1. No category

Prospección, cribado y escalamiento de
microorganismos útiles para la agricultura.
Propuesta de CORBANA.
Ing. Alejandro Rodríguez Morales
CENTRO DE CONTROL BIOLÓGICO
CORBANA
tels. 2713-1680, 1681, 1600
e-mail: [email protected]
Importancia Socio-económica del Banano en
Costa Rica (2012).
Área de siembra: 41.426 has.
Producción: 107 millones
cajas/año (2.570 cajas/ha. TM/ha.)
de
46
Valor: us$822 millones/año (34,3%
de las exportaciones agrícolas,
7,7% del total de exportaciones y
2,2% PIB).
Empleo: 40.000 directos y 100.000
indirectos.
Principales problemas fitosanitarios del cultivo
de banano en Costa Rica.
Sigatoka negra
Nematodos
AGROQUÍMICOS
Salud y calidad del suelo
Cochinillas y escamas
CENTRO DE CONTROL BIOLÓGICO (2007-2013)
Nuestra misión
Conducir y apoyar la investigación dirigida hacia el desarrollo
de productos biológicos como alternativas al uso de
agroquímicos en el cultivo de banano.
CENTRO DE CONTROL BIOLÓGICO
¿Cómo lo hacemos?
1. Bioprospección
y colección de
microorganismos.
3.
Escalamiento
de
bioproductos
2. I & D
(Cribado)
1. BIOPROSPECCIÓN Y COLECCIÓN DE
MICROORGANISMOS
¿Dónde buscar ACB?
Huertos familiares
(subsistencia)
Fincas con reducción de plaguicidas
Reducción
Bosquesde
agroquímicos
Cobertura regional
Huertos familiares
(subsistencia)
Fincas con reducción de plaguicidas
Reducción
Bosquesde
agroquímicos
Hongos y bacterias
Entomopatógenas
Hongos
Rizosféricos y
Endofíticos
Insectos
benéficos
Bacterias
Promotoras
de Crec.
Vegetal
Quitinolíticos
H-B-A
Bacillus
Pseudomonas
Colección de microorganismos nativos de la región
bananera nacional. Setiembre, 2013.
Colección de microorganismos identificados.
Setiembre , 2013.
Métodos de conservación.
• Viabilidad
• Constitución genética
Aceite mineral (3°C)
12-24 meses.
• Pureza
Liofilización (8°C)
+ 5 años
Nitrógeno líq. (-196°C)
+ 5 años
Congelador (-80°C)
2-5 años
Papel filtro (8°C)
+ 10 años
2. INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
(CRIBADO)
2.1. BIOCONTROL DE
INSECTOS
AISLAMIENTO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS (HE) DEL SUELO
Técnica del insecto cebo - Galleria mellonella (wax worm)
PROCESO DE CRIBADO HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
PASO 1: Productividad (conidios viables/g)
PROCESO DE CRIBADO
PASO 2: patogenicidad in vitro (G. mellonella)
Virulencia
PROCESO DE CRIBADO
PASO 2: patogenicidad in vitro (G. mellonella)
Agresividad
PROCESO DE CRIBADO
PASO 3: bioensayos de patogenicidad sobre plagas del
banano
Scarabidos (Colaspis sp)
Chinche de las cavernas (Scaptocoris sp)
Picudos (Cosmopolites sordidus)
Escamas (Diaspis boiduvalii)
Cochinillas (Diaspis boisduvalii)
Defoliadores (Pyroderces rileyi)
Evaluación de hongos nativos solos o en mezcla con metabolitos secundarios,
sobre cochinillas (Pseudococcus elisae) y escamas (Diaspis boisduvali)
Evaluación de hongos nativos solos o en mezcla con metabolitos secundarios,
sobre cochinillas (Pseudococcus elisae) y escamas (Diaspis boisduvali)
COCHINILLAS
RESULTADOS
PROPÁGULOS: 96%
COR Ma-15
METABOLITOS: 68%
Pl-11
Filtrado crudo de los
metabolitos secundarios (5%).
Hoja de “millonaria”
(Epipremnum aureum)
ESCAMAS
PROP: 38%
PROP + MQ: 48%
Propágulos (5,0 X 107 con/ml)
Propágulos (5,0 X 107 con/ml)
Control del picudo negro, Cosmopolites sordidus, mediante
Beauveria bassiana (COR Bb-60).
Control del picudo negro, Cosmopolites sordidus, mediante
Beauveria bassiana (COR Bb-60).
Cubillo y Obregón, 2006.
Aplicación al hijo
Trampa pseudotallo
Trampa cuña
FEROMONA DE AGREGACIÓN
Patogenicidad de Beauveria bassiana (COR Bb-60) con inducción de
actividad quitinolítica y proteolítica sobre Cosmopolites sordidus (2012).
Agresividad
2.2 BIOCONTROL DE
NEMATODOS
MICROORGANISMOS CON EFECTO CONTRA
NEMATODOS
BACTERIAS
Bacillus spp
Burkholderia cepacia
Arthrobotrys spp
Acremonium sp
HONGOS
Aspergillus niger
Candellabrella musiformis
Dacylella brochophaga
Pseudomonas sp
Dechmeria coniospora
Fusarium oxysporum
Pasteuria penetrans
Lecanicillium lecanii
Monacrosporium lysipagum
Streptomyces spp
Myrothecium verrucaria
Paecilomyces lilacinus
Penicilium spp
Pochonia chlamydosporia
Trichoderma spp
Bacillus spp como ACB de nematodos.
ESPECIE
NEMATODO
FUENTE
B. firmus
Meloidogyne incognita y
Ditylenchus dipsaci
Mendoza, et al., 2008; Terefe., et al.,
2009
B. subtilis
R. similis
Umamaheswari, 2006
B. nematicida
Panagrellus redivivus
Huang, et al., 2005
B. thuringiensis
M. Incognita
Márquez y Fernández, 2006; SalehiJouzani, et al., 2008
B. cereus
M. incognita, M. javanica
Gotke y Swarup, 1988; Oka, et al.,
1993 (citados por Siddiqui y
Mahmood, 1999)
B. pumilus
M. incognita, Heterodera
cajani,
Gotke y Swarup, 1988 (citado por
Siddiqui y Mahmood, 1999)
B. lincheniformis
M. Incognita
Siddiqui y Husain, 1991 (citado por
Siddiqui y Mahmood, 1999).
OBTENCIÓN DE AISLAMIENTOS BACTERIALES.
Muestra frente al
hijo de sucesión.
Pasteurización
65°C (30 min.- 0°C 30 min)
Pesaje
Suspensión
Dilución
Inoculación y
aislamiento
Suelos rizosférico, extra
rizosférico y raíz
Lavado
Desinfección
Macerado
Conservación
Caracterización cultural y celular.
GRUPOS MORFOLÓGICOS AFINES
TreeCon®
•Parálisis y mortalidad
Filtrado crudo
(10%)
•Evaluaciones (24, 48, 72 horas)
Células (5,0 x 107 ufc/ml
•Incubación a 27°C.
Cultivo líquido
Bioensayos de patogenicidad.
Efecto in vitro de hongos rizosféricos y endofíticos sobre el nematodos
barrenador, Radopholus similis.
405
aislamientos
5cm diam. petri dish
Chi Cuadrado de Wald (P˂0,0001)
2.3 BIOFERTILIZATION
Bioprospección de bacterias fijadoras de nitrógeno (NFB) en plantaciones
comerciales de banano.
Suelo rizosférico y raíz
Medios sin N
Azotobacter
Azomonas
Derxia
Beijerinckia
LG - LGD
Azospirillum
Herbaspirillum
Burkholderia
201 aislamientos
NFB
JNFB
3. ESCALAMIENTO DE ACB
IMPORTANCIA DEL ESCALAMIENTO
FACTORES
BIÓTICO Y ABIÓTICOS
Selección
ACB
Escalamiento
Aplicación
Regulación
biológica
EL ESCALAMIENTO RE REQUIERE DE INVESTIGACIÓN
CONTÍNUA E INTEGRAL
Sistema de escalamiento para hongos benéficos
Cepario
Incubación
Matriz sólida
CC
Inoculación del sustrato
CC
Matriz líquida
Colonias puras
CC
CC
CC
CC
CC
Sustratos y soportes
CC
Esterilización
Almacenamiento
Suplementos nitrogenados en la producción
de Beauveria bassiana (2008)
MATRIZ LÍQUIDA
•Fert. Org.
•Sangre seca
•Urea
300% más conidios/g
Picudo
Picudo parasitado
Conidios/g
MEDIOS LÍQUIDOS CON Y SIN QUITINA PARA LA
PRODUCCIÓN DE Lecanicillium lecanii (2010)
Cuadro 15. Combinaciones de fuentes de carbono (C), nitrógeno (N) y
quitina utilizadas.
COPONENTES DEL MEDIO
TRATAMIENTO
1
Saboraud Liquid Medium + Extracto de levadura
2
Peptona Bacteriológica + Soya + Melaza
3
Melaza + Soya + Extracto de levadura
4
Proteosa Peptona + NaCl + Soya
1
Saboraud Liquid Medium + Extracto de levadura + Quitina
2
Peptona Bacteriológica + Soya + Melaza + Quitina
3
Melaza + Soya + Extracto de levadura + Quitina
4
Proteosa Peptona + NaCl + Soya + Quitina
550%
600%
50%
SLMY
P+S+M
M+S+Y
PP+NaCl+S
SLMY
P+S+M
-80%
M+S+Y
PP+NaCl+S
SELECCIÓN DEL SUSTRATO
•Propiedades nutricionales (C/N)
•Granulometría y densidad
•Intercambio gaseoso
•Cosecha y productividad
•Costo
•Estabilidad en almacenamiento
•Aplicación
Bagazo de caña como soporte para la producción
de Trichoderma sp (2009)
PROPORCIÓN ARROZ : BAGAZO (GRAMOS)
(0 : 60)
(50 : 50) (100 : 40)
(150 : 30) (200 : 20)
(250 : 10) (300 : 0)
•66,7% de reducción en arroz
•234% más conidios/g
SEGUIMIENTO EN SALAS
Germinación, colonización, esporulación.
•Trichoderma (5-6 días)
•Paecilomyces lilacinus (8-10 días)
•Metarhizium anisopliae (10-15 días)
•B. bassiana, L. lecanii (15 días o más)
CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO FINAL
DILUCIÓN SERIADA DE MUESTRA
MUESTRAS
CONCENTRACIÓN
PUREZA
VIABILIDAD
Parámetros de calidad promedio observados para los
diferentes aislamientos de hongos benéficos reproducidos
utilizando un sistema bifásico de producción (líquido-sólido).
Parámetros de calidad promedio observados para diferentes
aislamientos de bacterias y un hongo antagonista.
PÉRDIDA DE VIABILIDAD DE 4 GÉNEROS DE HONGOS BENÉFICOS EN
ALMACENAMIENTO SOBRE SUSTRATO ARROZ-GRANZA (2012).
PROPUESTA FINAL
Colección
Medios cultivo
Estabilidad
Selección 1
Bioensayos
lab-vivero
Id. BM:
Bioseguridad
Ecotoxicidad
Selección 2
Eficaciacampo
Escalamiento
Selección 3
ACB
INGREDIENTES PARA ALCANZAR EL ÉXITO
«La tierra no es del hombre, el hombre es
de la tierra ».
anónimo