1. Ciencia

Neurobiología de la olfación en insectos: Obtención de registros
eléctricos en antenas de Apis mellifera y evaluación de preparados
histológicos
.
Introducción
El sistema olfativo de los insectos cuenta con numerosos órganos de detección
ubicados en las antenas, las sensilias olfativas, los cuales pueden evaluar una gran
cantidad de volátiles. Estos compuestos químicos pueden incluso ser detectados a
muy bajas concentraciones, desencadenando respuestas fisiológicas (potenciales
generadores) que permiten que el impulso nervioso migre hacia los distintos centros
de procesamiento del SNC (los lóbulos antenales primero y luego a los centros
superiores del protocerebro, entre los que se incluyen los cuerpos pendunculados).
A través de diferentes aproximaciones y metodologías evaluaremos en este
práctico aspectos vinculados a la detección y al procesamiento de la información
olfativa en el sistema nervioso de los insectos.
Detección
Se ha demostrado que determinadas técnicas electrofisiológicas son útiles
para la identificación y esclarecimiento de conductas y funciones fisiológicas
desencadenadas por ciertos compuestos químicos con importancia biológica como
las señales intraespecíficas (feromonas), y determinadas claves que puedan resultar
atractantes o repelentes para un insecto (alleloquímicos) (Bjostad, 1998). Una de
estas técnicas es el denominado Electroantenograma (EAG), especialmente
utilizada en insectos dado que sus quimiorreceptores son fácilmente accesibles y
están mayoritariamente ubicados en las antenas. El EAG permite medir la sumatoria
de potenciales en los receptores activos de las antenas (Kaissling, 1971). Las
fluctuaciones de voltaje registradas se deben a una depolarización eléctrica de un
número importante de neuronas olfativas. Se puede considerar entonces, que las
neuronas sensoriales olfativas de la antena de un insecto, son un arreglo de fuentes
de voltaje y resistencia, que generan una actividad eléctrica capaz de ser registrada
en un dispositivo diseñado para tal fin.
Para obtener los registros eléctricos es necesario contar con un circuito
cerrado, conformado por la antena extraída del insecto, un electrodo de referencia
situado en su base y un electrodo de registro ubicado en el extremo apical de la
misma (Fig. 1). Luego a través de un amplificador se obtiene la señal de EAG; es
decir, la deflexión del voltaje entre el extremo y la base de la antena cuando la
misma es expuesta a un determinado estímulo químico.
Amplificador de
la señal de EAG
Capilar de vidrio
Electrodo de Ag/AgCl
Solución salina
Antena del insecto
Corriente
de aire
Figura 1: Esquema general del dispositivo.
Cuando un estímulo olfativo es presentado, la señal del EAG presenta un pico que
corresponde a la depolarización de numerosos receptores antenales deviniendo
luego, una fase de recuperación. Dentro de esta señal podemos observar también
una línea de base de unos pocos milivoltios que representa la respuesta de los
receptores frente al aire limpio que debe entregarse de manera continua durante
todo el registro (Fig. 2).
Figura 2: EAG obtenida luego de estimular la antena con un compuesto químico volátil.
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Procesamiento
El impulso generado por los volátiles es guiado por fibras nerviosas hasta el lóbulo
antenal y desde allí proyecciones hacia otras partes del cerebro. Los axones de las
neuronas sensoriales de las sensilias se proyectan ipsilateralmente hacia el Lóbulo
antenal del deuterocerebro, donde terminan en agregaciones de neuropilos, los
Glomérulos. El procesamiento de esta modalidad sensorial se inicia aquí y se
puede visualizar a través de patrones de actividad espacio-temporales mediante
técnicas opto-fisiológicas y que son olor-específico. Desde este centro de
procesamiento se proyectan interneuronas hacia centros de procesamiento
superiores, como aquellas que convergen en los neuropilos conocidas como Cuerpo
Pedunculado (Mushroom bodies), los cuales son centros de convergencia de
información multi-modal además de estar asociados a procesos de aprendizaje y
memoria (figura 3)
Figura 3: Cerebro de un insecto mostrando los centros de procesamiento olfativo: Lóbulos antenales y
Cuerpos pedunculados.
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OBJETIVO
I. Conocer una técnica electrofisiológica sensible que muestre la respuesta de
detección de una antena completa frente a un estimulo odorífero específico y
controlado.
Para ello se estimularán a la antena de una abeja obrera, Apis mellifera con el fin de
obtener registros eléctricos pertenecientes a los órganos olfativos en su conjunto.
Los registros obtenidos corresponderán a distintos estímulos químicos y serán
analizados cuantitativamente.
II. Observar las distintos tipos de sensilias olfativas en imágenes digitales obtenidos
en un microscopio confocal. Junto con esta observación se discutirán técnicas de
cuantificación de un tipo de sensilia olfativa, las placoideas.
III. Con el fin de conocer las partes del sistema nervioso central involucradas en el
procesamiento de información olfativas se realizará una disección de cerebro de
abejas y se identificarán las partes más conspicuas.
IV. Con el fin de realizar una aproximación cuantitativa sobre determinados
neuropilos que participan en el procesamiento de información olfativa, se analizarán
preparados histológicos de cerebro de abejas. Con ellos se realizará una
observación de los distintos neuropilos al microscopio óptico
MATERIALES Y MÉTODOS
1.1 Disección de antenas:
Cada grupo deberá disecar la antena de una abeja obrera Apis mellifera. Utilizando
una tijera de disección se seccionará la base de la antena (unos milímetros antes del
extremo del escapo). La disección se completa realizando un corte con bisturí sobre
el primer segmento del flagelo (ver Figura 4). De esta manera nos aseguraremos
que la hemolinfa presente en ambos extremos seccionados este en contacto con la
solución salina y así cerrar el circuito con el fin de realizar los registros
correspondientes a cada estimulación olfativa.
Se plantea en este Trabajo Práctico realizar también disecciones de la
sección frontal de la cabeza de la abeja Apis mellifera (entre los ojos compuestos,
sobre la base de las antenas y por debajo de los ocelos), con el objeto de dejar
expuesta una ventana que permita visualizar parte del cerebro luego de la apropiada
separación de tejido conectivo y traqueal. Fundamentalmente se debería poder
reconocer a los lóbulos antenales (Ver Sección 2-)
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Figura 4: Antena de Apis mellifera, estructuralmente consta de un flagelo con 8 segmentos, el
pedicelo y el escapo. Las flechas indican los sitios de corte para la disección de la antena de la
cabeza del individuo.
1.2 Registros:
El dispositivo con el cual obtendremos los registros consta de un par de electrodos
(Ag/AgCl) sostenidos por micromanipuladores acoplados a un preamplificador (10x),
el cual está conectado con un amplificador (100x). La diferencia de voltaje en el
osciloscopio de la computadora se puede obtener gracias a una placa analógicadigital. La señal de la antena oscila generalmente entre 0.1 y 2 mV
aproximadamente dependiendo del estímulo ofrecido y su concentración. En el
osciloscopio podremos observar la señal procesada del EAG producto de una
estimulación olfativa. Para ello utilizaremos un programa diseñado específicamente
para obtener registros de EAG, PROTEST. Cada grupo deberá abrir un archivo por
cada estimulación. Para ello se debe ir a la sección “archivo” del programa, “nueva
base de datos” y darle un nombre. Luego deberán marcar el área del monitor que
representa “play” en el recuadro de “adquisición”. Para tomar el registro deben
marcar en el recuadro “registro”, cuyo símbolo es un círculo. Cabe destacar que el
programa también regula la entrega del estímulo.
1.3 Metodología para obtención de registros:
Una vez seccionada la antena, la misma será montada entre capilares llenos con
solución salina, los cuales se adosarán a los electrodos (Ag/AgCl) de registro y de
referencia (utilizando los micromanipuladores). Una vez ubicada la antena se
comenzará con el registro del EAG, para lo cual es necesario un flujo constante de
aire limpio (25-50cm/s), que será utilizado como control o línea de base, y una
aplicación del estímulo a intervalos regulares. Los olores puros a utilizar como
estímulo serán el 1-hexanol (un compuesto volátil relativamente neutro) y 3
concentraciones (1:1, 1:10 y 1:100) a partir de fracciones puras de 1-nonanol
(alcohol alifático, de respuesta olfativa general en abejas). Un volumen de 5µl de
estos compuestos se impregnarán en papel de filtro para luego ser ubicados en la
línea de flujo de aire mencionada anteriormente. La secuencia de señales obtenidas
corresponderá a la presentación sucesiva en la antena de aire, 1-hexanol y 1nonanol. La presentación de estos estímulos será en orden aleatorio y cada
presentación durará 2s, siendo el intervalo inter-estímulo de 2min aproximadamente.
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Los registros obtenidos deberán ser expresados relativos a una respuesta de
referencia, en este caso al control (aire limpio).
1.4 Análisis de los datos:
Una vez obtenidos los registros, los mismos serán exportados al programa Excel
para ser analizados. Los resultados obtenidos reflejarán la variación de voltaje de la
antena con respecto al tiempo de estimulación. La respuesta de la antena frente a
un estimulo olfativo se verá reflejada en este registro como un “pico”. Cada registro
tendrá un “pico” de amplitud característica, por lo que compararemos esta variable
entre las diferentes estimulaciones ofrecidas.
2 - Observación de sensilias placoideas en antena de Abeja Apis
Se observarán y cuantificarán sensilias placoideas (figura 5) de antenas de abejas e
preparados realizados por autofluorescencia con microscopia confocal. Se discutirán
técnicas de cuantificación de sensilias.
Figura 5: Sensilias Placoideas (Pa)
3 - Disección de cerebro de abeja
Se realizarán disecciones de la sección frontal de la cabeza de la abeja Apis
mellifera con el objeto de dejar expuesta una ventana que permita visualizar parte
del cerebro (ver esquema Figura 6).
3.1 Metodología
Colocar una abeja previamente anestesiada en frío en un cepo. Cortar la
cutícula de la cabeza realizando una ventana entre la línea de los ocelos y una línea
por delante de las antenas (sin cortarlas). Levantar con una pinza y despegar la
cutícula. Luego de la apropiada separación de tejido conectivo y traqueal se
deberían poder reconocer a los lóbulos antenales (Fig. 6), se podrá observar parte
del cerebro, en especial los lóbulos antenales.
Si es necesario, para observar el tejido nervioso con más detalle se pude teñir
con azul de metileno, antes de ponerlo en alcohol, colocando en la cavidad de la
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cabeza del insecto unas gotas de azul de metileno. Se dejará colorear unos minutos
y se lavará con abundante sl. fisiológica para eliminar el exceso de colorante. Luego
colocar en alcohol 70% para continuar la observación. El colorante se irá lavando
lentamente con el alcohol.
3.2 Materiales
- Pinzas de punta fina
- Solución fisiológica para insectos
- Alcohol 70%
- Azul de metileno
- Lupa
- cepo
a)
b)
Figura 6: a) Cabeza con detalles del SNC en la abeja obrera Apis mellifera. b) Detalle de las distintas
partes del cerebro, ganglio subesofágico y nervios principales. Partes principales: AntL: lóbulos
antenales (deuterocerebro), OpL: lóbulos ópticos, 1Br: protocerebro, SoeGng: ganglio subesofágico.
Bibliografía
Bjostad LB (1998). Electrophysiological methods, In: Methods in Chemical Ecology,
vol.1. (ed.: J.C. Miller and K. F Haynes), pp 339-375; Kluwer Academic
Publisher.
Kaissling KE (1971). Insect olfaction, pp. 351-431. In: L. M. Beidler (ed.), Chemical
Sense, 4., Part 1, in the series Handbook of Sensory Physiology,
Springer-Verlag, Berlin.
Knudsen JT, Tollsten L, Bergstrom LG (1993). Floral scents - A checklist of volatile
compounds isolated by headspace techniques, Phytochemistry 33, 253–
280.
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