1. Ciencia

AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE AMBIENTES IMPACTADOS
CARLOS ANDRÉS FAJARDO GÓMEZ
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTÁ D.C, COLOMBIA
2009
AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE AMBIENTES IMPACTADOS.
CARLOS ANDRÉS FAJARDO GÓMEZ
Ingrid Schuler, Ph.D.
Decana Académica
Facultad de Ciencias
Janeth Arias, M.Sc.
Bacterióloga
Directora de Microbiología Industrial
AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE
PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN) A PARTIR DE AMBIENTES IMPACTADOS.
CARLOS ANDRÉS FAJARDO GÓMEZ
Fabio Roldán, Ph.D.
Director
Ziv Arbeli, Ph.D.
Par evaluador
Johanna Santamaría, Ph.D.
Par evaluador
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo se velara porque no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo en buscar la verdad y la justicia”.
-1-
AGRADECIMIENTOS
A mi madre por su paciencia y apoyo en momentos importantes, cuya consigna fue
siempre creer en mis capacidades. A mi padre, que toda su sabiduría y experiencia
estuvo a mi alcance en el mejor de los guías. A mis hermanas que siempre son una
motivación. A Fabio Roldán y todos mis compañeros de la unidad de saneamiento y
biotecnología ambiental que permitieron un muy buen ambiente de aprendizaje y en los
que encontré no solo compañeros de trabajo si no también amigos.
-2-
1. RESUMEN
El uso de explosivos se ha extendido a diferentes áreas, además de la industria militar,
está presente en la minería y la construcción. Esto implica que la demanda de estos
compuestos se haya incrementado al igual que su distribución en diferentes ecosistemas,
bien sea por su uso en detonaciones o por el proceso de producción de los mismos.
El pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un compuesto de origen antropogénico usado como
explosivo para fabricar cordones detonantes y mechas. Es una molécula inestable por lo
tanto no es recalcitrante en comparación con otros explosivos, pero en grandes
concentraciones puede llegar a ser un problema ambiental.
El tratamiento de los residuos generados durante la fabricación y uso del PETN se limita a
la incineración y la disposición en vertederos, que representan un riesgo para el ambiente.
Por otro lado, la biorremediación es una alternativa económica y ambientalmente
amigable que permitirá la degradación de este tipo de moléculas.
En el presente trabajo se hizo un aislamiento de microorganismos a partir de ambientes
impactados por el proceso de producción de explosivos. Se realizo un muestreo en 12
puntos de una industria fabricante de explosivos, se utilizaron 3 condiciones de
crecimiento diferentes en las que se evaluó el uso del PETN como fuente de nitrógeno y/o
carbono. Con base en criterios morfológicos se escogieron 134 cepas, las cuales fueron
cultivadas en medio T2 con 100 ppm PETN. Finalmente se obtuvo 7 grupos de cepas, los
cuales presentaron degradaciones significativamente mayores.
-3-
2. INTRODUCCION
Desde la invención de la pólvora en el siglo XIII se ha descubierto una variedad bastante
amplia de formulaciones explosivas, y con el paso del tiempo, dichos compuestos se han
convertido convirtieron en herramientas de amplio uso.
La Primera Guerra Mundial trajo consigo un gran avance en la producción de explosivos,
hecho que implicó que se generaran nuevas moléculas que se podrían clasificar dentro
del grupo de xenobioticos, es decir compuestos cuya estructura no se encuentra en la
naturaleza.
El uso de explosivos se ha extendido a diferentes áreas. En la minería se usan en el
proceso de excavación para romper, destruir o debilitar materiales de gran dureza,
normalmente rocas. De igual forma son utilizados en construcciones de diversas obras
civiles, para eliminar obstáculos u obtener materiales para la construcción. Por otra parte
el conflicto armado global representa grandes demandas e implica mayor distribución de
los explosivos en diferentes ecosistemas, bien sea por su uso en detonaciones o por el
proceso de producción de los mismos (1).
El riesgo que el ambiente sea contaminado con explosivos se presenta desde el proceso
de fabricación en donde las aguas residuales y desechos, tienen trazas de estos
compuestos además de otras sustancias que pueden contaminar el ambiente. Otro
problema con el uso de explosivos se presenta cuando no se detonan, lo que forma
lixiviados. Pero no solo implica riesgos ambientales también sociales porque en este
proceso existe además la posibilidad que ocurra un accidente al detonar con su
manipulación
El pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un compuesto explosivo usado para fabricar
cordones detonantes y mechas. Se sintetiza a partir de la nitración de pentaeritritol. Al ser
de origen antropogénico se reducen las posibilidades que las comunidades bacterianas
de los ecosistemas, que son afectados con este explosivo, tengan la capacidad de
degradarlo. Sin embargo una exposición prolongada al contaminante puede generar
adaptación en los microorganismos que pueden llegar a utilizarlo en su metabolismo
primario (2)
El objetivo de este trabajo es realizar una búsqueda sistemática de microorganismos con
capacidad degradadora de PETN a partir de muestras de suelo y lodos provenientes de
-4-
una industria productora de explosivos, esto con el fin de aislar posibles cepas
bacterianas con la capacidad metabólica para realizar la degradación total o parcial del
PETN. El aislamiento se realizo en medios de cultivo sólidos suplementados con PETN, y
se verificó la capacidad degradadora mediante la implementación de la técnica de
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).
3. JUSTIFICACION
Hasta hace poco los métodos que se utilizaban para la eliminación de estos compuestos
se limitaban a la incineración y el uso de vertederos, pero estos no dejan de ser un riesgo
ambiental. La incineración produce gases tóxicos y con la implementación de vertederos
la contaminación se puede extender movilizándose a través de aguas subterráneas (3).
Una alternativa para el tratamiento de contaminantes xenobióticos como los explosivos,
es la biodegradación. Se han encontrado microorganismos capaces de degradar
sustancias tan complejas como lo son los hidrocarburos y los pesticidas, para convertirlos
en moléculas menos toxicas o mineralizarlos totalmente.
El pentaeritritol tetranitrato (PETN) es un compuesto explosivo usado para fabricar
cordones detonantes y mechas. Se sintetiza a partir de la nitración de pentaeritritol. Al ser
de origen antropogénico se reducen las posibilidades que las comunidades bacterianas,
de los ecosistemas que son afectados con este explosivo, tengan la capacidad de
degradarlo. Sin embargo una exposición prolongada al contaminante puede generar
adaptación en los microorganismos que pueden llegar a utilizarlo en su metabolismo
primario (2).
Se hace mucha investigación en el proceso de biodegradación de
compuestos
explosivos, sin embargo la degradación de PETN no ha sido suficientemente estudiada y
son pocas las publicaciones existentes en este tema. Es por esto que investigaciones
como esta, en la que se contribuye con información sobre la degradación de PETN son
necesarias.
-5-
4. REFERENTES CONCEPTUALES
4.1 BIODEGRADACIÓN
El proceso de biodegradación generalmente envuelve el rompimiento de moléculas
orgánicas contaminantes, usualmente por acción bacteriana. Proceso en el cual las
moléculas que experimentan la biodegradación, son utilizadas para generar biomasa y
energía. El resultado es la alteración en la estructura original del compuesto, el cual
puede convertirse en una molécula menos compleja que la original, además que
características
como
la
toxicidad
y
la
movilidad
pueden
verse
afectadas
(biotransformación). En el mejor de los casos, la biodegradación de un compuesto da
lugar a la mineralización completa hasta CO2.
La biodegradación de la mayoría de los contaminantes orgánicos ocurre mas rápido bajo
condiciones aerobias, cuando el oxigeno presente es usado como aceptor final de
electrones. Sin embargo en condiciones anaerobias también puede observarse
biodegradación, con la participación de otros aceptores de electrones como lo son el
nitrato (NO3) y el sulfato (SO4-2).
La biodegradabilidad definida como la susceptibilidad de las moléculas a la alteración por
el metabolismo microbiano depende del proceso de adaptación de los microorganismos,
en donde el tiempo de contacto del contaminante con el ambiente juega un papel
importante. Un mayor tiempo de contacto con el contamínate implica mayores
posibilidades de adaptación por parte de las cepas nativas.
La alteración de las moléculas contaminantes puede ocurrir por (i) ataque enzimático intra
o extracelular, en donde la sustancia diana es usada como fuente de carbono, nitrógeno o
energía. (ii) por ataque enzimático en el cual no se detecta beneficio para el
microorganismo pero igual ocurre la degradación, y es definido como cometabolismo. (3).
4.2. EXPLOSIVO
4.2.1 DEFINICIÓN
Un explosivo es un compuesto químico o una mezcla de compuestos que tiene la
capacidad de experimentar una reacción química de alta velocidad, que libera una gran
cantidad de energía, sin la participación de reactantes externos. Esta liberación de
-6-
energía puede ser disipada como ondas explosivas, propulsión de desechos, o por la
emisión de radiación (4).
4.2.2 PENTAERITRITOL TETRANITRATO (PETN)
El pentaeritritol tetranitrato, PETN (2,2-bis[(nitrooximetil]-1,3-propanodiol dinitrato) es un
explosivo secundario tipo nitrato éster (Figura 1). Hace parte de los denominados altos
explosivos ya que solo pueden detonar por la explosión originada por un explosivo
primario o iniciador (5). En términos generales es un compuesto de baja estabilidad (4) y
es utilizado principalmente como explosivo, en la fabricación de detonadores y cables de
detonación.
Figura 1: Pentaeritritol tetranitrato (2,2-bis[(nitrooximetil]-1,3-propanodiol dinitrato) PETN
(Tomado de: Spain et al., 2000)
El área de la medicina es el segundo campo de acción para el PETN en donde es usado
como vasodilatador. Este compuesto fue implementado en la terapia de enfermedades
cardiacas hace más de un siglo. En la actualidad el PETN es utilizado en el control de la
angina pectoris o angina de pecho, que es una enfermedad en el corazón, cuyos
síntomas son similares a los de un ataque cardiaco. (6)
El PETN fue sintetizado por primera vez en 1894 por la nitración de la molécula orgánica
pentaeritritol en presencia de acido sulfúrico como catalizador. Sin embargo, su
producción comercial solo pudo ser lograda hasta que la producción de formaldehído y
acetaldehído, requerido en la síntesis, empezó a estar disponible una década antes de la
segunda guerra mundial. Este compuesto resultaba ser muy sensible al impacto hecho
por el cual se empezó a fabricar una composición que contenía 50 % PETN y 50% TNT
que fue llamada pentolita, producto que presentaba mayor estabilidad. Esta formulación
fue usada para la fabricación de granadas y detonadores (4).
Debido a su baja presión de vapor (1.035×10-10 mmHg) y su baja constante de Henry
(1.2×10-11 atm·m3/mole), es poco probable que el PETN se volatilice fácilmente. Es un
compuesto hidrofóbico, posee una solubilidad en el agua de 6mg/L y tiene un bajo logKow
-7-
de 1.61, características que lo hacen débil a la absorción en materiales orgánicos en
suelos y sedimentos y puede ser transportado a través del agua subterránea,
expandiendo de esta forma la pluma de contaminación (2).
La estructura del PETN (C-O-NO2) es análoga a la de los sulfato esteres (C-O-SO3-) y
fosfato esteres(C-O-PO32) que se encuentran naturalmente en el ambiente. Sin embargo
los nitrato esteres solamente son introducidos en el ambiente por las actividades
humanas.
4.3 BIODEGRADACION DE PETN
Actualmente, se conocen diferentes tratamientos, físicos, químicos y biológicos para tratar
ambientes contaminados con explosivos, entre los que destacan la incineración de suelos,
el compostaje y la biorremediación. Sin embargo, estudios realizados (1) demuestran que
la degradación biológica de compuestos explosivos representa ventajas frente a las otras
soluciones, debido a que es un tratamiento ambientalmente amigable, económico, seguro
para el personal que lo efectúa y efectivo debido a que no traslada el contaminante de un
ambiente a otro, sino que realmente lo trasforma en metabolitos simples e inocuos (7).
Los estudios que se han realizado en degradación de 2,4,6 trinitro tolueno (TNT) (8,9) han
sido mas numerosos en comparación al estudio de la degradación de PETN. Hecho que
hace que aumente la relevancia de una investigación como esta, dentro de la comunidad
científica.
Uno de los mecanismos más importantes en la biodegradación de estos compuestos es la
desnitrificación reductiva por medio de una red de transferencia de dos electrones,
formando un alcohol y un nitrito, como compuestos intermediarios y finalmente dan lugar a
una molécula de tipo ester nitroso. Estas reacciones son catalizadas principalmente por la
familia de enzimas de la old yellow enzyme (OYE), las
cuales son flavo enzimas
dependientes de NADPH (Figura 2) (10).
Figura 2: ruta metabólica general de la desnitrificación reductiva de los esteres de nitrato
por flavo enzimas de la familia OYE.
-8-
A esta familia de enzimas también pertenecen la Enterobacter cloacae PB2
NADPH:PETN reductasa (PETNR), Agrobacterium radiobacter glicerol trinitrato (GTN)
reductasa. En las reacciones catalizadas por estas enzimas se observa la reducción de
uno o dos grupos nitrato tanto de PETN como de GTN el cual también es un explosivo
tipo nitrato ester con características fisicoquímicas similares a la del PETN. (10)
En el cultivo puro de Enterobacter cloacae PB2 (11) fue demostrado que esta cepa tenia
la capacidad de crecer en condiciones aeróbicas con PETN como única fuente de
nitrógeno y utilizaba dos átomos de nitrógeno por molécula de PETN produciendo
metabolitos secundarios como pentaeritritol dinitrato, 3-hydroxi-2,2-bis-[(nitrooxi) metil]
propanal y 2,2-bis-[(nitrooxi) metil]-propanodial. En este estudio se encontró que la enzima
responsable de la transformación de PETN era de tipo nitrato reductasa dependiente de
NADPH, y fue aislada del extracto celular. La enzima reducía los grupos nitro de la
molécula de PETN, con la formación de metabolitos secundarios como el pentaeritritol
trinitrato y pentaeritritol dinitrato (Figura 3). (12).
Pentaeritritol tetranitrato
Pentaeritritol trinitrato
Pentaeritritol dinitrato
Figura 3: vía de degradación de PETN por parte de Enterobacter cloacae PB2
Tomado de Binks et al., 1996.
-9-
Otra alternativa para realizar la biorremediación in situ es la fitoremediación y es una
proceso en el cual se usan plantas para limpiar sitios contaminados. Vanek y compañía
estudiaron un modelo de fitoremediación de PETN (13). El análisis de los productos
sugería que el PETN fue degradado hasta pentaeritritol como producto final. Sin embargo
esta tecnología puede tener limitaciones. No todas las plantas se adaptan a los diferentes
ambientes en los cuales se encuentra el contaminante en contraste con la adaptabilidad
que pueden presentar las bacterias nativas de los sitios contaminados.
4.4 CUANTIFICACIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE PETN
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados
Unidos (EPA, por el ingles
environmental protection agency) sugiere el método 8330 B de 2007 para el análisis de
trazas de explosivos (14). Este método se denomina Cromatografía Líquida de Alta
Eficacia (HPLC) y se utiliza para muestras de agua, suelo y sedimentos. En este método
se usa una columna C-18 de fase reversa de 25 cm x 4,6 mm DI (diámetro interno). Las
muestras de suelo y sedimentos son extraídas con acetonitrilo y como solvente de la fase
móvil es utilizado el metanol.
4.5 MEDIO DE CULTIVO
Para implementar ensayos de biodegradación in vitro de moléculas recalcitrantes, es
importante conocer los antecedentes de la molécula para determinar como seria el uso
del compuesto de interés por parte del sistema biológico que realizaría la biodegradación.
Basándose en ese conocimiento es necesario diseñar un medio de cultivo con una
relación adecuada de macronutrientes y micronutrientes que supla todas las necesidades
metabólicas, pero que estimule el proceso de biodegradación. Las investigaciones
realizadas en la biodegradación de PETN, reportan que este compuesto es usado como
fuente de nitrógeno por parte de los microorganismos. (11) En términos generales,
además del explosivo, los microorganismos deben contar con una fuente de carbono, una
solución mínima de sales, fósforo, vitaminas y elementos traza. Por esta razón se realizó
una revisión bibliográfica de diferentes medios para de esta manera diseñar un medio
apropiado para la degradación biológica del PETN. (Anexo 1)
- 10 -
5
OBJETIVOS
5.1 GENERAL:
Aislar, evaluar y seleccionar microorganismos degradadores de PETN a partir de
muestras de suelos y lodos contaminados con explosivos.
5.2 ESPECÍFICOS:
1. evaluar
diferentes
condiciones
para
el
aislamiento
de
microorganismos
degradadores de PETN
2. Comprobar
la
capacidad
degradadora
de
los
diferentes
grupos
de
microorganismos aislados.
3. Determinar los sitios con mayor probabilidad de presencia de bacterias
degradadoras.
- 11 -
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 MUESTREO
Las muestras fueron obtenidas de lodos y suelos provenientes de una industria fabricante
de explosivos. Se determinaron 12 sitios de muestreo (tabla 1) con base en su proximidad
a puntos de manipulación y presencia de materias primas. Los suelos muestreados se
dispusieron en bolsas estériles que
fueron almacenadas en refrigeración hasta su
análisis. Se determinó el pH y conductividad de las muestras.
Tabla 1: Puntos de muestreo seleccionados
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Área Muestreada
Exterior
Canal Exterior
Trampa Taller Multiplicador
Canal de la Trampa
Caneca
Tanque de Transporte
Ex Caja de Captación
Concentración Tensoactivos
Campo de Prueba
Lodos de Planta Tratamiento
de Aguas Residuales (PTAR)
Fitorremediación
Caño PTAR
6.2 MEDIOS DE CULTIVO
Para el aislamiento de microorganismos degradadores de PETN se evaluaron tres
condiciones nutritivas para el aislamiento (tabla 2), en las que se utilizaba como base, un
medio mínimo de sales (Anexo 2). Se realizo una revisión bibliográfica para determinar la
composición del medio mínimo de (Anexo 1).
6.3 ENRIQUECIMINETO
Para garantizar una mayor recuperación de microorganismos degradadores, se hizo un
enriquecimiento inicial a las muestras. Se coloco 1 g o 1 mL de suelo o lodo según la
composición de la muestra y 125 µL de PETN, se dejo evaporar el solvente durante dos
horas, para evitar los efectos tóxicos. Posteriormente se agregaron 4 mL o 4 g de muestra
y 45 mL de cada una de las condiciones de cultivo anteriormente nombrada (tabla 2). De
- 12 -
esta forma cada muestra fue enriquecida bajo las tres condiciones nutritivas a una
concentración final del explosivo de 50 ppm. Se realizo una incubación durante 10 días a
115 rpm a una temperatura ambiente de de (21º C + 0,9)
Tabla 2: condiciones de crecimiento Utilizados en el aislamiento de microorganismos
degradadores de PETN (0 indica ausencia y 1 indica presencia)
Condición de Características del medio de cultivo.
crecimiento
Fuente Carbono
Fuente Nitrógeno
T1
0
0
T2
1
0
T3
0
1
6.4 AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO:
Se hicieron diluciones seriadas, hasta 10
-6
, de cada condición nutricional, utilizando
solución salina al 0,85%. Según la metodología estandarizada por Latorre (2007) en el
laboratorio de USBA.
Se preparó medio sólido de cada una de las condiciones de cultivo nombradas (tabla 1)
añadiéndole agar bacteriológico nuero 1 marca oxoid, en una relación de 15g/L. El medio
estaba suplementado a una concentración final de PETN de 50ppm.
Se tomaron las diluciones
de 10
-2
hasta 10
-5
en cada una de las condiciones de
enriquecimiento para cada muestra y se hizo una siembra en superficie de los medios
sólidos preparados bajo las 3 condiciones de crecimiento y suplementados con PETN a
una concentración final de 50 ppm. Cada dilución se sembró por duplicado.
Las cajas de petri fueron incubadas durante 30 días a temperatura ambiente (21 ± 2 º C).
6.5 SUBCULTIVO Y SELECCIÓN DE LAS CEPAS
Se hizo una selección de cepas basándose en criterios macroscópicos y microscópicos,
evitando seleccionar una cepa más de una vez.
Las cepas seleccionadas fueron aisladas y purificadas en medio sólido bajo la condición
de crecimiento T2 con una concentración final de PETN de 100ppm.
- 13 -
6.6 DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADADORA
La cuantificación de la degradación se realizo por grupos de 5 cepas. Los grupos fueron
conformados con cepas provenientes de una misma muestra de suelo o lodo.
6.6.1 CONCENTRACIÓN INICIAL DEL CULTIVO POR GRUPOS
Con el fin de garantizar que todas las cepas se encontraran en la misma concentración
inicial, se prepararon inóculos de cada cepa, antes de la conformación de los grupos, y
fueron incubados durante 5 días a temperatura ambiente, en 10 ml de medio de cultivo,
condición T2. La concentración inicial de cada cepa se ajusto teniendo en cuenta el patrón
número 1 de macfarland (Anexo 3), no todas las cepas tenían la densidad óptica
adecuada (anexo 4) por esto se concentro o se diluyo el inoculo según la absorbancia
leída (540 nm, HACH DR 5000)
Las cepas con la concentración apropiada fueron inoculadas en grupos de 5 en un tubo
de Falcon de 10 ml, luego los grupos se centrifugaron a 6000 rpm durante 20 min (Hermle
Z), se descartó el sobrenadante y la biomasa correspondiente a las 5 cepas de cada
grupo se quedo en el fondo del tubo.
Se agregó a cada tubo falcon un volumen de 10 ml de medio de cultivo líquido, bajo la
condición de crecimiento T2, suplementado con PETN (100 ppm).
6.6.2 LAVADO CELULAR
Se realizó un lavado celular en solución salina estéril al 0,85 %. La biomasa fue
concentrada y se le añadió nuevo medio de cultivo líquido bajo la condición de
crecimiento T2 (100 ppm de PETN) y se incubaron durante 15 días.
6.6.3 EXTRACCION DE PETN Y CUANTIFICACION POR CORMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
Una vez finalizado el proceso de incubación, cada grupo se homogenizó en Vortex por 1
minuto. Luego todo el contenido del falcon fue depositado en un nuevo tubo falcon estéril
de 15 mL y se centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos.
Se tomaron 650 µL del sobrenadante los cuales fueron depositados en un tubo Eppendorf
estéril; a esta solución se le adicionó 650 µl de acetonitrilo grado HPLC y se homogenizó
en Vortex por 1 min.
- 14 -
Adicionalmente se realizó un lavado del tubo Falcon donde se encontraba originalmente
el cultivo liquido del grupo, para esto se adicionó 2 mL de acetonitrilo grado HPLC y se
homogenizó en Vortex por 2 min.
Posteriormente se unieron los dos volúmenes, el de la extracción del sobrenadante, con el
de la extracción del tubo falcón, de este volumen final se extrajeron 1,5 mL utilizando una
jeringa desechable de 2 mL, cantidad que fue filtrada y dispuesta en viales para la
cuantificación. Se usaron filtros de nylon marca Restek de 0,22μm.
Se determinó la concentración final de PETN en el medio de cultivo líquido basándose en
el método 8330 B de Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) descrito por la
Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA, 2007). Se uso una
columna C 18 de fase reversa de 25 cm de longitud, con un diámetro interno de 4,6 mm y
un tamaño de partícula de 5 µm, marca Shimadzu. El cromatógrafo utilizado es marca
Shimadzu, referencia Prominence LC 20 AT. Las condiciones aplicadas fueron: flujo de 1
mL/min con un volumen de inyección de 20 µL, detector UV a una longitud de onda 210
nm. Se usaron como solventes de la fase móvil, etanol acetonitrilo y agua tipo 1 (milliQ)
en una proporción de 56:2:42 de cada solvente respectivamente.
- 15 -
7. RESULTADOS
7.1 MUESTREO
Las muestras en su mayoría estaban constituidas de lodos, con tres excepciones: 2
muestras liquidas y una sólida que consistía en residuos de PETN presentes en un tanque
de transporte (Tabla 3)
Los valores de pH de la mayoría de las muestras estuvieron cercanos a la neutralidad
(Tabla 3), las muestras compuestas de lodos tenían un carácter ligeramente ácido. Sin
embargo, las muestras que se obtuvieron de la planta de tratamiento tuvieron valores de
pH alcalinos, probablemente por la presencia sales en estas aguas residuales.
La muestra 2 denominada caneca, tuvo un pH ácido; sin embargo, no fue un factor
limitante del crecimiento como se observó en la fase de aislamiento en medio sólido.
Ya que el pH del medio de cultivo fue ajustado a 7,02±02, las condiciones originales de
crecimiento tuvieron un cambio drástico en las muestras 4 (pH: 2,11) y 12 (pH: 8,95), por
lo tanto es probable que microorganismos adaptados a estas condiciones no crecieran en
el medio de cultivo ajustado, disminuyendo la probabilidad para su aislamiento.
Tabla 3: Caracterización físico-química de las muestras
No
nombre
pH
1
2
Exterior
Canal exterior
Trampa taller
multiplicador
Canal de la trampa
Caneca
7,11
7,34
Conductividad
(mS/metro)
0,34
0,22
6,58
0,17
Lodos
7,14
2,11
1,15
1,47
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Tanque de
transporte
Ex caja de captación
Concentración
tensoactivos
Campo de prueba
Lodos de planta
tratamiento de
aguas residuales
(ptar)
Fitorremediación
Caño ptar
Composición
Lodos
Lodos
7,54
0,44
Lodos
Líquido
Residuos de
PETN
Hidratados
Lodos
7,20
14,96
Líquida
7,88
0,63
Suelos
8,73
1,57
Lodos
7,42
8,95
0,47
0,44
Lodos
Lodos
-
-
- 16 -
De la muestra 8 proveniente del tanque de concentración de tensoactivos se obtuvo una
conductividad superior de 14,96 mS/m lo cual indica que es una muestra rica en iones que
puedan producir cargas. Esto es debido a que en el proceso de elaboración de PETN
están presentes compuestos como carbonatos, cloruros y sulfatos.
7.2 ENRIQUECIMIENTO
Todos los enriquecimientos realizados bajo las tres condiciones de cultivo presentaron
turbidez después de la incubación de 15 días. Esta turbidez fue asociada a la formación
de biomasa bacteriana, como se comprobó mediante la coloración Gram (Anexo 5). En
términos generales las morfologías encontradas en las 12 muestras fueron bacilos Gram
(-) y Gram (+). Estudios previos reportan cepas Gram negativas como Agrobacterium
radiobacter (15) y Enterobacter cloacae (11). En los dos casos se reporto actividad
enzimática en donde el PETN experimentaba una reducción secuencial de dos de sus
grupos nitrato. En los enriquecimientos del estudio se observo presencia de bacilos Gram
negativos en 7 de las 12 muestras.
7.3 AISLAMIENTO DE BACTERIAS EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO Y SELECCIÓN
DE CEPAS
La presión selectiva con PETN (50 ppm) no fue suficiente, ya que se observó un
crecimiento abundante en todas las cajas de petri. No se evidenciaron diferencias entre
las condiciones (T1, T2, T3) evaluadas. Sin embargo, en T2 (con fuente de carbono) se
observo mayor variabilidad en las morfologías bacterianas (datos no mostrados).
No se observaron halos de degradación ni pigmentos difusibles en los medios, por lo tanto
se descartaron criterios cualitativos de que evidenciaran la degradación. Sin embargo, en
la investigación llevada a cabo por Gunison y colaboradores (16) se presentó la formación
de halos producto de la degradación de TNT en la superficie del medio sólido y gracias a
este factor pudieron seleccionar los microorganismos durante el estudio. Al no disponer
de un criterio cualitativo de degradación, la elección de las cepas en el presente estudio
se realizó bajo criterios morfológicos de macroscopía y microscopía, tratando en lo posible
de no seleccionar cepas repetidas. De esta forma 176 cepas fueron seleccionadas y
purificadas en medio sólido T2, para continuar con el proceso de cuantificación de la
degradación del PETN (Tabla 4).
- 17 -
Tabla 4: Numero de colonias aisladas por sitio de muestreo.
NÚMERO DEL SITIO
ÁREA MUESTREADA
DE MUESTREO
NÚMERACIÓN DE
LAS COLONIAS
1
Exterior
20
2
3
Canal Exterior
Trampa Taller Multiplicador
22
10
4
5
Canal de la Trampa
Caneca
20
20
6
7
Tanque de Transporte
Ex Caja de Captación
7
13
8
Concentración Tensoactivos
19
9
Campo de Prueba
23
10
11
Lodos PTAR
Fitorremediación
13
4
12
Caño PTAR
5
7.4 ENSAYO DE BIODEGRADACIÓN
De las 176 cepas inicialmente aisladas solamente 134 cepas presentaron las condiciones
necesarias (crecimiento a una densidad de No. 1) para el ensayo de biodegradación. Se
establecieron 27 grupos cada uno con 5 bacterias con base en la metodología descrita
(Tabla 5). Es probable que las cepas que no crecieron adecuadamente en el medio
líquido no tuvieran la capacidad enzimática de utilizar el PETN dentro de su metabolismo.
En el ensayo de Binks y colaboradores (11),
también se aplico este parámetro de
selección, siendo la cepa Enterobacter cloacae PB2 la única que creció en presencia de
PETN como única fuente de nitrógeno. Las cepas que no tuvieron la densidad óptica
adecuada, fueron almacenadas para análisis posteriores, ya que una baja concentración
de biomasa no quiere decir que no presente degradación.
- 18 -
Tabla 5: Cepas utilizadas en la formación de los grupos bacterianos para el ensayo
de biodegradación de PETN.
Grupo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Cepas
1,2,3,4,5
7,8,9a,9b,10
11,13,14,15,16
6,19,20,21a,22
23,24,25,26,27
29,30,34,35,36
37,38,39,40,42
43a,43b,44,48,49
50,54,55,56,57
53,58,59,60,61
62,63,64,66,67
68,69,71,72,73
74,75,76,77,80
41,46,52,65
Grupo
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
cepas
82,85,86,88,89
90,91,92,93,94
95,96,97,98,103
105,106,108,110,111
112,113,115,116
119,120,121,123,124
126,127,129,130,131
132,133,135,136,137
140,141,142,143,144
145,146,147,148,149
151,155,156,157,159
161,162,163,165,167
169,170,171,172,174
7.5 EXTRACCIÓN DE PETN
El método EPA 8330 B recomienda 2 protocolos de extracción del explosivo desde las
muestras. El salting out, para muestras con concentraciones menores a 1 ppm y el
Aqueous high-level method para concentraciones de 1 a 50 ppm de explosivo. La
concentración inicial de PETN para en los cultivos líquidos fue de 100 ppm, pero a pesar
que esta excedía los límites del método, este se utilizó en la extracción de las muestras.
En los ensayos preliminares de extracción del T2, se obtuvieron bajos porcentajes de
recuperación (p.e., 12%). Al implementar lavados del tubo Falcon con el solvente de
extracción y cuantificar la concentración de PETN, se determinó que parte del PETN
quedaba como remanente en el tubo Falcon ya que probablemente cuenta con una
superficie porosa, lo cual podría inducir a un error sistemático en todas las extracciones.
Por lo tanto el proceso de lavado del tubo Falcon se incluyó en el protocolo de extracción,
como modificación del método EPA 8330 B.
Una vez realizada la determinación de PETN mediante HPLC, los datos obtenidos fueron
analizados para determinar cual de los grupos presentaba la mayor degradación. Se
presentó una distribución normal y por esta razón se utilizó una prueba de Tukey (p<0.05)
- 19 -
El control abiótico mostró una baja dispersión de los resultados con una alta precisión. De
igual forma esto indicaría una degradación por factores físicos y químicos del ~12%
durante el ensayo. En un estudio de la estabilidad del PETN llevado a cabo por Jenkins y
colaboradores (17) se evidencio la desaparición total del explosivo en un periodo de 4
días a temperatura ambiente, el ensayo se llevó a cabo en una matriz sólida como lo es el
suelo, sin embargo la concentración inicial fue mucho menor a la que se utilizó en este
estudio siendo tan solo 0, 701 ppm comparada con 100 ppm para este ensayo. Un factor
que puede afectar la determinación de la degradación abiótica, es la solubilidad. En el
ensayo anteriormente referenciado, se reporta una solubilidad de PETN en agua de 4
mg/L, al igual que se ha reportado 6 mg/L de solubilidad en agua (2), hecho que hace que
este compuesto sea más susceptible a reacciones fisicoquímicas como, la fotolisis y
reacciones de oxido reducción. Para observar este proceso de degradación abiótico, sería
necesario investigar concentraciones iniciales más pequeñas, que se puedan cuantificar
con más precisión
Tabla 5: Condiciones del control abiótico
Muestra
CA R1
CA R2
CA R3
Área
10.071.836,00
8.633.726,90
8.292.441,10
Concentración
ppm
98,08
84,32
81,06
Desviación
SD
Media
CV
%CV
9,03
87,82
0,10
10,29
.
7.6 RESULTADOS DEL ENSAYO DE BIODEGRADACIÓN
La prueba Shapiro wilk indico que los datos presentaban una distribución normal (Grafica
1). Se utilizaron las pruebas paramétricas de Anova y Tukey para evaluar cuáles de los
grupos presentaban una degradación significativamente mayor (p<0.05). Estos análisis
permitieron identificar diferencias significativas entre los grupos evaluados.
Se pudieron identificar 14 grupos que presentaban una concentración significativamente
menor (Gráfica 2).
- 20 -
Gráfica 1. Distribución de las concentraciones de PETN mg/L durante el estudio
45
.01
.05.10
.25
.50
.75
.90.95
.99
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-2
-1
0
1
2
3
Normal Quantile Plot
Gráfica 2: Prueba de Tukey para los 27 grupos bacterianos.
100
90
80
PENT mg/L
70
60
50
40
30
20
Grupo
G9
G8
G7
G6
G5
G4
G3
G27
G26
G25
G22
G23
G24
G21
G2
G20
G17
G18
G19
G16
G15
G14
G13
G12
G11
G1
G10
0
CA
10
All Pairs
Tukey-Kramer
0.05
La Annova aplicada a estos 14 grupos, mostró que existían diferencias significativas con
un valor de F de 0,0053. Por lo tanto se aplico nuevamente la prueba de Tukey para
comparar las medias entre estos grupos y definir los que tuvieran menor concentración
final (Grafica 3).
- 21 -
Gráfica 3: segunda prueba de Tukey a 14 grupos restantes
25
PENT mg/L
20
15
10
G9
G5
G4
G27
G26
G25
G24
G22
G21
G17
G16
G15
G13
G1
5
Grupo
Nuevamente se escogieron los grupos con la menor media de la concentración final de
PETN. El resultado fue la selección de 7 grupos bacterianos (grafica 4), en los que no se
encontraron diferencias significativas entre sus medias, Los cuales son los que tienen la
menor concentración de explosivo y por consiguiente presentan mayores porcentajes de
degradación teniendo en cuenta que la concentración inicial de todos los cultivos líquidos
por grupos fue de 100 ppm. Estos grupos son los que se escogerán para posteriores
investigaciones.
Gráfica 4: grupos bacterianos finales con la menor concentración final de PETN
20
18
PENT mg/L
16
14
12
10
8
6
4
2
G15
G21
G24
G26
Grupo
- 22 -
G27
G5
G9
Se evidenció reducción en la concentración inicial de PETN (100 ppm), en todos los
grupos de microorganismos lo cual impide determinar cuál de las muestras tiene mayor
probabilidad de aislamiento de cepas degradadoras, sin embargo
en la tabla 6 se
observa la relación entre los grupos bacterianos y las muestras de donde provienen las
cepas que hacen parte de los grupos.
- 23 -
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Se logró evidenciar el crecimiento bacteriano en los medios sólidos bajo las tres diferentes
condiciones suplementados con una concentración final de 100 ppm de PETN, sin
embargo no se pudo diferenciar resistencia de los microorganismos hacia el PETN o
degradación del mismo.
No se pudo establecer el uso del PETN como fuente de carbono o nitrógeno, para
realizar este objetivo son necesarios estudios mas detallados, en donde se definan cuáles
son los metabolitos producidos en la biodegradación, para poder hacer un seguimiento de
las rutas metabólicas implementadas por los microorganismos.
Se logró reducir el número de las cepas aisladas a a 7 grupos que podrian indicar 35
bacterias potencialmente degradadoras, son necesarios estudios individuales, para
determinar en cual de ellas se presenta la degradación de PETN. De igual forma se
determinaron los sitios de muestreo con el mayor potencia para el aislamiento de
microorganismos con la capacidad degradadora de PETN (Anexo 6).
Debido a la baja solubilidad del PETN, es aconsejable utilizar volúmenes más pequeños
para el cultivo líquido, en donde la concentración inicial, sea dispensada individualmente
para cada unidad experimental. Es necesario estandarizar el proceso de extracción del
explosivo de las muestras, para tener mayor confiabilidad en los datos obtenidos.
- 24 -
9. REFERENCIAS
1. Lewis T., Newcombe D., Crawford R. 2003. Bioremediation of soils contaminated
with explosives. Journal of Environmental Management. 70: 291-307
2. Zhuang L. 2007. Remediation of Pentaerythritol Tetranitrate (PETN) Contaminated
Water and Soil. Universidad de Waterloo, Ontario, Canada.
3. Hurst Christon., Knudsen Guy., Mlnerney Michael., Stetzenbach Linda., Walter
Michael. 1997. Manual of enviromental microbiology. American society of
microbiology. ASM press. Washington, USA.
4. Akhavan J. 2004. The chemistry of explosives. Segunda edición. The royal society
of chemistry. Manchester Inglaterra.
5. Fordham S. 1990 high explosives and propellants. Second edition pargamon
press. Oxford Inglaterra.
6. Torok J., Kristek F. 2002. Beneficial effect of pentaerythrityl tetranitrate on
functional and morphological changes in the rat thoracic aorta evoked by long-term
nitric oxide synthase inhibition. Vascular Pharmacology 38 177– 182
7. Zoe C., Neil B. 2006. Bacterial pathways for degradation of nitroaromatics. Natural
Product Reports 23: 845-850.
8. Park C., Kim T., Kim S., Kim S-W., Lee J., Kim S-H 2003. Optimization for
Biodegradation of 2,4,6_Trinitrotoluene (TNT) by Pseudomonas putida. Journalof
bioscienceandbioengineering. Vol. 95, No. 6: 567-571
9. Fleischmann T., Walker K., Spain J., Hughes J., Craig M. 2004. Anaerobic
transformation of 2,4,6-TNT by bovine ruminal microbes. Biochemical and
Biophysical Research Communications. 314: 957–963
10. Nivinskas H; Sarlauskas J; Anusevicius Z; Toogood H; Scrutton N; Cenas N.
Reduction of aliphatic nitroesters and N-nitramines by Enterobacter cloacae PB2
pentaerythritol tetranitrate reductase: quantitative structure-activity relationships.
The FEBS journal 2008;275(24):6192-203.
11. Binks R., French C., Nicklin S., Bruce N. 1996. Degradation of pentaerythritol
tetranitrate by Enterobacter cloacae PB2. Appl. Environ. Microbiol. 62:1214–1219.
12. French, C. E., Rosser, S. J., Davies G.J., Nicklin, S., and Bruce, N. C. 1999.
Biodegradation of Explosives by Transgenic Plants Expressing Pentaerythritol
Tetranitrate Reductase. Nature Biotechnology. 491-494
13. Vanek, T., Nepovim A., Podlipna, R., Zeman, S., Vagner, M. Fitoremediation of
selected explosives. Water, air and soil pollution.259-267, 2003.
- 25 -
14. EPA- Environmental Protection Agency. 2006. Nitroaromatics, nitramines, and
nitrate esters by high performance liquid chromatography (HPLC). Método 8330 B.
Port Royal Road Springfield, Virginia 22161, EEUU
15. White, G.F. and J.R. Snape. 1993. Microbial cleavage of nitrate esters: defusing
the environment. J. Gen. Microbiol. 139:1947–1957.
16. Gunnison, D., Pennington J., Price C., Myrick G., Screening Test and Isolation
Procedurefor TNT-Degrading Microorganisms. U.S army corp of engineers. Military
research.1993.
17. Jenkins T, Bartolini C, Ranney T. Stability of CL-20, TNAZ, HMX, RDX, NG, and
PETN in Moist, Unsaturated Soil. U.S army corp of engineers. Military
research.2003.
- 26 -
10. ANEXOS
ANEXO 1: REVISIÓN BIBLIOGRAFICA DE MEDIOS DE CULTIVO.
componentes
medio 1
medio 2
medio 3
fuente de carbono
22mM Glucosa
30mM de Piruvato
20mM Glicerol / 20mM
Glucosa
Solución Ésteres
0.2mM TNT,
de Nitrato
KH2PO4, 0.16 g/L;
K2HPO4 x 3 H20,
fuente de fósforo y 19.5 mM KH2PO4, 0.42 g/L; Na2HPO4
buffer
30.5 mM Na2HPO4 x 2 H20, 2.2 g/L;
NaH2PO4 x H20, 1.1
g/L.
Presente en la
solución
de
elementos traza:
20mM
Sulfato;
20mM
FeSO4,
fuente de azufre
50mL Na2S; 0.1 g/L
5mM ZnSO4, 5mM
MgSO4.7H2O.
MnSO4,
1mM
CuSO4, 1mM
CoSO4
4 mL de una
solución
compuesta
por:
0.5M HCl, 25mM 20mL
Elementos
MgO,
20mM traza
(no
CaCO3,
20mM especificados), 1mL
elementos traza
FeSO4,
5mM de
solución
de
ZnSO4,
5mM vitaminas
(no
MnSO4,
1mM especificadas)
CuSO4,
1mM
CoSO4, and 1mM
H3BO4
fuente de nitrógeno
autor, año
606µM TNT
7g/L Na2HPO4·12H2O,
3 g/L de KH2PO4
1 g de NaCl
-
-
Stenuit B., Eyers L.,
FRENCH
C.,
Preuss A., Fimpel Rozenberg R., HabibNICKLIN
S.,.
J., Diekert G. 1993
Jiwan J., Agathos S.
BRUCE N. 1998
2006
- 27 -
Continua Anexo 1:
Componentes
medio 4
medio 5
medio 6
200mg/L extracto de
Levadura,
0,02M
Fuente de carbono
20mg/L TNT
Acetato,
0,02M
Succinato
8, 15, 25, 35 and
0,25g/L
Fuente de nitrógeno
100mg/L TNT
45mg/L DNT
(NH4)2SO4
K2HPO4
0.7
g/L;
KH2PO4,
0.3
g/L; 7g/L K2HPO4; 3g/L
Fuente de fósforo y
(NH4)2SO4, 0.5 g/L; KH2PO4; 0,1 g/L
0,2g/L KH2PO4
buffer
NaCl, 0.5 g/L; CaCl2· NaCI;
2H20, 0.1 g/L; FeSO4
·7H20, 0.003 g/L;
Presentes
en
solución
de
elementos
traza: MgSO4 · 7H20, 0.05
5.0 g/L FeSO4 g/L;
0,1g/L
MgSO;
Fuente de azufre
×7H2O; 5.0 g/L FeSO4 ·7H20, 0.003 0,25g/L (NH4)2SO4
ZnSO4.7H2O; 5.0 g/L
g/L MnSO4 ×H2O;
5.0 g/L CuSO4
5.0
g/L
FeSO4.7H2O; 5.0
g/L ZnSO4 ×7H2O;
0.1 g/L H3BO3 y 0.05
5.0 g/L MnSO4
g/L de: CaSO4·5H20,
×H2O;
5.0 g/L
Elementos traza
ZnSO4·7H20
y CuSO4 ×5H2O; 0.1
Na2MoO2·6H20.
g/L CoCl2 ×6H2O;
0.1 g/L Na2B4O7
×10H2O y 0.1 g/L
Na2MoO4 ×2 H2O
Pacaa J., Haleckya Spanggord R., Spain Park C., Kim T.,
M.,
Bartaa
J., J.,
Nishino
S., Kim S., Lee J., Kim
Autor, año
Bajpai R.
Mortelmans K.
S-W.
2008
1991
2002
- 28 -
ANEXO 2: COMPOSICIÓN DEL MEDIO MÍNIMO DE SALES.
SOLUCIÓN
COMPOSICIÓN
CANTIDAD
Tampón
K2HPO4
17, 5 g
Llevada a 250 mL con agua
destilada.
KH2PO4
7,5 g
HCl
3 mL
NaCl
12,5 g
MgSO4 * 7 H2O
5g
CaCl2
1g
Hierro
HCl
3 mL
Llevada a 100 mL con agua
destilada.
FeSO4 * 7 H2O
0,3 g
HCl (18 – 19%)
20 mL
MnSO4*H2O
0,2 g
H3BO4
0,1 g
Elementos trazas
CaSO4*5 H2O
0,05 g
Llevada a 1000 mL con agua
destilada.
CoSO4 * 5H2O
0,01 g
Na2MoO4 * 2H2O
0,01 g
NiSO4 * 6 H2O
0,01 g
Piridoxina clorhidrato
0,05 g
p- ácido aminobenzoico
0,025 g
Ácido nicotínico
0,025 g
Vitaminas
Pantotenato de calcio
0,025 g
Esterilizada por filtración.
Llevada a 500 mL con agua
destilada.
Riboflavina
0,025 g
Vitamina B 12
0,025 g
Tiamina clorhidrato
0,025 g
Biotina
0,01 g
Àcido fólico
0,01 g
Sales
Llevada a 250 mL con agua
destilada.
- 29 -
Por cada 1000 mL de medio de cultivo se utilizó antes de esterilizar:
Solución
Cantidad
Buffer
10 mL
Sales
10 mL
Fuente de carbono ó
nitrógeno
10 mL
Agar (medio sólido)
15g/L
Se ajustó el pH a un pH 7,2 ±0,2 antes de esterilizar por autoclave. Después de
esterilizar se adicionó:
Solución
Cantidad
Hierro
1 mL
Trazas
1 mL
Vitaminas previamente esterilizada
mediante filtración
1 mL
PETN (100 ppm)
5 mL
ANEXO 3: PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DEL PATRÓN DE MAC FARLAND
 Solución de Cloruro de Bario (BaCl2) (0,048 M)
Molaridad = moles / Litro
0,048 M= moles BaCl2
0,1 L
Moles= 0,048 moles x 0,1L
Moles= 4,8 x 10-3 moles x 244,28 g = 1,17 gramos de BaCl2 para preparar
1 mol BaCl2
100 mL de solución de BaCl2.
 Solución de Ácido Sulfúrico (H2SO4) (0,36 N)
N= eq gramos
L
0,36 N = eq gramos
0,1 L
- 30 -
Eq gramo= 0,36 N x 0,1 L
Eq gramo= 0,036 eq g x 98.08 g H2SO4 / 2 = 1,765 gramos H2SO4
1 eq g H2SO4
1,765 g H2SO4 x 100 = 1,801 gramos.
98 pureza
CURVA DE CALIBRACIÓN DEL PATRÓN DE MAC FARLAND
0.7
0.6
Absrobancia (nm)
0.5
0.4
0.3
0.2
y=3.7333333333e-10x + 0.0206
R2=0.9961627405
0.1
0.0
0.0
2.0e+8
4.0e+8
6.0e+8
8.0e+8
1.0e+9
1.2e+9
1.4e+9
1.6e+9
Células/ mL
Volumen= 1 mL de H2SO4 para preparar 100 mL de solución con agua destilada
- 31 -
.ANEXO 4: ABSORBANCIA DE LAS CEPAS AISLADAS
cepa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
absorbancia
cepa
0,124
202
0,077
0,07
0,161
0,275
0,176
0,11
0,09
0,119
0,063
0,022
0,122
0,09
0,115
0,078
0,021
0,028
0,096
0,093
0,231
0,139
0,037
0,141
0,032
0,049
0,02
0,048
0,037
0,07
0,027
0,042
0,97
0,089
NC
0,032
- 32 -
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
absorbancia
0,324
0,214
0,126
0,065
0,047
0,156
0,055
0,029
0,092
0,098
NC
0,033
0,017
0,136
0,057
0,93
0,153
0,112
0,111
0,6
0,035
NC
0,042
0,013
0,0134
0,113
0,01
0,04
0,018
0,028
0,029
0,049
0,035
NC
0,033
0,033
ANEXO 5: COLORACION GRAM DE ENRIQUECIMIENTOS.
Tto
Bacilos
Gram
Positivos
Bacilos
Gram
Negativos
T1
T2
T3
T1
T2
T3
T1
T2
T3
T1
T2
T3
T1
T2
T3
T1
T2
T3
T1
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
T2
T3
T1
T2
T3
T1
T2
T3
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
-
Mtra.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
T1
T2
T3
T1
T2
T3
T1
T2
T3
- 33 -
Cocos
Gram
Positivo
s
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
-
ANEXO 6: MUESTRAS A LAS QUE PERTENECE CADA GRUPO
Grupo
5
9
15
21
24
26
27
muestra
# 2 Canal Exterior
# 4Canal de la Trampa
# 5 caneca
#8 cancentracion de
tensoactivos
# campo de prueba
# fitorremediacion
# caño PTAR
- 34 -
cepas
7,8,9a,9b,10
6,19,20,21a,22
23,24,25,26,27
126,127,129,130,131
145,146,147,148,149
161,162,163,165,167
169,170,171,172,174