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Identificación del gene lps B1 en distintas cepas de Rhizobium etli que participan en la infección
por un bacteriófago
Valeria Erendira Mateo Estrada
Asesor: César Rodríguez Sánchez
Escuela de Técnicos Laboratoristas
Área de Ciencia Químicas, biológicas y de la salud.
Proyecto con apoyo externo del Centro de Ciencias Genómicas de la UNAM.
Antecedentes:
La familia Rhizobiaceae de las α-Proteobacterias incluye a los géneros Rhizobium, Sinorhizobium
y Agrobacterium. R. etli, es s un bacilo aerobio Gram-negativo, sus dimensiones son de 0.5-0.9 x
1.2-3 micrómetros y cuentan con flagelos. El genoma del Rhizobium etli tiene un total de 6,
530,228 pb y consiste en un cromosoma circular y seis plásmidos grandes (p42a, p42b, p42c,
p42d, p42f) que comprenden un tercio del tamaño total del genoma.
Los plásmidos han sido caracterizados por alguna función importante para la bacteria. El plásmido
p42 a participa como un ayudante en la transferencia del plásmido simbiótico. El plásmido p42b,
contiene los genes de la biosíntesis de los lipopolisacáridos (lps)(González et al., 2006). El plásmido
p42c tiene varios genes que participan en la síntesis de carbohidratos. El plásmido p42d ha sido
identificado como el plásmido simbiótico debido a que contiene los genes necesarios para la
nodulación y fijación de nitrógeno. El plásmido p42e tiene genes que participan en la replicación y
el plásmido p42f tiene genes implicados en la síntesis de factores de crecimiento.
La membrana celular tiene un papel muy importante en la patogénesis de las infecciones
bacteriana, así como en la interacción del hospedero, organismos de su misma especie y
constituye su principal forma de defensa.
Su membrana interna está compuesta de fosfolípidos, mientras que la cara externa está
compuesta mayoritariamente por moléculas denominadas lipopolisacáridos.
En el R. etli CFN42 los lps se localizan en tres regiones genéticas diferentes; la región α y γ se
localizan en el cromosoma y la región β se encuentra en el plásmido b. En la región β se ubican dos
genes que participan en la biosíntesis de lo lps (β1 y β2) (García y Brom, 1997).
Marco Teórico:
Para que un fago realice el proceso de infección se necesitan receptores y factores que
intervengan en la unión a la célula y de acuerdo a Crook et al., 2013 los principales receptores de
bacteriófagos en bacterias Gram-negativas se clasifican en cuatro categorías: proteínas de la
membrana externa, flagelos, pili, y polisacáridos extracelulares, siendo los lps los más frecuentes
como molécula receptora para una gran variedad de bacteriófagos (Records, 2011). En trabajos
anteriores se ha demostrado que bacteriófagos de la familia Podoviridae infectan a las cepas de
Rhizobium utilizando la capacidad de los lps como moléculas receptoras para los procesos de
infección. En recientes investigaciones se ha comprobado que el lipopolisacárido β1 participa en la
infección del bacteriófago 1 y 11(presentación en el Congreso de la Sociedad Mexicana de
genética 20013).
Objetivo:
Identificar si el gene lps β1 se encuentra en distintas cepas de R.etli que son infectadas por los
bacteriófagos 1 y 11.
Metodología:
Las 30 cepas de R. etli y los fagos 1 y 11 (Santamaría et al 2014) fueron proporcionados por el
laboratorio de genómica evolutiva del Centro de Ciencias Genómicas de la UNAM.
Se verificó que el patrón de plásmidos fuera el correspondiente de las cepas utilizadas, por
medio de la técnica de Eckhardt horizontal y los geles fueron transferidos a membranas de
nitrocelulosa.
Se repitió el experimento de infección a las cepas de R. etli por los fagos 1 y 11, preparando camas
de bacterias y goteando los fagos 1 y 11 para verificar que se produjeran los halos líticos y se
registraron los resultados (se realizaron tres replicas). Posteriormente se realizó la extracción del
DNA total bacteriano y se digirió con la enzima de restricción BamH1 y se cargaron las muestras en
un gel vertical y se corrió a 40 volts durante 12 horas. Al finalizar se tomó la fotografía del gel y
posteriormente los geles fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa.
Después se realizó el proceso de hibridación con el detector intragénico lps β1 (422pb) utilizando
el kit de Rediprime; se lavaron las membranas para quitar el exceso de radiación y se secaron a
temperatura ambiente y luego se montaron en un casete de autoradiografía y se colocó la placa
fotográfica para observar la señal de hibridación.
Resultados:
Los patrones de plásmidos de las cepas de R. etli fueron los esperados.
Los halos líticos se observaron nuevamente en las cepas correspondientes de R. etli.
De las 30 cepas diferentes de R. etli hasta el momento hemos podido localizar la presencia del
gene lps β1 en 14 cepas. Estamos esperando la exposición por más tiempo de las placas para
observar la señal en las cepas restantes.
La infección de los fagos 1 y 11 se presentó en seis cepas: CIAT 894, 17NJ-2, GR56, MIM7-4, CR652,
D13 y en las ocho cepas restantes solo fueron infectadas por el fago 1 (KIM5, IE6840, BRA5,
IE4771, GR14, IE4777, 21NJ-2, IE951)
Consideramos que al ser infectadas las cepas de R. etli por los fagos 1y 11 y contar con el gene lps
β1 comparten la misma molécula receptora para los fagos.
Conclusiones:
La presencia del gene lps β1 es la molécula receptora para el proceso de infección de los fagos 1 y
11 en las cepas de R. etli.
En algunas de las cepas de R. etli la molécula lps β1 participa como receptor en la infección del
fago 1.
En el caso de las cepas de R. etli que no fueron infectadas por el fago 11 suponemos que tienen
otro mecanismo de infección.
Bibliografías:
Crook M., Draper A., Guillorry R. and Griffitts J.(2013) The Sinorhizobiummeliloti essential porin
RopA1 is a target for numerous bacteriophages. Journal of Bacteriology, USA. 195, 3663-3671.
DOI:10.1128/JB.00480-13.
García A. and Brom S. (1997) Characterization of Two Plasmid-borne lpsb Loci of Rhizobium etli
required for Lipopolysaccharide Synthesis and for Optimal Interacion with Plants. MPMI Vol. 10,
No. 7, 1997, pp.891-902. Publication no. M 1997-0714-01R.
González V., et al (2006) The partitioned Rhizobium etli genome: Genetic and metabolic
redundancy in seven interacting replicons. 3834-3839 PNAS March7, vol.103, no. 10.
Records A. (2011) The Type VI Secretion System: A Mulpurpose Delivery System with a Phage-Like
Machinery. Mol Pllant Microbe Interact. MPMI Vol.24, No. 7, pp.751-757. Doi:10.1094/MPMI-1110-0262.
Santamaría et al 20014. Narrow-Host-Range Bacteriophages That Infect Rhizobium etli Associate
with Distinct Genomic Types. App Environ. Microbiology 80(2):446-454