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EFICACIA DE BACTERIAS EPIFITICAS PARA EL CONTROL DEL TIZÓN
FOLIAR EN MAIZ CAUSADO POR Exserohilum turcicum
Sartori, M.1; Nesci, A. 1; García, J.2; Etcheverry, M. 1*
1
Laboratorio de Ecología Microbiana. FCEF-QyN. UNRC. Ruta 36 km 601. Río Cuarto, Córdoba, Argentina.
Oro Verde servicios fitosanitarios, Garibaldi 388. Río Cuarto, Córdoba, Argentina.
* Tel: 54 0358 4676231 E-mail: [email protected]
2
Abstract. The aim of this study was to test the capacity of eight potential biological control
agents (BCA) of different genus, to control Exserohilum turcicum on the phyllosphere of
maize, in vivo assay carried out in glasshouse. By foliar spraying were inoculated the BCAs
on plants of 26 days (stage V4). After ten days E. turcicum was inoculated similarly. Assay
evaluation was performed by monitoring the BCA in the phyllosphere at different times, the
percentage of leaf infected was calculated by the scale developed by Bleicher and the
incidence on plant and leaves were determined. At 20 days post-inoculation all selected
antagonistic microorganisms had a significant effect in reducing disease caused by E.
turcicum. At 39 days (stage V10) severity in control treatment was 50%, significantly higher
than the other treatments (about 30%). A principal component analysis indicated that all
BCAs had a significant effect on the control of E. turcicum on the severity of the disease. In
maize plants up stage V10, the isolate 8 (Bacillus spp.) showed the most control of northern
leaf blight, followed by isolates 6 (Bacillus spp.) and 7 (Bacillus spp.). Furthermore
coincidentally isolate 8 was the one that kept more stable their population size in the
phyllosphere. Moreover the correlation observed between the populations of the BCAs and
the severity of the disease at different times, allow us to interpret that in general the
decrease in the population of antagonists, favours an increase of disease severity. All BCAs
tested had a significant effect on controlling the disease caused by E. turcicum. The most
effective antagonists were those belonging to the genus Bacillus spp.
Palabras claves. E. turcicum; maíz; tizón foliar; control biológico.
Keywords. E. turcicum; maize; northern leaf blight; biological control.
Introducción
El tizón foliar causado por Exserohilum turcicum es una enfermedad foliar
endémica de la zona maicera núcleo Argentina, que se ha destacado por su alta
prevalencia e intensidad en las últimas campañas en maíces de siembra tardía
(Formento, 2010; Couretot, 2011). Las enfermedades foliares provocan destrucción
de los tejidos fotosintéticos limitando la captación de energía solar. Una reducción
del 50% de la radiación incidente 15 días antes y 15 días después de la floración
puede provocar una reducción del 40 al 50% del rendimiento en los granos (Fischer
y Palmer, 1984). En la zona centro de Córdoba, De Rossi et al., (2010)
determinaron que valores de severidad del 60 % causaron pérdidas de hasta el
40% de rendimiento en híbridos susceptibles.
El control biológico de enfermedades en plantas se considera un método
alternativo viable (Cook, 1993). Por lo tanto, consideramos posible incursionar en el
control biológico de E. turcicum. Para seleccionar un potencial agente antagonista,
es importante tener en cuenta la relación entre las interacciones biológicas y los
factores de estrés ambiental (Nesci et al., 2005). Hemos aislado y seleccionado
microorganismos epifíticos, presentes en el filoplano de la hoja de maíz, con
capacidad antagonista in vitro frente a E. turcicum (Sartori et al., 2013). El
presente trabajo tuvo como objetivo i) avanzar en el control biológico del patógeno,
ii) comprobar la capacidad de ocho microorganismos antagonistas seleccionados del
mismo ecosistema, de ejercer el control sobre la filósfera de la planta de maíz.
Materiales y métodos
Inóculos. Para obtener el inóculo de E. turcicum, se raspó la superficie de una
colonia de 30 días de crecimiento, se diluyó en 300 ml de agua estéril + vaselina
(2%), obteniendo un inóculo con 2 x 104 esporas/ml. Ocho cepas antagonistas
fueron obtenidas de hojas de maíz con lesiones de enfermedad (Sartori et al.,
2013). Las cepas fueron incubadas en caldo tripticasa soya (CTS) en agitación (140
rpm) durante 24 h. Se obtuvieron inóculos en el orden de 1 x 108 UFC/ml.
Ensayo de invernadero. Se realizó un diseño en BCA con tres repeticiones,
cada unidad experimental consistió de una maceta con cuatro plantas. Macetas de
5 L de capacidad se prepararon con una mezcla de tierra fértil y perlita. Por cada
maceta se sembraron cuatro semillas de maíz Dekalb 670, susceptible al tizón foliar
(Dekalb, 2013). Tratamientos: Control; T1: cepa 1 (Enterococcus spp.); T2: cepa 2
(Corynebacterium spp.); T3: cepa 3 (Patoea spp.); T4: cepa 4 (Corynebacterium
spp.); T5: cepa 5 (Patoea spp.); T6: cepa 6 (Bacillus spp.); T7: cepa 7 (Bacillus
spp.); T8: cepa 8 (Bacillus spp.). Se inocularon los antagonistas por rociado foliar
en plantas de 26 días (V4). Diez días posteriores, todos los tratamientos fueron
inoculados del mismo modo con E. turcicum, luego las macetas fueron cubiertas por
24 h con una bolsa plástica simulando una cámara con 100 % HR, y permanecieron
en invernadero con una temperatura media de 20°C.
Evaluación de la severidad de la enfermedad. Se analizó a partir de los 15
días post-inoculación del patógeno, determinando área foliar afectada mediante la
escala de Bleicher (1988), se determinó también la incidencia en planta y en hojas.
Se analizó estadísticamente con InfoStat (2013) la severidad de tizón foliar hasta
VT (39 días post-inoculación), el número de lesiones y el número de hojas muertas
a partir de VT (48 días post-inoculación) (ANAVA, DGC test p>0,10). Se realizó un
análisis de componentes principales (ACP) con los tratamientos como variable
clasificatoria y la severidad durante 39 días post-inoculación del patógeno (Balzarini
et al., 2008).
Monitoreo de los ACB en la filósfera. Se utilizó la resistencia a antibióticos
como marcador (Krishna Kishore, 2005). Se obtuvieron mutantes resistentes a la
estreptomicina y a la rifampicina. El monitoreo se realizó al momento de la
inoculación (T0), 48h post-inoculación (T1), 24h post-inoculación del patógeno (T2)
y 38 días post-inoculación de los antagonistas (T3). Una hoja de cada maceta, se
pesó y completó con Buffer fosfato hasta la dilución 10-1, se incubó durante una
hora a 180 rpm y 30°C. Se realizaron recuentos de UFC. Para analizar las
variaciones de las poblaciones en la filósfera se realizó un ACP, con los recuentos
como variable clasificatoria y el tiempo.
Resultados
Severidad de la enfermedad. La tabla 1 muestra los datos de severidad
correspondientes a los 20 días post-inoculación. La mayor severidad corresponde al
tratamiento control con el 5%, significativamente mayor, y la menor corresponde al
tratamiento con la cepa 8 (1,1 %). Todos los microorganismos antagonistas
tuvieron un efecto significativo en la reducción de la enfermedad causada por E.
turcicum (p 0,037).
Tabla 1. Severidad del tizón foliar en el día 20 post-inoculación, estadio V8.
Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
8
C Et
+ Et
+ Et
+ Et
+ Et
+ Et
+ Et
+ Et
+ Et
Incidencia en
plantas (%)
83 A
75 C
75 C
75 C
81 B
83 A
58 D
83 A
27 E
Incidencia
en hojas
1,1 a
0,8 a
0,8 a
1,3 a
1,0 a
1,2 a
0,6 b
0,9 a
0,3 b
Severidad
en V8 (%)
5,0 A
2,0 B
3,5 B
3,4 B
2,7 B
3,3 B
2,6 B
2,5 B
1,1 C
N° de
lesiones
20 a
12 a
18 a
16 a
15 a
14 a
8 b
11 a
6 b
Hasta el día 29 la mayor severidad continuó siendo el control de E. turcicum
con un 20%, diferenciándose de todos los tratamientos. El tratamiento 8 mantuvo
la menor afección con un 8,2 %. Luego de los 34 días, en tratamientos que tenían
baja incidencia, se produjo un aumento importante de nuevas lesiones. Al día 39
(V10) el tratamiento control mostró un significativo aumento de área afectada
pasando de casi un 30% a más del 50%, como muestra la tabla 2, el resto de los
tratamientos presentó una severidad cercana al 30%, significativamente menor (p
0,098).
Tabla 2: Severidad del tizón foliar en el día 39 post-inoculación, estadio V10.
Tratamiento
C Et
1 + Et
2 + Et
3 + Et
4 + Et
5 + Et
6 + Et
7 + Et
8 + Et
Incidencia
en plantas (%)
92 B
83 C
92 B
100 A
90 B
100 A
100 A
83 C
100 A
Incidencia
en hojas
1,8 a
1,3 a
1,6 a
1,8 a
1,5 a
2,0 a
1,8 a
1,6 a
1,8 a
Severidad
en V10 (%)
52 A
26 B
29 B
31 B
24 B
26 B
25 B
23 B
30 B
N° de
Lesiones
27 a
18 a
21 a
23 a
24 a
24 a
24 a
20 a
23 a
En la figura 1 se aprecia el ACP, la sumatoria de las dos componentes
principales (CP1 y CP2) explicó el 94,6% de la variabilidad total de los datos. La
cepa 8 ejerció el mayor efecto sobre la severidad del tizón mostrando una
correlación negativa (ángulos entre vectores mayores a 90º), con respecto al
tratamiento control, seguido por la cepa 6 y 7, y menor la cepa 5, 1, y 3. Por el
contrario las cepas 2 y 4 mostraron una correlación positiva con el control. Todos
los ACB tuvieron un efecto adverso al control de E. turcicum en la severidad de la
enfermedad. En cuanto al progreso de la severidad, se observó una correlación
positiva en el tiempo, hasta los 25 días un efecto similar y a partir del día 29 una
mayor afección.
6,00
Día 39
Día 29
CP 2 (12,4%)
3,00
8+Et
Día 34
C-Et
6+Et 5+Et 3+Et
0,00
7+Et
1+Et
2+Et
4+Et
Día 20
25
Día
Día
15
-3,00
-6,00
-6,00
-3,00
0,00
3,00
6,00
CP 1 (82,2%)
Figura 1: ACP con tratamientos como variable clasificatoria y severidad
A partir del día 40 se observaron hojas muertas o totalmente afectadas en
distintos tratamientos, por lo que la escala de Bleicher dejo de reflejar el valor real
de afección. A partir del día 48 post inoculación (VT) la severidad se evaluó
comparando el número de hojas muertas. El control mostró el mayor número de
hojas muertas, pero estadísticamente no fue significativo (p 0,479).
Monitoreo de los ACB en la filósfera. En el tiempo 2 (T2) todos los ACB se
mantuvieron en la filósfera en el mismo orden de logaritmo que en T1. En T3, 38
días post-inoculación, la mayoría de los antagonistas disminuyeron un logaritmo su
población, permaneciendo mayor a 104 UFC/ml. El ACP explicó casi el 90 % de la
variabilidad de los datos (89,2%), en la figura 2 se observa que la cepa 1, 3, 5 y 6
disminuyeron su población con el tiempo y la cepa 8 fue la que se mantuvo más
estable.
3,0
T3
C6
CP 2 (17,1%)
1,5
C7
C4
C8
0,0
T2
C3
C1
C2
C5
-1,5
T1
-3,0
-3,0
-1,5
0,0
1,5
CP 1 (72,1%)
Figura 2: ACP con cepas (C) como variable clasificatoria y tiempo (T).
3,0
La tabla 3 muestra el análisis de correlación general de las poblaciones de
antagonistas y la severidad de la enfermedad al día 15 post-inoculación del
patógeno y T2. Resultó una correlación positiva no significativa. El mismo análisis
realizado con los datos del día 39 post-inoculación y T3, mostró una correlación
negativa no significativa. Dichos análisis contribuyen a interpretar que en general
una disminución en la población de antagonistas, como ocurre en T3, favorece un
incremento de severidad de la enfermedad.
Tabla 3: Correlación de la severidad de tizón foliar en el día 15 y 39 post-inoculación y la
población de los ACB en la filósfera en diferentes tiempos, T2 y T3.
Variable(1)
Severidad día 15
Severidad día 39
Variable(2)
LOG10_T2
LOG10_T3
N
24
24
R
0,17
-0,08
P
0,4223
0,7260
Discusión
En un estudio previo de selección in vitro, las cepas 6, 7, y 8 mostraron una
dominancia del patógeno a distancia, y una reducción de la tasa de crecimiento de
E. turcicum del 84 al 98%, indicando que posiblemente tienen la capacidad de
sintetizar una sustancia difusible con capacidad inhibidora (Sartori et al., 2013). Las
cepas 1, 2, 3, 4 y 5 mostraron una inhibición mutua por contacto y una reducción
en la tasa de crecimiento del patógeno mayor al 50 % (Sartori et al., 2013). En el
presente estudio in vivo, en plantas de maíz hasta el estadio VT, la cepa 8 mostró
el mayor control del tizón foliar, seguida por la cepa 6 y 7. Además,
coincidentemente la cepa 8 fue la que mantuvo más estable su población. Todos los
ACB mantuvieron una población mayor a 104UFC/ml, lograron colonizar y adaptarse
exitosamente en la filósfera, quizás por su condición de bacterias nativas.
Dado que las curvas de progreso del tizón foliar son de tipo sigmoideas
(Oddino et al., 2010), creemos el control biológico podría favorecerse realizando
una segunda aplicación de los ACB en V9 o V10, coincidiendo con el comienzo del
período crítico del cultivo, esto mantendría el tamaño de las poblaciones en la
filósfera y consecuentemente, mejoraría el control o retrasaría la enfermedad.
Formento (2010) ha indicado que si la infección se retrasa hasta 6 semanas
después de la fecundación de los estigmas, la reducción de rendimiento será
mínima en comparación a una infección ocurrida antes de dicha fecundación. En
futuras experiencias in vivo, se probaran diferentes dosis, número y momento de
aplicaciones de antagonistas.
Conclusión. En plantas de maíz hasta el estadio VT, los ocho ACB tuvieron un
efecto significativo en el control de la enfermedad causada por E. turcicum. Los
antagonistas más efectivos fueron los pertenecientes al género Bacillus spp.
Apoyo financiero: Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, PICT 2268/12.
Bibliografía
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