1. Ciencia

Aplicación de la segunda derivada del espectro para el análisis cualitativo
y cuantitativo de la vitamina "C"
Second Derivative Spectroscopy Aplication for Qualitative and Ouantitative Analysis
of Vitamin •C•
Por
A. LAGE,
J.
SIMAL y M.
J.
TocA
Departamento de Bromatología, Toxicología y Análisis Químico Aplicado
de la Facultad de Farmacia. Sección de Química Analítica Bromatológica
del C. S. I. C. (Departamento de Investigaciones Químico Farmacéuticas) .
Santiago de Compostela
SUMMARY
Determination of vitamina "C" (Ascorbic acid), in Lemon (Citrus medica var. Limon L.)
and Spinach (Spinacia olaracea L.) is done. Criterions for qualitative and quantitative
analysis were studied. The results obtained have been treated statisticaly; they are
prefectly reproducible for each sample and similarity to the found by voltametry method.
Key Words: Vitamin "C" (Ascorbic acid). Secolld Derivative Spectroscopy. Lemon.
Spinach.
RESUMEN
En este trabajo se ha determinado vitamina "C"
medica var. Limón L.) y Espinacas (Spinacea olaracea
el análisis cualitativo y cuantitativo. Los resultados
ticamente, son perfectamente reproducibles para cada
por el método voltamétrico.
(ácido ascórbico) en Limón (Citrus
L.). Se han estudiado criterios para
obtenidos fueron tratados estadísmuestra y similares a los obtenidos
Palabras clave: Vitamina "C" (ácido ascó1·bico). Espectroscopía de segunda derivada.
Limón. Espinaca.
Dada la importancia de las vitaminas para el desarrollo de los procesos vitales
de nuestro organismo, se han realizado numerosos estudios para su determinación.
En este trabajo hemos puesto a punto una nueva técnica para la valoración de
vitamina «C» en los alimentos donde se encuentra mayoritariamente: frutas y
verduras.
Existen muchos métodos para la determinación de ácido ascórbico; unos basados en la formación de un compuesto coloreado, mediante la adición de un reactivo, como en el caso de RoE (1) que utiliza la 2,4-dinitrofenilhidrazina, recogido
también por MoNTES (2); otros, emplean un oxidante como el 2,6-diclorofenolinAnal. Bromatol. XXXII-4 (1980) 353-360
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J. SIMAL
y
M. J. TOCA
dofenol, en el método de TILLMANS (3 ), empleado por la A.O.A.c. ( 4 ), CASARF.S (5)
y MoRENO MARTÍN (6); o bien la solución de iodo décimo normal, que utiliza la
FARMACOPEA ESPAÑOLA (7), VILLARD (8), U.S.P. (9).
La vitamina «C» se valora, pues, por distintas técnicas (potenciométricas, volumétricas, calorimétricas ... , etc.), pero ninguna de ellas resulta específica.
CLARK (10) y ]ASELSKI (11) utilizan un método espectrofotométrico que es el
que nosotros hemos adaptado para la aplicación de la espectroscopía de segunda
derivada, consiguiendo una gran especificidad y sensibilidad, disponiendo además de
un criterio cualitativo de fácil medición.
En el presente trabajo se ha utilizado cianuro potásico, para la eliminación de
las interferencias producidas por el cobre y otros metales; el cianuro, forma un
complejo con estos elementos, que no muestra absorción a la longitud de onda en
la que absorbe la vitamina «C» (265 nm. en medio neutro).
Las muestras en las que hemos determinado la presencia de vitamina han sido:
zumo de limón natural, como representante de los frutos cítricos y entre las verduras hemos seleccionado las espinacas frescas.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
-
Y
APARATOS
Espectrofotómetro Hitachi de doble haz visible-ultravioleta, modelo 100-60.
Accesorio para la segunda derivada Hitachi 200-0507.
Registrador Hitachi, modelo 561.
Cubetas de cuarzo de un centímetro de espesor.
Lámpara de luz ultravioleta.
Material de uso corriente en laboratorio.
REACTIVOS
Solución «standard» de vitamina «C» (20 mg. en 200 ce. de agua destilada ).
Acido oxálico al 5 % p/v.
Cianuro potásico al 2 % p/v.
Cloruro cúprico al 1% p/v.
REALIZACION
D!E
LA RECTA DE CALIBRADO
En cuatro matraces aforados de 100 ce., se añaden sucesivamente: 10 ce. de
ácido oxálico, 5 ce. de cianuro potásico, 1, 2, 3 y 4 ce., respectivamente, de la solución «standard» de vitamina <,C», 1 gota de cloruro cúprico y se enrasa con agua
destilada.
A la vez se prepara un blanco con los mismos reactivos, pero sin la solución
de vitamina «C».
Esta escala se lee en el espectrofotómetro, realizando un barrido a 240 nm./min.
desde 320 a 186 nm., registrando el espectro directo y la segunda derivada (velocidad del papel de registro 80 mm./min.).
Análisis cualitativo
La presencia de vitamina «C» se comprueba por la apanc10n de un maxrmo
de absorción a 245 nm. en medio ácido, y a 265 nm. en medio neutro, pero esta
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ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE LA VITAMINA "C"
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prueba no es definitiva, ya que aunque existan interferencias de otras sustancias
que absorben a longitudes de onda próximas, este máximo puede seguir apareciendo.
Nosotros hemos encontrado para la segunda derivada, una relación que permite
apreciar la presencia de estas interferencias, siendo un método más rápido y
cómodo que la relación de absorbancias leídas a distintas longitudes de onda.
Hemos observado que dicha relación entre la distancia del cero de la plumilla
de la segunda derivada al mínimo y del cero al máximo es de 1,99 (Cv% = 2,5),
para patrones de vitamina «C» (véase figura).
320nm.
-cero
••pectro directo
- cero
•egunda derivada
En caso de muestras cargadas con solución de vitamina, la relación disminuye
con las interferencias y aumenta, aproximándose al valor encontrado para el patrón,
al ir incrementando la carga de vitamina «C».
Análisis cuantitativo
Se calcula la recta de regres10n entre las concentraciones de vitamina «C»
y las alturas correspondientes de la segunda derivada, desde el primer máximo al
mínimo.
Es recomendable realiZar la recta de calibrado en cada ensayo.
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TABLA
J. SIMAL
y
M.
J. TOCA
l.-Recuperación (Espinacas).
Vitamina e (mg.)
Añadida
Patrón
0,400
Muestras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,400
0,400
0,400
0,400
0,400
0,400
0,400
0,400
0,400
% recuperado
Altura de 2.a dev.
(cm.)
4,0
0,400
0,380
0,390
0,400
0,400
0,380
0,380
0,390
0,380
X
S
TABLA
Encontrada
=
=
4,0
3,8
3,9
4,0
4,0
3,8
3,8
3,9
3,8
0,39
0,0093
100,0
95,0
97,5
100,0
100,0
95,0
95,0
97,5
95,0
-
ev
x=
o¿
¡O
=
97,22
2,3
2.-Recuperación (Zumo de limón).
Vitamina e (mg.)
Añadida
Patrón
Muestras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Encontrada
% recuperadc:
Altura de 2.' dev.
(cm.)
10,0
0,500
0,500
0,490
0,495
0,495
0,495
0,505
0,505
0,495
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
0,500
x=
S
10,0
9,8
100
98
99
99
99
101
101
99
100
100
9,9
9,9
9,9
10,1
10,1
9,9
10,0
10,0
0,498
= 0,0048
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X = 99,6
Cv
%
=
0,97
ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE LA VITAMINA "C"
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PREPARACION DE LA MUESTRA
Limón
El zumo rec1en exprimido se filtra a vacío, se pesan de 8,00 a 12,00 g. del
filtrado y se diluyen con agua destilada hasta 100 ce.
Espinacas
Se pesan aproximadamente 30,00 g. de hojas de espinacas frescas, se lavan
con agua y una vez escurridas se ponen a macerar con 250 ce. de ácido oxálico,
durante media hora, transcurrida la cual se filtra a vacío; el residuo se macera de
nuevo durante quince minutos con 100 ce. de ácido oxálico, se filtra y se mezcla
con el anterior.
DETERMINACION DE LA VITAMINA "C"
a) Preparación del blanco: De forma similar a la utilizada para la obtención
de la recta de calibrado, se prepara un matraz aforado de 100 ce. al que se le añaden
5 ce. de la muestra, se toma una porción alícuota y se somete a la acción de la
luz ultravioleta durante una hora. Esta porción se utiliza como blanco en la cubeta
de referencia.
b) Para la determinación de la vitamina «C» en las muestras, utilizamos un
método de adición de cantidades crecientes y conocidas de vitamina.
Se preparan cuatro matraces aforados de 100 ce. de igual modo que el blanco
y se cargan con 1, 2, 3 y 4 ce., respectivamente, de la solución «standard» de
vitamina «C».
e) Se realiza el barrido en el espectrofotómetro, en las condiciones apuntadas,
poniendo el blanco en la cubeta de referencia; en la cubeta de muestra se van
colocando los valores de la escala en orden creciente de concentración, siendo el
primero la porción del blanco que no se sometió a la acción de la luz ultravioleta.
Se realizan las mismas etapas que cuando se elaboró la recta de calibrado:
registro del espectro directo y de la segunda derivada comprobándose que el
máximo de absorción aparece a 265 nm. y que se cumple la relación encontrada
para la segunda derivada. Se calcula la recta de regresión con los valores de concentración de la carga, frente a las alturas de la segunda derivada medida desde el
primer máximo al mínimo. La pendiente encontrada es sensiblemente igual a la
obtenida al realizar la recta de calibrado. A partir del valor de la ordenada en el
origen se calcula el contenido en vitamina «C» de la muestra.
PRECISION Y RECUPERACION
a) Hemos estudiado la precisión del método tomando los valores de la altura
de la segunda derivada, obteniendo un Cv% = 2,3.
b) Para estudiar la recuperación, se prepararon diez matraces aforados de
100 ce. según la forma ya indicada y con igual carga de vitamina «C» y se leyeron
frente a un blanco sin carga de vitamina.
Los resultados obtenidos se recogen en las tablas 1 y 2.
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TABLA
y
M. J. TOCA
3. Zumo de limón.
Vitamina C (mg.)
método
r
pendiente
patrón
0,9996
0,0251
muestra
0,9987
0,0256
patrón
0,9971
0,0265
muestra
0,9994
0,0266
patrón
0,9989
0,0246
muestra
0,9998
0,0246
patrón
0,9993
0,0259
muestra
0,9984
0,0259
patrón
0,9996
0,0241
muestra
0,9984
0,0246
patrón
1,0000
0,0250
muestra
0,9992
0,0247
patrón
0,9973
0,0265
muestra
0,9994
0,0266
patrón
0,9995
0,0259
muestra
0,9995
0,0259
patrón
0,9997
0,0232
muestra
0,9990
0,0235
1
2
a
b
e
d
e
3
espectrofotométrico
voltamétrico
26,72
25,00
38,38
35,13
37,15
36,52
36,98
36,21
31,54
31,24
28,57
28,42
28,52
26,03
14,44
22,30
4
NOTA.-La muestra núm. 2 la hemos analizado en días sucesivos (a, b, e, d y e)
para comprobar la pérdida de vitamina C con el tiempo.
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ANAl.ISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO Dt: LA VlTAMINA "C"
RESULTADOS
Los resultados obtenidos al valorar el limón se recogen en la tabla 3.
En dicha tabla se puede observar la pérdida de vitamina «C» que presenta la
muestra núm. 2, al ser analizada en días sucesivos.
Como hemos indicado en la parte experimental, se realizaron rectas de calibrado
para cada muestra, encontrando pendientes sensiblemente iguales para cada caso.
Para la comprobación de los resultados hemos utilizado un método voltamétrico puesto a punto con anterioridad en nuestro trabajo de Licenciatura (12), encontrando valores ligeramente inferiores a los obtenidos por este nuevo procedimiento (véase tabla 3 ). Se aplicó un método estadístico para la comparación de resultados obtenidos por dos procedimientos distintos, encontrándose que las diferencias no son significativas, de lo que se deduce que los dos métodos conducen a resultados iguales (t experimental = O,51).
Los resultados obtenidos para las muestras de espinacas se han recogido en
la tabla 4.
TABLA
4.-Espinacas.
Vitamina C (mg.)
método
r
pendiente
patrón
0,9996
0,0241
muestra
0,996
0,0241
patrón
0,9990
0,0227
muestra
0,9971
0,0221
patrón
0,9999
0,0260
muestra
0,9994
0,0258
patrón
0,9999
0,0255
muestra
0,9997
0,0255
patrón
0,9996
0,0241
muestra
0,9996
0,0248
espectrofotométrico
voltamétrico
23,40
20,48
16,05
14,96
9,97
8,36
69,23
68,52
71,15
70,97
Las muestras 1, 2 y 3 fueron conservadas en nevera durante 4, 5 y 7 días, respectivamente, antes de valorar su contenido en vitamina «C», por eso los valores
encontrados han sido más bajos.
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También en este caso aplicamos el método estadístico para la comparación de
resultados, encontrando un valor de la t experimental de 0,06.
CONCLUSIONES
Se propone un método de análisis cualitativo para la vitamina «C», basado
en la utilización de la segunda derivada. El procedimiento consiste en determinar la relación que existe en el registro de la segunda derivada desde
el cero al mínimo (correspondiente al máximo de absorción) y desde el cero
al máximo (véase figura 1 ).
Análogamente, la segunda derivada del registro ultravioleta, se utiliza para
el análisis cuantitativo en muestras complejas, empleando como blanco la
misma solución de la muestra en la que se ha destruido la vitamina «C».
Los resultados encontrados para la precisión y exactitud del método son ampliamente satisfactorios (Cv% = 2,3 y % de recuperación de 97,2 para
las muestras de espinacas y 99,6 para el zumo de limón).
BIBLIOGRAFIA
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