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IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE CUATRO AISLAMIENTOS DE Pseudomonas spp Y
CARACTERIZACIÓN DEL GEN phlD
JULIANA KATHERINE VÁSQUEZ ARDILA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
Microbióloga Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C. 2011
NOTA DE ADVERTENCIA
ArtÍculo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos omitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo se velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se
vea en ellas el anhelo en buscar la verdad y la justicia”
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………………
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general……………………………………………………………………………………………………………….
3.2 Objetivos específicos………………………………………………………………………………………………………..
4.1 MARCO TEÓRICO
4.2 Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal…………………………………………………………..
4.3 Pseudomonasfluorescens y su poder biocontrolador……………………………………………………..
4.4 Identificación molecular por ADN ribosomal 16S………………………………………………………………
4.5 El operónphl y el 2,4-diacetilfluoroglucinol………………………………………………………………………
4.6 Diversidad genética basada en el gen phlD……………………………………………………………………….
4.7 Evaluación de expresión génica del gen phlD……………………………………………………………………
4 METODOLOGÍA
5.1 Cepas y medios de cultivo…………………………………………………………………………………………………
5.2 Identificación molecular por medio de ADNr 16s………………………………………………………………
5.2.1 Extracción de ADN………………………………………………………………………………………………………….
5.2.3Amplificación de ADNr 16S…………………………………………………………………………………………….
5.2.3 Clonación de ADNr 16S…………………………………………………………………………………………………..
5.3 Caracterización del gen phD……………………………………………………………………………………………..
5.3.1 PCR anidada del gen phlD………………………………………………………………………………………………
5.3.2 Clonación del gen phlD y análisis de las secuencias………………………………………………………..
5.4 Evaluación de los niveles de expresión del gen phlD…………………………………………………………
5.4.1 Elaboración de cinéticas de crecimiento ………………………………………………………………………..
5.4.2 Extracción de RNA………………………………………………………………………………………………………….
5.4.3Extensión Reversa y evaluación de la expresión del gen phlD.……………………………………..
5.4 Evaluación de la producción del 2,4-diacetilfluoroglucinol y su efecto antagónico………….
5.4.1 Pruebas de antagonismo frente a Fusarium oxysporum cepa 308 y Colletotrichumsp….
5.4.2 Cromatografía en capa delgada (TLC) …………………………………………………………………………….
5.4.3 Evaluación de la actividad antimicrobiana por bioautografía………………………………………….
6.RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Identificación molecular por medio de ADNr 16s………………………………………………………………
6.2 Caracterización del gen phlD………………………………….…………………………………………………………
6.3 Evaluación de los niveles de expresión del gen phlD………………………………………………………..
6.4 Evaluación de la producción del 2,4-diacetilfluoroglucinol y su efecto antagónico……………
7. CONCLUSIONES………………………………….………………………………….………………………………………….
8. RECOMENDACIONES………………………………….………………………………….………………………………….
9. BIBLIOGRAFÍA………………………………….………………………………….…………………………………………….
ANEXOS
1
2
3
3
3
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5
5
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6
6
6
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10
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11
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24
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29
29
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.Producto de PCR ADNr 16S con primers específicos para Pseudomonasspp
(F311Ps y 1459rPs). Electroforesis en gel de agarosa 1%.
12
Figura 2. Producto de PCR ADNr 16S con primers Com1 y Com2. Electroforesis en gel
de agarosa 1%.
12
Figura 3. Árbol filogenético basado en el alineamiento de secuencias de 16S ADNr.
15
Figura 4. Producto de PCR del gen phlD con primers Phl2a y Phl2b. Electroforesis en
gel de agarosa 1,2%.
16
Figura 5. Producto de PCR anidada del gen phlD con primersphl536r, Phl310f y
Phl31chf. Electroforesis en gel de agarosa 1,2%.
16
Figura 6. Árbol filogenético basado en el alineamiento de secuencias parciales de
proteínas producto del gen phlD de las cepas de Pseudomonasfluorescens 1069 y
1067.
20
Figura 7. Cinética de
Pseudomonasfluorescens
de
21
Figura 8. ARN extraídos de fase estacionaria temprana y tardía para cinco cepas de
Pseudomonasfluorescens
21
Figura 9. RT-PCR limitante
Pseudomonasfluorescens
de
22
Figura 10. RT-PCR semicuantitativa del gen phlD en fase estacionaria temprana y
tardía con interrupción de ciclos para cinco cepas de Pseudomonasspp.
23
Figura 11. Inhibición de crecimiento de Fusarium oxysporum 308 y Colletotrichumsp.
25
Figura 12. Cromatografía en capa delgada de extractos de cinco cepas de
Pseudomonasfluorescens.
27
Figura 13. Bioautografía contra Fusarium oxysporum 308 y Colletotrichumsp.
28
crecimiento
consenso
(estacionaria
para
temprana)para
cinco
cinco
cepas
cepas
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Resultados de búsqueda de homología por BLASTN para el gen 16S de las
cuatro cepas de estudio
13
Tabla 2.Resultados de búsqueda de homología por BLASTN para los genes phlD de las
cuatro cepas de estudio
17
Tabla 3.Resultados de búsqueda de homología por BLASTX para los genes phlD de las
cuatro cepas de estudio
18
RESUMEN El metabolito antimicrobiano 2,4‐diacetilfluoroglucinol juega un papel importante en la capacidad biocontroladora de Pseudomonas fluorescens. El objetivo de este trabajo fue identificar cuatro cepas presuntivamente Pseudomonas sp y caracterizar el gen phlD con base al análisis de su secuencia y a la evaluación de los niveles de expresión en las cuatro cepas, con el fin de inferir su potencial para producir el 2,4‐DAPG y su correlación con el efecto antagónico sobre hongos fitopatógenos. Tres de las cepas en estudio fueron clasificadas como Pseudomonas fluorescens, pero es imprescindible una mejor identificación de la cepa 1038. Los análisis del gen phlD demostraron que las cuatro cepas pertenecían al genotipo A y expresaban el gen phlD implicado en la biosíntesis del 2,4‐DAPG. Sin embargo, las cepas 1069, 1067 y 1114 expresan en un nivel superior este gen, 24 horas después del inicio de la fase estacionaria. Las pruebas de antagonismo sobre Colletotrichum sp y Fusarium oxysporum 308 evidencian que los niveles de expresión del gen phlD no se relacionan con el poder antagónico. Es probable que el 2,4‐DAPG inhiba el crecimiento de dichos hongos, sin embargo, otros metabolitos secundarios con actividad antifúngica explican las inhibiciones observadas. 1. INTRODUCCIÓN La disminución de la fertilidad de los suelos ha generado la pérdida de áreas cultivables de gran extensión, las causas incluyen el uso desmesurado de insumos químicos como los plaguicidas que inhiben el crecimiento de patógenos responsables de las pérdidas de cultivos. En respuesta a esta problemática, el posible reemplazo de controladores de síntesis química ha incentivado el estudio de algunos microorganismos pertenecientes al género Pseudomonas spp que producen metabolitos como el 2,4‐diacetifluoroglucinol (DAPG) e inhiben una gran variedad de hongos fitopatógenos como Colletotrichum, agente causal de enfermedades en múltiples especies de frutales, de la pudrición roja de la caña de azúcar y responsable de grandes pérdidas económicas. El uso de estos microorganismos también es promisorio por la necesidad de reemplazar las sustancias químicas causales de enfermedades en trabajadores del sector agrícola e incluso en consumidores, sin embargo, la interacción de diferentes variables como la diversidad del suelo en el que se desarrollan los microorganismos estudiados, la planta hospedadora y los exudados que favorecen la colonización de ciertos microorganismos, entre otros, deben ser tenidas en cuenta para la evaluación de la viabilidad y eficiencia de estos microorganismos en una formulación (Akubara & Bonsall, 2008). Trabajos anteriores realizados en la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Universidad Javeriana, han permitido aislar de ecosistemas agroforestales cuatro cepas presuntivamente Pseudomonas spp portadoras del gen phlD implicado en la biosíntesis del DAPG (García A, Comunicación personal). Este trabajo propuso identificar molecularmente estas cepas y 1 caracterizar el gen phlD de acuerdo al análisis de su secuencia y a la evaluación de los niveles de expresión en las cuatro cepas, con el fin de inferir el potencial de estas mismas para producir el 2,4‐DAPG y su correlación con el efecto antagónico sobre hongos fitopatógenos. 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN Los plaguicidas son productos químicos utilizados para el control de los diferentes agentes patógenos de los cultivos, sin embargo su carácter xenobiótico los hace en la mayoría de los casos recalcitrantes en el ambiente. Dado que pueden permanecer intactos durante largos períodos de tiempo, la molécula puede tener contacto con el hombre, plantas y animales, lo cual representa un alto riesgo para la salud humana pues son agentes causales tanto de afecciones crónicas como agudas (Yanggen et al, 2003; Gerhardson, 2000). Su liberación en el medio ambiente involucra aspectos de gran impacto ambiental; en el suelo pueden afectar la diversidad microbiana y por lo tanto alterar su productividad agrícola. La transferencia por lixiviación y escorrentía representa contaminación de cuerpos de agua subterránea y superficial, afectando el equilibrio dinámico, especies de animales y microbiota (Picard y Bosco, 2008). Por otro lado, el uso de estos insumos representa una cifra significativamente alta entre los costos de producción agrícola (Compant, 2005). La búsqueda de mejores prácticas de producción agrícola no sólo está relacionada con el aumento de la productividad, por la directa disminución de costos en insumos, en este caso plaguicidas, sino con el desarrollo de estrategias amigables con el ambiente que eviten el deterioro del suelo, la contaminación del recurso hídrico y de la atmósfera y que además no representen un peligro contra la salud humana. El desarrollo de bioplaguicidas, es una alternativa a base de microorganismos que generan un efecto antagónico sobre patógenos de diferentes cultivos (Gerhardson, 2002). Bacterias pertenecientes a la especie Pseudomonas fluorescens han sido ampliamente reportadas por su actividad antagónica sobre patógenos de plantas, por esta razón es promisorio su uso como biocontrolador ya que produce diferentes metabolitos que contribuyen a dicha actividad como el 2,4‐Diacetilfluoroglucinol (DAPG) (McSpadden, 2007). La caracterización molecular de las cepas en estudio que permita determinar características acerca de su actividad en la rizósfera, así como la evaluación de la producción de este compuesto y su relación con el antagonismo sobre hongos fitopatógenos, hacen parte de las fases principales para el desarrollo de un biocontrolador. 2 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo general Identificar molecularmente cuatro aislamientos de Pseudomonas spp de ecosistemas agroforestales y caracterizar el gen phlD involucrado en la biosíntesis del 2,4‐
Diacetilfluoroglucinol. 3.2 Objetivos específicos 1. Identificar las cuatro cepas de Pseudomonas spp aisladas de ecosistemas agroforestales por medio de secuenciación de ADN ribosomal 16S. 2. Amplificar, clonar y secuenciar los genes phlD de las cuatro cepas de Pseudomonas spp aisladas. 3. Evaluar los niveles de expresión basal del gen phlD en cada una de las cepas aisladas. 4. Verificar la producción del 2,4‐diacetifluoroglucinol y su efecto inhibitorio en hongos fitopatógenos. 4. MARCO TEÓRICO 4.1 Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal La rizósfera se define como la porción del suelo que es adyacente al sistema radical de la planta y cuya actividad está influenciada por los exudados de la raíz. El contenido de aminoácidos, vitaminas, azúcares y metabolitos secundarios que estos contienen, ejerce un efecto selectivo sobre los microorganismos que allí se desarrollan (Manoharachary & Mukerji K, 2006). Debido al auge de implantar cultivos cada vez más libres de agroquímicos que afectan la salud y el ambiente, la introducción de microorganismos que además ejercen un efecto benéfico sobre las plantas se ha hecho promisoria, dentro de los estos se encuentran las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, las cuales son un grupo de bacterias tanto de vida libre como algunas endófitas, que colonizan la rizósfera y benefician el crecimiento vegetal directa e indirectamente (Antoun & Prévost, 2005). De manera directa, actúan favoreciendo la toma de nutrientes por procesos como la fijación de nitrógeno, producción de sideróforos y solubilización de fosfatos y minerales. A su vez la producción de fitohormonas como auxina y citoquinina y otros compuestos promotores del crecimiento vegetal como el etileno ha sido reportada, observándose crecimiento ramificado más acelerado el cual está directamente relacionado con el incremento en la toma de nutrientes; finalmente, estos microorganismos tienen la capacidad de degradar contaminantes orgánicos y así evitar que se conviertan en sustancias tóxicas para la planta, lo cual es conocido como rizorremediación (Antoun & Prévost, 2005; Podile & Kishore, 2006). 3 Los mecanismos indirectos se basan en la reducción de la probabilidad de infección por 1) la producción de sustancias inhibitorias del crecimiento de patógenos 2) competencia por nutrientes y espacio e 3) inducción de la resistencia sistémica de la planta (Antoun & Prévost, 2005). Las comunidades microbianas de la rizósfera también incluyen hongos cuyas hifas contribuyen a la estabilidad del suelo por la formación de agregados o unión entre las mismas, y cumplen otras funciones simbióticas gracias a la formación de micorrizas arbusculares y ectomicorrizas (Tarkka et al, 2006). Los protozoos de la rizósfera también juegan un papel importante en el flujo de nutrientes y energía debido a su papel predador de bacterias que favorece el flujo de biomasa, su capacidad de formar pseudópodos también les permite explorar localizaciones bacterianas de difícil acceso (Tarkka et al, 2006). 4.2 Pseudomonas fluorescens y su poder biocontrolador Las bacterias del género Pseudomonas spp son bacilos gram negativos rectos o ligeramente curvos, móviles y aeróbicos. Su actividad como rizobacteria promotora del crecimiento vegetal es atribuida principalmente a mecanismos indirectos por la producción de sustancias inhibitorias del crecimiento de patógenos, sin embargo Antoun & Prévost (2008) evidenciaron incremento en la nodulación, aumento del tamaño de la raíz y de la actividad nitrogenasa en combinación con R. leguminosarum.
Diversos son los compuestos producidos por las cepas de Pseudomonas fluorescens. Dentro de los más estudiados se encuentran las fenazinas, el ácido cianhídrico involucrado en la supresión de la pudrición negra de la raíz del tabaco (Paulin et al, 2009), pirrolnitrinas cuya actividad ha sido reportada sobre Rhizoctonia solanii, agente causal del volcamiento de plantas; pioluteorinas, que actúa contra Phytium ultimum (Loper & Gross, 2007) y el 2,4‐DAPG, un compuesto de tipo poliquétido cuya actividad controladora ha sido evidenciada sobre Gaeumannomyces graminis, responsable de enfermedades del trigo; Fusarium oxysporum, agente causal del marchitamiento del tomate y otros organismos como bacterias causales de la pudrición blanda de la papa e incluso nematodos que también afectan este cultivo (Schnider‐Keel et al, 2000). Otros compuestos del tipo de lipopéptidos cíclicos, producidos por esta especie, han sido descritos por su actividad antimicrobiana como la viscosinamida, las tensinas y la orfamida A, sin embargo poco se ha estudiado acerca de éstos (Loper& Gross, 2007; Picard y Bosco, 2008). 4.3 Identificación molecular por ADN ribosomal 16S El uso de marcadores moleculares, específicamente ADN ribosomal 16S, es útil para la identificación a nivel de especie y estimación de relaciones filogenéticas pues su función en la síntesis de proteínas no ha cambiado a través del tiempo en todos los procariotas y sobre todo por ser una región conservada a nivel evolutivo. A su vez el gen ARNr 16S es seleccionado para este fin 4 sobre los demás genes del operón rrn, dado que el ARNr 23S es altamente conservado y el ARNr 5S es muy pequeño (Peix et al, 2009; Janda & Abbott, 2007). 4.4 El operón phl y el 2,4‐diacetilfluoroglucinol El 2,4‐DAPG es un compuesto de tipo poliquétido aromático al igual que las tetraciclinas, la doxorubicinas y algunas micotoxinas, caracterizados todos por su efecto antimicrobiano (Schönfeld& Herbert, 2002). La síntesis de este compuesto está mediada por los productos de expresión del operón phl, el cual está compuesto por cinco genes. Los genes phlACBD flanqueados en el extremo 5’ por el gen phlE que codifica una permeasa encargada del transporte del DAPG al exterior y en el extremo 3’ por el gen phlF que codifica un represor transcripcional, el cual se transcribe de manera divergente a los demás genes (Bangera & Thomashow, 1999; Delany et al, 2000). La síntesis se lleva a cabo por medio de reacciones sucesivas de condensación de ácidos grasos de cadena corta; las enzimas productos de expresión de los genes phlA, phlC y phlB participan en una reacción de monoacetilación del precursor MAPG para producir finalmente 2,4‐
DAPG, y también catalizan una reacción de condensación cuyo producto es una unidad de acetoacetil‐coA. Sobre esta actúa una poliquétido sintasa codificada por el gen phlD, capaz de producir el monoacetilfluoroglucinol (MAPG), precursor del 2,4‐DAPG. Este último gen es clave en la síntesis del metabolito dado que el precursor (MAPG) no puede ser sintetizado por otra vía y su ocurrencia se ha relacionado con la producción in vitro de 2,4‐DAPG (Bangera & Thomashow, 1999; Mcspadden et al, 2000). 4.5 Diversidad genética basada en el gen phlD Dado que el gen phlD es altamente conservado y tiene una relevancia importante en la producción de 2,4‐DAPG, ha sido utilizado como marcador de diversidad genética de bacterias productoras de dicho compuesto (Imfeld et al, 2006). El uso de técnicas como rep‐PCR, BOX‐PCR, análisis de restricción (RFLP) del gen phlD y análisis de su secuencia han permitido definir diferentes genotipos de los aislamientos phlD+ con el fin de distinguir cepas que tengan diferentes habilidades de colonizar la rizósfera y suprimir agentes patógenos de la misma (Mcspadden et al, 2000; Raaijmakers & Weller, 2001; De La Fuente et al, 2006). 4.6 Evaluación de expresión génica del gen phlD El estudio de los niveles de expresión del gen phlD es de gran importancia dado que ésta se ve modulada por múltiples factores bióticos y abióticos como las fuentes nutricionales. Duffy y Défago (1999) reportan la inhibición de la producción del DAPG por fosfato inorgánico y la estimulación por Zn2+, glucosa y NH4Mo2+, lo cual puede relacionarse con el grado de adaptación a la rizósfera por asimilación de los diferentes sustratos disponibles en ésta (Imfeld et al, 2006). Otros reportes demuestran que las pioluteorinas y el salicílico, también producidos por Pseudomonas fluorescens, inhiben la producción de 2,4‐DAPG (Schnider et al, 2000). 5 Técnicas de PCR en tiempo real acopladas a transcripción inversa son herramientas útiles para la evaluación de la expresión génica, sin embargo, aproximaciones a esta técnica como la RT‐PCR en condiciones limitantes de ciclos, pueden ser utilizadas para el mismo fin. Esta metodología se basa en la amplificación de ADNc obtenido por retrotranscripción, fijando un número de ciclos previo a la fase de saturación de la amplificación. De tal modo, la diferencia en el número de ciclos en el cual se alcanza un umbral en la intensidad del producto de PCR es un indicativo de mayor o menor cantidad del transcrito y por lo tanto diferencias en niveles de expresión para dos condiciones diferentes. Así como en la qRT‐PCR, que usa un gen normalizador cuya expresión es constitutiva, la metodología de PCR en condiciones de ciclos limitantes normaliza los resultados por medio de comparación de intensidad del ARNr en electroforesis, lo cual permite determinar que se parte de la misma cantidad de ARN para llevar a cabo la retrotranscripción. 5. METODOLOGÍA 5.1 CEPAS Y MEDIOS DE CULTIVO En éste estudio se trabajó con las cepas de Pseudomonas spp1069, 1067, 1038, 1114 y se usó como referencia la cepa Pseudomonas fluorescensPf‐5 (ATCC BAA 477); estas cepas se cultivaron en medio King B y en medio Luria Bertani (LB) (Anexo I) y fueron incubadas a 30°C. La cepa Escherichia coli DH5αse empleó como hospedadora de plásmidos para los estudios de clonación de los genes de interés, ésta se cultivó en medio LB y medio S.O.C y fue incubada a 37°C. 5.2 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR POR MEDIO DE ADNr 16S 5.2.1 Extracción de ADN Se extrajo el ADN de las cuatro cepas de Pseudomonas spp (1069, 1067, 1038 y 1114) y de Pseudomonas fluorescensPf‐5 (ATCC BAA 477), usando el protocolo basado en CTAB, descrito por Ausubel y colaboradores (1992). La cuantificación y calidad del ADN fue evaluada por espectrofotometría usando el espectrofotómetro NadoDrop® ND‐100 y por electroforesis en gel de agarosa al 1%. 5.2.2 Amplificación de ADNr 16S Para la identificación molecular de las cuatro cepas de Pseudomonas spp se realizó una reacción en cadena de la polimerasa en dos pasos, tomando como molde el ADN extraído previamente. Se llevó a cabo una primera amplificación haciendo uso de la pareja de primers F311Ps (5’CTGGTCTGAGAG GATGATCAGT 3’) y 1459rPs (5’AATCACTCCGTGGTAACCGT 3’) (Milling et al, 2004), que amplifican una región específica de la subunidad ribosomal 16S. El volumen final de cada reacción de PCR fue de 20µL y contenía 0,25µM de cada primer, MgCl2 1,5mM, Taq buffer Promega 1X, dNTPs 0,2mM y 0,5U Taq ADN polimerasa (Promega, ref. M8291). El programa consistía de una desnaturalización a 94°C durante 4 minutos, 30 ciclos cada uno de: 30 segundos a 6 94°C, 30 segundos a 50°C y 45 segundos a 72°C y finalmente una última extensión de 7 minutos a 72°C (Milling et al, 2004). La segunda amplificación tomó como molde el producto de amplificación obtenido en la primera reacción, luego de ser diluido 10 veces en agua destilada‐desionizada; para esta se utilizaron los primers Com1 (5’CAGCAGCCGCGGTAATAC3’) y Com2 (5’CCGTCAATTCCTTTGAGTTT3’) (Schwieger & Tebbe, 1998) a una concentración final de 0,25µM. El volumen final de cada reacción de PCR fue de 20µL y contenía MgCl2 1,5mM, Taq buffer Promega 1X, dNTPs 0,2mM y0,5U Taq ADN polimerasa (Promega, ref. M8291). El programa consistía de una desnaturalización a 94°C durante 4 minutos, 30 ciclos cada uno de: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C y 45 segundos a 72ºC. Finalmente se realizó una última extensión de 7 minutos a 72°C. Los productos de amplificación en todos los casos se verificaron por electroforesis en gel de agarosa, haciendo uso de buffer TAE [Tris‐base), ácido acético glacial, EDTA 0,5M]. 5.2.3 Clonación de ADNr 16S Para clonar las secuencias de interés se prepararon células quimio competentes de E. coli DH5α siguiendo el protocolo descrito por Liu et al (2004) y su eficiencia fue evaluada realizando una transformación con el plásmido pUC 19 (Invitrogen, ref. 15364‐011) El producto de amplificación fue clonado en el vector pCR 2.1 (Invitrogen, ref. K202040), conservando una relación 3:1 (inserto‐vector). La reacción de ligación contenía 1,55ng de producto de PCR fresco, 12,5ng de vector, 1µL de buffer de ligación 10X, 6 unidades de T4 ADN ligasa (Invitrogen, ref. 15224‐041) y se completó a un volumen final de 10µL con agua destilada‐
desionizada, esta fue incubada durante 16 horas a 14°C. Posteriormente se llevó a cabo la transformación siguiendo el protocolo descrito por Sambrook & Russell (2001), de tal modo se transfirió el volumen total de la reacción de ligación a un vial que contenía 500µL de células quimio‐competentes de E. coli DH5α. Luego de mantenerse durante 30 minutos en hielo, se hizo un choque térmico a 42°C durante 30 segundos y posteriormente volvieron a incubarse en hielo durante 5 minutos. Seguidamente se adicionaron 400µL de medio S.O.C. precalentado y se incubó durante una hora a 37°C. Finalmente se sembraron 200µL sobre placas de agar LB que contenían kanamicina (50µg/mL), IPTG (µg/mL) y X‐gal (50µg/mL) y se incubaron durante 16 horas (Sambrook & Russell, 2001). Para la verificación de los plásmidos recombinantes, se realizó PCR a partir de colonias blancas o presuntivas de poseer el inserto. Dicha reacción se realizó en un volumen final de 15µL haciendo uso de los primers universales M13 y T7y contenía 0,2µM de cada primer, MgCl2 1,5mM, Taq buffer Promega 1X, dNTPs 0,2mM y 0,5U Taq ADN polimerasa (Promega, ref. M8291). El programa consistía de una desnaturalización a 94°C durante 4 minutos, 30 ciclos cada uno de: 30 segundos a 7 94°C, 45 segundos a 59°C y 45 segundos a 74°C para posteriormente hacer una extensión final de 5 minutos a 74°C. Se obtuvo ADN plasmídico de alta pureza a partir de colonias positivas para el plásmido recombinante, haciendo uso del sistema comercial Ultraclean 6 minutes Mini Plasmid Prep Kit (MO BIO, cat. 12300‐50), y se extrajo de 2mL de cultivo en medio LB con kanamicina (50µg/mL), el cual había sido incubado durante 16 horas a 37°C. La verificación de los plásmidos recombinantes se llevó a cabo por medio de electroforesis en gel de agarosa, PCR siguiendo el programa previamente descrito para los primers M13 y T7 y finalmente los insertos clonados se secuenciaron con primers flanqueantes al sitio de inserción, a través de los servicios de Macrogen (Corea). El análisis de las secuencias fue llevado a cabo por un alineamiento pareado haciendo uso de la herramienta BLASTN (Altschul et al, 1990). Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple con secuencias de ARNr 16S de especies de Pseudomonas spp anotadas en su mayoría en la base de datos RefSeq y con este resultado se construyó un árbol filogenético por el método de neighbour‐
joining y el parámetro Kimura 2 (Sangui et al, 2008), aplicando un análisis de bootstrap de 1000 réplicas. Los árboles fueron realizados haciendo uso del programa MEGA5 (Fischer et al, 2010). 5.3 CARACTERIZACIÓN DEL GEN phlD 5.3.1PCR anidada del gen phlD Para la primera reacción de PCR se utilizó como molde el ADN extraído de las cinco cepas de Pseudomonas spp y los primers phl2a (5’‐GAGGACGTCGAAGACCACCA‐3’) y phl2b (5’‐
ACCGCAGCATCGGTATSA‐3’), que amplifican una región del gen phlD de 745pb aproximadamente (Raaijmakers, 1997), 0,25µM de cada primer, MgCl2 3,0mM, Taq buffer Promega 1X, dNTPs 0,2mM y0,5U Taq ADN polimerasa (Promega, ref. M8291). El programa consistía en una desnaturalización a 95°C durante 2 minutos, 30 ciclos cada uno de: un minuto a 95°C, 30 segundos a 60°C y un minuto a 72°C. Finalmente se hizo una extensión final de 5 minutos a 72°C. El producto de amplificación se usó como ADN molde en la segunda reacción de PCR luego de diluir 10 veces en agua destilada‐desionizada. En ésta reacción se utilizaron los primers JAV‐
Phl536r (5'TTRATGGAGTTCATSAC‐3’), Phl310f (5’‐CTCTGCTATCAACCMCA‐3’) y Phl31chf (5’‐
CTCTGCTATCAACCMCA‐3’) para obtener un producto más específico del gen phlD de aproximadamente 226pb (Imfeld et al, 2006). Las condiciones de amplificación fueron las mismas utilizadas en la primera PCR y el programa consistía de una desnaturalización a 95°C durante 4 minutos, 30 ciclos cada uno de: 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 52°C y 30 segundos a 74°C, el último ciclo consistía en una extensión final de 5 minutos a 74°C. 8 5.3.2 Clonación del gen phlD y análisis de las secuencias La estrategia de clonación para éste gen se encuentra descrita en el numeral 5.2.3, se usaron 2,17ng para el inserto de 226pb y 7,16ng para el inserto de 745pb. Las secuencias obtenidas fueron analizadas inicialmente con la herramienta BLASTN (Altschul et al, 1990) y BLASTX (Altschul et al, 1997) y posteriormente se construyó un árbol filogenético con el alineamiento múltiple (MUSCLE) de secuencias de aminoácidos reportadas por De La Fuente et al (2006), haciendo uso del método Neighbour‐joining y el parámetro p‐distance, aplicando un análisis de bootstrap de 1000 réplicas. Los árboles fueron realizados en el programa MEGA5 (Fischer et al, 2010). 5.4 EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DEL GEN phlD 5.4.1Elaboración de cinéticas de crecimiento Se preparó un pre‐inóculo en 10mL demedio LB a partir de una caja con las cinco cepas de Pseudomonas spp previamente crecidas, conservando relación 1/5. A partir de éste se realizó un inóculo en 100mL de medio LB, ajustando por espectrofotometría la absorbancia a 0,055 (600nm) para cada una de las cepas. Esta medición fue tomada como punto cero en la cinética de crecimiento. La cinética fue realizada por triplicado para cada una de las cepas, incubando a 29°C y 200rpm. Se midió la absorbancia en cada inóculo a intervalos de una hora, hasta que cuatro mediciones consecutivas fueron similares, lo cual indicaba el inicio de la fase estacionaria. 5.4.2 Extracción de RNA Se extrajo ARN de las cepas de Pseudomonas spp 1069, 1067, 1038, 1114 y de la cepa Pseudomonas fluorescens Pf‐5 (ATCC BAA 477), siguiendo el protocolo recomendado para el reactivo Trizol® (Invitrogen, 15596‐018) (Anexo III). Los ARN fueron extraídos en fase estacionaria temprana, cuando los inóculos alcanzaban una absorbancia de 2,3 a 600nm y en fase estacionaria tardía cuando el inóculo había sido incubado por 24 horas y se alcanzaba una absorbancia entre 2,5 y 2,7 a 600nm. La cuantificación y calidad de los ARN extraídos fue evaluada por espectrofotometría usando el espectrofotómetro NadoDrop® ND‐100. Para verificar la integridad del ARN,1µg de cada ARN fue tratado con 2µL de sal MOPS 10X, 4µL de Formaldehído (37% v/v), 10µL de formamida y 2µL de bromuro de etidio (200mg/mL) y luego incubados a 85°C durante 10 minutos, lo cual favorece la denaturación de las estructuras secundarias. Pasado este tiempo se sembró en un gel denaturante que contenía agarosa al 2% (p/v), formaldehido 37% y sal MOPS 10X (Sambrook & Russell, 2001). Todos los reactivos fueron preparados en agua DEPC (Dietilpirocarbonato). 9 5.4.3 Extensión Reversa y evaluación de la expresión del gen phlD Con el ARN extraído de las cinco cepas de Pseudomonas spp se realizó un primer paso de hibridación del primer reverse BPR4 (2pmoles) (McSpadden, 2000) con 300ng de ARN en un volumen final de 12,5µL a 65°C durante 10 minutos. Se incluyó un control negativo de transcripción reversa que consistía en reemplazar el volumen de ARN por agua DEPC. Luego de enfriar lentamente hasta alcanzar 42°C, cada ARN hibridado y la mezcla de extensión que contenía 10U de transcriptasa reversa de virus de mieloblastosis de ave (Roche,ref. 03531287001), 10U de inhibidor de ARNasa (Roche, 03531287001), dNTPs (10µM) y buffer de extensión, se sometieron a un paso de calentamiento durante 3 minutos. Posteriormente cada ARN hibridado se completó a 20µL con la mezcla previamente descrita y se incubó una hora a 42°C. La reacción fue detenida por un paso de inactivación de la transcriptasa reversa a 70°C por 10 minutos. La evaluación de la expresión del gen phlD se llevó a cabo usando0,8µL del ADNc como molde para la amplificación con Taq polimerasa haciendo uso de los primers B2BF y BPR4 (McSpadden, 2000). Para la determinación preliminar del ciclo de inicio de amplificación se realizó PCR en condiciones limitantes de ciclos para los ADNc de fase estacionaria temprana, la reacción se llevó a cabo en un volumen final de 20µL y ésta contenía 0,2µM de cada primer, MgCl2 1,5mM, Taq buffer Promega 1X, dNTPs 0,2mM y0,5U Taq ADN polimerasa (Promega, ref. M8291). El programa consistía en una desnaturalización a 94°C durante 4 minutos, 27 ciclos cada uno de: un minuto a 94°C, un minuto a 56.7°C, un minuto a 72°C y una extensión final de 5 minutos a 74°C (McSpadden, 2000). Una alícuota de 5µL de cada reacción fue tomada en el ciclo 24 y sometida a una extensión final de 72°C. Finalmente se comparó con los productos obtenidos después de 27 ciclos por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1,2% (p/v). Habiendo obtenido una estimación del ciclo de inicio de amplificación, se realizó otra PCR usando como molde 2µL del ADNc para un volumen final de reacción de 50µL; se siguieron las condiciones y el programa anteriormente descritos. En este caso se tomaron alícuotas consecutivas desde el ciclo 18 al ciclo 23 para las cepas 1069 y 1067; ciclo 18 al ciclo 24 para la cepa 1114 y del ciclo 25, 26 y 27 para las cepas 1038 y Pseudomonas fluorescens Pf‐5. Estas fueron sometidas a una extensión final de 72°C y los resultados fueron observados por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1,2% (p/v). Para los ADNc de fase estacionaria tardía se realizó directamente una PCR de la cual se tomaron alícuotas consecutivas desde el ciclo 18 al ciclo 24, usando como molde 2µL del ADNc para un volumen final de reacción de 50µL; se siguieron las condiciones y el programa anteriormente descritos. Los controles negativos incluían amplificación de cada ARN con Taq polimerasa en ausencia de transcriptasa reversa para descartar posible contaminación con ADN y un control negativo para la 10 reacción de amplificación en el cual se reemplazaba el ADN/ARN por agua. Como control positivo se usaron 20ng de ADN de la cepa Pseudomonas fluorescens Pf‐5. 5.5 EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DEL 2,4‐DIACETILFLUOROGLUCINOL Y SU EFECTO ANTAGÓNICO 5.5.1 Pruebas de antagonismo frente a Fusarium oxysporum cepa 308 y Colletotrichum sp. Para evaluar el efecto antagónico se realizó la técnica de enfrentamiento dual en agar King B sobre los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum cepa 308 y Colletotrichum sp, aislados por el grupo de investigación UNIDIA de la Universidad Javeriana. Debido a que este medio de cultivo es específico para el género bacteriano Pseudomonas spp, el crecimiento óptimo de los hongos fitopatógenos en este medio fue evaluado por microscopía. Se prepararon inóculos en solución salina al 0,85% a partir de las cinco cepas de Pseudomonas spp crecidas en agar King B por 24 horas a 28°C, esta suspensión se ajustó a una absorbancia de 0,2 a 600nm de longitud de onda. A partir de estas suspensiones se sembraron de forma masiva 50µL en agar King B ocupando 2cm del borde de la caja al centro y se incubó a 29°C durante 24 horas estimando que pasado dicho tiempo se alcanzaba la fase estacionaria en la cual se producía el metabolito de interés. Pasadas estas 24 horas, se sembraron discos de 0,3cm del respectivo hongo fitopatógeno a una distancia de 3cm con respecto a la bacteria, estos hongos provenían de cajas incubadas durante 6 días a 25°C en agar King B. Los ensayos fueron realizados por cuadruplicado y se sembraron como control los hongos sin crecimiento influenciado, al mismo tiempo del montaje de la prueba. Pasados seis días de incubación fue medido el crecimiento radial tanto de los controles, como el crecimiento influenciado por las cepas bacterianas, para realizar los cálculos de los porcentajes de inhibición. 5.5.2 Cromatografía en capa delgada (TLC) Para la identificación de los compuestos antimicrobianos producidos por las cepas en estudio, 5mL del sobrenadante de cultivos de 4 días de incubación en medio King B (relación 1/5 y 100rpm) fueron acidificados con HCl 1N hasta pH 2,0. Posteriormente, se llevó a cabo la extracción de los compuestos con 10mL de acetato de etilo; las dos fases fueron combinadas y posteriormente separadas por centrifugación para recuperar la fase orgánica. Esta fue concentrada por medio de rotaevaporación y finalmente los extractos se resuspendieron en 200µL de metanol. Los extractos orgánicos (10µL) fueron separados por cromatografía en capa delgada (TLC) sobre placas Macherey‐Nagel (ref. 818133) en cloroformo‐acetona (9:1 v/v) y fueron asperjados con ácido sulfanílico diazotizado (Anexo I), para la visualización de los compuestos bajo luz UV. 11 e la actividad antimicrobiaana por bioau
utografía 5.5.3 EEvaluación de
nación de la aactividad antifúngica, espeecífica para ccada uno de los compuesttos Para la determin
previam
mente identificados, se realizó una cromatografía en capa delgada baajo las mism
mas condiciones previam
mente descrittas, pero sem
mbrando 20µLL de los extractos y sin som
meter las placcas do (Howans, 1970). Lueggo de la sep
paración de los a reveelado con áccido sulfanílicco diazotizad
compu
uestos, las placas fueron asperjadas con c una susp
pensión de co
onidios (5x10
05 conidios/m
mL) preparrada en medio FSM (Anexo
o I) (Cooper &
& Wood 1975
5) y se incubaaron en cámaaras húmedas a 25°C p
por 6 días. Los ensayos para los dos ho
ongos fitopató
ógenos estud
diados fueron
n realizados p
por triplicaado y revelado
os con yodo. 6. RESULTTADOS Y DISC
CUSIÓN 6.1 IDEENTIFICACIÓN
N MOLECULA
AR POR MEDIIO DE ADNr 1
16S En la primera reacción r
de amplificación
n de ADNr 16S 1 con los primers F311Ps y 1459rPs, específficos para Psseudomonas spp, se amplificó un fragmento de aproximadaamente 1148
8pb (Figuraa 1). Al realizaar la segunda PCR, con loss primers Com
m1 y Com2, see amplificó un fragmento de 404pb correspondie
ente a lo espeerado (Figura 2). 20
000 1 2 3 4 5 6
6 7 2000
0
1200
0
800
0
12
200 8
800 1 2 3 4 5 6 7 400
0
4
400 200
0
2
200 1
100 100
0
n de ADNr 16S obtenida con los Figura 2. Amplificación
m2. (1) Low Masss (Invitrogen), primers Com1 y Com
069,(3) 1067, (4)) 1038, (5) 1114,, (2)Pseudomonas spp10
(6)Pseudomonas fluoresscens Pf‐5 y (7)ccontrol negativo.
Figuraa 1. Amplificació
ón de ADNr 16S obtenida con loss primeers F311Ps y 145
59rPs. (1) Low M
Mass (Invitrogen)), (2)Pseudomonas spp1
1069,(3) 1067, (4
4) 1038, (5) 1114
4, (6)Pseudomonas fluorrescens Pf‐5 y(7) control negativo. d alineamieento pareado
o fueron sim
milares para las cuatro cepas en estud
dio Los resultados del d con cepas de d Pseudomo
onas fluoresccens y ademáás valores de E‐
obteniéndose 99% de identidad
s
. Sin embarggo, dado que la herramienta BLASTN hace uso de la informaciión value significativos.
depositada en unaa base de daatos primariaa (GenBank),, también see obtuvo alin
neamiento con c
porcen
ntajes de iden
ntidad e E‐vaalue óptimos con secuenccias que no han h sido iden
ntificadas hassta especiee (Tabla 1). P
Por esta razón
n, se decidió eelaborar un ccladograma para una mejo
or identificación de las afiliaciones a nivel de especie de estoss aislamientoss, así como p
para observar la relación q
que existen
n entre ellas. 12 Tabla 1. Resultados de búsqueda de homología por BLASTN para el gen ADNr 16S de las cuatro cepas de estudio Pseudomonas sp 1069 Query Coverage Descripción de la cepa Pseudomonas fluorescens NSBm.15(AN7) 100% Pseudomonas sp. SJ2FM4 100% Pseudomonas fluorescens TAUC8 100% Pseudomonas fluorescensYC0356 100% Pseudomonas sp. HME6892 100% Pseudomonas sp 1067 Query Coverage Descripción de la cepa Pseudomonas fluorescens NSBm.15(AN7) 98% Pseudomonas sp. SJ2FM4 98% Pseudomonas fluorescens TAUC8 98% Pseudomonas fluorescensYC0356 98% Pseudomonas sp. HME6892 98% Pseudomonas sp 1038 Query Coverage Descripción de la cepa Pseudomonas fluorescens NSBm.15(AN7) 100% Pseudomonas sp. SJ2FM4 100% Pseudomonas fluorescens TAUC8 100% Pseudomonas fluorescensYC0356 100% Pseudomonas sp. HME6892 100% Pseudomonas sp 1114 E value Porcentaje de identidad 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 99% 99% 99% 99% 99% E value Porcentaje de identidad 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 99% 99% 99% 99% 99% E value Porcentaje de identidad 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 99% 99% 99% 99% 99% Descripción de la cepa Query Coverage E value Porcentaje de identidad Pseudomonas fluorescens NSBm.15(AN7) Pseudomonas sp. SJ2FM4 Pseudomonas fluorescens TAUC8 Pseudomonas fluorescensYC0356 Pseudomonas sp. HME6892 100% 100% 100% 100% 100% 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 99% 99% 99% 99% 99% En el árbol filogenético obtenido (Figura 3) se observan valores aceptables de bootstrap para los clusters que agrupan las mismas especies como es el caso de Pseudomonas putida (bootstrap: 92), Pseudomonas aeruginosa (bootstrap: 94) y Pseudomonas stutzeri (bootstrap: 82), sin embargo, valores poco significativos de este parámetro para algunos clados (menor a 80), permiten inferir baja confiabilidad de la agrupación obtenida. La amplificación inicial haciendo uso de primers específicos para ADNr 16S de Pseudomonas spp, junto con la amplificación del gen phlD, identificado únicamente en la especie Pseudomonas fluorescens, permitían inferir que todas las cepas pertenecían a esta especie. Tres de las cepas en 13 estudio fueron agrupadas con Pseudomonas fluorescens Pf‐5 y todas las secuencias de Pseudomonas syringae, cluster que es soportado por un valor de bootstrap óptimo de 83. Este resultado concuerda con estudios de taxonomía realizados por Palleroni (2010), quien ha establecido grupos basados en análisis de ARNr y clasifica en un mismo grupo las especies de Pseudomonas fluorescentes (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida y Pseudomonas syringae). La dificultad para clasificar la especie Pseudomonas fluorescens puede ser atribuida a que, como reportan Guttman et al (2008), es un grupo muy diverso dentro del género Pseudomonas en el que incluso actualmente están incluidas otras especies. Otros estudios demuestran baja confianza en el clado construido para esta especie y análisis de disimilaridad entre dos de las P. fluorescens secuenciadas completamente (Pf‐01 y Pf5) han generado discusión sobre la posibilidad de que no deberían estar clasificadas como la misma especie (Silby et al, 2009). Dado que estas dos especies están incluidas en el análisis de este trabajo, es probable que la definición poco óptima del clado de Pseudomonas fluorescens se deba a las diferencias presentes entre las mismas. Por otro lado, aunque el ADNr 16S contiene dentro de su secuencia conservada siete regiones variables, se sabe que presentan diferentes grados de diversidad y que no hay una región variable específica, capaz de distinguir entre todas las bacterias. Independientemente de esto, es probable que no se haya obtenido una mejor aproximación de la especie a la que pertenecen las cepas en estudio debido a que las secuencias utilizadas eran de tan sólo 404pb y la secuencia completa del ADNr 16S es de 1542pb (Nath et al, 2000), por lo tanto se infiere que la secuencia utilizada puede no contener regiones esenciales para la identificación de esta especie en particular. De las cuatro cepas en estudio, tres de ellas se agrupan en un mismo clado junto con la cepa de referencia Pseudomonas fluorescens Pf‐5, descrita por su actividad biocontroladora en el suelo rizosférico (Loper& Gross, 2007). Respecto a la agrupación de la cepa Pseudomonas spp 1038 con Pseudomonas mendocina NK‐01 (bootstrap: 100), se observa que esta cepa genéticamente distanciada de las otras tres. Es probable que la secuencia analizada del ADNr 16S no sea significativa o no contenga las regiones necesarias para hacer un análisis óptimo. Aunque algunas cepas de Pseudomonas mendocina sean patógenas de humanos, algunas otras son aisladas de suelo e incluso producen sideróforos (Ams et al, 2008) y favorecen la degradación de tolueno (Fishman et al, 2004). Sin embargo es importante lograr una identificación más certera de esta cepa dada su agrupación con una especie potencialmente patógena oportunista (Argone et al, 1992). A su vez, diversas han sido las limitaciones descritas para ADNr 16S como marcador molecular, principalmente porque su análisis no discrimina lo suficiente como para alcanzar relaciones entre un género. Por esta razón, otros marcadores para Pseudomonas fluorescens han sido estudiados por Yamamoto et al (2010), estos incluyen secuencias de los genes que codifican la subunidad B de 14 la ADN girasa (gyrB) y el gen rpoD que codifica el factor σ70. Las ventajas de estos dos genes se basan principalmente en que tienen una tasa de evolución mayor que el ADNr 16S ya que las regiones variables de este último tienen pocas sustituciones de bases aparte de las sustituciones compensatorias de las hélices o estructuras secundarias que debe formar el ARN ribosomal para cumplir su función en la síntesis de proteínas. El uso de estos genes como marcadores moleculares también ha demostrado mayor correlación con el uso de otras técnicas de identificación como hibridación de ADN. Este tipo de resultados lo hace más viable para ser usado en la identificación molecular de cepas (Yamamoto et al, 2010). Finalmente, es importante tener en cuenta que para hacer identificación de ciertas especies, no sólo bastan las técnicas moleculares, en algunos casos es necesario recurrir a un análisis polifásico para hacer una identificación correcta. Para el caso específico de Pseudomonas fluorescens, los sistemas API no son lo suficientemente útiles dada la cantidad de sustratos que deberían analizarse por provenir del ambiente (Peix et al, 2009), sin embargo, Meyer et al (2008) reportan que la siderotipificación por medio de caracterización isoelectroforética de los sideróforos y el estudio de la especificidad de pioverdinas puede ser útil para la clasificación taxonómica de esta especie (Meyer et al, 2008). Pseudomonas 1067
23
64
Pseudomonas 1114
7
Pseudomonas 1069
4
Pseudomonas fluorescens Pf-5 (RefSeq ID:58639)
11
Pseudomonas syringae pv. syringae B728a (RefSeq ID:58639)
83
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A (RefSeq ID:58639)
66
Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 (RefSeq ID:58639)
Pseudomonas brassicacearum subsp. brassicacearum NFM421 (RefSeq ID:58639)
61
61
Pseudomonas fluorescens SBW25 (RefSeq ID:58639)
Pseudomonas putida F1(RefSeq ID:58639)
76
Pseudomonas putida KT2440 (RefSeq ID:58639)
92
Pseudomonas putida BIRD-1 (RefSeq ID:58639)
15
Pseudomonas putida W619 (RefSeq ID:58639)
12
48
20
Pseudomonas putida GB-1 (RefSeq ID:58639)
Pseudomonas entomophila L48 (RefSeq ID:58639)
40
Pseudomonas mendocina ymp (RefSeq ID:58639)
Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 (RefSeq ID:58639)
100
Pseudomonas aeruginosa LESB58 (RefSeq ID:58639)
94
Pseudomonas aeruginosa PA7 (RefSeq ID:58639)
18
17
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (RefSeq ID:58639)
Pseudomonas stutzeri A1501 (RefSeq ID:58639)
82
Pseudomonas stutzeri DSM 4166 (RefSeq ID:58639)
100
Pseudomonas mendocina NK-01 (RefSeq ID:58639)
Pseudomonas 1038
Pseudomonas fluorescens Pf0-1 (RefSeq ID:58639)
Figura 3. Árbol filogenético basado en el alineamiento de secuencias de 16S ADNr. Las secuencias señaladas corresponden a las cepas en estudio. Los valores de bootstrap expresado como porcentaje de 1000 réplicas son mostrados en los puntos de ramificación 15 6.2
6.2 CARACTERIZACIIÓN DEL GEN
N phlD eacción de am
mplificación del gen phlD ccon los primeers Phl2a y Ph
hl2b, se obtuvvo, En lla primera re
para laas cepas 1038
8 y 1114 una banda que ccorresponde aproximadam
mente a 745p
pb, sin embarrgo para laas cepas 1069
9, 1067 y para la cepa Psseudomonas fluorescens f
P se observó en el gel de Pf‐5 electro
oforesis un barrido b
que probablemen
p
nte correspon
ndía a produ
uctos inespeccíficos o a baaja eficiencia de amplifficación (Figura 4). Al realizar la PCR anidada, con lo
os primers phl536r, Phl310
0f y Phl31cchf se amplificcó un fragmento de 226pb
b para las cincco cepas (Figu
ura 5). 2000 1 2 3
3 4 5 6 7 2000
1200
800
00 120
00 80
400
400 200
20
00 10
00 1 2 3 4 5 6 7 100
Figuraa 4. Amplificació
ón del gen phlD o
obtenida con loss prim
mers Phl2a y phll2b. (1) Low Masss (Invitrogen), (2)Pseud
domonas spp106
69,(3) 1067, (4) 1038, (5) 1114, (6) Pseud
domonas fluoresscens Pf‐5 y (7) ccontrol negativo. Figura 5. Amplificación
n de ADNr 16S obtenida con los primeers phl536r, Phl3
310f y Phl31chf. (1) Low Mass (Invittrogen),(2) Pseudomonas spp 10
069, (3) 1067, (4) 1038,, (5) 1114, (6) Psseudomonas fluo
orescens Pf‐5 y ((7) conttrol negativo. del alineamiento pareado para la secuencia del gen
n phlD tanto de nucleótid
dos Los resultados d
bla 2 y 3). Los L
como de aminoáciidos fueron similares enttre las cuatrro cepas en estudio (Tab
porcen
ntajes de iden
ntidad obteniidos para seccuencias de n
nucleótidos fu
ueron superio
ores al 92% ccon E‐valuee significativo
os. Para secueencias de proteínas se obtuvieron alineeamientos con
n porcentaje de identid
dad superior al 95% e E‐vvalue muchoss más significcativos, lo cuaal puede atribuirse a quee la tasa dee mutación de d nucleótido
os es superio
or a la de aminoácidos. Sin embargo, se s observó que q
tanto p
para BLASTN como para B
BLASTX, las seecuencias de las cuatro ceepas en estud
dio se alinearron con seccuencias ortó
ólogas pertenecientes a lass cepas Pseud
domonas fluo
orescens Pf‐5 y Pseudomon
nas fluoresscens CHAO, cepas ampliaamente estud
diadas por laa producción de 2,4‐DAPG
G y clasificad
das dentro
o del genotipo
o A (De La Fueente et al, 2006; Loper y G
Gross, 2007).
16 Tabla 2. Resultados de búsqueda de homología por BLASTN para los genes phlD de las cuatro cepas de estudio Pseudomonas sp 1069 Query Coverage Descripción Pseudomonas protegensPGNR1 100% Pseudomonas sp. K94.41 PhlD 100% Pseudomonas fluorescens BAA‐47 100% Pseudomonas fluorescens PGNR2 100% Pseudomonas fluorescens PGNL1 100% Pseudomonas sp 1067 Query Coverage Descripción Pseudomonas protegensPGNR1 100% Pseudomonas sp. K94.41 PhlD 100% Pseudomonas fluorescens BAA‐47 100% Pseudomonas fluorescens PGNR2 100% Pseudomonas fluorescens PGNL1 100% Pseudomonas sp 1038 Query Coverage Descripción Pseudomonas fluorescens CHA0 100% Pseudomonas fluorescens PGNR1 98% Pseudomonas fluorescens Pf‐5 100% Pseudomonas fluorescens BAA‐47 100% Synthetic construct phlD gene 99% Pseudomonas sp 1114 Porcentaje de identidad 1e‐92 1e‐92 1e‐92 1e‐92 1e‐92 94% 94% 94% 94% 94% E value Porcentaje de identidad 5e‐96 5e‐96 5e‐96 5e‐96 5e‐96 95% 95% 95% 95% 95% E value Porcentaje de identidad 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 94% 94% 93% 93% 93% Descripción Query Coverage E value Porcentaje de identidad Pseudomonas fluorescens CHA0 Pseudomonas fluorescens PGNR1 Pseudomonas fluorescens Pf‐5 Pseudomonas fluorescens BAA‐47 Pseudomonas fluorescens PR3‐A52 100% 98% 100% 100% 99% 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 93% 93% 93% 92% 92% 17 E value Tabla 3. Resultados de búsqueda de homología por BLASTX para los genes phlD de las cuatro cepas de estudio Pseudomonas sp 1069
Query Porcentaje Descripción E value Coverage de identidad putative polyketide synthase
99%
3e‐36 98%
[Pseudomonas fluorescens] PhlD [Pseudomonas sp. K94.41]
99%
6e‐36 97%
2, 4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 99%
6e‐36 97%
[Pseudomonas fluorescens] PhlD [Pseudomonas sp. S8‐62]
99%
6e‐36 97%
2,4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 99%
6e‐36 97%
[Pseudomonas fluorescens] Pseudomonas sp 1067
Query Porcentaje Descripción E value Coverage de identidad putative polyketide synthase
99%
3e‐36 98%
[Pseudomonas fluorescens] PhlD [Pseudomonas sp. K94.41]
99%
6e‐36 97%
2, 4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 99%
6e‐36 97%
[Pseudomonas fluorescens] PhlD [Pseudomonas sp. S8‐62]
99%
6e‐36 97%
2,4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 99%
6e‐36 97%
[Pseudomonas fluorescens] Pseudomonas sp 1038
Query Porcentaje Descripción E value Coverage de identidad putative polyketide synthase
99%
7e‐123 97%
PhlD [Pseudomonas fluorescens Pf‐5]
99%
4e‐122 96%
putative polyketide synthase PhlD
99%
9e‐121 96%
[Pseudomonas fluorescens] 2,4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 98%
8e‐120 96%
[Pseudomonas fluorescens] 2,4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 88%
2e‐117 96%
[Pseudomonas fluorescens] Pseudomonas sp 1114
Query Porcentaje Descripción E value Coverage de identidad putative polyketide synthase
99%
4e‐122 96%
PhlD [Pseudomonas fluorescens Pf‐5]
99%
2e‐121 96%
putative polyketide synthase PhlD
99%
5e‐120 95%
[Pseudomonas fluorescens] 2,4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 98%
4e‐119 96%
[Pseudomonas fluorescens] 2,4‐diacetylphloroglucinol biosynthetic protein 88%
1e‐116 95%
[Pseudomonas fluorescens] 18 Al igual que para el gen ADNr 16S, se elaboró un cladograma con el objetivo de corroborar a que genotipo, descrito a partir del gen phlD, pertenecía cada aislamiento (Figura 6). Aunque en el árbol filogenético obtenido se observan clados con valores de bootstrap no óptimos, también se hace evidente que el clado en el cual se ubican las cepas en estudio tiene un valor boostrap de 99, parámetro que soporta la agrupación obtenida. A su vez, otros análisis filogenéticos soportan lo obtenido ya que los genotipos A, PfY y PfZ siempre se agrupan en un mismo clado (Mazzola et al, 2004; De La Fuente et al, 2006). Haber clasificado las cuatro cepas aisladas dentro de un mismo genotipo permitiría inferir que una sola población de Pseudomonas fluorescens phlD+ domina la rizósfera bajo un conjunto de condiciones medioambientales dadas. Sin embargo, esta premisa no puede tomarse como conclusión de los resultados de este estudio ya que está soportado sólo por la evaluación de cuatro especies aisladas. Como reportan Landa et al (2002), es probable que muchos genotipos colonicen la rizósfera, pero que dentro de ellos, algunos específicos predominen debido a su alto grado de competencia en la rizósfera (Raaijmakers & Weller, 2001). Hasta el momento no se ha logrado determinar cuales genotipos son los que más grado de competencia presentan. Estudios realizados por Landa et al (2002) evidencian la competencia marcada del genotipo D y P en cultivos de trigo pero es un comportamiento que depende de muchos otros factores tanto ambientales como relacionados con el tipo de especie cultivada. P. fluorescens Q2-87 (B)
P. fluorescens W4-4(L)
P. fluorescens HT5-1 (N)
P. fluorescens 7MA15 (P)
41 P. fluorescens FFL1R22 (J)
P. fluorescens CV1-1 (H)
P. fluorescens FTAD1R36
52
P. fluorescens MVW4-3 (Q)
P. fluorescens FFL1R18 (G)
P. fluorescens 7MA20 (O)
18
P. fluorescens D27B1 (M)
P. fluorescens JMP7 (F)
2627
99
P. fluorescens F113 (K)
P. fluorescens Q2-2 (E)
P. fluorescens MVP1-62 (D)
P. fluorescens P2112 (C)
P. fluorescens HR3-A13 (PfY)
99
69 P. fluorescens CHAO (A)
P. fluorescens Pf-5 (A)
80
P. fluorescens PR3-A52 (PfZ)
69
Pseudomonas fluorescens 1069
66 Pseudomonas fluorescens 1067
Pseudomonas sp 1038
Pseudomonas fluorescens 1114
Figura 6. Árbol filogenético basado en el alineamiento de secuencias parciales de proteínas producto del gen phlD de las cepas de 1069, 1067, 1038 y 1114. Las especies señaladas corresponden a las cepas en estudio. Los valores de bootstrap expresado como porcentaje de 1000 réplicas son mostrados en los puntos de ramificación 19 6.3 EV
VALUACIÓN D
DE LOS NIVELEES DE EXPRESSIÓN DEL GEN
N phlD Con
n el fin de caaracterizar el gen phlD en las cuatro cepas c
estudiaadas, se analizó la expresiión transcrripcional de este gen en
n dos fases de crecimiento. Para ello se realizaaron curvas de crecimiento de cadaa cepa con el fin de identificar el inicio de la fase esstacionaria, faase en la cual se obtiene una mayor expresión deel gen phlD (D
Delany et al, 2001). En la figura 7 se ilu
ustra la cinética de crecimiento con
nsenso para las l cuatro ceepas de Pseud
domonas fluo
orescens en estudio y de la cepa P
Pseudomonas fluorescens P
Pf‐5, dado qu
ue fue observado un comp
portamiento ssimilar entre las mismas. Cinética de crecimiento
c
conse
enso para cinco
cepas de
e Pseudomonas fluorescens
f
Unidades de absorbancia (DO600nm)
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
2
200
400
600
Tiempo (minutos
s)
800
1000
Figuraa 7. Cinética de ccrecimiento conssenso para cinco
o cepas de Pseud
domonas fluoresscens En la figura 8 se observan los ARN exxtraídos de la fase estaccionaria temp
prana y tard
día, respectivamente. Se S evidencia su integridad por la visu
ualización dee dos bandass definidas que q
corresp
ponden a loss ARN ribosom
males y la ausencia de barrido que corrrespondería a degradació
ón. Este reesultado perm
mite evidenciiar que las diiferencias de expresión ob
btenidas no sse deben a u
una mala calidad o cuan
ntificación del ARN extraído y utilizado en la retro‐transcripción. 1 2 3 4 5
1 2 3 4
4 5
A B
Figura 8
8. ARN extraídoss de fase estacionaria temprana (A) y tardia (B) de las cepas(1) P
Pseudomonas sp
pp 1069, (2) 106
67, 38, (4) 1114 y (5) Pseudomonas ffluorescens Pf‐5
5.
(3) 103
Los resultados de d la RT‐PCR limitante para todos los ADNc de la fase f
estacion
naria tempran
na, hasta eel ciclo 24, se
e observan een la Figura 9
9 y reflejan que sólo se ob
btuvo amplifiicación para las cepas 1069, 1067 yy 1114, indicaativo de mayo
or expresión de estas cepas sobre las ccepas 1038 yy P. fluoresscens Pf‐5. Se
e evidencia además a
que los l ARN no estaban e
contaaminados con ADN y por lo tanto los resultado
os sí correspo
onden a estu
udios de exp
presión. El co
ontrol de rettrotranscripciión 123 4 5 6 7 8
8 20 tambiéén fue sometiido a PCR y een todos los ccasos se evideenció ausenciia de amplificcación en gel de agarossa. Se obtuvo
o lo mismo para p
el control negativo con agua, lo
o cual valida los resultad
dos obtenidos. 1 2 3 4 5 6 7 8
3 4 5 6 2 3
7 8
‐ R
RT Figura 9. RT‐PCR
R limitante del gen phlD (estacio
onaria tempranaa). En los carriless se observa (1) 1
1Kb Ladder, (2) Pseudom
monas fluoresceens Pf‐5, (3) 1069
9, (4) 1067, (5) 1
1038, (6) 1114, ((7) control positivo con ADN y (8
8) control negatiivo con agua.En la p
parte inferior see observan los co
ontroles negativos de contaminaación de los ARN
N con ADN. Los resultados de la RT‐PC
CR semicuantitativa del gen phlD en las dos faases evaluad
das (estacionaria temp
se prana y tardíía), tomando
o alícuotas consecutivas c
en ciclos establecidos, e
observvan en la figu
ura 10. Se lo
ogró confirmaar que todass las cepas aisladas, a
inclu
uida la cepa de referen
nciaP. fluoresscens Pf‐5, expresan e
el gen phlD en
n forma bassal en la fasse estacionarria, indican
ndo que éste
e operón esttá activo en estas cepas y que el DA
APG puede ser uno de los metabolitos que co
ontribuyen all antagonismo o potenciaal biocontrolaador de las mismas. m
Para la d referenciaa P. fluoresccens Pf‐5, se hace evidente que hayy mayor exp
presión en faase cepa de estacio
onaria tardía ya que se alccanza el mism
mo umbral dee amplificació
ón en el ciclo 22 a diferencia de la fase f
estacionaria tempran
na en donde se alcanza este e
umbral en e el ciclo 25
5. Un resultado similarr se observa p
para la cepa10
038 con una diferencia dee tres ciclos. SSin embargo, no se observvan diferen
ncias significaativas entre laas dos fases p
para las cepas 1069, 1067 yy 1114. Maurhofer et al a (2004) dem
mostraron el aumento en la produccción del DAP
PG debido a la presión de los genes responsables en su síntesis, causada por c
la presencia del d
inducción de la exp
mismo
o compuesto. Esto permitee inferir que existe una m
mayor expresió
ón del operón phl conform
me se va entrando y permanecien
ndo en fase estacionaria. Sin embarggo, aunque se observa essta e la expresión del gen phlD, se considera que no son lo suficientemen
s
nte misma tendencia en marcad
das debido a que ambos puntos fuero
on tomados een fase estaccionaria. Es probable que de haber extraído el A
ARN en fase eexponencial yy no al inicio d
de la fase esttacionaria, see hubieran vissto ncias marcadaas. diferen
Porr otro lado, al comparar en
ntre las especcies estudiadaas, se evidencció que las ceepas 1069, 10
067 y 1114
4 tienen un paatrón de expresión similar y a su vez eexpresan máss el gen phlD en condicion
nes basaless que las cepaas 1038 y P. ffluorescens Pff‐5. Debido a que la especcie Pseudomo
onas fluoresceens producce muchos metabolitos differentes al DAPG, que con
ntribuyen al aantagonismo,, este resultado no perrmite inferir una u relación entre el niveel de expresió
ón y su capaacidad biocon
ntroladora, o su compo
ortamiento en
n la rizósfera. 21 25 26 27 35
18 19 20 21 22 23 24 27 I
II
III IV
18 19 20 21 22 23 24 27 I
II
III IV
18 19 20 21 22 23 24 27
I
II
III IV
18 19 20 21 22 23 24 27 I
II
III IV
18 19 20 21 22 23 24 27 I
II
P. fluorescens Pf-5
18 19 20 21 22 23 35
1069
18 19 20 21 22 23 35
1067
25 26 27 35
1038
18 19 20
21
22 23 35
III IV
1114
Figura 10. RT-PCR semicuantitativa del gen phlD en fase estacionaria temprana (izquierda) y fase estacionaria tardía (derecha) para las
cepas Pseudomonas fluorescens Pf-5, 1069, 1067, 1038 y 1114. En la parte superior de cada gel de electroforesis (1,2% p/v) se especifica
el número de ciclos de amplificación para cada muestra analizada.
En los geles de la derecha se incluyen un control negativo que indica que no hay contaminación con ADN (I), el control negativo de la
transcripción inversa (II), el control positivo con ADN (III) y el control negativo con agua (IV).
El marcador molecular usado en todos los casos fue Low Mass (Promega)
22
6.4 EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DEL 2,4‐DIACETILFLUOROGLUCINOL Y SU EFECTO ANTAGÓNICO Los porcentajes de inhibición obtenidos contra los hongos Fusarium oxysporum (A) y Colletotrichum spp (B) se comparan en la Figura 11. Estos resultados hacen evidente que no hay relación entre los valores de expresión y su poder antagónico ya que, si bien las cepas 1038 y Pf‐5 eran aquellas que menos expresaban el gen phlD, presentaron el mayor porcentaje de inhibición contra Colletotrichum sp (69,2% y 62% respectivamente). Así mismo la cepa 1038 presentó una inhibición comparable (35‐37%) a la de las cepas 1067 y 1114contraFusarium oxysporum 308 (Figura 11), siendo la cepa P. fluorescens Pf‐5 la que presentó el mayor porcentaje de inhibición contra este hongo (52,2%). Las diferencias en los porcentajes de inhibición entre las cepas pueden atribuirse a diferentes razones, dentro de ellas se encuentran las diferencias genotípicas entre estas mismas, lo cual determina la producción o no de ciertos metabolitos diferentes al DAPG. La alta capacidad biocontroladora observada para la cepa Pseudomonas fluorescens Pf‐5 (una de las cepas de esta especie cuyo genoma ha sido totalmente secuenciado) puede atribuirse a que aproximadamente el 6% de su genoma contiene información para la síntesis de todos los metabolitos secundarios estudiados para la especie P. fluorescens, que le confieren una alta actividad antagónica contra fitopatógenos (Loper y Gross, 2007). De acuerdo a lo anterior, es probable que las cepas en estudio no produzcan todos los compuestos que produce la cepa P. fluorescens Pf‐5, o no los produzcan en las mismas combinaciones y proporciones, y a esto se deban los altos porcentajes de inhibición obtenidos para la misma. Esto también podría explicar las diferencias en los porcentajes de inhibición entre las demás cepas y se confirma con los perfiles de metabolitos secundarios detectados en la cromatografía en capa delgada, ya que no hay un patrón que se comparta entre ellas (Figura 12). Igualmente existen evidencias de que ciertos metabolitos del hongo pueden llegar a modular la síntesis de compuestos antimicrobianos por parte de bacterias como P. fluorescens (Notz et al, 2002). Adicionalmente, las diferencias de antagonismo entre un hongo y otro para una misma cepa, ponen de manifiesto que el potencial biocontrolador no sólo depende del genotipo del agente de control biológico sino de la interacción dual con el hongo. A su vez, es importante resaltar que la producción de algunos metabolitos producidos por P. fluorescens, como es el caso del DAPG, se ve regulada además por la presencia de ciertos sustratos como fuentes de carbono, fosfatos y minerales (Duffy y Défago, 1999). De tal modo se infiere que, debido a la amplia diversidad de sustratos e interacciones que se encuentran en la rizósfera, los resultados de inhibición in vitro seguramente no reflejan el comportamiento a esperar in situ. Debido a que son fenómenos que responden a densidad poblacional y han sido relacionados con mecanismos de quorum sensing, podría pensarse que las poblaciones de Pseudomonas se autoregulan de cara a la producción de estos compuestos, sin embargo, no es adecuado hacer una 23 estimación de este tipo ya que son muchos los factores que deben ser evaluados (Delany et al, 2000). Inhibición del crecimiento fúngico
Porcentaje de ihibición (%)
80
60
40
20
0
A
B
Hongos fitopatógenos
Pseudomonas fluorescens 1069
Pseudomonas fluorescens 1067
Pseudomonas sp 1038
Pseudomonas fluorescens 1114
Pseudomonas fluorescens Pf-5
Figura 11. Porcentajes de inhibición de cinco cepas de Pseudomonas spp sobre los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum 308 (A) y Colletotrichum sp (B). Como fue mencionado previamente, diferentes patrones de metabolitos secundarios fueron observados en la cromatografía en capa delgada, sin embargo, se observaron algunos compuestos en común entre algunas de las cepas, los cuales son a destacar porque además presentaron inhibición en la bioautografía (Figura 13). Debido a dificultades en el revelado con ácido sulfanílico diazotizado (Fig.13A), no se pudieron observar las fluorescencias esperadas. Por otro lado, las diferencias de los valores de Rf obtenidos con los reportados, pueden atribuirse a problemas de reproducibilidad del ensayo. A pesar de esto, es probable que algunos de los compuestos esperados sí hayan sido identificados, como puede que correspondan a compuestos cuya producción no ha sido elucidada previamente para P. fluorescens, y además posean actividad biocontroladora. Cazoria et al (2006) esperaban que el antagonismo ejercido por P. fluorescens PCL 1606 fuera por alguno de los compuestos ampliamente estudiados para esta especie, sin embargo demostraron que su poder antagónico se debía a la producción de 2‐Hexyl 5‐Propyl resorcinol, un compuesto que no había sido descrito previamente. Un primer compuesto con fluorescencia azul y un Rf: 0,5 fue observado en todas las cepas, pero fue mayor su concentración en el extracto de la cepa P. fluorescens Pf‐5. Comparando con los Rf reportados, se estima que este corresponde al DAPG. Al realizar la bioautografía con 24 Colletotrichum sp, un claro halo de inhibición fue revelado en dicha zona para la cepa de referencia, sin embargo, esta inhibición no fue comparable en las demás cepas probablemente por la baja concentración en la que se encontraba este mismo metabolito. Aunque se sabe que el DAPG es producido por todas las cepas, no se observa relación entre lo obtenido en la cromatografía en capa delgada y los análisis de expresión, ya que la cepa P. fluorescens Pf‐5expresaba menos el gen phlD y en la cromatografía en capa delgada se estima que hay mayor concentración de este compuesto para dicha cepa. Debido a que la extracción de ARN se realizó hizo a partir de cultivos de 24 horas y los compuestos extraídos para la realización de la bioautografía provenía de cultivos de cuatro días de incubación, es probable que la cepa P. fluorescens Pf‐5 produzca este compuesto en una fase más tardía que las demás cepas y a esto se deba la mayor concentración del mismo en los extractos. Las cepas 1069, 1038 y 1114 presentaron un compuesto de fluorescencia naranja en común, el cual tenía un Rf: 0,32 y presentaba inhibición sobre Colletotrichum sp. Compuestos con esta propiedad y con el mismo valor de Rf han sido identificados como pioluteorinas, en cromatografías realizadas bajo las mismas condiciones (Whistler, 2000; Cazorla et al, 2006). El antagonismo de este compuesto sobre hongos fitopatógenos ha sido ampliamente reportado para la especie Pseudomonas fluorescens (Schnider‐Keel et al, 2000). P. fluorescens Pf‐5 presentó un compuesto de fluorescencia azul (Rf: 0,2) que no se observó en ninguna otra cepa y cuya inhibición fue marcada contra Colletotrichum sp. Los reportes bibliográficos no demuestran compuestos con Rf similares a lo obtenido, por lo tanto puede tratarse de compuestos antimicrobianos no descritos anteriormente. Así mismo, otros compuestos cuyo Rf fue inferior a 0,1 fueron revelados para todas las cepas y diferían en su fluorescencia. Algunos de estos presentaban fluorescencia morada que correspondería a la presencia de cumarinas y otros, fluorescencia azul, que podría tratarse de flavonoides. Sin embargo, aunque estos compuestos presentan actividad antimicrobiana, su producción está asociada a plantas y no hay reportes para P. fluorescens (Ojala et al, 2000; Cushnie & Lamb A, 2005).Esto permite inferir que la especie P. fluorescens produce diversos compuestos de naturaleza polar con actividad antifúngica, pero no han sido estudiados previamente. Por otro lado, la bioautografía para Fusarium oxysporum 308 hace evidente que la inhibición fue producto principalmente de metabolitos de naturaleza polar, sin embargo, algunas zonas de inhibición fueron reveladas a la altura esperada del DAPG, corroborando el potencial de este metabolito en el control biológico de hongos como Fusarium oxysporum. Las pruebas de antagonismo y la bioautografía revelan mayor inhibición sobre Colletotrichum sp que sobre Fusarium oxysporum 308, esto puede atribuirse a los múltiples mecanismos de defensa y tolerancia existentes en estos microorganismos, los cuales varían entre género, especies y genotipos. 25 A 1 2 3 4 5 6 2 3 4 5
B C
Rf: 0,5 (DAPG)
Rf: 0,32 (PLT)
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 Figura 12. Cromatografía en capa delgada revelada con (A) ácido sulfanílico diazotizado y observada bajo luz ultravioleta de longitud de onda (B) corta y (C) larga, sin revelar. Para todas las placas se sembraron los extractos (1) P. fluorescens Pf‐5, (2) 1069, (3) 1067, (4) 1038 y (5) 1114.Las regiones en línea punteda corresponden a posibles pioluteorinas (PLT) y los de línea recta corresponden probablemente a DAPG. El carril 6 (Figura A) corresponde al extracto del medio de cultivo. Debido a que los ensayos de antagonismo realizados presentan diferencias en el porcentaje de inhibición sobre Colletotrichum y Fusarium oxysporum 308 y al parecer cepas de P. fluorescens del mismo genotipo (A, para el caso de las cuatro cepas de este estudio) no se inhiben entre sí; evaluar un posible sinergismo en la actividad biocontroladora entre las cepas estudiadas las cuales podría ser promisorio para el desarrollo de un consorcio controlador. 26 A 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 B 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 Figgura 13. Bioauto
ografía sin revelaado (izquierda) yy revelado con yyodo (derecha) ccontra(A) Colleto
otrichum sp y (B) Fusa
arium oxysporum
m 308.Para todaas las placas se sembraron los exxtractos (1) P. flu
uorescens Pf‐5, ((2) 1069, (3) 106
67, (4) 103
38 y (5) 1114. Laas partes señalad
das correspondeen a las zonas dee inhibición geneeradas probablemente por el 2,4
4‐
diacetilfluorogllucinol y las pioluteorinas. 7
CO
ONCLUSIONEES Las cepas Psseudomonas sp 1069, 10
067 y 1114 pertenecen a la especiee Pseudomon
nas fluoresscens. Las cepas 1069, 1067, 1038 yy 1114 se classificaron denttro del genottipo A, hacien
ndo uso del ggen phlD co
omo marcado
or molecular de cepas productoras de 2
2,4‐diacetilflu
uoroglucinol. 27 El operón phl, el cual contiene el gen phlD y es responsable de la síntesis de 2,4‐DAPG, se expresó activamente en las cuatro cepas en fase estacionaria y en condiciones basales. A las 24 horas de haber iniciado la fase estacionaria, las cepas Pseudomonas fluorescens 1069, 1067 y 1114 presentaron un mayor nivel de expresión del gen phlD que las cepas 1038 y Pseudomonas fluorescens Pf‐5. Las cepas 1069, 1067, 1038 y 1114 producen otros metabolitos secundarios con actividad antifúngica diferentes al 2,4‐DAPG, lo cual explica las diferencias en las inhibiciones observadas en las pruebas de antagonismo. 8 RECOMENDACIONES Hacer una mejor identificación de la cepa 1038 para descartar que sea clasificada como Pseudomonas mendocina, potencialmente patógena oportunista Evaluar los niveles de expresión del gen phlD en fase exponencial, para evidenciar las diferencias en la producción del 2,4‐diacetilfluoroglucinol a través de las fases de crecimiento de Pseudomonas fluorescens. Complementar la identificación de las cepas haciendo uso de otros marcadores moleculares y por medio de la búsqueda de genes de virulencia de P. syringae, que permitan discriminar entre la misma y P. fluorescens. Confirmar la inhibición del 2,4‐diacetilfluoroglucinol y de otros metabolitos específicos por bioautografía, haciendo uso de los estándares de los metabolitos de interés de los metabolitos de interés y/o purificándolos mediante HPLC. Realizar ensayos in situ de la actividad biocontroladora de estas cepas con el fin de evaluar las posibles diferencias de su actividad en la rizósfera y su efecto sobre el desarrollo de la planta. Evaluar la posibilidad de un consorcio microbiano debido a que están en el mismo genotipo y producen diferentes metabolitos con actividad antimicrobiana. 28 9
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ANEXO I. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Medio Luria Bertani (LB)
Triptona
10g/L
Extracto de levadura
5g/L
NaCl
10g/L
pH 7,2
Medio S.O.C
Triptona
Extracto de levadura
NaCl
KCl
MgCl2
20g/L
5g/L
0,5g/L
250mM
2M
Medio King B
Peptona
Glicerol
MgSO4
K2HPO4
pH 7,0
20g/L
10mL/L
1,5 g/L
1,8 g/L
Agar Avena
Avena en polvo
Agar
pH 7,2
20g/L
15g/L
Todos los medios fueron esterilizados en autoclave a 115ºC durante 15 minutos; los medios sólidos
se prepararon a una concentración final de agar del 1,5% (p/v).
ÁCIDO SULFANÍLICO DIAZOTIZADO (7M)
Disolver 5g de ácido sulfanílico en 1,75g de Na2CO3 disueltos en 75mL de agua destilada y 2g de NaNO2
disueltos en 10mL de agua. Posteriormente y en agitación, se enfría la solución para que se lleve a cabo
la diazotización y se adicionan lentamente 35mL de HCl (1N).
Ajustar el pH a 7,6
MEDIO FSM
Sales macro
Nitrato de sodio anhidro
Dihidrogenofosfato de potasio
Sulfato de magnesio heptahidratado
2g/L
1g/L
0,5g/L
Sales micro
Sulfato ferroso heptahidratado
Sulfato de zinc heptahidratado
Molibdato de sodio heptahidratado
Sulfato de cobre pentahidratado
Cloruro de manganeso tetrahidratado
Sucrosa
0,02g/L
0,1g/L
0,002g/L
0,002g/L
0,002g/L
1,5%
ANEXO II. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO
Luego de incubar 5mL de cultivo bacteriano hasta saturación, transferir 1,5mL de cultivo a un tubo
eppendor y centrifuga a 10000rpm durante 3 minutos.
Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 567µL de Buffer TE (Tris-HCl [100mM pH 8,0];
EDTA [100mM pH 8,0]) por pipeteo repetido.
Adicionar 30µL de SDS (10% [p/v]) y 3µL de proteinasa K (20mg/mL).
Mezclar e incubar a 37°C por una hora
Adicionar 100µL de NaCl 5M y mezclar
Adicionar 80µL de solución CTAB/NaCl, mezclar e incubar por 10 minutos a 65°C.
Adicionar un volumen igual de cloroformo/isoamilalcohol (24:1)
Mezclar y centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.
Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, teniendo cuidado de no tocar la interfase
Realizar tratamiento con ARNasa, adicionando 5mg/mL e incubando a 37°C durante una hora
Adicionar un volumen igual de fenol/cloroformo/isoamilalcohol
Mezclar por inversión y centrifugar a 13000rpm durante 5 minutos
Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y adicionar 0,6 volúmenes de isopropanol
Mezclar suavemente hasta que el ADN precipite
Centrifugar a 13000rpm durante 5 minutos y descartar el sobrenadante
Resuspender en 700µL de etanol al 70%
Centrifugar a 10000rpm por 5 minutos, descartar el sobrenadante y dejar el tubo en posición invertida
hasta eliminar todo el etanol
Resuspender el pellet en 100µL de Buffer TE
ANEXO III. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ARN
Homogenización: Resuspender las células de un pellet bacteriano en 0,5mL de reactivo Trizol ® por
pipeteo repetido e incubar por 5 minutos a 21ºC para permitir la completa disociación de los complejos
de nucleoproteínas.
Fase de separación: Adicionar 0,1mL de cloroformo y agitar manual y vigorosamente por 15 segundos,
luego incubar por 3 minutos a 21ºC.
Centrifugar a 12000g por 15 minutos a una temperatura entre 2 y 8°C.
Precipitación de ARN: Transferir la fase acuosa (corresponde aproximadamente el 60% del volumen de
reactivo Trizol ® utilizado) a un tubo nuevo que contenga 250µL de isopropanol frío y adicionar 250µL de
solución salina que contiene (Citrato de Sodio 0.8 M y NaCl 1.2M).
Incubar por 10 minutos a 21°C y centrifugar a 12000g por 10 minutos entre 2 y 8°C.
Limpieza del ARN: Descartar el sobrenadante y adicionar 500µL de etanol 75%, mezclar la muestra
haciendo uso de un vortex y centrifugar a 7500g por 5 minutos a una temperatura entre 2 y 8°C.
Repetir el paso anterior una vez más y descartar el sobrenadante.
Secar el ARN dejando el tubo en posición invertida hasta que el etanol se evapore y resuspender en
50µL de agua DEPC.
Antes de la cuantificación, incubar a 60°C para favorecer la denaturación de estructuras secundarias.
Almacenar a -70°C.
ANEXO IV. MARCADORES DE PESO MOLECULAR
Low Mass Ladder (Invitrogen)
1Kb Ladder (Fermentas)
ANEXO V. SECUENCIAS DE ADN RIBOSOMAL 16S
Secuencia ADNr 16S cepa Pseudomonas sp 1069
AGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAA
GTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTG
GTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGAC
TGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG
ATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTAC
GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGG
Secuencia ADNr 16S cepa Pseudomonas sp 1067
AGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAA
GTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTG
GTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGAC
TGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG
ATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTAC
GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGAAGCC
Secuencia ADNr 16S cepa Pseudomonas sp 1038
CCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAA
GAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCC
CACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCA
TTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTG
AGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCA
CCCTCTGTATTACCGCGGCT
Secuencia ADNr 16S cepa Pseudomonas sp 1114
AGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAA
GTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTG
GTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGAC
TGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG
ATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTAC
GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGG
ANEXO VI. SECUENCIAS DE LOS GENES phlD
Secuencia del gen phlD cepa Pseudomonas sp 1069
CTGTGCTACCAGCCGGACGACACCAAGCTGCACGCCTTCATCTCGGCGGCACTGTTCGGCGATGCGGTTTCGGCTT
GCGTGCTGCGGGCCGACGATCAGGCCGGCGGCTTCAAGATCAAGAAGACTGAGTCGTTCTTCCTGCCCAAGAGCG
AGCACTTCATCAAGTACGACGTGAAGGACACCGGCTTCCACTTCACCCTCGACAAGGCAGTGATGAACTCCATCAA
Secuencia del gen phlD cepa Pseudomonas sp 1067
CTGTGCTACCAGCCGGACGACACCAAGCTGCACGCCTTCATCTCGGCGGCGCTGTTCGGCGATGCGGTTTCGGCTT
GCGTGCTGCGGGCCGACGATCAGGCCGGCGGTTTCAAGATCAAGAAGACCGAGTCGTTCTTCCTGCCCAAGAGCG
AGCACTTCATCAAGTACGACGTGAAGGACACCGGCTTCCACTTCACCCTCGACAAGGCGGTGATGAACTCCATCAA
Secuencia del gen phlD cepa Pseudomonas sp 1038
CCGCAGCATCGTGTATGAGCGTGAAGCCCGGCAGATGTCGTCGGCCGCCGCACGCCAGGCGATCGAGAATGCCG
GCCTGCAGATCAGCGATATCCGCATGGTGATCGTCACTTCCTGCACCGGCTTCATGATGCCGTCGCTGACCGCGCA
CCTGATCAACGACCTGGACCTGCCGACCTCCACCGTGCAGTTGCCGATTGCCCAGCTGGGCTGCGTGGCCGGTGC
CGCGGCAATCAACCGGGCCAACGATTTCGCCCAGCTCGATGCACGCAACCATGTGCTGATCGTGTCCCTGGAGTTC
TCCTCGCTGTGCTACCAGCCGGACGACACCAAGCTGCACGCCTTCATCTCGGCGGCGCTGTTCGGCGATGCGGTTT
CGGCTTGCGTGCTGCGGGCCGACGATCAGGCCGGCGGTTTCAAGATCAAGAAGACCGAGTCGTTCTTCCTGCCCA
AGAGCGAGCACTTCATCAAGTACGACGTGAAGGACACCGGCTTCCACTTCACCCTCGACAAGGCAGTGATGAACT
CCATCAAGGACGTGGCACCGGTCATGGAGAAGCTCAACTACGACAGTTTCGAACAGAACTGCGCGCACAACGACT
TCTTCATCTTCCACACCGGCGGCCGCAAGATCCTCGACGAGCTGGTCAAGCACCTGGACCTGGCAACCAACCGCGT
CTCGCAATCGCGCAGCAGCCTGTCGGAAGCCGGCAACATCGCCAGCGTGGTGGTCTTCGACGTCCTC
Secuencia del gen phlD cepa Pseudomonas sp 1114
CCGCAGCATCGTGTATGAGCGTGAAGCCCGGCAGATGTCGTCGGCCGCCGCACGCCAGGCGATCGAGAACGCCG
CTCTGCAGATCAGCGATATCCGCATGGTGATCGTCACCTCCTGCACCGGTTTCATGATGCCGTCGCTGACCGCGCA
CCTGATCAACGACCTGGACCTGCCGACCTCCACCGTGCAGCTGCCGATTGCCCAGCTGGGCTGCGTGGCCGGTGC
CGCGGCAATCAACCGGGCCAACGATTTCGCCCAGCTCGATGCACGCAACCATGTGCTGATCGTGTCCCTGGAGTTC
TCCTCGCTGTGCTACCAGCCGGACGACACCAAGCTGCACGCCTTCATCTCGGCGGCACTGTTCGGCGATGCGGTTT
CGGCTTGCGTGCTGCGGGCCGACGATCAGGCCGGCGGCTTCAAGATCAAGAAGACTGAGTCGTTCTTCCTGCCCA
AGAGCGAGCACTTCATCAAGTACGACGTGAAGGACACCGGCTTCCACTTCACCCTCGACAAGGCAGTGATGAACT
CCATCAAGGACGTGGCGCCGGTCATGGAGAAGCTCAACTACGACAGCTTCGAACAGAACTGCGCGCACAACGACT
TCTTCATCTTCCACACCGGCGGCCGCAAGATCCTCGACGAGCTGGTCAAGCACCTGGACCTGGCAACCAACCGCGT
TTCGCAATCGCGCAGCAGCCTGTCGGAAGCCGGCAACATCGCCAGCGTGGTGGTCTTCGACGTCCTC
ANEXO VII. INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE Fusarium oxysporum308
ANEXO VII. INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE Colletotrichum sp