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UNALM
RESULTADOS PRIMERA PARTE
“Obtención de péptidos bioactivos con
actividades antihipertensiva y antioxidante a
partir dos variedades de quinua
Chenopodium quinoa) y evaluación de su
estabilidad al metabolismo gastrointestinal y
biodisponibilidad in vitro”
I B T
Dr. David campos G.
[email protected]
15 Agosto 2013
Péptidos bioactivos
Péptidos con actividad biológica,
• Naturalmente presentes en los alimentos
• Durante el procesamiento, fermentación
• Consecuencia de la digestión gastrointestinal
• A través de procesos de biotransformación enzimática
Fuente: proteínas origen animal y vegetal
(cereales y leguminosas nativos)
Péptidos bioactivos y sus efectos benéficos en el organismo
Hipertensión
péptidos inhibidores de la
enzima convertidor de angiotensina (ACE)
Péptidos antioxidantes
El mecanismo exacto de la actividad antioxidante de péptidos aun no está
esclarecido, se ha propuesto (Qian et al., 2008; Rajapakse et al., 2005). :
• péptidos son inhibidores de la peroxidación de lípidos,
• atrapadores de radicales libres y
• quelantes de iones metálicos de transición
Además, los péptidos antioxidantes mantienen a las células a salvo de daños
por estrés oxidativo a través de la inducción de genes. En este sentido, el
péptido Met-Tir del músculo de sardina previene el estrés oxidativo
estimulando la expresión de hemo oxigenasa-1 y ferritina en células
endoteliales (Erdmann et al., 2006).
Formación de péptidos bioactivos
Péptido antihipertensivos
Phe-Phe-Val-Ala-Pro
Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr-Gly-LeuPhe
Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu
Ile-Pro-Ala-Val-Pke-Lys-Trp-LeuAla-His-Lys-Ala-Leu-Pro-Met-HisIle-Arg
Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-ProArg
Leu-Leu-Pro-His-His
Low molecular weight peptides
Ile-Val-Tyr
Arg-Pro-Leu-Lys-Pro-Trp
MATERIALES Y METODOS
Dos variedades de quinua:
1.Blanca Hualhuas
2.Pasankalla
Péptidos obtenidos de la proteína de
quinua con actividad antihipertensiva y
antioxidante
Harina de quinua
Extracción de la proteína
Hidrólisis enzimática
Péptidos antioxidantes e
inhibidores ACE:
Determinación de la estabilidad
Biodisponibilidad
METODOS
Determinación de la humedad, materia seca y proteína: método
AOAC 925.40 (1995).
Determinación de la capacidad antioxidante: Para ABTS, se utilizó
el método reportado por Torruco–Uco et al. (2009) y Re, et al.
(1999) adaptado para hidrolizados proteicos. Para ORAC (Cao et al.,
1993)
Determinación de proteína soluble: Se determinó mediante el
método de Lowry et al. (1951).
Determinación del grado de hidrólisis: Se determinó mediante el
método reportado por Adler – Nissen (1979)
Determinación de la actividad inhibitoria (I-ACE) : Se determinó
por el método de Wu et al. (2002).
….METODOS
Determinación del IC50 : Se determina según lo propuesto por Barbana y Boye (2011).
El valor de IC50 se define como la concentración de inhibidor requerida para reducir
50% de la enzima convertidora de angiotensina (ACE). Los resultados se expresan en
mg/mL.
Evaluación de la estabilidad de los péptidos frenta a condiciones de digestión
gástrica in vitro: Las muestras (4mg/mL), se someterán secuencialmente a la acción de
la pepsina (0,05 mg/mL) durante 2 horas a 37 ºC en un medio ajustado a pH 2.0 con HCL
1N y pancreatina (0,05mg/mL) por 4h ajustando el pH a 5.3 con Na 2CO3 y 7 con NaOH
1N, a 37ºC, finalmente se detiene la reacción colocando las muestras en tubos
herméticamente sellados en un baño de 95ºC por 10 minutos.
Evaluación de la biodisponibildad in vitro
Purificación y caracterización :
Cromatografía de filtración sobre gel
Cromatografía en fase reversa (HPLC-DAD)
Electroforesis
….METODOS
Determinación del IC50 : Se determina según lo propuesto por Barbana y Boye
(2011). El valor de IC50 se define como la concentración de inhibidor requerida
para reducir 50% de la enzima convertidora de angiotensina (ACE). Los
resultados se expresan en mg/mL.
Evaluación de la estabilidad de los péptidos frenta a condiciones de
digestión gástrica in vitro: Las muestras (4mg/mL), se someterán
secuencialmente a la acción de la pepsina (0,05 mg/mL) durante 2 horas a 37 ºC
en un medio ajustado a pH 2.0 con HCL 1N y pancreatina (0,05mg/mL) por 4h
ajustando el pH a 5.3 con Na2CO3 y 7 con NaOH 1N, a 37ºC, finalmente se
detiene la reacción colocando las muestras en tubos herméticamente sellados en
un baño de 95ºC por 10 minutos.
Evaluación de la biodisponibilidad in vitro : Se realizará según las
condiciones establecidas por Pacheco-Palencia et al. (2008) y Satake et al.
(2002).
Resultados
Optimización de extracción de la
proteína
1.
2.
Screening
Optimización estadística ,
metodología de superficie de
respuesta
Screening: Grafica de Pareto, efectos estandarizados
Diagrama de Pareto Estandarizada para Proteina soluble A
10
G:Relación solvente a mp
2do
A:pH
B:NaCl
4to
D:Temperatura
3ro
C:Tiempo
E:Solvente
F:Tamaño de partícula
0
1
2
3
Efecto estandarizado
4
5
+
-
Factores y niveles por factor del diseño central
compuesto, para la optimización de la extracción de la
proteína de quinua.
Factor
Niveles
-2
-1
0
+1
+2
pH
7
8
9
10
11
Tiempo (h)
30
60
90
120
150
Temperatura (ºC)
14
23
32
41
50
Relación solvente /
materia prima (v/p)
6
12
18
24
30
Superficie de respuesta de la optimización de
extracción de proteína temperatura (ºC) y relación de
solvente a materia prima (v/p)
F it t e d S u r f a c e ; V a r ia b le : P r o t e in a s o lu b le ( m g / 1 0 0 m g m a t e r ia p r im a )
4 f a c t o r s , 1 B lo c k s , 2 9 R u n s ; M S R e s id u a l= , 2 3 5 7 0 4 5
D V : P r o t e in a s o lu b le ( m g / 1 0 0 m g m a t e r ia p r im a )
Tem
per
atu
ra(
ºC)
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
v
tra(
ues
am
ente
solv/p)
ción
Rela
3032
2
8
26
2224
2
0
1618
1
4
1012
8
46
g/100mg
soluribalep(rim
Proteinam
ate ma)
R2 = 94,7823 %
R2(adj) = 85,6513 %
Error estándar del est. = 2,82424
Error absoluto medio = 1,46833
Estadístico Durbin-Watson = 2,49927 (P=0,7355)
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,320727
12
10
8
6
4
2
0
P.S. = -98,1516 - 0,587633*T + 5,2435*SMP + 20,3264*pH- 0,208855*θ - 0,0184275*T^2
+ 0,0212269*T*SMP + 0,17875*T*pH- 0,00314352*T* θ- 0,079934*SMP^2 0,239792*SMP*pH - 0,00217361*SMP* θ - 1,15263*pH^2 + 0,045875*pH* θ 0,000180694* θ^2
>
<
<
<
<
8
8
6
4
2
Condiciones óptimas de extracción
• Temperatura es 36,2ºC,
• Relación de solvente a materia prima (v/p) de 20/1;
• pH 11 y
• Tiempo 149 minutos,
RENDIMIENTO:
• 63.92 miligramos de proteína soluble por cada 100
miligramos de proteína total (Kjeldahl, fc=5,85),
• que corresponde al 11,1% de la materia prima.
Estudio de la hidrolisis
enzimática
Selección de enzimas: de uso alimentario
, propiedades cinéticas y mecanismos de
acción diferentes.
• Flavourzyme®
• Alcalase®
• Neutrase®
Enzimas empleada durante la hidrólisis de la proteína
de quinua
Enzima/reacción
Alcalasa®
0.385 UA(1)/g de proteína
pH inicial y
Temperatura
8.3 y 50 °C
Flavourzyme®
50 U LAPU(2)/g de proteína
7.0 y 50 °C
Neutrasa®
0.385 UA(1)/g de proteína
7.0 y 50 °C
Dos etapas:
Primera etapa Alcalasa®
Segunda etapa Flavourzyme®
0.385 UA/ g de proteína
50 U LAPU/ g de proteína
8.3 y 50 °C
7.0 y 50 °C
Dos etapas:
Primera etapa Alcalasa®
Segunda etapa Neutrasa®
50 U LAPU/ g de proteína
0.385 UA/ g de proteína
7.0 y 50 °C
8.3 y 50 °C
Dos etapas:
Primera etapa Neutrasa®
Segunda etapa Alcalasa®
0.385 UA(1)/g de proteína
0.385 UA(1)/g de proteína
8.3 y 50 °C
7.0 y 50 °C
(1)
(2)
Anson units
Leucine aminopeptidase unit
Concentración de enzima
Porqué trabajar con reactores en dos etapas??
70
Primera etapa
Segunda etapa
60
50
Reactor dos etapas
40
30
Reactor una etapa
)
(%
ls
ió
h
e
o
d
ra
G
20
10
0
0
50
100
150
Tiempo (min)
200
250
Evolución de la hidrolisis, a diferentes tiempos, en
reactores de una (A) y dos etapas (B)
A
B
Grados de hidrólisis (%) obtenidos a 240 min de reacción:
Alcalasa
Neutrasa
Flavourzyme
36.86±0.5
31.46±0.9
11.86±2.2
Alcalasa y flavourzyme
Flavourzyme y alcalasa
Alcalasa y neutrasa
Neutrasa y alcalsa
61.81±1.9
62.62±1.1
49.75±1.4
47.85±0.6
Evolución de la proteína soluble, a diferentes
tiempos, en reactores de una (A) y dos etapas (B)
Capacidad antioxidante ABTS, a diferentes
tiempos, en reactores de una etapa
Capacidad antioxidante
obtenida a 240 min de
reacción:
Alcalasa
1697.07±50.9 µmol TE/g de prote.
Neutrasa
1480.50±21.6 µmol TE/g de prote.
Flavourzyme
1281.87±35.1 µmol TE/g de prote.
Capacidad antioxidante ABTS, a diferentes
tiempos, en reactores de dos etapas
Capacidad antioxidante
obtenida a 240 min de
reacción:
Alcalasa y flavourzyme
Flavourzyme y alcalasa
Alcalasa y neutrasa
Neutrasa y alcalasa
2311.36±77.1 µmol TE/g de prote.
2146.40±72.2 µmol TE/g de prote.
2075.78±46.2 µmol TE/g de prote.
2007.88±87.8 µmol TE/g de prote.
Hidrólisis de la proteína de quinua con endo-proteasa Alcalasa®
y capacidad antioxidante
Blanca Hualhuas
Pasankalla
Inhibición de la angiotensina a diferentes
tiempos, en reactores de una etapa
Porcentaje de inhibición de
la angiotensina obtenido
120 min de reacción:
Alcalasa
87.34±0.8 %.
Neutrasa
89.22±0.7 %.
Flavourzyme
17.02±0.2 %.
Inhibición de la angiotensina a diferentes
tiempos, en reactores de dos etapas
Porcentaje de inhibición de
la angiotensina obtenido
120 min de reacción:
Alcalasa y flavourzyme
Flavourzyme y alcalasa
Alcalasa y neutrasa
Neutrasa y alcalasa
76.72±0.9 %.
73.29± 0.9 %.
93.05±0.3 %.
88.58±0.4%.
Hidrólisis de la proteína de quinua con endo-proteasa Alcalasa® e
inhibición de la enzima convertidora de angiotensina
Blanca Huallhuas
Pasankalla
Valores IC50 para diferentes tratamientos
enzimáticos
Valores ACE,
IC50
Alcalasa 60 min
280 µg/ml.
Alcalasa 120 min
120 µg/ml.
Neutrasa 120 min
98 µg/ml.
Valores IC50 para diferentes tratamientos
enzimáticos
Valores ACE,
IC50
Alcalasa y neutrasa 120 min
79.5 µg/ml.
Neutrasa y alcalsa 120 min
103.9 µg/ml.
Falvourzyme y alcalasa 120 min
470 µg/ml.
Valores IC50 de los péptidos inhibidores de la enzima
convetidora de angiotensina. Hidrólisis con alcalasa, 60 min
IC50 = 0.28 mg/ml
Efecto de la simulación gastrointestinal in vitro en la actividad
inhibitoria ACE-I del hidrolizado de tiempo 60 (min) con grado de
hidrólisis 31.4 %.
Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante
cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )
Hidrólisis con alcalasa
I-ACE (%)
DO, 214 nm
Separación de los péptidos con actividad inhibidora angiotensina mediante
cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )
Hidrólisis con alcalasa – neutrasa
I- ACE
Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante
cromatografía de filtración de gel (Biogel P2® )
Hidrólisis con alcalasa – neutrasa
I- ACE
Separación de los péptidos con actividad inhibidora de angiotensina mediante
cromatografía de filtración en gel (Biogel P2® )
Hidrólisis con neutrasa
Conclusiones
 Se ha optimizado el procedimiento de extracción de la proteína de
quinua. pH = 11. Temperatura =36 °C. Rela. solv/mp = 20/1. Tiempo
=150 min.
 Con reactores de dos etapas, combinando enzimas con mecanismos de
acción diferentes se obtienen Grados de Hidrólisis de la proteína altos ,
mayores a 60% y Capacidad antioxidante elevada .
 La hidrólisis en dos etapas también permite obtener péptidos con alta
actividad anti - hipertensiva (IC50 = 80 µg/ml) y estables al sistema
gastrointestinal.
 La proteína de quinua hidrolizada podrá ser empleada
elabaoracion de alimentos funcionales y/o nutraceuticos .
para la