como se 33 La actividad por mg de 600 nm Actividad 7 8 lanqostilla La proteina que de con PMSF los con el mØtodo de mM n colÆgeno hepatop6ncreas 2 en DespuØs se de Rak sobre pH descrito la ensayos de 20 mM 10 indicada la hidr la por lisis del 1 Y la final es incubaron durante realiz 1991 pertenece que EDTA propanol concentraci n La la a realiz se Las enzimas se Hyeung del el metanol en inhibidores Efecto 9 a muestra los extractos de en clase de enzima la 2 la mezcla de reacci con 7 n hidroliza fenantrolina 4 mM en de la soluci n absorbancia la como acocil aaericano y inhibici n expresada de la colaqenolltica determinaci proteinasa fue especifica una hora colÆgeno anteriormente quimotrlptica actividad y colaqenolltica Se y del colÆgeno emple El registr un influencia del pH sobre la hidr las con 1989 En el cubre enzimÆtico expuesto 7 es de 4 empleado amortiguador intervalo metodologia intervalo de pH amortiguador Stauffer la a 10 para en los 1 apØndice desde pH a una 2 misma de a del SAPNA 1953 al Se ensayo de las actividades el fue ensayos se et Mandl lisis muestra 10 su lo por composici n descrito el composici n que Este extracto el de sales por en todo el pH 10 Termoestabilidad Se SAPNA registr colÆgeno y despuØs que por hora una la actividad con la residual sobre metodologia los extractos fueron tratados Se tomaron muestras cada la actividad enzimÆtica empleando 15 la hidr descrita a 20 30 minutos y las tØcnicas lisis del anteriormente 40 se 50 Y 70 Oc cuantific6 descritas 34 7 11 Constantes cin6ticas las determinaron Se de Linewever metodolog a segœn Whitaker Burk la ecuaci n de Michaelis Menten se ajusta la a y l Vo a l Vmax b Km Vmax X l 1 Km Vo Vmax Vmax So sobre mM Los las la hidr valores 0 lisis 1 de 12 c mputo columna fue el que 01 se SAPNA M en obtuvo determin 7 pH describi 8 Los de 0 1 a de ensayos anteriormente cinØticas Simpson trataron se basic diseæado segœn calculando concentraciones a CaCl2 constantes se los extractos de por page y Haard en un La 1987 1984 en la Vmax primero de y quimotripsinas de quimotripsina se realiz de afinidad por medio de colectaron se peptidasas despuØs cromatogrÆfica las en adheridas no por cambio de pH consisti una proceso inverso un muestras empleando agarosa 4 las al proteinasas SBTI El proceso siguiente Allcuotas fueron se cromatogrÆfica La matriz 0 como enriquecimiento decir ligando 1 encontramos de aparentes enzimÆticos del iterativo Enriquecimiento El Es Km M las eficiencia catalitica relaci n constantes los extractos en realizaron se programa de de Tris en actividad 7 Al transformar Velocidad inicial Abs min Concentraci n de sus trato mM So obtenci n Vo 01 la donde L Vo quimotripsina 0 recta una 1972 rec procos sus a empleando So La las de cinØticas constantes de cargados 1 en 5 mI una de los columna extractos con de acocil 5 mI de matriz y langostilla cromatogrÆfica 35 2 Las muestra cuales se incubadas fueron pas columna la por colectaron fracciones 3 Las de 25 a 280 0 2 fueron mezcladas 4 La fue columna recolectÆndose absorbancia 280 a restablecer el pH y LAP quimotripsina fracciones de fracci mI de aquellas como absorbancia con mezcladas fueron CPB Y A y n 0 5 los se Y que M lisis de BAPNA se Hidr lisis de SAPNA DeLMar quimotripsina bovina como Hidr de azocaseina utiliz 3 mayor Tris para n l de los en tripsina extractos esquema tripsina porcina 1979 et al pH registraron fracci siguiente a mayor HCl agregando la por la A 01 cuantificadas el segœn l 7 pH mM proteolitica incluyendo actividad Hidr lisis mI 3 etiquetaron se de despuØs fueron determinadas como 15 con fueron nm La actividad de crudos eluida fracciones 50 Tris fracciones etiquetadas y de proteina Aquellas nm mI minutos 10 mI 3 fracciones que contenian absorbancia durante como control utiliz se control se utiliz tripsina porcina como contro l Hidr lisis de Leu Na Hidr lisis de Hipuril Arg Todos realizaron se los ensayos segœn las con utiliz se LAP utiliz excepci n porcina CPB como porcina de la hidr especificaciones del control como lisis manual de control de SAPNA se Worthington 1972 El rendimiento recuperada crudo actividad se calcul a partir especlfica protelna de la actividad total de muestra total en el 36 8 8 RESULTADOS 1 Actividad La para hidr quiaotr1ptica lisis de SAPNA fue mayor quimotripsina la comparaci n en inhibidor ningœn tripsina cuando tØrminos porcentuales represent fue menos con magnitud realizada la utilizado Tabla por VIII la En del 1 QUDlOTRIPTlCA SAPJIA tres ordenes de VIII Tabla IVl DAD ACT en COIIO USDDO O l SUSTRA Tratamiento Enzima TLCK Ninguno TRIPSINA 0 PORCINA 0 100 QUIMOTRIPSINA 90 89 90 PMSF o O O O 100 00 O BOVINA 100 SALMON 0 44 0 40 O 0 44 0 40 O LANGOSTILLA ACOCIL AMERICANO 99 4 40 4 19 O 4 36 4 15 O 0 08 0 08 O 0 08 0 08 O Las unidades de actividad estÆn a 410 nm por minuto de actividad por mg respecto de a expresadas prote na la O presente en como el incremento en quimotripsina bovina la absorbancia 37 La acocil activi dad americano de especifica detectada los extractos hidr61isis muestran langostilla en fue 55 de veces langostilla de superior actividad La SAPNA la que y de acocil americano proteinasas de En obtuvo un ZPCK Tabla fue minimo 1 redujo solo las completamente de como el caso de actividad de la despuØs usando en de con excepci6n los extractos quimotripsina quimotripsina bovina que fueron tratadas SAPNA o las todas en las muestras enzimÆticas inhibici6n respectivamente nulo de la preparaciones 84 o actividad la acci6n del TLCK sobre La tripsina la de acocil y abati6 PMSF El azocaseina con se TPCK sustrato como IX Tabla BlBC O DE CBTODS l IX CLOROIIftILO SOBRB DE LA JlI DROLI8 IS DB 8APD Y UOCUEDIA INHIBICION SAPNA AZOCASEINA MUESTRA TPCK ZPCK TPCK ZPCK QUIMOTRIPSINA 84 96 90 86 SALMON 84 70 26 26 LANGOSTILLA 13 93 12 15 o 72 o BOVINA ACOCIL AMERICANO 3 38 La hidr fue mÆs solo inhibidor sin nulamente El a sus 3 Los controles cinco y con de Fig 5 6 caso ambos inhibida del en en seis los la de los que azocase na es us se PCK con los ensayos como us su poco 4 Al usar al preincubar dos zonas Fig al en se parecer 7 que una activas de cuando TLCK igual los el o los dos acocil n os extrac fueron la extractos la de extractos de de zonas que muestra inhibici clara los langostilla reduce es langostilla mientras exhiben zonas acocil ZPCK tambiØn extractos por TPCK proteol tica zimogramas Al disminuye para tratados en de lisis langostilla actividad el de Fig PMSF muestra inhibidas En fueron extractos los por de referencia del extracto de Fig langostilla la lisis solo sucedi hidr la actividad con tiene trece de de salm n afectada bandas tratados hidr cuando o esto embargo zimograma respecto La reduj se sustrato como los extractos enzimÆticos la influencia de inhibidores que cuando sustrato como crustÆceos diez de SAPNA por afectada por azocase na SAPNA lisis y de actividad acocil con TPCK tres acocil ividad ac correspondiente a en una son una la Fig zona que fue 39 Fig L nea 3 Zimograma 1 MPMi 2 Fig control langostillai 4 3 acocil americano Zimograma preincubando con PMSF 40 0J Fig L nea 5 Zimograma preincubado 1 MPM 2 con langostilla 3 TLCK acocil americano C0 J Fig 6 Zimograma preincubando con TPCK 41 Fig L nea 7 Zimograma preincubando 1 americanoi acocil 4 americano langostilla con ZPCKi ZPCK 2 langostilla ZPCKi 3 acocil 42 8 2 8 2 Actividad Comparaci6n 1 colÆgeno de de los concentraci n La fue nolltica cOlag influy en de SOS de Xandl que se et al agreg Jg la fue Esta la absorbancia del concentraci n reactivo Duhamel las mÆxima nm de Fig et al muestras Ouhamel et al 700 a y a el mØtodo modif icado de Bradford en 3 O mØtodos SDS de 1981 que no 8 0 12 0 1 0 08 E e O o o f 0 06 ł en 3 0 04 0 02 o o 10 20 30 40 50 l Fig 8 Efecto de la reactivo de Bradford concentraci 60 70 80 90 100 SOS n SOS sobre la absorbancia del 43 una al variaci n 1953 en que registrados sensible su seleccion control colÆgeno de diferente colagenasas Con en el lisis mØtodo n tØcnica sustrato del Tabla que et Para ninhidrina con ya X esta con cambios Duhamel de purificaci n colÆgeno diferenciar permite detecci la del la hidr grado de al los Se se mØtodo registr de Mandl fueron aunque que 1981 ensayos no fue tan rutinarios introdujo tripsina serina et proteinasa no se como hidroliza nativo Tabla X DBTBRlUDCIOII DB LA ACTIVIDAD COLAGDJOLITICA METO DO ENZIMA Duhamel Colagenasa C 111 1981 Mandl et 1953 al 0 022 0 857 0 029 1300 histolyticum Tripsina de O 0 actividad estÆn expresadas como la absorbancia 700 nm unidades de actividad estÆn expresadas como la 600 nm Las unidades ras al histolyticum Colagenasa C lA et absorbancia 5 5 170 hrs hrs 44 8 2 Colaqenollsis 2 los por extractos de hepatopincreas de lanqostilla y acocil americano El sustrato espec fico Cuando no para se total de la XI Esta utiliz relaci n las que la hidr lisis del fue 37 us se PMSF 7 de Aun por sobre las enzimas la siempre colÆgeno TRATAMIENTO NINGUNO es Colagenasa 0 1 227 034 0 TRIPSINA 37 02 136 33 15 85 3 03 98 555 0 100 FENANTROLINA colagenasa 100 5 27 EDTA de colagenasa 1 259 0 009 0 la n en COLAGERO Clostridium 100 quelantes la XI porcina 034 Tabla la relaci original mayor para actividad tripsina de fue tripsina siendo mayor empleo TRIPSINA 0 PMSF el con HIDROLISIS DEL 10 alta que la la actividad Tabla 1 fue actividad degradado no mÆs veces de ensayos varia dependiendo del efector obtuvo se ya que efector ningœn colagenasa los para colagenasas diferencia cuando que empleado 44 028 0 82 085 7 Las unidades de actividad colagenolitica estÆn la absorbancia a 600 nm por 5 horas expresadas como el incremento de de actividad remanente La hidr crustÆceos lisis evidenci sobre el colÆgeno actividad por los colagenol tica extractos Aun de cuando los la 45 actividad encontrada presente langostilla en superior acocil en langostilla en es actividad la la que COLAGBlJOLITlCA DB el espec fica obtenida para Tabla ACTIVIDAD aproximadamente doble 2 es acocil la que 6 veces XII Tabla XII LAS PRBPARACIOIIBS DlZDmTICAS ACTIVIDAD MUESTRA ACTIVIDAD PROTEINA ESPECIFICA mgjml Clostridium 1 259 0 025 50 360 LANGOSTILLA 0 494 0 145 0 681 ACOCIL 0 929 0 710 0 261 hystoliticum AMERICANO Las unidades de actividad absorbancia a 600 8 2 3 inhibici extractos especifica estÆn expresadas miligramo de proteina n de XIII Los lisis efecto de langostilla americano m nima y de los para que en en la mientras que la 10 la hidr inhibi incremento en la fueron EDTA lisis al Tabla de completamente la en un colÆgeno utilizados fue los por la actividad lo hizo de mayor bacteriana importante casi coliqeno colÆgeno del americano inhibi de los crustÆceos fenantrolina lisis colagenasa el el como hidrolizan hidr forma colÆgeno sobre que acocil fenantrolina quelantes s la 10 1 extractos enzimÆticos mientras sobre quelantes redujeron hystoliticum hidr proteinas PMSF por mientras que fuØ 90 c por Clasificaci6n de las La los nm 55 por El los despreciable extractos de acocil 46 Tabla DE IDIBlDORES BPECTO XIII SOBRE LA ACTIVIDAD COLAGBIIOLITlCA DE INHIBICION MUESTRA c PMSF hystoliticum 1 10 EDTA FENANTROLINA 1 93 55 LANGOSTILLA 95 2 2 ACOCIL 94 10 7 8 3 AMERICANO Efecto del pH la hidr sobre lisis de SAPNA y collqeno SAPNA influencia La extractos muestra a pH 4 de una meseta entre actividad total de alcalino es al 30 pH En mÆxima similar el 5 Y caso a conservando a pH acocil pH 6 lisis de actividad Figura 8 de actividad hidr mÆxima mostr mientras que 10 la sobre pH langostilla fue del definido del 10 La 9 se conserva se actividad los extractos la 6 pH por los curva actividad residual americano La SAPNA una el forma a de la 40 pH un pico Æcido y actividad mayor 47 100 90 80 70 60 U as U 50 o 40 30 20 10 5 6 7 8 10 9 pH 11 Figura 9 ACOCIL AMERICANO LANGOSTILLA Influencia del pH sobre la hidr lisis de SAPNA 48 colÆgeno La hidr fue mayor lisis entre actividad La alcalinos acocil a 6 Y hidr de pH se lisis mÆxima Y 20 mÆs de colÆgeno entre pH su un 6 Y por la 7 actividad langostilla de la pico sensible es disminuyen a extractos mostrando 10 encuentra acocil 10 Fig 8 langostilla la americano 50 un de La los extractos en pH por los colÆgeno de a mÆximo pH los a pH Æcidos extractos curva muestra 7 que de que hasta proteol tica 4 pH 110 100 90 80 f C 70 60 C S 50 40 30 20 10 O 4 5 6 7 8 9 10 pH 11 Figura 10 LANGOSTILLA Influencia del pH sobre ACOCIL AMERICANO la hidr lisis de colÆgeno 49 8 5 Termoestabilidad Hidr lisis Los de SAPNA extractos de langostilla totalmente activos cuando exhiben de activaci una langostilla cuando son fue de 20 exhibieron los del pØrdida de Figura de lisis El 30 Figura n de mientras 70 oC capacidad La 15 hidr de 20 40 a 50 a a del los 30 oC 40 y primeros 15 minutos A OC OC A 60 OC original despuØs minutos se de a 14 50 oc obtuvo 15 Se los 15 minutos 45 oc 50 a oc ces la los a extractos una activaci n 13 El Figura a minutos 60 los de minutos de incubaci n de perdiendo 20 a toda minutos por a los 20 extractos exhibi OC y redujo actividad cesando de solo del la el 45 hidr acocil una actividad la obteniØndose una exhibi y de residual colÆgeno Figura minutos 70 70 a y los por incubaci n fue constante al tratarse las muestras a oc de oc actividad colÆgeno 20 a minutos 45 lisis lisis lisis constante y una hidr de minutos los 15 a acocil de oc 3 O a la actividad residual extractos 40 50 a 11 incubados fueron 100 los fue de actividad tiene se de casi de hidr fue de que acoc l SAPNA colÆgeno entre porcentaje actividad oc de extractos hidrolizar 70 y 12 porcentaje oc al hora una Los a langostilla permaneci a actividad oC minutos la actividad 45 minutos 30 la incubar Al a oc 15 permanecen durante 40 extractos 40 oc a los a de 55 un 20 a incubadas son americano por 60 minutos activaci una fue Hidr cesa Y tratados son cuando pierden incubados Cuando oc n acocil y fue activaci durante 20 a a los los respecto lisis n a los 60 la 60 50 120 100 80 O lU O 60 05 l o 40 20 o 15 30 45 Tiempo 20 e e50 Figura 11 e 30 C w 70 60 min lE 40 C C Termoestabilidad de langostilla sobre la hidr lisis de SAPNA 200 180 160 140 ij 120 O lU O 100 5 0 1 o 80 60 40 20 O O 30 15 Tiempo El Figura 12 20 C 30 50 C w 70 Termoestabilidad de acocil sobre 45 min C 40 C C la hidr lisis de SAPNA 60 51 120 100 80 lIS 60 S 3 o t 40 20 O O 15 Tiempo 20 e a50 Figura 13 Termoestabilidad 45 30 de e 30 e 60 min 40 e 70 e langostilla sobre la hidr lisis de colÆgeno 100 i o 80 t1l o es Q O 60 40 20 O O 15 30 Tiempo E3 Figura 14 20 e 30 e 50 e 70 e Termoestabilidad de acocil sobre 60 45 min 40 e la hidr lisis del colÆgeno 52 5 Constantes cinØticas 8 La muestra bovina quimotripsina el quimotripsinas presentes Tabla XIV fisiol gica La o evidentemente de langostilla que la los en superior a y acocil 87 SAPNA veces de bovina tiene mayor que la langostilla fue superior y CONSTANTES CIHETICAS Muestra eficiencia langostilla Aun cuando por la Vmax 36 XIV USAlmO SAPO Vmax Km QUIMOTRIPSINA 0 002 a 0 COMO SUSTRATO Eficiencia 5 970 a 0 9 720 a 2 0 271 a 0 2985 00 34 35 1 20 BOVINA LANGOSTILLA Km AMERICANO 0 283 a 0 0 226 a 0 001 092 069 mM Vmax mM min Eficiencia catal tica VmaxjKm y es los Km veces catal tica ACOCIL acocil de acocil Tabla las la eficiencia catal tica parecidos muy una como con langostilla la eficiencia de acocil son rÆpidamente comparaci n en extractos quimotripsina catal tica del extracto de obtenido Km pequeæo reconoci 24 62 09 mayor 53 Enriquecimiento 8 6 obtuvo Se fracciones actividad por la las de referidas de LAP hidr la por acocil exopeptidasas actividad fracci n enriquecimiento opuesto un colectadas de quimotripsinas de I aumentaron y que la acocil de exhibida cromatogrÆfica en la fracci A de n los factores de de LAP de 2 es 3 BAPNA crudo Tabla espec fica los en sin en de de excepci n en como embargo extractos de acocil la langostil1a la exopeptidasas que la de acocil obtenidos detectada A XVI y fue mayor de la que endopepdidasas XV con las en azocase na y tratamiento del n de actividad enriquecimiento langostilla mayor al la fracci en SAPNA del purificaci n veces aument endopeptidasas actividad la Mientras de DespuØs CPB por langostilla la respecto antes proteasas CPB lsis La actividad de exo y y de el lo la columna fue mayor constatan rendimiento respecto a los langostilla Tabla XV ACTIVJ DAD BBZIXATICA DB FRACCIONES DE ACOCIL AHERICABO Azocaseina FRACCION LAP CPB SAPNA BAPNA CRUDO 0 26 0 07 0 37 0 36 0 005 A 1 25 0 19 0 08 0 04 0 009 Fp 4 81 2 71 0 21 0 12 1 800 389 96 216 68 17 54 9 69 146 000 Rendimiento I O O 320 00 15 00 0 144 FP O O 865 00 42 00 28 800 Rendimiento O O 58 00 2 80 1 920 Actividad especifica Factor de purificaci n 54 La actividad de mayores que las de fueron superiores acocil que en fracci endopeptidasas langostilla en el Los n I de porcentajes enriquecimiento acocil de fueron rendimiento de las fracciones A y I en langostilla Tabla XVI ACTIVIDAD FRACCION DZInTICA DB FRACCIOna LAP CPB BAPNA 6 069 o 0 100 o o 1 450 O O 54 0 03 15 A 8 00 8 88 o 14 87 296 00 169 41 3892 00 92 60 Azocaseina 0 0 Rendimiento LMlGOSTILLA SAPNA CRUDO Fp DB 16 500 1 O O 50 00 0 40 0 FP O O 3 10 0 06 1 450 Rendimiento O O 2 39 0 05 1 Actividad espec fica Factor purificaci n de 100 100 55 9 DISCUSIOII 9 1 Actividad Varios encuentra 1980 quimotrlptica et y Garc a quimotripsina de inhibici et al presencia camarones Los la necesidad identificaci n de crustÆceos presencia existe de una quimotr ptica Tasai por la bovina En raz utilizando relacionada los bovina tiene acuerdo El a i responsables de 1986a cinco de 1986b DelMar 1991 y empleada la en sustrato la se SAPNA y contrast et al sustrato fue la quimotripsina de quimotripsina en SAPNA la 1979 la el son enzima Tabla VIII validan y quimotripsina para este obtenidas que otra con ademÆs catalitica del actividad 1979 1991 comprueba la aquellos Chen como presenta resultados cinØticas lisis 1991 por DelMar et al eficiencia hidr detectado especificidad y 1986b PMSF han de sobre todos embargo 1986b et al Los reportados gran Sin que la digestivas las conclusiones en seleccion DelMar 1986a del se evalu las constantes efecto al 1986a proteinasas 1986a catal tica se como et al una tØcnicas sustrato como al SAPNA con al tripsina e et metodolog a Tabla IV la cual trabajo los datos de Tsai et sustrato SAPNA la sobre trabajaron por este este confirman n et disparidad gran eficiencia alta con reevaluar quimotripsina que La de Tsai actividad de extractos en SAPNA emplearon trabajos investigadores 1991 cuando de enzimas estas Osnes emplearon Tsai embargo Neurath y 1987a encontraron cuando se no quimotripsinas diversos En de Zwilling Nagayama no decÆpodos Sin hallazgos 1979 plantean de quimotripsina 1969 y 1993 Haard y TPCK con Galgani 1984 extractos en la de especies al la que Travis Gates y Carreæo n reportaron reportado crustÆceos en Galgani 1985 han autores trato sus Tabla XIV tipo de serina de proteasas proteinasas 56 La actividad encontrada Tabla VIII es m nima la apoyando la en de especificidad preparaci n de quimotripsina tripsina bovina por SAPNA langostilla acocil y Tabla VIII la de estos actividad respecto la a hidrol tico no TLCK fue nula espec fica debe ademÆs hay corroborar Para langostilla escogieron se el la realizaron TPCK los extractos de los quimotripsina por el ZPCK otro reafirmando as los extractos ya acocil bovina la que cuenta los en se que es Aun poca efecto el influencia del trabaj TPCK bovina presencia langostilla niveles presentan bajos Estos crustÆceos con un como quimotripsinas inhibici n y tuvo a espec f influencia pesar que Ambos extractos acocil es IX Se icos de importante un conocido fueron afectados Segal et al 1971 n Tabla explican quimotr ptica en en americano afinidad de Tabla y IX por muestran la porque que el TPCK quimotripsina otros crustÆceos Tabla de autores IV no usando inhibidor reducci n La no acocil en proteinasas tipo quimotripsina de y n inhibidores quimotripsinas resultados detectaron actividad inhibici de crustÆceos inhibidor de la de El quimotripsinas ser por resultados de inhibici Los cetona ensayos ZPCK y inhibidor de salm n en de presencia de vertebrados quimotripsina TPCK tripsinas que tener de extracto quimotripsina sus a de bovina quimotripsina con proteinasas presentes los en en extractos capaces de hidrolizar SAPNA decÆpodos presente se obtenidos los en crudo extracto sobre los y encontrada decir que existen podemos hepatopÆncreas cuando actividad la Contrastando que de de de se de actividad quimotr ptica vertebrados como obtuvieron para quimotripsina clorometilo no bovina tiene lo muestran los el IX mismo a TPCK los porcentajes de enzimÆticos de extractos Tabla afecta por Sin embargo efecto sobre esta las 57 de quimotripsinas reportados Astacus crustÆceos Zwilling por leptodactylus Neurath y los y porcentajes 1980 acocil para encontraron se que inhibici de europeo trabajo este en n lo confirman as La es no baja especificidad fen meno un trabajaron mosquito TPCK ausencia llegar de proteinasas espec ficos Determinar la quimotripsinas las fueron afectadas por el y del inhibidor este PØrez proteinasa clases catal ticas del grupo DespuØs pueden usados del par relaci n descubierta es uso entre la conocidas ser uso selecci la en et al ser de pertenece no son Sin 1987 importantes extremo asignada en cuando una As a inhibidores de n o emplear a la que a proteol ticas debe de por el presencia inhibidores los Montfort probado la inhibidores porque del estudio de enzimas etapas ser sobre considerar de tipo dif cil resulta los inhibidores han embargo acertadas necesario es espec ficos absolutamente la 1980 al streptomyces griseus naturaleza de la clase catal tica proteinasa nueva inhib a las no conclusiones a sustratos muchas James de la bacteria quimotripsina et 1990 Para una crustÆceos en aegypti tampoco Aedes Bauman exclusivo el que inhibidor de del TPCK corno quimotripsinas con encontrando a los de una las espec ficos inhibidores selectivos dentro de la misma clase para de identificar los sitios activos sustratos enzima nueva espec ficos con aquellas y as de la enzima establecer ya conocidas la Knight 1986 Podr a proteinasas pensarse de bacterias forma similar ya que 1980 Zwilling embargo parecer que y mecanismos invertebrados estructuralmente Nerauth los estudios de existen los sitios 1980 interacci n catÆlisis vertebrados parecidas Zwilling especificidad de son o de et al demuestran lo secundaria de las actœan James et al Sin 1975 contrario que hacen de que Al el 58 mecanismo de catÆlisis al 1971 efecto El zimogramas de y Blout Thompson y proteasas del m nimo deberse puede lo por inhibici n que bandas algunas Osnes las en 1985 crustÆceos Øl lo actividad los pueden mismas trabajo al dos molØculas decÆpodos como se quimotripsina crustÆceos en este se como zonas como purificar actividad Galgani de error et caracterizar y encuentran se otras a al enzimas quienes 1984 kerathurus de querer los con ni veles lo tanto en hasta se que acerca purifique de debe al diseæo la debe se que y no En no de baj os de metodol gico de muchos casos las compartir n por los extractos quimotripsinas son como maneJar caracterize presencia las enzimas inhibici la proteinasas Las que hidrolizaron el SAPNA lo equiparar inferiores encontr se Tabla IX y es de importante que uni n con quimotripsina superiores que existe mayor el tipo adecuadamente quimotripsinas empleado surge como Gates y partir a similitud sustrato en entre vertebrados plantean Kolodzeiskaya animales los datos la actividad de disminuye diferentes y por por hecho encontrados tripsina a se en apreci trabajo otro las general reevaluada para efectivamente que Penaeus el conocen controversia La ser los en quimotr ptica cetonas de clorometilo tal de extractos caracter sticas de estos sustrato un Contrariamente atribuirse la puede organismos superiores ser es la necesidad de comprobar comete comœnmente Se quimotripsinas debe de el TPCK encontraron para ya que en las case na tØcnica et elastasas de Bacillus sp de crustÆceos plantea seæala observaron la que reportan Morihara lo para sobre ZPCK a As la electroforesis en quimotripsinas como de se 1973 esta que las extractos enzimÆticos de diferente sea et al Travis 1988 1969 en los como que las de los datos estructuras de activos de centros el salm n y bovinos entre crustÆceos Zwilling et al 1975 y 59 evidencias indirectas que Una de las proteinasas tipo quimotripsina enzimas digieren que digestivas trabajan convertirse Neurath 1964 conjunto La y quimotripsina convierten Galgani que las gran et al la 1984 en de rompimiento de quimotripsina aminoÆcidos libres dos digestivo A CPA en y Galgani cinco en de Se y ha decÆpodos 1987b 1987a CPA tipos tripsina prote na y proteasas pueda serino Nagayama y las prote na paquete un actœan Las los carboxipeptidasa Galgani el presencia de existencia de como la que formar contraparte su actividad de complementar an report y de ah es la 1964 lograr para especificidad carboxipeptidasas detectado Neurath pØptidos pequeæos en crustÆceos en proteina en soportan 1988 1988 especies de Penaeus En Figura la quimotripsina aminoÆcidos y 17 muestra se la CPA de acuerdo como a su actœan en especificidad conjunto hasta la formar libres Ser NH2 Leu Phe Ala Met COOH Gly t Quimotripsina CPA Ser NH2 Ser NH2 Leu COOH 15 Hidr lisis sitio de hidr lisis Figura Mientras que la Phe Leu CPA lo terminales hace concertada de quimotripsina junto Neurath a 1964 Phe NH2 los quimotripsina aromÆticos aminoÆcidos Dixon y COOH CPA y hidroliza enlaces el extremo carboxilo de aminoÆciodos la COOH Webb E pept dicos dentro del aromÆticos 1979 Cheng en pØptido carboxilo 1992 60 Aunque Garc a quimotr ptica Carreæo los en extractos detectaron actividad de CPA estos refuerza 2 tesis lo hacen como 9 la tripsina de Mandl et al actividad Los altos extractos proteinasas y hidr de lisis comœnmente Chen poseen de estuvieron inhibe digestivo de P estas dos serina estÆ el monodon y los presente proteinasas en tripsina proteinasa de en debajo La la e del la 10 lisis de de presenta se ha encontrado monodon del que existen estrella de mar de y de colagenol tica debe se SBTI lisis Sus a conclusiones sobre tripsina colÆgeno autores hasta contribuci n Estos datos en de acci n la y Ya que el presumiblemente estos hidrolizan que hidr capacidad proteinasas i los en proteinasas de XII y para 1991 quimotripsina mientras XI se la h dr resultados X serina una de que la actividad efecto mayor las enzimas a como quimotripsina y proteinasas por as PMSF con capacidad la habilidad Peneus ten a Tabla obtenidos serina por Chen et al tripsina la metalo Tabla seæalaron 1991 basadas quimotripsina esta n 1981 propiedad una invertebrados ya que en et al combinada colÆgeno nativo colÆgeno que ensayos proteinasas presentes tienen vertebrados que colÆgeno de es y encontr caracterizan serina Las helianthoides sistema el STBI de lo conjunto en para los et al acoc l y lisis nativo enzimas que pycnopodia en no se que inhibici de de crustÆceos colÆgeno s encontramos que escogido fue de Duhamel hidr Tabla XIII crustÆceos otras mØtodo la crudos el sobre 1953 langostilla de trabajo actuen proteasas despuØs porcentajes de responsables extractos el acocil y CPB y El mØtodo sensibilidad que mas estas colaqenolltica de langostilla de actividad proteinasas tipo quimotripsina Actividad rutinarios los de que no encontraron el presente En presentan decÆpodos 1993 y Haard ninguna sugieren un las 90 que el metalo encontrados para 61 P monodon concuerdan extractos los Tabla hÆbitos Los acocil y alimentaci La principalmente amplia proteinasas 1993 Haard acociles de casi que diferentes Rizo se tipos Diaz langostilla tolerancia raz n variaciones que la a actividad discute relaci en temperatura la enzimÆtica no por Los alimento y como fuentes part culas y habilidad de acociles los que y el ayudan se total a de digerir 3 el los n al tiene lo 200C ptimo 13 y la oc de y su ox geno de la mÆxima Es por capacidad adaptativa migra aumenta de metab lico 17 consumo que temperatura a XII varias hepatopÆncreas que entre langostilla cuando su Fig prote na los 20 oc a en de Carreæo consideradas aparente sugiere formas variedad de Garc a macrofitas Esta fuente nuevas son Esta 1991 la por utilizar 1987 crustÆceos Tabla VIII y europeos prefiriendo encuentra batimØtricamente la de de constituida Flores metalo pueden y encuentran 1993 se es como cualquier a PØrez quimotripsinas y estÆ diatomeas de aspÆrtico Shurdal y rÆpidamente proteasas 1986 colaqenasas y soportada ser parece bent nicas alimentarse and Hird capaces de hidrolizar langostilla radiolarios y oportunistas Hessen contienen ventaja importante seguido detritus cisteino detr ticas crustÆceos ocasiones quimotripsinas la americanos tanto alimenticias esta de colagenasas omn voros adaptan n alimentos como como americano por de gama de algunos proteinasas una las foramin feros pequeæos los en quelantes ciancoisi nativo de serina de Caracter1sticas lanqostilla usar muchas en que colÆgeno les confieren nativo colÆgeno al carroæeros y organismos presencia por lo que la 9 3 detritivoros cantidades de grandes acocil y obtenidos porcentajes XIII consumir hacen los langostilla de inhibidores con las La a latitudinal y estabilidad de proteinasas tipo 62 Fig quimotripsinas los parÆmetros acociles mÆximo la los a 12 n de las la sustrato sintØtico proteinasas no Masui n de encuentre vÆlidas las n No al que temperatura Al de existen constantes colagenasa sustratos sintØticos y cromatograf a de para al pero las parecer cinØticas para fueron fue hidrolizado Debe probablemente serÆn las afinidad al que se de de la hasta considerarse pueden en proteinasas mezcla una en mente toman como factores purificar que o por siempre aparentes tales la de SAPNA que quimotripsinas tenerse dependiendo de la que comprobamos por de ellas estudiados dado lo pendiente estarÆ para colagenasas por determinadas posible sintØticos Clostridium de colagenasa por enzimas para especificidad decÆpodos variaciones purificar corno recomiendan se sugeridos los valores obtenidos cinØticas 1981 sustratos de las constantes cinØticas muy ensayos hidrolizado sea no porque son que los usaron espec fico es Km pH se constantes n los En Steinbrik y sustrato 1977 cuando solo Wart actividad este proteinasas tipo quimotripsina hablamos Van la que de los evaluaci La emplearon sustrato adecuado un aun aparentemente ya y colagenol tica diferente tipo quimotripsinas que con Sin de bacteria una La determinaci enzimas y colagenol tica es tienen crustÆceos como oc de las ademÆs FALGAPA histolyticum se et crudos determinaci 17 determinar las constantes cinØticas crustÆceos de vertebrados que para encontr se reportan extractos actividad responsables colagenasas 1990 utilizamos FALGAPA preliminares que a los a coincidiendo 19B7 Avramova proteinasas tipo quimotripsina Ostrowski y determinar embargo m nimo valor un Respecto 14 Y Divakaran para Karafezlieva 1993 D az tiene in vitro concuerda 13 Fig Rizo nutricional oC 27 Y colagenasas fisiolog a su ndice su activaci Fig de 11 como enzima la las diferentes proteinasas se recuper tipo quimotripsinas mayor actividad en por acocil que 63 langostilla en factores a a nesesario esta se mantuvo determinar rendimiento mayor recurri al general pH descrito ya producci n de este factor un de langostilla sin busca enriquecidos extractos hace se evaluar purificaci n las metas de una de proceso sentido purificaci n de que En el diferentes pH para a obtener otros mØtodos 3 actividad menor en Y entre otros deba se tiene 9 de estabilidad posible con mØtodo Fig menor estudio de enzimas de de la para un la Es metodolog a langostilla acocil de las que purificaci n Probablemente las enzimas de la que Æcidos pH Tabla XV y XVI embargo del una se proyecto v a barata yendo exo en y proteasas Demartino las de interpretaciones la tener concluirse ser consecuencia lugar el en presencia cÆlculos la extracto y de con n entre crudos lo por e e pueden que puede Esto puede sustratos protØicos En segundo inhibidores interpretaci n cautela Por porciento al explicados cuando e de pasos lo y las purificaci n tanto purificar de las los los proteasas con tablas de de las œtiles extractos sean inhibidores naturales de superiores acocil purificadas Los espec fica pero y se la afectan debe consideraciones rendimientos y purificaci n actividad son Los sustrato end genos competitivos cambios siempre del que crudos extractos especificidad la los los en a el monitoreo en pØptido prueba o darse de existe la enzima buscada prote na la debe extractos actividad competencia con rendimiento y mencionadas activadores no que proteasas los lugar actividad la de sustratos diferentes vistos que relacionados la construcci los de enmascarar problemas cuidado proteasas tienen inhibidores proteicos end genos muchas pueden el inexistente err neamente end genos primer incluso o en sobre los ensayos de En purificaci n baja enfatiza 1989 en ser arriba cien al serÆn mejor analizen sus 64 10 COl1CLUSl OJIBS SAPNA es sintØtico sustrato un es que hidrolizado por quimotripsinas Existen y acocil Los proteinasas tipo quimotripsinas presentes mecanismos de son El mØtodo mejor Existen La de inhibici cuantificaci que el de quimotripsinas purificaci n de de de vertebrados y et al en nativo tipo por medio de langostilla y acocil y al 1953 serina bajos americano acocil americano que proteinasa cromatografia da et 1981 langostilla es de Mandl colagenasa langostilla en enzima de quimotripsinas n de Duhamel colagenasas clase n diferentes hidroliza colÆgeno La langostilla americano crustÆceos es en de afinidad rendimientos SBTI de 65 11 RBCOJIDDACIOnS resultados Los de habrÆ reportados aqu seguirse digestivas de siguiente paso estudiadas los ello los colagenol tica en los que las de mØtodos icos cromatrogrÆf la caracterizaci n deberÆ dilucidar estructura peso molecular as como proteinasas incluir la primaria se de o estables conserven lado mecanismos en escoger los de La uso aminoÆcidos de sensiblidad cinØticas adecuado esquema enzimas estas el proteinasas secuencia y enzimas quimotr ptica secuencia termoestabilidad y su un Por otro adecuados mas las actividad purificaci n propiedades sus diseæar de ensayos los diferentes pasos la necesario es que trabajo este con caracterizar y madeja las actœan continuar Para purificar es Para considerando crustÆceos la punta de como comprender para la son para determinar el diferentes pH a catÆlisis de e inhibici n informaci Esta clasificaci dentro de criterios los cuenta En que de a este punto Si Ærea muchos de medida que SØ los se este decidimos por es en la de forma estÆ en una proteasas de que nuevos permitan i natural mas que la los al jucio respecto requisitos tomar e trabaj obtener para un forma de contribuir al conocimiento interesada ramas Biolog a una de panacea la o emitir mi de la enfrenta del Bioqu mica sino la elementos estoy articulen sentido nuevos parte son problemas prÆctica proponer permito que que investigaci n forma En la las a filogenØticas tambiØn en profesional la bien acadØmico una me colocar dependiendo proteinasas relaciones las de de clÆsicos bien existentes n jucios los evaluar enzimas al tratar grupos estas efectuØ grado las podrÆ de clasificaci clasificar en de n n nuestro permitirÆ aportaci n en mi Biotecnolog a conocimiento comprensi n Marina ingresar dar de los que no pa s en no sistemas podemos resolverÆ Pero como luz desarrollo dar en este solo en la caso una biol gicos los que nos 66 12 LITERATURA CITADA Adler Nissen J approach in new Adler Nissen the J Chem Tech ´sgeirsson Biotechnol and B of Comparison with bovine Baca 2 327 Peæa D protein A Food Van Bailey T R T Reinhold Company meat and and Gadus kinetic morhua Physiol Biochem An Pub A yield proteases 2 309 of and Production of 1991 314 collagen A and vol a 4 Bailey family collagen ed p of as 1 17 Degradation vol Bailey 4 ed of Collagen p 1 17 collagen as Van Food En A Nostrand NY introduction proteinase Inhibitors Sci J NY 1987 research Dutson 1986 56 Dutson D M meat research Company Etherington Pearson Elsevier cod Comp bacterial Food Sci Reinhold in A atlantic Castaæeda with J A M Advances Barrett and of processes Structural chymotrypsin Advances in En Nostrand and J 222 biology diversity The pearson A hydrolases reaction proteolytic 1990 from and D az M hydrolysates molecules A 156 215 J proteins 335 Vera 1987 34B chymotrypsin nutritional value Bailey of of protein hydrolysis Bjarnason properties 99B 138 32 bitterness in of application Control of the 1984 level enzymic degradation industrial the Biotechnol Tech Chem Limited 1982 Barrett cambridge A to and G the proteinases Salvesen ed En p 3 12 67 E Baumann Isolation 1990 like chymotrypsin Wolfbeis J Baustert 20 from 8 cockroach and R FIuorometric continuous kinetic assay of emission maxima C 1986 Industri Bracho G Novo II Slab and Haard pacific Subtropical Bradford M quantitation N of principIe excitation and 397 17 p Novo Biotechnology Characterization 1990 with collagenase activity Fisheries Technological proceedings rapid A 105 p protein dye binding alkaline the muscle Tropical Conference and of the for the 125 sensitive and of from En sp microgram quantities of chymotryosin using wave of Practical 1988 E Instruction Manual Sebastes 1976 Koller a 393 rockfish Second Americas intestinal edition metalloproteinases of 171 Cell Hanbook s 2nd AjS possessing long Biochem al protein 1970 Bio Rad Boyce substrates protease new a 768 761 Moser o of characterization partial endoprotease Biochem Insect system and of method protein utilizing Anal Biochem 72 2 the 248 254 Cano Simpson A Lopez carotenoprotein atlantic Cawston codo and T Methods in 721 Ciancoisi animals Sci Food G Murphy Enzymology Academic D shrimp from J and Comp S Haard N 1987 Extraction waste with the aid of 52 2 1981 503 trypsin of from 504 Mammalian Colowick and N collagenases Kaplan ed 80 En 711 NY Press Hird and B F Biochem 1986 The Physiol collagen 85B 295 content 298 of selected 68 Clark J oleic of effects Haire T llgen inhibitors on acid the M and sodium 413 Chen Lu P 100B 4 C 763 1992 De Haºn marnmalian C activities of Comp Biochem 1991 Collagenolytic protease the lobster 99B Physiol 2 Educat H relationships 99 Largman 316 DeMartino Biol the Physiol substrate the actions 1975 The and their of distant 92 for of digestive 55 D Brodr ick C Purification 1989 Proteolytic Enzymes Dendinger of 225 J phylogeny zimogens of New evolutionary 259 and Geokas chymotrypsin M Anal 1979 A Biochem 320 G Oxford press 52 and Teller Mol J new 1 investigation methods for the sensitive 20 on serine proteases related E with Biochem Comp enzymes activity Comparison proteases Laboratory experiments Neurath trypsin J Physiol B 1992 evolutionary proteases Beyonon y Digestive proteases blue 88B R of proteolytic J Bond En enzymes eds p 15 24 IRL UK 1987 atlantic Dittrich and sulfate 768 Biochem enzymes l serine midgut and bacterial Tasai and crustacean DelMar Differential 1991 417 Y cheng dodecyl endopeptidase multicatalytic proteinase D Mykles crab 2 503 Life Callinectes Biol midgut gland sapidus Comp of the Biochem 506 under adaptation Polar in the 12 extreme to 269 conditions temperature 274 aspects n of crustacean 69 and ostrowski S oivakaran extracts of Aquacult Soco M oixon 1 Webb E 1979 R Meezan E and to the Bradford incresed 5 67 Eisen 35 Henderson crab Uca K 9 1814 A and F Galgani D Williams a NY ed of SDS modification with Biochem and Meth Biophys ed 1988 497 F hepatopancreas 1973 of the properties A f iddler Biochemistry digestive proteases of four U and H 73 3 Etude de 92 Tschesch comparative Biol 1984 Bergrneger H Verlag crevettes Marine Chem press des 3 Biochem 97 from the 231 236 Proteinases En J and Bergmeger ed Basel digestives protŒases pØnØides and purification Syst Ecol de 16 504 Benyamin digestive Y and Ceccaldi proteinases comparison Physiol R Bradshaw Isolation 1988 Enzymatic AnaIysis cinq espcŁs 5 3th 1822 Seernuller Gassl Galgani from the chracterization Methods of M J Jeffrey i seastar Pisaster ochraceus purple H assay J collagen press The addition 1981 Purification and pugilator partial Fritz K Brendel collagenolytic protease Farrand Academic Enzymes to Wordl J 40 dye binding protein sensitivity hippurus coryphaena 74 A 12 Enzymes present in pancreatic 1990 dolphin 21 and ouhamel the A 78B with 2 of Penaeus 355 361 Peneaus H 1984 Identification of kerathurus japonicus Bate F Comp rskal Biochem a 70 Galgani and F species 87B Galgani F and 1 103 Physiol Galgani F 87B F 889 palinurus Comp five Biochem japonicus Comp in the Biochem 893 F Nagayama digestive proteinases Chionoecetes Decapoda Digestive proteinases 1987b lobster 4 and crustacea in 107 Nagayama j apanese spiny Digestive proteinases 1987a lithodidae of Physiol F Nagayama in japonicus Digesti ve 1988 deep Bull crabs sea Jap affinis and Geryon 54 Fish Soco and proteolysis 6 983 987 Garc a Carreæo F Biotechnol Carreæo Garc a 1991 Educat F Pleuroncodes Garc a Biochem Carreæo practice Garc a proteases Garc a F i 214 or 1 Educat L and 69 on their 4 145 compositien in theory and classification fer 150 friendly En partial 578 inhibition prensa Haard composition proteinaseous 65 3 Student Dimes for 575 langostilla of their decapoda Educat 1992c electrophoresis proteinases digestive proteases Protease Biotechnol F 153 105B 1992b technolegy food and the effect of feed Biotechnol Carreæo Biochem The Physiol F Carreæo 150 planipes characterization Comp 2 1992a in Proteases N and 1993 Substrate molecular proteinase gel weight inhibitors ef Anal 71 carreæo Garcia and F classes proteinase in Pacific crayfish Haard N langostilla astacus Characterization 1993 Pleuroncodes J extracts Food of planipes and Biochem En prensa B Gates and Travis of shrimp trypsin R Geiger H 1984 Chem Gibson R 1982 Gibson R from Ann and Uca M in of 4489 Enzymatic Analysis Gassl decapod ed 3 99 118 crustaceans En 17 decapod 285 pugilator 71 hepatopancreas 346 Methods En ed 59 p on Collagenolytic protease 1981 R Conference University state The Rev Kaplan N 4483 International 1979 and Bradsaw fiddler crab and Lousiana P Biol Mar 11 Methods digestion Second Barker Colowick s and comparative properties Basel Nutrition Eisen A G ed 3 the of and Oceanogr En Bergmeger Feeding Aquacultural Grant J press Proceeding 8 Biochemistry Chyrnotrypsin Bergmeger Verlag lsolation and 1969 J 80 722 734 in Enzymology Academic Press NY Haard N 1992a Control of chemical attributes of cultured fish Haard N 1992b organisms Aquatic Haj s milk 53 and 3 review their Food Producto EliÆs G A l of composition Food Research Inter proteolytic application Technol and HÆlasz and A 1 1988 in 1 enzyrnes the 17 food 742 25 289 from 307 marine industry J 35 Methionine protein by enzyrnatic peptide modification 739 quality food enrichment of J Food Sci 72 Harris and E Vater C Methods in 82 452 Academic 423 Hessen and D Skurdal Freshwater B Hummel 309 p 12 Rak 1393 K clarkii Iida Y the Thesis T Nakagawa James 2j3 M 1980 crab 403 En Symposium of determination of Can Biochem J Physiol Brayer crystal Louisina and crawfish of hepatopancreas F Properties 1991 japanese ln procambarus University State Nagayama utilization of potential spiny lobster Biochem Comp of and Physiol 410 G Delbaere structure Moody characterization shrimp rates Astacus astacus spectrophotometric hepatopancreas griseus protease S turnover International and thrombin tripeptide chloromethyl Jiang cryafish Seventh proteinase collagenolytic 98B consumption Characterization and from PhD horsehair ed 1399 1991 proteases Frederikse D 317 trypsin chymotrypsin Food noble modified A 1959 and En NY 1987 VI collagenases Vertebrate Cunningham press J crayfish Astacology Hyeung L Enzymology asimilation in the and 37 1982 B M J of studies Biol Chen proteases penaeus monodon J and A 139 H from and inhibition inhibitors ketone Mol and Sielecki L 432 with 2 A of streptomyces 438 digestive 56 kinetics Purification 1991 Food Sci Gertler tract 322 326 of and grass 73 Karafezlieva the on Avramova one 359 planipes Pleuroneodes Fisheries Rev Mar Kimoto 4 745 A Biophysie Y Chem 1986 Elsevier Kolodzeiskaya 1988 salrnonids Pacific Ocean K from Sci Soe Jap Partial 1986 proteinases Bull abdomen Fish Structure Barrett 52 6 1599 Balaevskaya and of Biochem 1420 1411 of and T properties and hepatopancreas 3 166 Euphausia 1603 N crab from and inhibition enzyme ed Salvensen En 23 p 51 Pub T serine protease Prikl Biokhim The and ed from Purification 1985 like protease characterization Pivnenko M K isolation Communie inhibitors Sci 49 The 1990 The 1987 Burgeson Galatheidae crab the eastern Solovyeva S Research proteinase K red Murakami krill collagenolytic proteases K hn p 29 chymotrypsin Biol Borukhov strongin C in Murakarni and T Agrie O V Astacology of 749 superba G to the Freshwater En symposium pelagic and A characterization of Klimova 19 of antartic Yokoi K Knight leptodactylus coditions and characterization off purification rnuscle the fishery 36 Fukamizu K part of Development 1974 Kimoto artificial PT temperature 362 S Kato of Astacus Seventh International VI crayfish in year The influence of water 1987 feeding intensity of age R classical fuetion p 1 37 of Malen kikh of the L pyloric Mikrobiol collagens collagen Academic Press 24 caeca types Y Kladnitskaya of far 353 3 types N and eastern 360 III I II R Magne and En R 74 Laemmli U 1970 of Cleavage of the head of the assembly proteins structural the Nature 227 T4 bacteriophage during 680 685 A L Lehninger l Mandl 1984 Isolation collagenase 32 Manu 1323 Tawiah from Y N exoskeleton of Food Sci with 17 K A proteinase of A and Clinical Invest J 1985 estimating 20 for 1 Km Can opilio 33 Hori vertebrate Tsuzuki H from digesting H and Y Nagai 1977 Biochem collagenase R Beynon Comparative study Biophys Sci and J S 305 6 11 proteolytic of 297 146 Am of specificity microorganisms enzyrnes diversity The 1971 Biochem Arch 68 En enzyrnes Bond eds p 1 79 13 IRL UK Thesis A 31 S carotenoprotein Chinocetes crab Peptide hydrolases PhD 1987 J of Recovery snow proteinases enzymes Oxford superba Page and Protein 1989 press Sohler 221 T serine proteolytic Osnes 215 1964 H Neurath and R histolyticum Sakakibara oligopeptides H Neurath T Oka various Debellis 1987 Technol substrates Synthetic K Barcelona Omega characterization and Haard Takemoto Morihara E from Clostridium and W Medicine Howes ed 1329 the Inst Masui J Maclennan 1953 2do Bioqu mica non University linear and Vmax of antartic of Trondheim regressien Cambios krill Commun program 3 49 Euphausia Norway in 51 basic fer 75 PØrez Flores R Stimpson planipes 1990 marzo Tesis de Perez Licenciatura R proteinases of Parasit 87 26 M Reece P 1 Oiaz 62 n abundancia I Sur F Velazquez Medina i Catalytic 1987 histolytica Racicot of Lo classes of Biochem Molecular W 1987 kinetic Some Biochem Comp fish from proteases Metabolismo funci n en and de rutinario de la Physiol waste C la Proc o langostilla temperatura de Explicaci n la Costa Occidental de B MØxico distribuci su S sexo Tesis n y y de Maestr a 1993 Li tvin F protease camtschatica A 1990 from Comp hepatopancreas Biochem serine of Stability of crab 97B Physiol 3 410 I Litvin Purification from I and H planipes en Parali thodes Sakharov P D Baja California 66 collagenolytic 407 Saloma reproductiva IPN CICIMAR Sakharov MØxico reproducci n de 98 1993 Pleuroncodes condici Occidental de Entamoeba Recovery 6 L periodo Pleuroncodes 30 1988 Biochem el dogfish chymotrypsin of 25 langostilla de la durante Becker Hultin properties Rizo and n UNAM ostoa I Montfort 87B 1860 la Costa en Montfort Ramakrishna Alimentaci 1991 the and F Artyukov and characterization of hepatopancreas Biochemistry A URSS 53 10 of 1586 Kofanova 1988 collagenolytic protease Parali thodes 1591 N camtschatica 76 Sal vensen and G enzymes En editors p D Segal Powers R enzymes 104 IRL Press J Cohen Oxford in proteolytic of Beynon J and D and Wileox bovine inhibitors specific Shamsuzzaman and K making properties of Biochem 173 Food simpson 9 and Haard N B from trypsin the 894 9 Simpson NY Smith M 31 Knorr ogac Can J 1 3737 cheese mucosa Kinetic Biochem an 1025 V Haard and N J and Physiol aquacultural 1029 N 1989b Biochem Wieg fed of fish Mareel 1989a On froro 11 D red En Dekker Kinetics digesti ve protease proteases Applied and 527 Food Biochem and Haard L 495 a from enzymes p utilization and as adapted edit J Digestive Lehman processing Can Gadus characteristies of Biotecnol J planipes D Yaylayan action organisms eod Cold Gadus morhua Simpson B enzyme Spinelli J thermodynamic atlatic cod Simpson as Purification and eharaterization af 1987 INC and and seal harp A ketones 3728 clotting from AT 900 Biotechnology B like 20 1971 192 greenland Food Simpson Milk 1984 chymosin 1984 and Haard N B N characteristics thermodynamic 62 a 10 Biochemistry Haard Bond P ehymotrypsin christallographic study using peptide chloromethyl site S UK Davies G site binding Inhibition 1989 Proteolytic 83 Substrate H Nagase fram 13 201 213 the roechanism af selected 226 marine 234 1974 Composition crab Pleuroncodes ingredient J Fish Res Bd 77 stauffer 1989 C Effect of food scientist R stroud 1975 1 74 Tsai peptide Chuang digestive Biochem Tsai and H and 3 Turkiewicz serine Physiol Van Wart 231 248 M Galas H 2 and spectophotometric collagenase H Verlag Anal The Penaeus 1984 Bergmeger Chem from 359 the 65 in Comp of of two Penaeus prawn 261 midgut chymotrypsins japonicus Acta 1080 Collagenase J and 59 En Penaeus 67 Methods of and Bergmeger of M Gassl Basel and Kalinowska E proteinase 99B H shr imps Properties gland Biophysic Macartney 57 1 Chymotrypsins decapods 198Gb K 1991 monodon 12 on 239 257 J kinetic the hydrolysis 1986a digestive 2 Biochim 239 235 1 Chuang Analysis Enzymatic J crustacean 203 penaeus penicillatus ed Sci Am of Biochemistry Chuang the Lett amide catalyzed Chuang from and P shrimps Tschesche N Y Dependence 1973 8SB H FEBS Lu E of Physiol monodon l assay for Enzyme proteins cutting proteins and K chyrnotrypsins Tsai En activity press substrates tracts Liu l of elastase for of l Avi 77 Blout and parameters length family A on 89 R Thompson 76 p pH Euphausia H 1991 superba Collagenolytic Comp Biochem 371 steinbrink assay for Biochem 113 R 1981 Clostridium 356 365 A continuous histolyticum 78 H Welgus Grant specificity 5183 whitaker J and Eisen cellagenelytic the A serine cellageneus 1982 Substrate frem pretease substrates Uea Biochemistry 5189 1972 reactiens Sciences Food O cencentratien substrate Effect ef catalyzed enzyme the of J Jeffrey i Studies with pugilator 21 G En of PrincipIes ed Fennema 175 p rates en Enzymology Marcel 209 ef tor Dekker Inc Winter W and trypsin Neurath like 9 24 Purification and 1970 from enzyme Biochemistry wilcox H the fish Evasterias star Enzymology G a trochelii 4679 4673 Chymotrypsinogens Chymotrypsins P ef properties and Perlmann L 1970 Lorand Methods ot En ed 19 64 Academic Press NY Worthington Manual Enzyme related biochemical Yamashita Arai M 1972 216 New p Shoichi Enzymes A high tyresine dietetic Method protein food of and hydrolysis and Jersey Fujimaki and phenylalanine reagents enzyme plastein preparation resynthesis J M 1976 as by Food low acceptable an use A ef Sci enzymatic 41 1029 1032 Zwilling Methods Zwilling and R in R Neurath Enzymology Neurath H H 80 FEBS leptodactylus Lett 60 2 247 633 an L and Enfield invertebrate hemology 249 Invertebrate Protases En 664 Ericssen amine terminal sequence ef Astacus 1980 D trypsin 1975 The crayfish with other serine preteases 79 13 1 APBJlDICB Amortiguador universal Cuando un expuesta Para su 0 HCl N continuaci g de Æcido 7 00 g 4 60 g de fosfato Æcido ml 1 N Aforar a un buena de algunas debe ser capacidad los a la soluci ml La mezclas intervalo amplio para n actua enzima entre concentrada de representativas va pH en pH Æcidos amortiguar la composici n de de mezcla una cuales amortiguador Este 100 un en una a ser 12 2 Y con X mI un de litro pH se de de dan n 3 5 310 a usado aniones 20 ml afora se concentrada de una los concentrada y soluci n Soluci n que mezcla se Y dar los mismos sean uso 1 y 1989 planeado cubrir amortiguador puedan que amplia escala a el ensayo dØbiles tiene se Stauffer de del amortiquador universal b rico c trico hidr litro monohidratado s dico xido con monobÆsico de sodio agua destilada Iili K 2 73 3 4 50 5 8 28 0 10 17 9 12 0 4 80 11 Diaqramas de flujo ACTIVIDAD 1 490 QUIMOTRIPTICA SAPNA 0 ul 2 M 0 1 CaC12 I pH Tris M 7 0 01 M 8 V 10 de ul enzimÆtica prep v I 5 mino Abs 410 nm I INHIBICION Inhibidores 50 ul enzimÆtica prep 5 ul inhibidor v Incubaci n 1 hr TLCK 10 PMSF 20 TPCK 5 ZPCK 0 5 mM 81 ACTIVIDAD PROTEOLITICA l Tris 240 10 50 rnM 7 8 pH enzimÆtica l prep I V Blanco Reacc I l Azocasein a 2 500 I 500 l TCA 20 60 V 500 l TCA 20 I V I Abs 440 nm I INHIBICION Inhibidores mM 10 l prep enzimÆtica 60 TPCK ZPCK 0 5 0 1 5 235 l inhibidor l Tris 50 mM pH 7 8 9 o I 82 ACTIVIDAD 6 Blanco mg 1 25 COLAGENOLITICA de colÆgeno TES 0 35 CaC12 0 1 mM M 7 pH 5 Reacci n v I enzimÆtical l prep 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