1. Healthcare

APLICACIÓN DE Coriolus antarcticus EN BIOBLANQUEO DE PASTA KRAFT
Verónica Da Re1, Leandro Papinutti1 y Laura Levin1
(1)Laboratorio de Micología Experimental PROPLAME-PHRIDEB-CONICET, DBBE. FCEN-UBA. Intendente Güiraldes 2160. Ciudad Universitaria, Pabellón 2. 1428,
CABA, Argentina.
E-mail : [email protected]
Palabras claves: Bioblanqueado, Coriolus antarcticus, lacasa, pasta kraft, Mn-peroxidasa.
RESUMEN
En este trabajo, pulpa kraft de pino taeda se blanqueó en una secuencia totalmente libre de cloro usando
en la etapa enzimática sobrenadantes de cultivo del hongo de pudrición blanca Coriolus antarcticus (BAFC
266) seguida de una etapa de blanqueo con peróxido de hidrógeno. Se prescindió del uso de mediadores. Se
evaluaron diferentes condiciones durante la incubación y el blanqueo (temperatura, tiempo del proceso,
concentración de peróxido). El mejor resultado se obtuvo con sobrenadantes de 28 días del medio
suplementado con Cu 0,5 mM con una hora de tratamiento enzimático seguido de blanqueado con 2,5%
H2O2 por 168 h. Se obtuvo un aumento notable de la luminancia (L *) = 95,42 comparación con L * = 72,2
de la pasta inicial, y el 84 del blanco tratado con H2O2, con menor pérdida de masa (menos de 1%),
esencialmente bajo condiciones suaves, usando una fuente económica de enzima
Keywords: Biobleaching; Coriolus antarcticus ; Laccase; Mn-peroxidase, Luminance, kraft pulp.
ABSTRACT
In this work, loblolly pine kraft pulp was bleached in a totally chlorine free sequence that involved treatment
with crude culture extracts from the white rot fungus Coriolus antarcticus (BAFC 266) followed by a
peroxide stage. The process did not require mediator addition in the enzymatic stage. Different operating
conditions in the incubation and peroxide stages (temperature, peroxide concentration and treatment time),
were tested. Best results were obtained using 28 days cultures from Cu 0,5 mM supplemented medium after 1
h of enzyme incubation (6 U laccase, 0,5 U Mn-peroxidase per g of oven-dry pulp) followed by 2,5% 168 h
peroxide treatment in distilled water (5% consistency). We obtained a noteworthy increase in pulp
luminance (L*) = 95,42, in comparison with L * = 72,2 of the initial pulp, and L *= 84 of the peroxidebleached control, with minor pulp yield loss (less than 1%), under essentially mild conditions, using a lowcost source of enzyme.
1. INTRODUCCIÓN
Los hongos tanto por su capacidad hidrolítica como por su amplia distribución, son los organismos
lignocelulolíticos por excelencia. Entre ellos existen algunos con una importante capacidad degradativa
de la lignina: los que producen la llamada “pudrición blanca”. Esta categoría definida por el tipo de
deterioro que causan en la madera abarca cientos de especies de basidiomicetes. Estos organismos son
capaces de degradar la lignina, celulosa y hemicelulosa de la madera, pero la velocidad y la secuencia de
degradación de cada componente de la pared celular varían considerablemente. La lignina es degradada
por la interacción de diversas enzimas extracelulares, principalmente fenoloxidasas (lacasas) y
peroxidasas (manganeso-peroxidasa (MnP) y lignin-peroxidasa) [1].
Los hongos ligninolíticos han desarrollado un sistema enzimático único y no específico que funciona en
el ambiente extracelular. El mecanismo del sistema degradador de lignina está basado en la producción de
radicales libres. Este mecanismo permite que estas enzimas sean catalíticamente activas sobre una gran
diversidad de sustratos orgánicos.
La demanda de papel aumenta globalmente, por lo que la producción de desechos asociados se torna
relevante. En el caso del blanqueado de pastas tipo kraft se realizan distintas secuencias en varias etapas,
la cuales usualmente incluyen cloro o derivados de éste. Su utilización genera la formación y posterior
emisión de sustancias organocloradas, cuya alta toxicidad y presencia en los residuos industriales líquidos
conlleva potenciales daños a los ecosistemas depositarios de tales efluentes. La búsqueda de tecnologías
más amigables con el medioambiente sumada a la notable capacidad de algunos hongos de degradar la
lignina en la naturaleza constituye a la industria celulósico-papelera como un mercado potencial para la
aplicación de enzimas fúngicas. Estas tienen aplicación en diversos pasos del proceso: pulpado, blanqueo,
tratamiento de efluentes, y otras particulares como desentintado y remoción de extractivos, para disminuir
el uso de químicos y la contaminación ambiental asociada [2][3][4]. El uso de hemicelulasas,
principalmente xilanasas, libera la lignina reduciendo significativamente el uso de compuestos clorados
[5]. El preblanqueo con xilanasas es utilizado actualmente en varias plantas productoras de papel. Pero sin
duda el método enzimático más promisorio, desde el punto de vista de su aplicación industrial al blanqueo
de pulpas, lo constituye el sistema lacasa-mediador [6]. Debido a su alto potencial redox, la lacasa puede
oxidar estructuras de lignina fenólicas, pero la adición de mediadores (moléculas de bajo peso molecular
capaces de intervenir en reacciones redox) extiende su acción a estructuras no-fenólicas [7].
Sin embargo, los elevados costos asociados a la producción enzimática y purificación a gran escala, el
precio de los mediadores artificiales requeridos en el proceso y su posible toxicidad, restringen al presente
su uso industrial.
Anteriormente se ensayaron sobrenadantes de Trametes trogii en bioblanqueo, de pasta kraft industrial
obteniéndose resultados promisorios sin el agregado de mediadores [8]. Esto resulta promisorio ya que el
alto costo de estos limita las posibilidades de utilización de la lacasa en las secuencias de blanqueado.
Durante el curso de esta investigación se evaluó la factibilidad de aplicar sobrenadantes de cultivo de
otro hongo de pudrición blanca Coriolus antarcticus para su utilización en una secuencia de blanqueo
libre de cloro. Estos sobrenadantes presentan varias ventajas, en primer lugar su producción es
relativamente poco costosa, en segundo lugar al no requerir la aplicación de estrategias de purificación se
evita la erogación que ellas implican. Estos sobrenadantes podrían además contener mediadores naturales
secretados por el propio hongo [9] por otra parte, las proteínas y otros factores que pueden estar presentes
en el filtrado que contiene a las enzimas podrían contribuir a su estabilidad.
2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL / METODOLOGÍA
Organismo: Coriolus antarcticus. (Poriales, Basidiomycetes) BAFC 266 (cepario de la Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires).
Medio y condiciones de cultivo: glucosa 10 g, asparagina 4 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, H2KPO4 0,5 g,
HK2PO4 0,6 g, CuSO4·5H2O 1 mM, MnCl2·4H2O 0,09 mg, H3BO3 0,07 mg, Na2MoO4·2H2O 0,02 mg,
FeCl3 1 mg, ZnCl2 3,5 mg, tiamina 0,1 mg, agua destilada hasta 1 L. pH inicial del medio: 6,5. Los
cultivos se realizaron en Erlenmeyers de 250 mL con 50 mL de medio. Los medios fueron adicionados
con tres suplementos distintos: CuSO4 0,5 mM, CuSO4 1 mM o 500mg de aserrín de pino taeda. Como
inóculo se utilizó 1 cubo de 25 mm2 de superficie de una colonia crecida en agar-extracto de malta (1,3%
extracto dee malta, 1% glucosa, agar 2%) durante 7 días. Se incubó a 28 ± 1ºC
C en condiciones estáticas.
El micelio fue cosechado a distintos días a partir del día 7, por filtración a presión reducida, la fuente de
enzima fue el sobrenadante crudo de cultivo, que se oobtuvo
btuvo directamente de la filtración de los mismos.
Medición de las actividades enzimáticas:
enzimáticas Todas las actividades enzimáticas se determinaron a 30ºC.
30
Actividad Lacasa:: por oxidación del ABTS (2,2'-azino
(2,2'
bis (3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic
sulphonic acid) en
buffer acetato de sodio 50 mM a pH 3,5, midiéndose el incremento de absorbancia a 420 nm
(ε420=36/mM cm). Manganesoperoxidasa (MnP):
(MnP): por oxidación del rojo fenol en buffer 0,1 M sodio
dimetilsuccinato (pH 4,5) (ε610=22/mM
0=22/mM cm) . Una unidad enzimática (U) se definió como la cantidad de
enzima necesaria para liberar 1 µmol
mol de producto por minuto bajo las condiciones del ensayo.
Tratamiento enzimático de la pulpa kraft: Muestras correspondientes a 1 g de pasta kraft de Pinus taeda
lavada y secada de 5 % de consistencia),
sistencia), más 8 mL de crudo enzimático (pH final 7) se incubaron a
distintos tiempos (entre 1 y 24 h)
h a 30°C y 50 rpm, en tubos de ensayo. Blanqueo: Se varió la
concentración de H2O2 entre 2 y 2,5 %. Se analizaron los resultados obtenidos usando dos mét
métodos
distintos de incubación el primero a temperatura elevada 80°C y tiempos breves (1 y 2 hh). El segundo a
temperatura ambiente 28ºC, y con
n tiempos largos (96 y 168 h)
h
Los ensayos se realizaron en agua
destilada.
En las muestras control el extracto enzimático fue reemplazado por agua. Todos los experimentos se
realizaron por triplicado.
Evaluación de las propiedades de la pulpa: Las hojas de pulpa se prepararon filtrándolas a presión
reducida en un embudo Büchner. La luminancia (L*) se midió contra unn standard de blanco (óxido de
titanio L*=94.5) con un espectrofotómetro esférico portátil (SP62) (D65/10º). El rendimiento de la pulpa
se determinó gravimétricamente
ricamente luego de secarla a 37ºC hasta peso seco constante.
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Crecimiento
ento del micelio en tres condiciones de cultivo diferentes
C. antarcticus cultivado en un medio líquido
uido sintético con glucosa como fuente de carbono y asparagina
como fuente de nitrógeno se suplementó con dos concentraciones diferentes de CuSO4 0,5 mM y 1 mM
mientras que en el tercer caso se suplementó con 500 mg de aserrín de pino
ino taeda. Resultó notable la
influencia de la presencia de cobre en el medio de cultivo sobre el desarrollo del micelio, obteniéndose en el
medio con aserrín más del doble de la masa
m
miceliar en medios con cobre. Esto podría deberse a que a pesar
de que este hongo precisa de la presencia de iones Cu2+ para la producción de lacasas, este metal presentaría
algún nivel de toxicidad.[10]. Las diferencias entre los dos medios con cobre fueron menor
menores, en especial
entre los días 14 y 21.
Figura 1. Crecimiento del micelio en medio glucosa asparagina usando tres suplementos distintos. Cu0,5:
CuSO4 0,5 mM; Cu1: CuSO4 1mM; GA Aserrín : medio GA más 500 mg de aserrín de pino.
3.2 Actividades enzimáticas
El medio suplementado con CuSO4 1 mM fue el que mayor actividad lacasa registró contando con 1,9 U/mL.
La Manganeso peroxidasa alcanzó el valor máximo en el medio suplementado con aserrín 0,27 U/mL.
Durante la evaluación de los sobrenadantes para el blanqueo, el correspondiente al medio correspondiente a
28 días de cultivo suplementado con cobre 0,5 mM exhibió los mejores resultados aunque,
aunque este medio no
mostró los valores máximos para ninguna
ningu de las dos enzimas valoradas (figuras 2 y 3). Existe la posibilidad
de que lacasa y MnP contribuyan al proceso de bioblanqueo cuando se utilizan los extractos crudos de C.
antarcticus [11]. Se describió un efecto sinérgico entre la MnP y la lacasa de Rigidoporus lignosus en la
degradación de la lignina [12] se postuló que existe “una
una interacción entre la MnP y la lacasa de Stropharia
rugosoannulata: la lacasa produjo indirectamente H2O2 por oxidación de Mn+2, necesario para la acción de la
peroxidasa”[12]. Este tipo de cooperación podría aumentar la velocidad de degradación si ambas enzimas
están presentes.
No obstante, otros mecanismos indirectos podrían estar involucrados en la degradación de la lignina, Gómez
GómezToribio describió en
n un hongo de pudrición blanca Pleurotus eryngii, la inducción de la producción de
radicales hidroxilo (OH) a través de un ciclo redox que involucra quinonas [13].
Figura 2. Actividad Lacasa en medio glucosa asparagina usando tres suplementos distintos. Cu 0,5: CuSO4
0,5 mM; Cu 1: CuSO4 1mM; GA Aserrín:
Aserrín: medio GA más 500 mg de aserrín de pino .
Figura 3. Actividad Manganeso peroxidasa en medio glucosa asparagina usando tres suplementos distintos.
Cu 0,5: CuSO4 0,5 mM; Cu1: CuSO4 1mM; GA Aserrín : medio GA más 500 mg de aserrín de pino
pino. Eje
horizontal tiempo de cosecha del sobrenadante en días.
3.3 Bioblanqueo
Para testear los niveles de blanqueoo se utilizó el modelo cromático tridimensional CIE L*a*b*
L*a*b cuyos tres
parámetros definen la cantidad de luz presente en un color determinado (L*, L*=0 negro y L*=100 blanco),
la posición entre rojo y verde (a*, valores negativos indican verde mientras valores
valores positivos indican rojo) y
la posición entre amarillo y azul (b*, valores negativos indican azul y valores positivos indican amarillo)
amarillo). Un
valor alto de L* indica una pasta clara,
lara, mientras que uno bajo indica una pasta oscura.
oscura
Se evaluaron los niveles de luminancia alcanzados usando sobrenadantes de cultivos a partir del día 7 de
crecimiento hasta el 32. Los mejores resultados de blanqueado correspondieron al medio suplementado
suplementad con
Cu 0,5 mM y los peores al medio suplementado con aserrín. Para el mejor medio, en todos los casos se
registró una diferencia con el valor del blanco sin tratamiento enzimático (Tabla 1).. Los valores más altos de
L* se encontraron
ontraron entre los días 24 y 32, siendo el día 28 el que
ue mostró mejores resultados. (Figura
(F
4) La
comparación
Figura 4;; evolución de los niveles de blanqueado en los distintos
días del cultivo.(medio suplementado con Cu 0,5 mM)
El estudio de la influencia del tiempo de incubación sobre los valores de luminancia
luminancia alcanzados no mostró
diferencias importantes para los tiempos de
d incubación de una y dos horas, tanto paraa el blanqueado a 80°C
(figura 5)) como para el realizado a 28°C(datos no mostrados)
mostrado
Conociendo la posibilidad de usar sobrenadantes recuperados después de un ciclo de incubación en T. trogii
[8] se testearon sobrenadantes frescos y sobrenadantes recuperados después de un ciclo, haciendo uuso
durante la etapa de blanqueoo de dos concentra
concentraciones diferentes de H2O2 , 2 y 2,5%. (Figura 6) Las diferencias
de blanqueoo resultaron mínimas entre sobrenadantes enzimáticos mientas que una diferencia de 0,5% en la
concentración de H2O2 permite casi triplicar el delta de luminancia ((∆ L*= L* Muestra –L*Blanco).
El análisis morfológico del estado de las fibras usando microscopio electrónico de barrido no mostró mayor
pérdida estructural en las fibras tratadas con sobrenadante enzimático y blanqueadas, comparadas con las
fibras sin tratamiento enzimático
co (datos no mostrados).
mostrados)
Tabla 1: Variación del ∆ L* en función de la edad del cultivo.
Día de
cosecha de
sobrenadante L*
7
14
18
21
24
28
32
ΔL*
84,2
87,11
87,89
88,8
89,9
95,4
89,71
0,38
3,29
4,07
4,98
6,08
11,58
5,89
Figura 5:: Valores de luminancia. Pasta kraft corresponde a pasta lavada con agua destilada. 1 y 2 horas
indican el tiempo de incubación con el sobrenadante enzimático. Blanco, 1hora y 2 horas de incubación
blanqueados con H2O2 2% durante 1 hora a 80°C.
Figura 6: Valores
alores de luminancia alcanzados usando sobrenadantes frescos y reciclados (28
28 días de cultivo,
medio suplementado con CuSO4 0,5mM). Blanque
Blanqueoo hecho usando dos concentraciones diferentes de H2O2.
4. CONCLUSIONES
La degradación de la lignina por parte de los hongos de pudrición blanca es un proceso complejo en el que
intervienen múltiples enzimas, mediadores naturales y mecanismos indirectos como la inducción de la
producción de radicales hidroxilo (OH) [13].
Entre las enzimas modificadoras de la lignina podemos encontrar enzimas oxidativas que catalizan
reacciones inespecíficas como
omo la lacasa, lignin peroxidasa , manganeso peroxidasa y a la peroxidasa versátil.
También pueden ser consideradas como parte de la batería ezimática que interviene en la degradación de la
lignina algunas enzimas generadoras de H2O2 como la aril alcohol oxidasa y la glioxal oxidasa.[15] Esta
complejidad imposibilita por el momento asignar un peso particular a cada uno de los componentes
involucrados en el proceso de degradación de la lignina.
Figura 7; abajo a la derecha pasta kraft lavada; abajo izquierda blanco pasta kraft lavada y
blanqueada con H2O2 2%; superior pasta Kraft lavada, incubada una hora con sobrenadante de
cultivo de Coriolus antarcticus y blanqueada con H2O2 2,5%.
En el presente trabajo, probablemente debido a que la presencia de hidrolasas (celulasas y hemicelulasas) y
oxidasas (ligninasas) varía en diferentes proporciones en función de la edad del cultivo, resultó que el
blanqueo de la pulpa difiere cada día.
Comparando los momentos en los que se obtienen los mejores valores de luminancia con la curva de
crecimiento del hongo (figura 1), se evidencia que la producción de aquellos factores que intervienen en la
degradación de la lignina presente en la pasta comienza cuando el hongo ya pasó la etapa de activo
crecimiento, algo que también se comprueba al observar que el aumento en la actividad de la lacasa y la
manganeso peroxidasa comienza en torno al día 21. Otro factor importante que podría estar presente, es la
concentración de mediadores secretados por el hongo, que además posibilitan extender el rango de sustratos
susceptibles, de modo tal que no sólo se ataca a la lignina sino a otros posibles cromóforos que podrían estar
presentes. El rol de las enzimas analizadas resultaría relevante ya que trabajando con otras cepas de hongos,
T elegans (BAFC 2127) y Steccherinum sp. (BAFC 1171) para las cuales no se encontró actividad Lacasa ni
manganeso peroxidasa en idénticos medios de cultivo a los utilizados en esta oportunidad, los resultados de
las secuencias de blanqueado no mostraron diferencia con los blancos sin tratamiento enzimático. (Datos no
mostrados). Sin embargo, la eficiencia en el blanqueo no puede ser atribuida pura y exclusivamente a estas
enzimas ya que sobrenadantes con concentraciones más altas de las mismas, no necesariamente aseguran un
mejor blanqueado. En T trogii se alcanzaron valores similares de luminancia usando la misma secuencia de
blanqueado propuesta aquí, con niveles de producción de enzimas ligninolíticas mucho más elevados [8].
Esto permite suponer que además resultan indispensables otros factores como la concentración de
mediadores naturales que puede variar en función del estado fisiológico del cultivo.
Por otra parte, uno de los enfoques más prometedores para la mejora de la economía de la producción de
papel blanco a partir pulpa Kraft consiste en el aumento de rendimiento de la pasta en general, y la
reducción de la cantidad de pasos implicados en su procesamiento. En el presente estudio toda la secuencia
blanqueo se llevó a cabo esencialmente bajo condiciones suaves (28 º C) para minimizar la pérdida de pulpa.
Se utilizó una secuencia sencilla de pocos pasos, con bajo consumo de energía ya que todas las etapas se
llevaron a cabo a temperatura ambiente. También se trata de un tratamiento totalmente libre de cloro y que
evita el costo elevado de la purificación enzimática y del uso de mediadores adicionales. Por todas estas
razones, Coriolus antarcticus parece un candidato a ser tenido en cuenta para las estrategias de
bioblanqueado.
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