1. Healthcare

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS
DE SUELOS DEL PARQUE NATURAL NACIONAL (PNN) LOS NEVADOS.
LIZA MARÍA FRANCO GONZÁLEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
Bogotá D.C.
Mayo 19 de 2010
1
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS
DE SUELOS DEL PARQUE NATURAL NACIONAL (PNN) LOS NEVADOS.
LIZA MARÍA FRANCO GONZÁLEZ
APROBADO
INGRID SCHULLER, PhD
Decana Académica
JANETH ARIAS, M.Sc
Directora de Carrera
2
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS
DE SUELOS DEL PARQUE NATURAL NACIONAL (PNN) LOS NEVADOS.
LIZA MARÍA FRANCO GONZÁLEZ
APROBADO
SANDRA BAENA, Ph.D
Bióloga
Directora
BALKYS QUEVEDO, M.Sc
Ingeniera Química
Jurado
3
AGRADECIMIENTOS
A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) en especial a mi directora
Sandra Baena por darme la oportunidad de entrar a este grupo de investigación y realizar
mi trabajo de grado.
Al Centro Colombiano de Genómica y Bioinformática de ambientes extremos (GeBiX) por
el financiamiento de este proyecto de grado.
A José Montana, Diego Jiménez y Daniel Borda por ser los responsables del aislamiento
de algunas cepas estudiadas durante este proyecto de grado.
A mi codirectora Gina López por guiarme en este camino y enseñarme muchos
conceptos.
A Ángela Mantilla, por su ayuda incondicional, aporte de conocimiento y apoyo.
A Andrea Espitia, Carolina Rubiano y Javier Goméz por ayudarme en este proceso y por
su colaboración.
4
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace
responsable por lo conceptos
emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo
velará por que no se publique
nada contrario al dogma y a la
moral católica y porque la tesis
no
contenga
ataques
personales contra persona
alguna, antes bien se ve en
ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia”
Art 23 de la resolución 13 de
Julio de 1946
5
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................ 1
1.
INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 2
2.
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................... 3
3.
MARCO TEÓRICO ............................................................................................... 3
3.1
Microorganismos del suelo productores de enzimas lipolíticas ...................... 3
3.2
Carboxil éster hidrolasas ............................................................................... 3
3.3
Factores que influyen en la producción de lipasas ........................................ 4
3.4
Detección de la actividad lipolítica ................................................................. 4
3.4.1
Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cualitativas ......... 4
3.4.2
Evaluacion de la actividad lipolítica por el método colorimétrico con pnitrofenil
éster ………………………………………………………………………………..…………5
4.
OBJETIVOS ......................................................................................................... 5
4.1
Objetivo general ............................................................................................ 5
4.2
Objetivos específicos..................................................................................... 5
5.
METODOLOGÍA ................................................................................................... 6
51
Población de estudio ..................................................................................... 7
5.2
Medio de cultivo y condiciones de cultivo ...................................................... 7
5.3
Selección de cepas lipolíticas ........................................................................ 7
5.4
Características morfológicas y fisiológicas de las cepas ................................ 8
5.5
Determinación de las condiciones óptimas de crecimiento ............................ 8
5.5.1
Determinación de la temperatura óptima de crecimiento .............................. 8
5.5.2
Determinación del pH óptimo de crecimiento ................................................ 8
5.6
Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos lipídicos .......................... 8
5.7
Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cuantitativas ....... 9
5.7.1
Cuantificación de la actividad lipolítica por medio de la técnica del pnitrofenil
éster
……………………………………………………………………………………….9
6.
RESULTADOS/ DISCUSIÓN............................................................................. 10
6.1
Selección de las cepas ................................................................................ 10
6.2
Características fenotípicas .......................................................................... 10
6.3
Determinación de las condiciones óptimas de crecimiento .......................... 11
6.3.1
Serratia USBA-GBX- 513 ........................................................................... 11
6.3.2
P.brenneri USBA-GBX-514 y P. extremaustralis USBA-GBX 515 ............. 12
6
6.3.3
P.oleovorans USBA-GBX 828 .................................................................... 13
6.4
Evaluación de crecimiento en sustratos lipídicos ......................................... 14
6.5
Evaluación de la actividad lipolítica por pnitrofenil éster .............................. 14
6.5.1
Serratia USBA-GBX 513 ............................................................................. 14
6.5.2
P.brenneri USBA-GBX 514.......................................................................... 15
6.5.3
P.extremaustralis USBA-GBX 515............................................................... 16
6.5.4
P.oleovorans USBA-GBX 828 ..................................................................... 17
7.
CONCLUSIONES ............................................................................................. 18
8.
RECOMENDACIONES .................................................................................... 19
9.
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 19
10. ANEXOS ............................................................................................................. 22
7
RESUMEN
Dentro de la colección de microorganismos de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología
Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana, se encuentran 43 cepas
bacterianas aisladas de suelos del Parque Nacional Natural (PNN) Los Nevados. Estas
cepas fueron evaluadas para determinar su actividad lipolítica, inicialmente realizando un
tamizaje en medio sólido Luria Bertani (LB) suplementado con sustratos lipídicos como
Tween 80, Aceite de oliva, Gliceril tributirato y Gliceril trioleato al 1%v/v, para seleccionar
aquellas cepas que presentaran una mayor actividad al formar halos de hidrólisis iguales
o superiores a 5mm de diámetro en más de un sustrato. Las cepas USBA-GBX-513, con
similitud del 99% con el género Serratia, USBA-GBX-514 y USBA-GBX-515, con similitud
del 99% con el género Pseudomonas y USBA-GBX-828 con similitud del 99% con el
género Paenibacillus (99%), fueron seleccionadas para evaluar la actividad lipolitica
cuantitativa. Las condiciones óptimas de crecimiento de estas cuatro cepas fueron
evaluadas, evidenciándose un pH óptimo de crecimiento de 6.0 en las cuatro cepas. La
temperatura óptima de crecimiento para la cepa USBA-GBX-513 fue de 25°C, para la
cepa USBA-GBX- 828 fue de 35°C, y para las cepas USBA-GBX-514 y 515 fue de 30°C.
La evaluación cualitativa de la actividad lipolítica se realizó bajo el mismo esquema del
tamizaje, teniendo en cuenta las condiciones óptimas de crecimiento de estos
microorganismos. Paralelamente se evaluó el crecimiento en medio líquido suplementado
con diferentes sustratos lipídicos. A partir de los resultados obtenidos se escogió el
sustrato donde se presentó la mayor actividad lipolítica e igualmente favoreció el
crecimiento de las cepas. El Aceite de oliva se escogió para las cepas USBA-GBX-513 y
828, el Tween 80 para la cepa USBA-GBX-514 y el Gliceril tributirato para la cepa USBAGBX-515, con estos sustratos se cuantificó la actividad lipolítica con el substrato p
Nitrofenil (pNP) butirato tomando muestras en diferentes tiempos durante la curva de
crecimiento de los microorganismos. Finalmente, se determinó que la actividad lipolítica
(unidades lipolíticas –U-), para la cepa USBA-GBX-513 fue de 336.32 U/L, similar a la
cepa USBA-GBX-828, 393U/L, para la cepa USBA-GBX-515 fue de 255.1U/L, en último
lugar la cepa USBA-GBX-514 obtuvo la menor actividad con 73,50 U/L. Las cuatro cepas
trabajadas presentaron actividad lipolítica en diferentes sustratos lipídicos con ácidos
grasos tanto de cadena larga como de cadena corta; la cepa USBA-GBX-515 fue la única
que produjo la enzima lipolítica en la fase exponencial mientras que las demás cepas
produjeron la enzima en la fase estacionaria como se ha reportado en la mayoría de los
microorganismos productores de estas.
1
1
1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas lipolíticas tienen importancia a nivel industrial, ya que forman parte en
procesos como la fabricación de detergentes, industria láctea, la bioconversión de
residuos de aceites para la producción de biodiesel como nueva fuente de
biocombustible1, y fabricación de productos químicos de alta pureza como el ibuprofeno
en el sector farmaceutico2.
En la naturaleza las enzimas lipolíticas están presentes en mohos, levaduras, bacterias, y
organismos como plantas y animales, sin embargo, se están utilizando en mayor
proporción las enzimas producidas por bacterias debido a que el crecimiento de estas es
más rápido, la producción se da en tiempos más cortos, son biodegradables y se pueden
escalar fácilmente en la industria ayudando así a reducir los costos de producción 3,4.
Estas enzimas se pueden encontrar en microorganismos mesófilos y psicrótrofos
pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Serratia, Paenibacillus, Achromobacter,
Alcaligenes, Bacillus, Burkholderia, Chromobacterium, entre otros5. Algunas de estas
enzimas lipolíticas pueden actuar en condiciones extremas, como a altas temperaturas,
donde pueden ser altamente termoestables en solventes orgánicos, se emplean en la
producción de fármacos, cosméticos y síntesis orgánica, mientras que las enzimas que
operan a bajas temperaturas son estables en solventes orgánicos y se utilizan mucho en
las industrias por su estereoespecificidad, actúan en la producción de aditivos para
detergentes y en la biotransformación de compuestos termolábiles2,4,6.
Algunos de los organismos pertenecientes al género Pseudomonas son utilizados en
diferentes industrias debido a la aplicabilidad de sus lipasas, algunas ya se encuentran en
el mercado como es el caso de Lumafast nombre comercial de una enzima lipolítica
producida por Pseudomonas mendocina, Lipomax producida por Pseudomonas
alcaligenes, estas dos utilizadas para la producción de detergentes, y Lipasa AK, YS de
Pseudomonas fluorenscens utilizada para la síntesis de ácidos grasos5.
Debido a la importancia que tienen las enzimas lipolíticas por sus características, y a uno
de los objetivos del proyecto GeBiX, el objetivo de éste trabajo es determinar la actividad
lipolítica de cepas aisladas de suelos del PNN Los Nevados de la colección de
microorganismos de la USBA.
2
2
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Actualmente se estima que menos del 1% de los microorganismos ha logrado ser aislado
de sus ambientes naturales, debido a que los métodos de aislamiento tienen dificultad de
simular las mismas condiciones ambientales en las que se encuentran las poblaciones
naturales7. A pesar de la baja recuperación de microorganismos por métodos
dependientes de cultivo, sus caracterizaciones morfológicas, fisiológicas, y metabólicas
han permitido desarrollar más de 500 productos comerciales a partir de sus enzimas 8.
Dentro de las enzimas secretadas por los microorganismos se encuentran las lipasas, que
tienen importantes características como ser estables en solventes orgánicos, no necesitar
cofactores, presentar alta regioselectividad, quimioselectividad, y estereoselectividad9,10,
por ello se consideran biocatalizadores de alta versatilidad.
Como parte de los estudios que se llevan a cabo en el Centro colombiano de excelencia
en Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos (GeBiX), que pretende explorar,
aprovechar y valorar la diversidad microbiana de estos ambientes se aislaron
microorganismos de suelos del PNN Los Nevados. Estos aislamientos se realizaron a
partir de cultivos enriquecidos con sustratos lipídicos. Debido a las características y
aplicaciones que poseen las enzimas lipolíticas, es relevante adelantar estudios donde se
determine si los microorganismos aislados y cultivados pueden presentar actividad
lipolítica.
3. MARCO TEÓRICO
3.1 Microorganismos del suelo productores de enzimas lipolíticas
Algunas de las bacterias ampliamente estudiadas por poseer actividad lipolítica
pertenecen a los géneros Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Paenibacillus, Achromobacter,
Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Chromobacterium y Streptomyces5. También se
ha encontrado dicha actividad en mohos de los géneros Penicillium, Aspergillus,
Geotricum, Rhizopus2 y levaduras como Candida, Rhodotorula, Saccharomyces y
Yarrowia5.
3.2 Carboxil éster hidrolasas
Las carboxil éster hidrolasas o más conocidas como enzimas lipolíticas, son catalizadores
que pueden hidrolizar enlaces éster de triglicéridos y otros compuestos en presencia de
agua, también pueden participar en la síntesis y transesterificación de ácidos grasos en
3
presencia de solventes orgánicos6. Estas enzimas se dividen en diferentes grupos, dos de
estos grupos son las denominadas lipasas verdaderas (EC 3.1.1.3), que catalizan la
hidrólisis, en la interfase lípido-agua de triacilgliceroles de cadenas largas (C>10) a
monoacilgliceroles o diacilgliceroles, ácidos grasos y glicerol11, mientras que el otro grupo
de enzimas son las llamadas carboxilesterasas (EC 3.1.1.1) las cuales hidrolizan los
enlaces éster de ácidos grasos de cadenas cortas (C<10) solubles en agua
4,6
. También
pueden ser regioselectivas cortando el sustrato en diferentes posiciones del enlace éster
dentro del triacilglicerol.
3.3 Factores que influyen en la producción de lipasas
Existen diferentes factores que pueden tanto inhibir como inducir la producción de lipasas,
los cuales pueden variar según el microorganismo, entre estos factores se encuentra la
fuente de nitrógeno, que generalmente es de tipo orgánico como extracto de levadura,
peptona y triptona, o de tipo inorgánico como el cloruro de amonio y fosfato hidrógeno
diamonio. Entre los factores inhibitorios más comunes se encuentran la presencia de
azúcares, iones metálicos y sales, por su parte algunos sustratos lipídicos pueden inducir
dicha producción5,12.
Otro tipo de factores que influyen son el pH y la temperatura. Se ha reportado que la
mayoría de los microorganismos presentan una mayor producción de enzima a pH 7.0,
mientras que aunque la temperatura puede o no estar relacionada, se ha observado que
estas enzimas generalmente están activas en un rango entre 20-45°C12.
3.4 Detección de la actividad lipolítica
La actividad lipolítica se puede determinar por la generación de los ácidos grasos libres,
triglicéridos y desaparición del sustrato. Para ello, existen diferentes métodos que
permiten evaluar esta actividad, ya sean cuantitativos como los colorimétricos,
fluorimétricos, y de titulación, y cualitativos como la formación de halos de hidrólisis en
medio sólido, entre otros13.
3.4.1 Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cualitativas
Una de las técnicas cualitativas para evaluar la presencia de enzimas lipolíticas es la
formación de zonas de aclaramiento generadas por la hidrólisis del sustrato en el agar.
Para la verificación de la presencia de la enzima se puede utilizar Rodamina B, colorante
fluorescente que al producirse la hidrólisis del sustrato genera una coloración rosada en el
halo, visible por medio de lámpara de luz ultravioleta13,14.
4
3.4.2 Evaluación de la actividad lipolítica por el método colorimétrico con pnitrofenil éster
Uno de los métodos colorimétricos más empleados en la detección de la actividad
lipolítica es el uso del p-nitrofenil éster, el cual es hidrolizado por la enzima al romperse el
enlace éster generando un producto coloreado llamado p-nitrofenol. Se utilizan diferentes
p-nitrofenil ésteres, de cadena larga como el palmitato (ácido hexadecanoico) y ácido
oléico (ácido 9-octadecanoico) que se emplean para medir la actividad de lipasas siendo
estos más específicos y estables en presencia de agua15, y de cadena corta como el
butirato y el acetato que se emplean para medir la actividad esterasa. Sin embargo, esta
técnica presenta desventajas ya que los sustratos de cadenas cortas poseen poca
estabilidad debido a que pueden hidrolizarse espontáneamente16.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Determinar la actividad lipolítica de microorganismos seleccionados de la colección de
microorganismos de la USBA aislados suelos del PNN los Nevados.
4.2 Objetivos específicos

Seleccionar cepas de la colección de microorganismos de la USBA aislados de
suelos del PNN Los Nevados, que presenten la mayor actividad lipolítica.

Determinar las condiciones óptimas de crecimiento (temperatura y pH) de las
cepas seleccionadas.

Evaluar cualitativa y cuantitativamente la actividad lipolítica de las cepas
seleccionadas bajo las condiciones óptimas de crecimiento.
5
5. METODOLOGÍA
Este estudio se llevó a cabo en la USBA del Departamento de Biología de la Facultad de
Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, vinculado al proyecto del Centro de
Excelencia en Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos (GeBiX).
Todos los ensayos evaluados se realizaron por triplicado luego de hacer subcultivos
consecutivos a cada cepa, subcultivo1 y subcultivo 2, y a partir de este último se
trabajaron todas las pruebas.
Se inoculó el 10% del volumen final del subcultivo 1 al subcultivo 2 para la determinación
de las condiciones óptimas de crecimiento de los microorganismos y para las pruebas
enzimáticas.
5.1 Población de estudio
En la colección de microorganismos de la USBA se encuentran 43 cepas aerobias
aisladas de suelos del PNN los Nevados las cuales crecen sobre sustratos lipídicos, estas
cepas provienen de ecosistemas como páramos, superpáramos y Bosque Alto Andino, los
cuales presentan temperaturas entre 4.4°C y 9.8 °C y pH entre 4.6 a 6.2.
Tabla 1. Características del ambiente de los microorganismos aislados de suelos del PNN Los
Nevados
Muestra
Ecosistema
T° Suelo
pH
Microorganismos aislados
M5
Páramo
5.2
5.3
1 Serratia 99%
M6
Páramo
4.4
5.3
4 Serratia 99%
M7
Super páramo
13.5
4.9
2 Pseudomonas brenneri 98%
M8
Super páramo
9.9
5.2
1 Pseudomonas extremaustralis
99%
6 Paenibacillus 100%
1 Staphylococcus 100%
M14
Bosque Alto
Andino
1 Pseudomonas 100%
9.8
5.4
3 Cupriavidus 100%
3 Bacillus 100%
16 Enterobacterias
6
Estos microorganismos se encuentran preservados en glicerol al 20% a -80°C en medio
mineral M9 (anexo 1) con y sin sustrato lipídico.
5.2 Medio de cultivo y condiciones de cultivo
El medio M9 fue empleado para la determinación de las condiciones óptimas de
crecimiento y pruebas enzimáticas. El medio de cultivo escogido para hacer la selección
de la cepas fue el medio LB (anexo 2), suplementado con los sustratos lipídicos a evaluar
como Gliceril tributirato, Gliceril trioleato, Tween 80 y Aceite de oliva (1%v/v) (anexo 3).
Inicialmente las condiciones del cultivo fueron aquellas en las que se aislaron las cepas,
(pH 6.0 y/o 7.0, T° 30 y/o 35°C).
5.3 Selección de cepas lipolíticas
Se realizó un tamizaje de 43 cepas en el medio de cultivo LB con agar 10g/L, el pH del
medio estaba en 6.0 o 7.0 dependiendo de las cepas, a cada medio se le adicionó un
sustrato lipídico como el Gliceril trioleato, Gliceril tributirato, Tween 80 y Aceite de oliva
(1% v/v), posteriormente se añadió Triton X-100 al 0.1% (v/v); luego de esterilizar se
sonicó por 20 minutos a 75°C hasta lograr que el sustrato se homogenizara en el medio,
consecutivamente se agregó Rodamina B (0.01% p/v). Las cepas se sembraron de dos
formas 1) inoculando 1µl del cultivo en un disco de papel y 2) sembrando por
agotamiento. Finalmente se incubaron por 5 días a 30°C y/o a 35°c dependiendo de la
cepa. Se utilizó Pseudomonas aeruginosa del cepario de USBA, como control positivo,
reportado en la literatura como organismo lipolítico5.
A partir del tamizaje en medio sólido, se escogieron cuatro cepas que generaron el mayor
halo de hidrólisis en más de un sustrato con un diámetro igual o superior a 5mm (anexo
4). Estas fueron USBA-GBX- 513, 514, 515, y 828.
Posteriormente a las cepas seleccionadas se las realizó una nueva evaluación cualitativa
empleando los mismos sustratos anteriormente mencionados, bajo sus condiciones
óptimas crecimiento.
5.4 Características fenotípicas de las cepas
Se evaluaron características fenotípicas de las cepas seleccionadas como morfología de
la colonia y del microorganismo, tinción Gram, movilidad y catalasa.
7
5.5 Determinación de condiciones óptimas de crecimiento
Para determinar las condiciones óptimas de crecimiento de las cepas USBA-GBX- 513,
514, 515, y 828, se usó medio M9 con peptona 0,4% (p/v). Se realizó el seguimiento del
crecimiento y verificación de las cepas por densidad óptica a 580nm y microscopía. Los
valores obtenidos de absorbancia a 580nm fueron transformados a concentración (µg de
biomasa seca/ml) por medio de la curva de peso seco17.
5.5.1 Determinación de la temperatura óptima de crecimiento
Para determinar la temperatura óptima de crecimiento de las cepas seleccionadas, se
evaluó la producción de biomasa en el medio de cultivo M9 a diferentes temperaturas
desde 4 hasta 45°C con intervalos de 5°C. La temperatura óptima fue aquella donde la
cepa presentó el valor más alto de velocidad específica de crecimiento (µx) y menor
tiempo de duplicación (td).
5.5.2 Determinación del pH óptimo de crecimiento
Para determinar el pH óptimo de crecimiento de las cepas seleccionadas, se evaluó la
producción de biomasa en el medio M9 a diferentes pH entre 3.0 y 9.0 con intervalos de
0.5, los cuales se ajustaron con HCl 0,1M y 1M, y NaOH 0,1M y 1M. El pH óptimo de
crecimiento fue aquel donde la cepa presentó el valor más alto de la velocidad específica
de crecimiento (µx) y el menor tiempo de duplicación (td).
5.6 Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos lipídicos
Las cepas se sembraron en el medio básico M9 suplementado con los sustratos lipídicos
Etil oleato, Tween 80, Gliceril tributirato, Gliceril trioleato, Aceite de Oliva, y Aceite de
Palma (1% v/v) (anexo 4), estos cultivos fueron comparados microscópicamente con su
respectivo control (la cepa sembrada en el medio sin ninguna fuente de carbono
adicional).
Todos los ensayos fueron considerados positivos si se observaba aumento en la
concentración celular respecto a su control.
Se escogió para hacer la evaluación cuantitativa de la actividad lipolítica el sustrato que
favoreció el crecimiento de la cepa comparado con el control y a su vez el sustrato donde
se generó el mayor halo de hidrólisis.
8
5.7 Evaluación de la actividad lipolítica por medio de técnicas cuantitativas
Una vez determinadas las condiciones óptimas de crecimiento de las cepas, se realizó
una fermentación discontinua utilizando el sustrato lipídico escogido en el ítem 5.6, con
agitación de 120 rpm. Se tomaron muestras de las 0 a las 24 h con intervalos de 2h, para
la evaluación de crecimiento por recuento en caja y para la evaluación cuantitativa
utilizando el pNP éster (anexo 4).
El recuento en caja se realizó mediante diluciones de 10-1 a 10-7, las últimas tres
diluciones se sembraron en superficie en medio M9 suplementado con peptona al 0.4%
p/v. Los resultados obtenidos fueron en UFC/ml, y transformados a Log10 UFC/ml.
5.7.1 Cuantificación de la actividad lipolítica por medio de la técnica del p- nitrofenil
éster.
Se realizó la curva patrón del p-nitrofenol tomando concentraciones conocidas entre
0.6µM y 25µM, diluidas en buffer HEPES (concentración final de 50mM pH 7.5),
posteriormente se midió la absorbancia de cada concentración por espectrofotometría a
410nm. Se tomó como blanco el buffer HEPES.
La cuantificación de la actividad lipolítica se llevó a cabo adicionando 100µL del extracto
crudo y 50 µL de Triton X-100 al 0,5%, en el buffer HEPES (concentración final 50mM pH
7,5), esta mezcla se preincubó por 10 minutos a 30°C; posteriormente se adicionó el
sustrato p-nitrofenil butirato o p-nitrofenil palmitato (a una concentración final de 0,5mM
diluido en acetonitrilo) obteniéndose un volumen final de reacción de 2,5ml, se incubó
aproximadamente 25 minutos; luego se midió la absorbancia a una longitud de onda de
410nm. Se tomó como blanco el buffer HEPES, Triton X-100 y el sustrato p-nitrofenil éster
evaluado. Los controles fueron Pseudomonas aeruginosa del cepario de USBA, el medio
básico y el medio suplementado con el sustrato lipídico.
La actividad enzimática se expresó como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de pnitrofenol por minuto bajos las condiciones de cultivo.
9
6. RESULTADOS /DISCUSIÓN
6.1 Selección de las cepas
En estudios anteriores por medio del análisis de la secuencia del gen 16S rRNA, se
determinó la posición taxonómica de las 43 cepas aisladas del PNN Los Nevados. Las
cepas seleccionadas luego del Tamizaje inicial fueron, la cepa USBA-GBX-513 que
presentó una similitud del 99% con el género Serratia, USBA-GBX-514 que presentó una
similitud del 98% con el género P. brenneri, USBA-GBX-515 con un porcentaje de
similitud del 99% con P. extremaustralis y USBA-GBX-828 con un porcentaje de similitud
del 99% con Paenobacillus, los cuales presentaron halos iguales y/o superiores a 5mm de
diámetro en más de un sustrato (tabla 2). Se puede resaltar que la cepa Serratia USBAGBX-513 presentó una mayor actividad al obtenerse halos de 12mm, a diferencia de las
otras cepas donde el halo fue menor (<7 mm). Por otro lado, P. brenneri USBA-GBX-514
presentó actividad en todos los sustratos evaluados. Cabe señalar que los halos
producidos por las cepas USBA-GBX-513, 514, 515 y 828 fueron mayores que los
producidos por la cepa control.
Tabla 2. Cepas seleccionadas a partir de la formación de halos de hidrólisis en medio sólido con
diferentes sustratos lipídicos
Serratia USBA-
P. brenneri
P.extramaustralis
Paenibacillus
Control positivo
GBX-513
USBA-GBX-514
USBA-GBX-515
USBA-GBX-828
(Pseudomonas
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
aeruginosa)
Aceite de Oliva
12
7
5
6
4
Gliceril tributirato
11
4
6
4
3
Gliceril trioleato
Negativo
4
Negativo
4
3
Negativo
Negativo
Sustrato*
Tween 80
Negativo
7
Negativo
*Ensayos realizados por triplicado en medio LB suplementado con el sustrato al 1% v/v. Después de 5 días de
incubación.
6.2 Características fenotípicas
Se observaron algunas de las características fenotípicas como tinción Gram, movilidad,
forma de la colonia, y prueba de la catalasa, presentadas por P.brenneri USBA-GBX-514,
P.extremaustralis USBA-GBX-515, Serratia USBA-GBX-513, y Paenibacillus USBA-GBX828 (Tabla 3).
10
Tabla 3. Características generales de las cepas seleccionadas.
Cepas
Microscopía- Gram
Serratia USBA-
Bc gruesos largos
GBX-513
Gram negativos
P.brenneri USBAGBX-514
P.extremaustralis
USBA-GBX-515
Paenibacillus
USBA-GBX-828
Macroscopía
Catalasa
Movilidad
Colonia blanca opaca, cremosa,
con borde irregular ligeramente
positivo
positiva
positivo
positiva
positivo
positiva
positivo
positiva
ovalada
Bc medianos
Colonia cremosa, redonda, grande,
gruesos Gram
borde irregular, blanca brillante con
negativos
centro café
Bc pequeños
Colonia cremosa, redonda,
ligeramente gruesos
pequeña, borde irregular, blanca
Gram negativos
opaca, centro café,
Bacilos pequeños
gruesos Gram
Colonia cremosa, grande, borde
negativos.
regular, beige opaca.
6.3 Determinación de condiciones óptimas de crecimiento
Las cepas seleccionadas presentaron un pH óptimo cercano a la neutralidad. Por otro
lado las cepas Serratia USBA-GBX-513, P. brenneri USBA-GBX-514 y P. extremaustralis
USBA-GBX-515 presentaron una temperatura óptima entre 25-30°C considerándose
bacterias psicrótrofas18, que crecen en un rango de temperatura entre 5 y 35°C con su
óptima entre 25 y 30°C, la cepa restante Paenibacillus USBA-GBX-828 se considera
mesófila debido a que al igual que estas crece entre 5 y 47°C con un óptimo entre 30 y
45°C.
6.3.1 Serratia USBA-GBX- 513
La cepa Serratia USBA-GBX- 513 presentó una temperatura óptima de 25°C con una
velocidad específica de crecimiento de 0,12h-1, y un tiempo de duplicación de 5,7h, a su
vez su pH óptimo fue de 6,0 con una velocidad específica de crecimiento de 0,14h-1 y
tiempo de duplicación de 5h (Figura. 1). De 14 especies reportadas del género Serratia19,
Fu, et al. (2008) aislaron una cepa de Serratia sp. xjF1, la cual creció desde 4°C hasta
37°C con un óptimo de 20°C, comparando con los resultados obtenidos en este trabajo,
se observó que Serratia USBA-GBX- 513 presentó un comportamiento similar ya que
creció en un rango amplio de temperatura entre 8°C y 30°C con una temperatura óptima
de 25°C.
11
Figura 1. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento de Serratia USBA-GBX-513.
a.) Temperatura b.) pH
6.3.2 P. brenneri USBA-GBX-514 y P. extremaustralis USBA-GBX-515
P. brenneri USBA-GBX-514 al igual que P. extremaustralis USBA-GBX-515 presentaron
un rango de crecimiento de pH entre 4,5 y 8,5 teniendo un mejor crecimiento en los pH
cercanos a la neutralidad (Figura. 2 y 3), por otro lado P. brenneri USBA-GBX-514 tuvo un
rango amplio de crecimiento de 4°C a 35°C, similar a P. extremaustralis USBA-GBX-515,
sin embargo esta última disminuía su crecimiento considerablemente a temperaturas
inferiores a 20°C (Figura.3), mientras que P. brenneri USBA-GBX-514 a temperaturas
inferiores a 20°C fue estable (Figura.2).
La temperatura óptima de P. brenneri USBA-GBX-514 fue 30°C, donde se presentó la
mayor velocidad específica de crecimiento de 0,26h-1 y tiempo de duplicación de 2,62h, a
su vez su pH óptimo fue de 6,0 con una velocidad específica de crecimiento de 0, 262h-1 y
tiempo de duplicación de 2,65h (Figura.2). Según lo reportado por Baïda, et al. (2001) P.
brenneri es capaz de crecer en un rango entre 4°C y35°C pero no a 41°C.
Figura 2. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento de P. brenneri USBA-GBX514.a.) Temperatura b) pH
12
A su vez P.extremaustralis USBA-GBX-515 presentó una temperatura óptima de 30°C,
con una velocidad específica de crecimiento 0,33h-1, y tiempo de duplicación de 2.04h y
un pH óptimo de 7,0 con una velocidad específica de crecimiento de 0,31h-1, y tiempo de
duplicación de 2.1h (Figura 3), estos resultados son congruentes con los reportados por
López, et al. (2009), donde la temperatura de crecimiento de P. extremaustralis está entre
4°C y 35°C y no es capaz de crecer a 42°C.
Figura 3. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento de P. extremaustralis USBAGBX-515.a.) Temperatura b) pH
6.3.3 Paenibacillus USBA-GBX- 828
Paenibacillus USBA-GBX-828 creció en un rango de temperatura entre 8 y 35°C, y una
temperatura óptima de 35°C (Figura.4), con una velocidad específica de crecimiento de
0,29h-1 y un tiempo de duplicación de 2,3h, a su vez su pH óptimo fue de 7,0 con una
velocidad específica de crecimiento de 0,23h-1 y un tiempo de duplicación de 2,9h. Los
organismos del género Paenibacillus tienen temperatura óptima de 30°C y pH óptimo de
7,0 sin embargo Paenibacillus USBA-GBX-828 tuvo una temperatura óptima mayor que
las reportadas para este género23.
Figura 4. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento de Paenibacillus USBA-GBX-828.
a.) Temperatura b) pH
13
6.4 Evaluación de crecimiento en sustratos lipídicos
A partir del crecimiento en sustratos lipídicos por observación al microscopio, se evidenció
que todas las cepas crecieron abundantemente en Aceite de palma, Serratia USBA-GBX513 tuvo un buen crecimiento tanto en Aceite de oliva como en Tween 80, P. brenneri
USBA-GBX-514 creció bien en los sustratos Tween 80, Etil oleato y Gliceril trioleato, en
cambio P. extremaustralis USBA-GBX-515 creció en todos los sustratos evaluados, por
último, Paenibacillus USBA-GBX-828 creció en Aceite de oliva, Tween 80 y Gliceril
tributirato (tabla 4).
Tabla 4. Crecimiento de las cuatro cepas en diferentes sustratos lipídicos
USBA-GBX-513 USBA-GBX-514 USBA-GBX-515 USBA-GBX-828
Etil oleato
**
****
***
**
Gliceril trioleato
**
***
***
**
Gliceril tributirato
***
**
****
***
Aceite oliva
****
***
****
****
Aceite palma
***
***
****
***
Tween 80
****
****
***
***
Control sin sustrato
**
**
**
**
*Se mantiene, ** poco crecimiento, *** buen crecimiento, **** abundante crecimiento.
Para realizar la cuantificación de la actividad lipolítica se escogió el sustrato donde mejor
creció el microorganismo comparado con su control y a la vez el que haya presentado
mayor halo de hidrólisis. Por lo tanto, para Serratia USBA-GBX-513 y Paenibacillus
USBA-GBX-828 se escogió Aceite de oliva, mientras que para P.brenneri USBA-GBX-514
fue Tween 80 y para P.extremaustralis USBA-GBX-515 fue Gliceril tributirato.
6.5 Evaluación de la actividad lipolítica por p-nitrofenil (p-NP) éster
La cuantificación de la actividad lipolítica se realizó con el pNP butirato y pNP palmitato,
sin embargo para éste último, se obtuvieron lecturas de falsos positivos y no hubo
reproducibilidad en la prueba, por lo tanto éste sustrato no se reportó en este estudio.
6.5.1 Serratia USBA-GBX- 513
Durante su crecimiento en Aceite de oliva, Serratia USBA-GBX-513 presentó actividad
lipolítica desde la hora 6 hasta la hora 24 con un máximo de actividad a la hora 16, de
336.32 U/L, en la fase estacionaria (Figura.5). Este valor es mayor al reportado por Zhao,
14
et al. (2008) donde obtuvieron una actividad lipolítica de 33.9 U/L utilizando S.
marcescens creciendo en Tween 80, a partir del extracto crudo, el cual fue evaluado con
el sustrato pNP butirato. Sin embargo, al ensayar con otros pNP éster con ácidos grasos
de cadena larga como el pNP miristato (C14), encontraron una mayor actividad lipolítica;
concluyeron que la enzima es una lipasa verdadera que puede cortar tanto sustratos con
ácidos grasos de cadena corta como ácidos grasos de cadena larga. De acuerdo con los
resultados obtenidos, Serratia USBA-GBX-513 posee una enzima lipolítica capaz de
1,00
0,90
0,80
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
400,00
350,00
300,00
250,00
200,00
U/L
Log 10 UFC/ml
hidrolizar ácidos grasos de cadena tanto larga como corta (tablas 1 y 3).
Curva de
crecimiento
150,00
100,00
50,00
Actividad
lipolítica
0,00
0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (h)
Figura 5. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Aceite de oliva de
Serratia USBA-GBX-513, bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
6.5.2 P. brenneri USBA-GBX-514
A partir del crecimiento de P. brenneri USBA-GBX-514 en Tween 80 (Figura. 6), se
observó la mayor actividad a la hora 15, cuando el microorganismo probablemente se
encontraba en fase de adaptación al sustrato lipídico, luego de esta fase el
microorganismo empezó a crecer nuevamente posiblemente a partir del ácido oleico,
producto de la hidrólisis del Tween 80, como se observó en otros ensayos (no mostrados),
donde P. brenneri USBA-GBX-514 tuvo la capacidad de crecer en éste ácido graso.
La actividad lipolítica presentada por P. brenneri USBA-GBX-514 fue de 73,50 U/L mucho
menor que lo reportado por Hong- wei, et al. (2009) y Ruchi, et al. (2007), donde
obtuvieron a partir de P. aeruginosa valores de actividad de 58,9 U/ml (58900 U/L)12 y de
4580 U/ml (4580*103 U/L)10, respectivamente; sin embargo, el valor tan bajo de esta
cuantificación, pudo deberse a que no se empleó el pNP éster indicado ya que se
15
cuantificó con pNP butirato, que es apropiado para medir actividad esterasa, y de acuerdo
con los resultados mostrados en las tablas 2 y 4 y el tipo de sustrato (Tween 80) utilizado
en esta fermentación, la enzima lipolítica producida por P. brenneri USBA-GBX-514 puede
cortar sustratos complejos, por ende este valor puede mejorar, al evaluar con pNP ésteres
de ácidos grasos de cadena larga como el pNP palmitato como lo reportaron los autores
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
400,00
350,00
300,00
250,00
200,00
U /L
Log 10 UFC/ml
anteriormente mencionados.
150,00
Curva de
crecimiento
Actividad lipolítica
100,00
50,00
0,00
0
10
20
Tiempo (h)
30
40
Figura 6. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Tween 80 de P. brenneri
514 bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
6.5.3 P. extremaustralis USBA-GBX-515
A partir del crecimiento de P. extremaustralis USBA-GBX-515 en Gliceril tributirato, se
observó que la producción de la enzima lipolítica estaba ligada al crecimiento, donde se
obtuvo la mayor actividad a la hora 15 (finalizando la fase exponencial), con una actividad
de 255,1U/L (Figura.7). Aunque no se ha reportado actividad lipolítica en la cepa P.
extremaustralis, se ha encontrado que P.veronni, que tiene similitud del 99.7% con P.
extremaustralis
25
, posee una esterasa22, comparando estas dos cepas se podría llegar a
pensar que P. extremaustralis USBA-GBX-515 puede llegar a poseer también una
esterasa debido a que crece abundantemente en sustratos con ácidos grasos de cadena
corta y cuantifica utilizando pNP butirato.
16
400,0
350,0
300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
U/L
Log 10 UFC/ml
0,900
0,800
0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
Curva de crecimiento
Actividad lipolítica
50,0
0,0
0
5
10
15
20
Tiempo (h)
25
30
Figura 7. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Gliceril tributirato de
P.extremaustralis USBA-GBX-515 bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
Las cepas P. brenneri USBA-GBX-514 y P. extremaustralis USBA-GBX-515, presentaron
diferencias en las enzimas que expresan, ya que la enzima producida por P. brenneri
USBA-GBX-514 (Figura. 6) tuvo su mayor actividad en la fase de adaptación al sustrato
lipídico, mientras que la producida por P. extremaustralis USBA-GBX-515 (Figura.7) la
presentó en la fase exponencial. Esto pudo deberse al tipo de sustrato en que están
creciendo, ya que P. brenneri USBA-GBX-514 creció en un sustrato complejo como
Tween 80 a diferencia P. extremaustralis USBA-GBX-515 quien creció en Gliceril
tributirato.
6.5.4 Paenibacillus USBA-GBX-828
A partir del crecimiento de Paenibacillus USBA-GBX-828 en aceite de oliva, se observó
que la producción de la enzima estaba asociada al crecimiento, sin embargo la mayor
actividad lipolítica se presentó a la hora 12 en fase estacionaria, con una cuantificación de
393 U/L (Figura. 8), esta actividad fue mayor que lo reportado por Prim, et al. (2000)
donde obtuvieron una cuantificación de 0,2 U/L en la fracción del sobrenadante en
Paenibacillus BP-33, sin embargo cabe resaltar que la enzima producida por Paenibacillus
USBA-GBX-828 probablemente posee dos enzimas lipolíticas y por esta razón pueden
cortar sustratos con ácidos grasos tanto de cadena larga como de cadena corta (tabla 2 y
4), mientras que la enzima del Paenibacillus trabajado por Prim, et al. (2000) fue una
esterasa.
17
1,200
400
350
300
0,800
250
0,600
200
150
0,400
100
0,200
U/L
Log 10 UFC/ml
1,000
Curva de crecimiento
Actividad lipolítica
50
0,000
0
0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (h)
Figura 8. Cuantificación de la actividad lipolítica y crecimiento en sustrato Aceite de oliva de la cepa
Paenibacillus USBA-GBX-828 bajo las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa.
Según las condiciones de crecimiento de Serratia USBA-GBX-513, P. brenneri USBAGBX-514, P.extremaustralis USBA-GBX-515, probablemente sus enzimas pueden actuar
a temperaturas bajas, mientras que la enzima producida por Paenibacillus USBA-GBX828 probablemente actúa a temperaturas entre 20 y 45°C como se ha observado en la
mayoría de las enzimas producidas por mesófilos12, sin embargo hay que estudiar más a
fondo su comportamiento a diferentes temperaturas para llegar a concluir cual es la
temperatura ideal, para que se presente la mayor actividad.
7. CONCLUSIONES
Se seleccionaron cuatro cepas que presentaron la mayor actividad lipolítica.
Serratia USBA-GBX-513, P. brenneri USBA-GBX-514 y P.extremaustralis USBA-GBX515 son microorganismos psicrótrofos con una temperatura óptima entre 25 y 30°C,
mientras que la Paenibacillus USBA-GBX-828 es un microorganismo mesófilo con una
temperatura óptima de 35°C, todos son organismos neutrófilos ya que presentaron pH
óptimos entre 6.0 y 7,0.
Serratia USBA-GBX-513 y Paenibacillus USBA-GBX-828 presentaron la mayor actividad
lipolítica en la fase estacionaria con una cuantificación en pNP butirato de 393 U/L y
336.32 U/L respectivamente. P. extremaustralis USBA-GBX-515 fue en la fase
exponencial, con una cuantificación de 255.1 U/L y P. brenneri USBA-GBX-514, presentó
una cuantificación de 73.5 U/L.
18
Todas las cepas produjeron una enzima lipolítica asociada al crecimiento del
microorganismo y con capacidad de cortar sustratos de cadenas largas como cortas.
8. RECOMENDACIONES
Evaluar diferentes sustratos de cadenas largas para cuantificar lipasas verdaderas y así
corroborar el tipo de enzima que produce cada cepa.
Evaluar diferentes factores que influyen en la actividad enzimática como la relación
carbono nitrógeno, concentración de sales, iones metálicos y la aireación, y la
temperatura y pH en los cuales se presente la mayor actividad de esta.
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21
10. Anexos
Anexo 1 Composición del Medio de Sales Minerales (M9)25.
Componente
g/L
NaCl
0.5
KH2PO4
3
Na2HPO4
6
NH4Cl
1
Extracto de levadura
0.05
Agar
10
Anexo 2. Composición del Luria Bertani (LB)13.
Componente
g/L
Digerido pancreático de caseína
10
Extracto de levadura
5
NaCl
0,5
Agar
10
Anexo 3. Medición de halos de hidrólisis27.
La medición de los halos se realiza teniendo en cuenta la siguiente fórmula:
C=A-B
C: Diámetro del halo de hidrólisis.
A: Diámetro de la colonia en mm.
B: Diámetro de la colonia.
Anexo 4. Sustratos lipídicos
Sustrato
Concentración inicial
Concentración final
Gliceril Trioleato
0.25M
10mM
Gliceril tributirato
1M
10mM
Aceite de palma
0.25M
10mM
Etil Oleato
0,25M
10mM
Tween 80
No aplica
1µl/ml
Aceite de Oliva
No aplica
1µl/ml
22
Anexo 5. Obtención del extracto crudo 28

Obtención del extracto crudo para enzimas extracelulares.
Se tomará la cepa crecida con el sustrato, se centrifugará por 7 minutos a 11000 rpm y el
sobrenadante (extracto crudo) obtenido se utilizará para los ensayos.
23