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Las Directrices sobre Validación de la OIE aportan información detallada y ejemplos que respaldan
la norma de validación de la OIE publicada como Capítulo 1.1.5 del Manual Terrestre, o como
Capítulo 1.1.2 del Manual Acuático. El Término “Norma de Validación de la OIE” de esta Directriz
hace referencia a estos capítulos.
Para el diagnóstico de enfermedades infecciosas tanto en varias especies animales y como en el
hombre se están utilizando cada vez más pruebas de detección de ácido nucleico (NAD). Los
métodos más frecuentes son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de la cual existen
distintas variantes, y los métodos de amplificación isotérmica (como la amplificación isotérmica
mediada por bucle). Además, están apareciendo chips de ADN de fase líquida o de fase sólida que
son nuevas herramientas de diagnóstico basadas en la biotecnología. Las técnicas de
amplificación que se utilizan en estas pruebas les confieren una sensibilidad analítica alta. Los
productos de la reacción de amplificación pueden detectarse de muchas formas distintas, como por
ejemplo, por visualización en geles de agarosa, utilizando sondas marcadas (como las sondas
TagMan), mediante detección de la acumulación de los productos en tiempo real o utilizando chips
donde se captura sondas específicas en una matriz de superficie sólida o en perlas (Lauerman,
2004; Viljoen et al., 2005). Pueden ejecutarse al mismo tiempo distintas PCR para detectar varios
analitos en un mismo tubo o para combinar analitos y controles que generen distintos productos de
la amplificación, todos en un solo recipiente de reacción. Aunque ello tiene evidentes ventajas,
debe procederse con mucho cuidado durante la optimización para asegurarse de que no se
comprometa el rendimiento diagnóstico de la prueba. De forma similar, puede crearse una PCR de
múltiples resultados empleando un conjunto de cebadores, pero utilizando sondas marcadas que
se unan a distintas secuencias diana en función de la especie o cepa que detecte la PCR (Wakeley
et al., 2005; 2006).
Las técnicas de amplificación para la NAD suelen basarse en el principio de que hay una
amplificación exponencial de la secuencia específica que se pretende detectar en la reacción. Ello
aporta una NAD con sensibilidad y especificidad analíticas altas. Debido a este característico nivel
alto de sensibilidad logrado con la NAD, debe procederse con cuidado y, de hecho, deben
emprenderse pasos preventivos especiales para impedir la contaminación de la NAD por
amplicones en los análisis de las siguientes muestras. Es más probable que ello suponga un
problema cuando en el laboratorio se abren los tubos de reacción para un posterior procesado, por
ejemplo para analizar geles o para llevar a cabo pruebas anidadas. Para evitar tal contaminación,
deben aplicarse estrictos protocolos de laboratorio que incluyan salas o cabinas independientes
para cada fase de las pruebas, cambios de batas y guantes de laboratorio y rigurosos programas
de limpieza (Viljoen et al., 2005; Subcommittee of Animal Health Laboratory Standards). Por estos
motivos, las pruebas que se basan en sistemas de tubo cerrado en general son más adecuadas
para el diagnóstico (Sawyer et al., 2006). Como ocurre con todas las pruebas, es importante utilizar
protocolos adecuados para demostrar que la prueba está ofreciendo el rendimiento diagnóstico
esperable. Es necesario conocer sin duda la procedencia de las muestras que se utilicen en el
desarrollo de la prueba, y el desarrollo debe realizarse en el contexto de un sistema de calidad que
permita asegurar unos niveles adecuados de formación, mantenimiento y seguimiento del equipo,
etc. (Burkhardt, 2000).
Lo primero a tener en cuenta al desarrollar una prueba es la
necesidad de definir claramente el propósito y aplicación concreta
Propósito de la prueba:
de la prueba en cuestión, y de saber cómo se aplicará, porque de
 ¿Es la prueba de cribado, confirmativa o
ello dependerán muchas decisiones que se tomen a lo largo de la
para ambos fines?
fase de desarrollo. Por ejemplo, podría desarrollarse una prueba
 ¿Sirve la prueba para detectar un grupo
de cribado para detectar todos los subtipos o variantes de
de agentes patógenos?
 ¿Sirve la prueba para detectar un solo
influenza aviar (IA) en las aves, para lo cual sería necesaria una
agente patógeno?
prueba inclusiva que reaccionara ampliamente, o bien puede
 ¿Sirve la prueba para distinguir entre
desarrollarse una prueba para determinar el tipo de hemaglutinina,
animales vacunados y animales
en cuyo caso será necesaria una prueba más específica. En
infectados?
algunas pruebas, el requisito es detectar un grupo de virus, como
en el caso de las PCR que detectan todos los pestivirus, útiles
para detectar los virus de la diarrea vírica bovina (DVB), la
enfermedad de la frontera (EF) y la peste porcina clásica (PPC). En otras pruebas, el requisito podría ser la
detección de un solo agente patógeno, o a veces incluso permitir un enfoque DIVA (es decir, que distinguiera
entre animales infectados y vacunados). Un ejemplo de este tipo de método es la PCR en tiempo real que se ha
publicado recientemente para el virus de la PPC, que se desarrolló para la distinguir genéticamente entre el jabalí
infectado de forma natural y el vacunado (Liu et al., 2009).
Es importante que las pruebas se desarrollen en laboratorios en los que se apliquen rigurosas normas
de garantía y control de calidad (véase el Capítulo 1.1.3 Gestión de la calidad en los laboratorios de
pruebas veterinarias del Manual Terrestre). Los datos de validación del rendimiento y la exactitud
diagnóstica de la prueba que se determinan durante la fase de desarrollo y validación deben ser
robustos, porque constituyen la base para la interpretación del estado de la población respecto a la
enfermedad y las consecuentes acciones a emprender cuando la prueba se utiliza de forma rutinaria.
Elección de la muestra (véase el Capítulo 1.1.1 Recogida, presentación y almacenamiento de
muestras para el diagnóstico del Manual Terrestre).
En la mayoría de enfermedades, es probable
que las muestras necesarias para las pruebas
 What kinds of samples will be used from the target
de NAD sean similares a las que se utilizan para
population?
los métodos actuales de detección, como el
 What are the predilection sites for the agent in the
cultivo o el aislamiento vírico. Por ejemplo, en la
host?
detección mediante RT-PCR en tiempo real y el
 What sample collection, storage and transport
aislamiento vírico de la IA se utilizan las mismas
methods are anticipated and what are the possible
muestras. Recientemente, se ha demostrado
effects on results?
que el hisopado de cortes frescos de muestras
 Will samples be single or pooled?
de órganos es un enfoque práctico que sustituye
 Will samples in the validation panel be
a la laboriosa homogenización de las muestras
representative of the target population?
de órganos. De forma similar, existe una
tendencia a utilizar muestras como la saliva, que
pueden obtenerse mediante métodos no invasivos, para detectar el síndrome disgenésico y
respiratorio porcino (SDRP) en el cerdo (Prickett et al., 2008) o muestras de leche de tanque para
determinar el estado del rebaño respecto a la DVB. Antes de escoger muestras combinadas, como la
leche de tanque, los responsables de desarrollar una prueba deben tener en cuenta y evaluar las
implicaciones que tendrá la dilución del analito en cuestión en la sensibilidad diagnóstica, y añadirlas
al plan de validación (véase abajo).
Es importante conocer la biología del agente patógeno en cuestión y con qué dispositivos se obtendrá
la muestra. Como en el caso de la IA, cada subtipo o variante de los virus tienen distintos puntos de
preferencia en las aves hospedadoras. Por ejemplo, las muestras cloacales son adecuadas para
ciertos subtipos, mientras que las bucales zona aceptables para otros. Por lo tanto, una prueba que
vaya a utilizarse en un programa de vigilancia debe especificar los puntos de muestreo, y debe
validarse con ambos tipos de muestra. Otro factor importante es la matriz en la cual reside el analito
en el hospedador. En las muestras cloacales es más probable encontrar inhibidores de la PCR que en
las muestras bucales. Otro posible factor de confusión es el tipo de hisopo que se utiliza para obtener
las muestras; algunos contienen materiales que inhiben las PCR. Así pues, es muy importante
especificar claramente qué muestra se prefiere y describir detalladamente los hisopos a utilizar y el
protocolo de hisopado, incluidos los tampones y los medios de transporte de elección, así como las
condiciones de almacenamiento.
También debe tenerse en cuenta si las muestras van a analizarse individualmente o de forma
combinada, y si las combinaciones deben ser de distintas muestras de un mismo animal o de
diferentes animales. Todas las estrategias de combinación deben definirse con detalle y estar
validadas antes de su aplicación. Por último, si la población de destino es “aves”, el estudio de
validación deberá cubrir una gran población representativa de distintas especies para demostrar que la
prueba es ampliamente aplicable, aunque se concentre en las especies más prevalentes o en las que
se utilizan como centinelas de la infección.
En el caso de las actividades de vigilancia,
pueden analizarse primero grandes cantidades
de muestras mediante una prueba de cribado.
En el ejemplo anterior de la IA, la prueba de
cribado descrita debe detectar todos los
subtipos o variantes conocidos de influenza A,
de una región concreta o de todo el mundo. La
prueba debe ser muy sensible, para que no
pase por alto muestras realmente positivas, y
debe tener especificidad analítica (ser
inclusiva) para poder detectar todos los virus
del grupo de la influenza A.






¿Se va a utilizar la prueba solo en una zona
concreta o bien en todo el mundo?
¿Es suficientemente sensible y el objetivo a
analizar es lo bastante inclusive para no
pasar por alto muestras positivas?
Debe tenerse en cuenta la influenza de una
proporción alta de falsos positivos que no
pueden confirmarse
¿Es posible y/o necesaria una rapidez de
los resultados?
¿Se utilizarán las pruebas (una herramienta
analítica) para determinar/confirmar el
fatotipo (cepa) del agente patógeno?
¿Tendrá la determinación de la cepa un
peso importante en la acción emprendida?
La influenza A es una enfermedad de perfil
alto. En el caso de que una prueba nueva dé
muchos falsos positivos que no puedan
confirmarse por ningún otro medio, será difícil
determinar el estado de las aves respecto a la infección. Por lo tanto, es fundamental excluir los
agentes íntimamente relacionados que no sean de interés en cuanto al propósito previsto para
la prueba.
Para seguir con el ejemplo del cribado respecto a la IA, también es importante que la prueba
produzca resultados rápidos, de tal modo que puedan aplicarse cuanto antes las medidas de
control de la enfermedad. Así pues, para la detección de la influenza aviar, lo lógico sería elegir
una PCR en tiempo real utilizando sondas TaqMan o una prueba de campo. En el caso de una
prueba de cribado respecto a la IA, es probable que los cebadores y las sondas se basen en el
gen de la Matriz (M) que se sabe que se encuentra en todas las cepas de influenza de tipo A.
En función de la idoneidad para el propósito previsto, los científicos pueden optar por
desarrollar otra prueba que se utilice junto con la de cribado para determinar qué cepa concreta
de IA se encuentra en la muestra y si la cepa es altamente patógena, porque ello influye en
gran medida en los requisitos de notificación y en las medidas de control que a continuación
podrían establecerse.
Algunos métodos analíticos podrían calificarse como herramientas
analíticas secundarias que se aplican al analito detectado en las pruebas primarias, y podrían
utilizarse para caracterizar con mayor detalle el producto que se ha detectado en la prueba de
cribado (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.1.4).
Un ejemplo de este tipo de método analítico sería el análisis de secuencias de la matriz del
amplicón obtenido mediante PCR que se ha detectado durante la prueba de cribado respecto a
la IA. Para desarrollar pruebas confirmativas pareadas, como las de PCR en tiempo real, que
detecten otros genes, como los de la hemaglutinina o la neuraminidasa en los virus de IA con el
fin de identificar el subtipo o el fatotipo, sería necesario someterlas también a todos los pasos
de desarrollo, optimización y validación. Recientemente, en el Centro Colaborador de la OIE
para el Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas por Biotecnología, de Upsala, Suecia, se ha
desarrollado una PCR novedosa basada en plexo y cebadores. Esta prueba permite la
determinación simple y rápida de distintos fatotipos de virus de ARN. Por ejemplo, pueden
detectarse virus de la influenza aviar y de la enfermedad de Newcastle y evaluarse con un
equipo de bajo coste (máquina de PCR) y en muy poco tiempo (menos de
laboratorios equipados de forma sencilla o incluso a pie de explotación, en
campo, durante un brote (Leijon et al., 2011; Yacoub et al., 2012). Ello indica
simplificación muy rápidos en el ámbito de las pruebas de NAD para el
condiciones de campo o a pie de explotación.
tres horas), en
condiciones de
un desarrollo y
diagnóstico en
El método debe diseñarse cuidadosamente
para cumplir el propósito definido inicialmente.
 ¿Se ha evaluado la prueba primero en un
Los factores importantes a tener en cuenta
grupo pequeño de muestras (seis a ocho
muestras) para evaluar la viabilidad del
son la aplicación, los tipos y las cantidades de
enfoque?
muestras a analizar. Ello, a su vez, comporta
 ¿Ha habido Buena separación entre los
planteamientos de tipo logístico y práctico
resultados del análisis de muestras negativas
respecto a la prueba candidata, como si se
y de muestras positivas?
llevará a cabo en un laboratorio, con o sin
 ¿Se ha preparado una prueba preliminar con
automatización para lograr una alta capacidad
una serie de diluciones en la matriz para
de procesado de muestras por unidad de
evaluar la sensibilidad analítica relativa
tiempo, o en condiciones de campo
preliminar?
empleando una prueba a pie de explotación.
Debe aprovecharse toda la información
disponible, como publicaciones, secuencias
depositadas en bases de datos y datos de secuencia internos. Existen programas informáticos
sofisticados que sirven para optimizar el diseño de cebadores y sondas; un primer paso
consiste en el cálculo informático de secuencias probables para su uso en la prueba.
Antes de emprender la validación de un prototipo de prueba recientemente desarrollado, debe llevarse
a cabo un estudio de viabilidad empleando un grupo pequeño de unas seis u ocho muestras bien
caracterizadas para comprobar si el sistema es viable. Este grupo de muestras debe consistir en
muestras representativas de todo el intervalo de funcionamiento de la prueba, es decir, debe haber al
menos dos muestras negativas, al menos dos muestras débilmente positivas y, a ser posible,
muestras que se sitúen en la parte central del intervalo. Lo ideal es que estas muestras procedan de
distintos animales. La prueba debe ofrecer la máxima separación posible entre los resultados
analíticos de las muestras fuertemente positivas y de las negativas de este grupo. Llegados a este
punto, tal vez sea útil analizar una serie de diluciones (analito diluido en la matriz), con el fin de evaluar
la sensibilidad analítica relativa si la prueba es una posible sustituta de otro método en el que la
sensibilidad sea un criterio importante (véase la Directriz sobre Validación 3.6.8 1 de la OIE
Comparabilidad entre pruebas tras pequeños cambios en un método analítico validado).
El objetivo de esta fase es definir y optimizar el método que se
aplicará para llevar a cabo la prueba en futuros análisis rutinarios.
 ¿Cuál es la ubicación óptima? Una sala o
Ello incluye la descripción de instalaciones adecuadas para ejecutar
cabina limpias para minimizar la
la
prueba.
Es
contaminación
importante tener en
 ¿Cuál es el método óptimo de extracción
 ¿Se ha comprobado si las
cuenta
tanto
el
de muestras para prepararlas? ¿Se
concentraciones de reactivos dan una
método de extracción
realiza manualmente o por
reactividad óptima?
automatización?
de la muestra exigido
 ¿Se ha optimizado la extracción?
para
preparar
 ¿Cuáles son las adiciones de molde y
muestras para la
los tiempos de reacción para optimizar
prueba como el procedimiento analítico. En cualquier
la prueba?
PCR es necesario definir protocolos de sala limpia para
 ¿Qué factores tienen un intervalo
óptimo de funcionamiento estrecho?
minimizar la contaminación. Si se prevén grandes
- ¿Está este intervalo definido?
cantidades de muestras, puede resultar fundamental
elegir un procedimiento de extracción automatizada
(Jungkind, 2001).
Normalmente es necesario evaluar varias metodologías analíticas distintas y variar las
concentraciones de los reactivos, las adiciones de molde y los tiempos de reacción para optimizar la
extracción y la prueba. Es importante cambiar solo una variable cada vez o bien utilizar un diseño y
1
Nota para el lector: Una vez finalizada la Directriz sobre Validación 3.6.8 de la OIE Comparabilidad entre pruebas tras
pequeños cambios en un método analítico validado se publicará en la página web de la OIE.
análisis multifactorial (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección A.2.5 sobre Robustez). Es
importante determinar qué factores tienen solo un intervalo estrecho de actividad óptima, puesto que
estos son puntos cruciales en el procedimiento analítico y pueden afectar a la robustez de la prueba.
En general, las fases de la prueba son relativamente sencillas de optimizar, pero hay que tener
cuidado de garantizar una extracción robusta del ácido nucleico, y todos los reactivos de la prueba, y
de que los pasos del procedimiento se optimicen y sean adecuados para la aplicación sistemática de
la prueba en el laboratorio (Burkhardt, 2000).
Los controles para la PCR son muchos y variados. Es importante incluir los controles adecuados para
comprobar que la prueba está rindiendo como era esperable. Los controles que deben tenerse en
cuenta son los siguientes:
Este control permite comprobar que la especie
de destino se ha muestreado adecuadamente.
¿Se han incluido todos los controles necesarios
En el ejemplo de la prueba de cribado respecto
para demostrar que la prueba está rindiendo
a la IA, el control verifica que el hisopo con la
como era esperable?
muestra ha estado en contacto con una
 ¿Control del molde?
 ¿Control de la inhibición?
especie de destino y que la muestra contiene
 ¿Control de muestra positiva?
ácido nucleico de “ave”, que está disponible
 En el caso de pruebas de ARN - ¿Control de
para su extracción mediante el protocolo
la transcripción inversa?
definido. Una posible diana para este control es
un gen de mantenimiento como el de la beta
actina, que está presente en la especie
hospedadora de destino. Es algo relativamente sencillo si la especie hospedadora es solo una,
como por ejemplo, el pollo, pero será más difícil hallar una diana adecuada para todas las
muestras de “ave”. Este tipo de control puede no ser necesario si una muestra se añade
directamente al proceso de extracción, como un trozo de tejido o sangre, pero se recomienda
para muestras “indirectas” como las que se obtienen mediante hisopo; en este caso, debe
utilizarse el control respecto a la especie hospedadora en cada muestra analizada.
Este control revela si se ha producido contaminación de la muestra, dando lugar a un producto
amplificado cuando no debería haber producto amplificado, como en el caso de las muestras
que no contienen la sustancia a detectar. Debe tenerse en cuenta el número y posición de los
controles sin molde. En general, se distribuyen aleatoriamente varios controles sin molde (en
alrededor de un 5% de los pocillos) durante la prueba o por la placa cuando se utilizan formatos
de placas de 96 y de 386 pocillos.
Este control positivo, que tiene una actividad de ciclo umbral (Ct) de la PCR en tiempo real
situada dentro del intervalo de funcionamiento definido para la prueba, se utiliza en cada placa.
Una buena opción para este control podría ser un plásmido que contenga la secuencia diana,
que puede utilizarse para comprobar si el nivel de amplificación de la prueba es el esperable.
No obstante, no permite evaluar la eficacia del proceso de extracción, que requiere una
muestra de campo conocida o su equivalente (como una muestra de una infección
experimental).
Este control es necesario para detectar
 ¿Se han tenido en cuenta tanto las ventajas como los
posibles inhibidores de la PCR. Si un
inconvenientes de incluir un control interno?
control de la inhibición da un resultado
 ¿Está claramente especificado en el protocolo de la
negativo, este permite deducir que la
prueba el propósito y la aplicación del control de la
muestra
contiene
sustancias
inhibición?
inhibitorias y que un resultado negativo
en la prueba no podrá interpretarse
como “negativo” porque la prueba no
ha funcionado correctamente. Ciertas muestras, como las heces o el semen, a menudo
contienen inhibidores, mientras que ello puede ser menos problemático cuando se analizan
muestras de sangre o microorganismos procedentes de cultivo (Ballagi-Pordány & Belák,
1996). Los datos que se obtienen durante el proceso de validación relativo al rendimiento
diagnóstico de la prueba, a partir de las matrices de muestra previstas, permitirán tomar una
decisión, basada en el riesgo, acerca de si debe incluirse un control de la inhibición para cada
muestra o si es improbable que el sistema analítico resulte afectado por la inhibición. Si las
sustancias inhibitorias son un problema importante, deberá incluirse un control de la inhibición
para cada muestra analizada.
Existe un considerable debate acerca de cuál es el control de la inhibición más adecuado y
efectivo. Se ofrecen los siguientes ejemplos:
i)
Una diana artificial, como un segmento de ADN incluido en un plásmido, que se añade a
la muestra extraída y se amplifica con los mismos cebadores que la diana de la prueba,
pero que tiene diferente tamaño o contiene una secuencia interna distinta, de tal modo
que es identificada como control interno cuando se aplica el método de detección (Sawyer
et al., 2006). La ventaja de este enfoque es que utiliza los mismos cebadores que se
utilizan en la prueba, y el control puede añadirse a concentraciones precisas. Dado que la
diana para la prueba es la misma que para el control, la competición por el cebador y las
dNTP puede reducir el rendimiento analítico de la prueba. Durante la optimización de la
prueba debe procederse con cuidado, de tal modo que la sensibilidad analítica de la
prueba no quede afectada negativamente. Otro inconveniente es que, como componente
añadido, este control solo verifica la fase analítica de la prueba y no actúa como control
para la fase de extracción.
ii)
Una estrategia alternativa para un control de inhibición es amplificar un gen de
mantenimiento o estructural, como el de la β-actina, que siempre está presente en el tejido
analizado, y por tanto, en la muestra. Si el gen de mantenimiento se ha inhibido por
sustancias de la muestra, se deduce que la amplificación del gen que se pretende
encontrar con la prueba también podría estar inhibido. Pero esta conclusión no siempre
está justificada. Los genes de mantenimiento a menudo se encuentran en abundancia, de
tal modo que a veces pueden detectarse incluso en presencia de sustancias inhibitorias,
mientras que la amplificación de cantidades más bajas de las secuencias que se pretende
encontrar con la prueba podría resultar inhibida. En este caso, el gen de mantenimiento
amplificado y detectado no sería un control suficiente para los inhibidores, lo cual daría
lugar al riesgo de deducir que el resultado de la prueba es un falso negativo. No obstante,
si se conoce el alto riesgo que se corre con los genes de mantenimiento, que están
presentes en la muestra de forma natural, estos genes pueden constituir un control útil de
los inhibidores durante toda la prueba, incluidos el muestreo, el almacenamiento y la
extracción.
En general, para los métodos de NAD, los cultivos puros, la sangre y la mayoría de tejidos son las
muestras de elección porque la extracción y la recuperación de ácido nucleico amplificable en general
funciona bien. Las muestras fecales, el semen y el tejido autolisado pueden comportar más
dificultades porque en general contienen más inhibidores para las pruebas de NAD. Es fundamental
disponer de un procedimiento de extracción de la muestra robusto y repetible, que sea adecuado para
las cantidades de muestras que se van a manipular (automatizado, si es necesario), así como utilizar
controles de inhibición cuando sea necesarios (véase el apartado anterior).
El intervalo de funcionamiento de la
prueba debe determinarse diluyendo una
 Para determinar el intervalo de funcionamiento de la
muestra
fuertemente
positiva
y
prueba, ¿se diluyeron las muestras en la matriz para la cual
representando en un gráfico el intervalo
está diseñada la prueba?
de resultados obtenidos frente a
 ¿Cumple el intervalo de funcionamiento de la prueba con
cantidades conocidas de ácido nucleico
las normas esperables para tal prueba?
(concentración, dilución, número de
copias genómicas, etc.). Esta muestra
de referencia debe estar en la misma matriz que la muestra problema, es decir, no es correcto
determinar el intervalo de funcionamiento de una muestra diluida en tampón si la matriz habitual es la
sangre.
Una prueba debe tolerar pequeños cambios en las concentraciones de los reactivos y/o ligeras
variaciones en los tiempos y temperaturas de procesado que se utilizan en cada fase, con el fin de
poder implementarse eficazmente y aportar resultados reproducibles cuando se utilice en varios
laboratorios. Ello puede evaluarse durante la optimización de la prueba, cuando se determinan los
pasos críticos del procedimiento, los reactivos y el equipo. Estos factores, que cuando no se respetan
causan una variabilidad inaceptable, deben estar bien descritos en el protocolo de la prueba para que
se garanticen unos procesos especialmente rigurosos para llevarlos a cabo. Se trata de un proceso
laborioso, cuyo seguimiento de la precisión y exactitud en último término se realiza mediante muestras
de control interno y externo de la calidad que se analizan con la prueba.
Teóricamente, deben utilizarse patrones de
referencia internacional o nacional para calibrar la
 ¿Se ha calibrado la prueba respecto a patrones de
prueba. No obstante, no siempre se dispone de
referencia externos?
dichos patrones, de tal modo que podría ser
 Si no se dispone de patrones de referencia
necesario crear un patrón de referencia interno
externos, ¿se ha creado un patrón de referencia
(véase la Directriz sobre Validación 3.6.6 de la
interno?
OIE). Debe crearse un/os patrón/es de trabajo
 ¿Se han preparado patrones de referencia de
trabajo en cantidades suficientes para utilizar en
que se pueda incluir en todas las ejecuciones de
todos los estudios de desarrollo y de validación?
la prueba, dividirse en alícuotas y almacenarse en
cantidades suficientes para poder utilizarlo en
cada ejecución del proceso de validación y para
su uso rutinario una vez terminada la validación. El/los patrón/es de trabajo podrían ser múltiples
alícuotas de una muestra determinada, que pueda/n utilizarse en cada ejecución de la prueba.
También podría consistir en un plásmido que contenga la secuencia de interés, añadido en pequeñas
cantidades a la matriz de la muestra. El uso de este último sistema permite que quien desarrolla la
prueba determine el número de copias de genoma que se puede detectar con la prueba. En algunos
casos, los resultados de la muestra problema se “normalizan” por comparación con la/s muestra/s de
patrón de trabajo que se incluyen en cada ejecución de la prueba. Ello permite una comparación
directa entre los datos obtenidos en distintas ejecuciones (Huggett et al., 2005; y Norma de Validación
de la OIE).
Una vez desarrollado y optimizado el protocolo de la prueba, debe fijarse y mantenerse constante mientras se
evalúa a lo largo de las distintas etapas de la fase de validación y durante su uso rutinario. Los pequeños
cambios realizados en una prueba validada se someten a estudios de comparación para documentar que la
prueba sigue rindiendo como se había definido inicialmente (Directriz sobre Validación 3.6.8 de la OIE: véase la
nota 1 a pie de página).
La repetibilidad de la prueba es el grado de
acuerdo entre resultados (de una misma
 ¿Se ha determinado la repetibilidad para una
ejecución o entre ejecuciones) obtenidos con el
misma prueba y entre pruebas?
mismo método analítico y en un mismo
 ¿Se encuentra la repetibilidad dentro del
laboratorio. Normalmente, se escoge y analiza un
intervalo aceptable de valores del coeficiente de
pequeño grupo de tres (preferiblemente cinco)
variación (CV)?
muestras que cubran todo el intervalo de
funcionamiento de la prueba, utilizando todo el
procedimiento analítico (incluida la extracción de ácido nucleico). La variación dentro de una misma
prueba (intra-prueba) se determina analizando múltiples (al menos cinco) réplicas de cada muestra de
este grupo en una sola ejecución de la prueba. Las variaciones entre ejecuciones (inter-prueba) se
determinan analizando estas muestras en varios días distintos, con los mismos operarios y realizando
al menos 20 ejecuciones. El grupo de muestras destinado a determinar la repetibilidad debe analizarse
tratando todas las muestras y cada una de sus réplicas exactamente como muestras de diagnóstico
individuales, sometiéndolas a todos los pasos, desde la preparación de la muestra hasta el análisis de
datos. En consecuencia, cada réplica de cada muestra se someterá a una extracción independiente.
Ello permite determinar la repetibilidad, tanto de una ejecución de la prueba como entre ejecuciones
que se realicen como se hará en el futuro cuando la prueba se utilice para el diagnóstico. Es
importante que haya muy poca variación en la repetibilidad, sobre todo cerca del umbral/es de corte
que establece/n los valores positivos, dudosos y negativos, porque una variabilidad más alta puede
dar lugar a malinterpretación (véase la Directriz sobre Validación 3.6.4 Incertidumbre de la medición).
La repetibilidad puede expresarse como un coeficiente de variación (véase la Directriz sobre
Validación 3.6.5 Enfoques estadísticos de la validación). La prueba debe diseñarse de tal modo que el
punto de decisión (umbral) se sitúe en la parte más alta de la curva de ciclos umbrales de la PCR en
tiempo real. Si se logra, la repetibilidad será óptima en el punto crítico de la prueba. (Se obtienen CV
más altos en los extremos claramente negativos y fuertemente positivos del intervalo de
funcionamiento de la prueba pero influyen poco en la interpretación de los resultados).
En función del propósito previsto para una prueba, se determina su especificidad analítica mediante
la/s secuencia/s genética/s seleccionada/s del/los microorganismo/s que la prueba detecte. La prueba
puede diseñarse para ser muy selectiva, con una especificidad analítica para una sola secuencia
genética que sepa que no se encuentra en los demás microorganismos o cepas del microorganismo
que la prueba detecta. Este tipo de prueba se dice que implica exclusividad y constituye una prueba
confirmativa de ASp alta.
Como alternativa, la prueba puede diseñarse para detectar una secuencia genética conservada que
sea común a varias cepas de una especie determinada, o a varias especies de un género. Este tipo de
prueba tiene una ASp que implica exclusividad, haciéndola útil como prueba de cribado. En el caso de
una prueba de cribado inclusiva, la especificidad analítica debe determinarse analizando todos los
linajes, cepas, especies, etc., que se espera que la prueba detecte. A continuación, debe comprobarse
su capacidad de excluir microorganismos relacionados, como cepas no patógenas que no sean de
interés para el propósito previsto para la prueba candidata.
En el ejemplo de una prueba de cribado respecto a la
IA, la prueba debe evaluarse utilizando todas las
cepas del virus de la IA bien caracterizadas de las
que se disponga, para asegurarse de que todas las
cepas de varias zonas geográficas y hospedadores se
van a detectar (es decir, para demostrar inclusividad).
Se suele proceder empleando cepas/cultivos o ácido
nucleico extraído procedentes de laboratorio. En el
caso de la IA, existen distintos linajes del virus, como
el asiático, el europeo o el norteamericano. Es
importante tener en cuenta cómo se utilizará la
prueba y en qué zonas geográficas. Ello ayudará a
determinar si es necesario evaluar solo algunos o
bien todos estos linajes.
 ¿Se ha analizado un grupo de la máxima
cantidad posible de cepas bien
caracterizadas del agente patógeno que se
pretende detectar, incluidas cepas de varias
zonas geográficas y de varios
hospedadores?
 ¿Se han analizado microorganismos y
agentes patógenos relacionados que causen
síndromes clínicos similares?
Este importante requisito se pone rápidamente de manifiesto con las pruebas de fatotipificación de
virus de ARN rápidas y sencillas que se han desarrollado recientemente, y que se comprobaron con
una gran colección de virus de la IA y la enfermedad de Newcastle procedentes tanto de oriente como
de occidente (Leijon et al., 2011; Yacoub et al., 2012) a partir de colaboración entre distintos Centros
Colaboradores de la OIE. Otro factor importante es que los virus pueden cambiar rápidamente y las
mutaciones resultantes pueden hacer que la prueba diagnóstica se vuelva subóptima. Un ejemplo de
ello es la aparición de una cepa pandémica de la Influenza A H1N1 en 2009 y el brote levemente
patógeno de IA H7N9 del sur de China de 2013. La sensibilidad analítica de la PCR para el gen M
tradicional resultó perturbada para esta cepa porque la secuencia que hacía que la prueba fuera
específica había mutado. En la mayoría de países se han introducido nuevos cebadores y se han
utilizado como prueba nueva, o bien en combinación con los cebadores tradicionales del gen M a
modo de prueba combinada.
La potencia discriminatoria de la prueba debe comprobarse analizando microorganismos relacionados
con el virus de la IA. Estos serían agentes patógenos que causen síndromes clínicos similares, como
la enfermedad de Newcastle, la bursitis infecciosa, etc., y otros microorganismos que puedan hallarse
en la muestra analizada (es decir, para demostrar exclusividad).
Para evaluar la sensibilidad analítica, también denominada límite de detección, se suelen aplicar dos
enfoques. El primero consiste en utilizar una serie de diluciones del agente patógeno que se pretende
detectar (en este caso, virus de la IA) diluido en la matriz de la muestra y no en tampón. La serie de
diluciones suele analizarse empleando la prueba en proceso de validación y un método estándar. En
el caso de la IA, el método estándar podría ser el aislamiento del virus u otro método estándar interno
de detección. Este enfoque da una medida comparativa de los dos métodos (véase la Directriz sobre
Validación 3.6.5 de la OIE). El segundo enfoque consiste en utilizar un constructo de plásmido que
contenga la secuencia diana y analizarlo en una serie de diluciones en la matriz de la muestra. De esta
manera, puede estimarse el número de copias del genoma detectable mediante el método analítico.
En algunas ocasiones, no es posible terminar un
ejercicio de validación completo por escasez de
 ¿Ha dado la prueba nueva un rendimiento
muestras de las que se sepa si contienen o no el
satisfactorio en comparación con un
analito (por ejemplo, en el caso de enfermedades
método estándar?
exóticas) o bien, cuando surge una situación de
 ¿Es la reproducibilidad preliminar
emergencia, porque la prueba tiene que utilizarse
aceptable?
antes de que haya sido totalmente validada. Puede
 ¿Merece la prueba que se inicien los
conseguirse un reconocimiento provisional siempre
estudios de validación completa (Etapas
2.4)?
que los resultados de la Etapa 1 del proceso de
validación sean favorables respecte a los resultados
de un método analítico de estándar o a un método
establecido conocido y, preferiblemente, publicado. Otra opción para un método estándar es el que se
utiliza rutinariamente en el laboratorio. Es importante tener en cuenta que cada método identifica unas
entidades morfológicas o funcionales del microorganismo. Por lo tanto, es posible que un método
estándar basado en el cultivo y una técnica nueva de NAD den resultados discrepantes (véase en la
Sección B.2, Etapa 2, abajo, una explicación sobre la resolución de discrepancias). La elección del
grupo de muestras para la evaluación también es muy importante y debe ser lo más extenso posible
(véase la Directriz sobre Validación 3.6.6 de la OIE Elección y uso de tipos y grupos de muestras de
referencia). Si para la evaluación solo se dispone de un pequeño grupo de muestras, merece la pena
determinar si la prueba supera las expectativas de reproducibilidad, es decir, resiste las exigencias de
uso en otros laboratorios. Ello requiere que ambos laboratorios utilicen el mismo protocolo, y los
mismos reactivos y grupo de muestras, así como un equipo similar (si no idéntico).
Si la falta de muestras impide pasar a la siguiente etapa de la fase de validación (Rendimiento
Diagnóstico de la prueba), es aceptable utilizar una prueba de NAD que haya sido aceptada
provisionalmente tras una exhaustiva validación mediante la Fase 1 de validación (véase la Norma de
Validación de la OIE, Sección B.2.6). La aceptación de una validación provisional depende por
completo de que la prueba haya sido aprobada por las autoridades locales, o por acuerdos bilaterales
entre países.
Las herramientas analíticas, diseñadas para proporcionar información para caracterizar muestras que
se detectan con una prueba de cribado, solo requieren la validación de sus características de
rendimiento analítico. Así pues, en estos casos no existe el requisito de determinar la sensibilidad y la
especificidad diagnóstica. Algunos ejemplos de estos enfoques son las pruebas de tipificación
mediante PCR que se usan para determinar si una cepa de influenza A cuya matriz da un resultado
positivo es H5 o H7, o los métodos con que se determina la resistencia a los antibióticos que solo se
aplican a cultivos bacterianos. Una tecnología basada en el ácido nucleico que se utiliza para estas
pruebas incluye métodos basados en chips de ADN, que introducen sus propios desafíos debido a la
gran cantidad de datos generados para cada muestra analizada. Antes de implementar tales pruebas,
es necesario tener en cuenta cómo puede lograrse este análisis. Un enfoque más sencillo consiste en
comparar los resultados de una herramienta analítica nueva con los de una prueba estándar y permitir
su uso siempre que los resultados de la técnica nueva sean comparativamente mejores que los de la
técnica pre-existente (Anjum et al., 2007; Batchelor et al., 2008).
La sensibilidad diagnóstica (DSe) y la especificidad diagnóstica (DSp) constituyen los indicadores de
rendimiento principales de una prueba de diagnóstico. Cuando se determinan estos valores, es
fundamental escoger suficientes muestras que representen a la población de destino de la prueba que
se está evaluando. Puede ser difícil obtener cantidades grandes de muestras (sobre todo positivas) en
el caso de ciertas enfermedades exóticas, y negativas en el caso de las enfermedades endémicas. En
tales casos, cuando se dispone de pocas muestras, la cantidad de error permisible en las
estimaciones de la DSe y la DSp necesariamente será alto (véase la Norma de Validación de la OIE,
Sección B.2, Tabla 1). Si puede utilizarse un diseño de muestreo adecuado y pueden utilizarse
métodos analíticos independientes diferentes para analizar las muestras, es posible obtener
estimaciones de la DSe y la DSp utilizando métodos bayesianos (modelos de clase latente) (Véase la
Directriz sobre Validación 3.6.5 de la OIE). A menudo, las muestras de referencia negativas se
obtienen de animales que viven en regiones donde la enfermedad no está, mientras que las muestras
positivas suelen obtenerse de animales con signos clínicos que han sido confirmadas en el laboratorio.
Ello puede dar lugar a estimaciones excesivamente optimistas de la DSe y la DSp porque las muestras
no representan todo el espectro del proceso de la enfermedad, es decir, no se incluyen los animales
no clínicos, que pueden tener cargas de agente patógeno muy distintas a las de los animales que
sufren un cuadro de la enfermedad fulminante o crónico.
Las muestras a menudo se clasifican
 El valor umbral (Ct) es el resultado escogido para
empleando métodos analíticos actuales, como
distinguir entre negativo y positivo en una escala
el aislamiento vírico (VI) o el cultivo bacteriano.
continua de valores analíticos.
No obstante, ello puede ser problemático
 Indeterminado, intermedio, sospechoso, límite,
cuando se validan pruebas moleculares
zona gris o ambiguo son términos que se utilizan
nuevas, porque la base de ambos sistemas
indistintamente para un intervalo de valores
analíticos es distinta. Por ejemplo, un resultado
analíticos que se encuentra entre los umbrales de
positivo en un cultivo bacteriano es la
positividad y negatividad.
presencia de un microorganismo viable,
mientas que los métodos basados en ácido
nucleico detectan secuencias genómicas de microorganismos tanto vivos como muertos siempre que
en la muestra siga habiendo ácido nucleico. Los métodos de VI pueden ser especialmente
susceptibles a los inhibidores y contaminantes presentes en la matriz de la muestra, lo cual comporta
la subestimación de los “positivos verdaderos”. Ello puede dar lugar a aparentes discrepancias cuando
las muestras dan positivo al emplear la prueba molecular nueva y negativo con los métodos
tradicionales. Las estrategias para resolver estas anomalías, aunque no sean las únicas, consisten en
la secuenciación (que permite demostrar que el agente patógeno de interés estaba en una muestra
determinada) o el análisis mediante otra prueba molecular.
Para calcular las estimaciones de DSe y la DSp de la prueba candidata, los resultados de la prueba
deben reducirse antes a categorías (positivo, negativo o indeterminado). Ello se logra insertando uno o
dos puntos de corte o valores umbral (límites de decisión) en la escala continua de resultados de la
prueba. Por ejemplo, en algunas circunstancias es adecuado utilizar un valor umbral para una PCR en
tiempo real en la región de 35 Ct, que significa que las muestras que produzcan un valor de Ct más
alto se clasificarán como negativas o inconcluyentes. No obstante, en otra PCR es posible que
cualquier muestra que simplemente registre un Ct se clasifique como positiva. Al plantear el uso de un
valor umbral, deben tenerse en cuenta el rendimiento de una determinada PCR en tiempo real, los
datos de validación comparativos, la aplicación definitiva de los resultados generados y la posible
información veterinaria relevante.
La reproducibilidad es una medida del grado de coincidencia entre los resultados obtenidos en distintos
laboratorios empleando el mismo protocolo, un equipo similar (preferiblemente el mismo) y el mismo grupo de
muestras. Teóricamente, el grupo de muestras debería consistir en 20–30 muestras que incluyan algunas que
están presentes por cuadruplicado. El grupo debe consistir en muestras que abarquen todo el intervalo dinámico
de la prueba, y varias de ellas deben tener una actividad cercana, por ambos lados, al/los valor/es de corte de la
prueba. El grupo de muestras que se utilice para determinar la repetibilidad podría utilizarse también para esta
evaluación, pero aumentando las cantidades de réplicas. Se puede estimar la precisión de los datos tanto de
repetibilidad como de reproducibilidad (véase la Directriz sobre Validación 3.6.4 de la OIE para una explicación
más detallada de este tema y su aplicación). En la Directriz sobre Validación 3.6.4 de la OIE se aporta más
información sobre la elección y uso de grupos de muestras de referencia.
Las mejores prácticas para implementar el programa son generales para todo tipo de pruebas (véase
la Norma de Validación de la OIE). En el caso de las pruebas de NAD, una ventaja inherente es la
posibilidad de una secuenciación genómica de seguimiento para resolver aparentes falsos positivos.
Las pruebas basadas en PCR se suelen validar con cantidades similares de muestras positivas y
negativas. No obstante, en los programas de vigilancia suelen aplicarse resultados analíticos para
afirmar la ausencia de la enfermedad en cuestión en lugares donde la prevalencia de la enfermedad
es muy baja y a menudo se acerca a cero. En tales circunstancias, los falsos positivos pueden ser un
importante problema incluso cuando la especificidad diagnóstica de una determinada prueba es alta.
Si la DSp de una prueba es del 99,5%, significa que uno de cada 200 resultados positivos será falso si
la prevalencia es cercana a cero. Si se analiza una cantidad grande de muestras de una población de
prevalencia cero o muy baja, estos falsos positivos pueden superar considerablemente en número a
los verdaderos positivos (véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.4.2 para una explicación
más detallada de los valores predictivos de los resultados de las pruebas como función de la
prevalencia de la enfermedad). En el caso de las pruebas de NAD que se utilizan en tales
circunstancias, sería una buena práctica confirmar los resultados positivos de la PCR mediante
secuenciación.
El seguimiento de la repetibilidad mediante representación gráfica de los valores de Ct obtenidos con
muestras control de patrón de trabajo permite comprobar si la prueba está dando el rendimiento
esperado. Asimismo, la participación en programas de comprobación de la competencia organizados
por proveedores externos de muestras de garantía de calidad indica cuál es la reproducibilidad actual
y también permite comparar la exactitud de la prueba si se incluye un/os patrón/es de referencia en
cada ejecución para la “normalización” de los datos. Algunos laboratorios también vuelven a analizar
una parte (normalmente un 1–5% en función de la capacidad de procesado de muestras por unidad de
tiempo) de muestras retenidas para comprobar si la prueba está rindiendo siempre del mismo modo en
todas las ejecuciones.
Con el tiempo, tal vez sea necesario modificar la prueba debido a un cambio en el analito que se
pretende detectar, como por ejemplo, cuando la prueba para la influenza aviar va a aplicarse en otra
parte del mundo o cuando han emergido nuevas cepas o linajes de un virus (véase la Sección B.1.2,
arriba, sobre la evolución del nuevo linaje pandémico de H1N1). Los virus de ARN evolucionan
rápidamente y pueden producirse mutaciones puntuales, de tal modo que es aconsejable confirmar
con regularidad las secuencias de nucleótidos de los puntos del cebador y la sonda para asegurarse
de que siguen sido adecuadas.
Con el tiempo, es probable que sea necesario aplicar modificaciones a una prueba. Los
cambios de equipo o de protocolo de extracción, así como la automatización de determinadas
etapas, requerirán solo una mínima comparación entre la prueba validada inicialmente y la
versión modificada (véase la Directriz sobre Validación 3.6.8 de la OIE: nota 1 a pie de página).
Pero si los resultados de la versión modificada se sitúan fuera del intervalo de funcionamiento o
no cumplen las expectativas de rendimiento de la prueba original, puede ser necesaria una
revalidación.
Es importante asignar número propios de identificación a todos los lotes de reactivos y registrar
los componentes que se utilizan para cada prueba. Los componentes más críticos de las PCR
son las sondas, los cebadores y las enzimas. Deben analizarse lotes actuales y nuevos de los
reactivos críticos paralelamente antes de la introducción de estos últimos. No obstante, en el
caso de otros reactivos, como los tampones o los nucleótidos, suele ser suficiente con realizar
un seguimiento de los lotes para disponer de datos en caso de que deban solucionarse
posibles problemas.
En algunos casos, es posible que la aplicación de la prueba tenga que ampliarse más allá del ámbito
previsto inicialmente. Algunos ejemplos son la inclusión de otra especie hospedadora o de una
población de animales de una zona geográfica distinta. En tales casos, es importante revalidar la
prueba debido a los nuevos aspectos biológicos y a sus muchas variables relacionadas. Los detalles
concretos dependerán del grado de cambio. Aplicar la prueba a una nueva zona geográfica podría
significar que las características analíticas de la prueba siguen siendo válidas pero que los criterios de
diagnóstico tienen que redefinirse. Por otra parte, es posible que se realicen modificaciones en las
secuencias de cebador o sonda de una PCR para que pueda detectar nuevas cepas. En tal caso, será
necesario comprobar cómo se comportan los nuevos reactivos en cuanto a exactitud analítica y
diagnóstica en comparación con la versión previa de la prueba.
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