1. Ciencia

REPASO DE CONOCIMIENTOS PREVIOS
ESTRUCTURA, ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN DEL
MATERIAL HEREDITARIO
9 LA QUÍMICA DEL GEN – Tema 0-1
9 EXPRESIÓN GÉNICA: FLUJO DE INFORMACIÓN GENÉTICA – Tema 0-2
9 EXPRESIÓN GÉNICA: TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN – Tema 0-3
9 ORGANIZACIÓN DEL MATERIAL HEREDITARIO EN EUCARIOTAS Tema 0-4
9 REPLICACIÓN Tema 0-5
Facultad de Medicina
Genética – 1er Curso
TEMA
0-1
LA QUÍMICA DEL GEN
9
9
9
9
El ADN como sustancia genética.
Estructura de los ácidos nucleicos.
Propiedades físico-químicas.
Propiedades espectroscópicas y térmicas.
El ADN como sustancia genética
Apartados
Griffiths, Avery, McCarty y MacLeod
Hershey y Chase
1944
1952
El ADN como sustancia genética
Griffiths, Avery, McCarty y MacLeod
El ADN podía transformar una cepa de bacteria en otra
Dos cepas de Streptococcus pneumoniae (patógena y no patógena)
• patógena, tiene una cápsula que causa la muerte del ratón
• ADN de células patógenas codifican información para transformar
células no patógenas
El ADN como sustancia genética
Hershey y Chase
ADN, no proteína, es el agente infeccioso
Bacteriófagos son un tipo de virus que infectan bacterias
• se unen a la superficie de la bacteria e inyectan su ADN a las células
• bioquímicamente, es fácil separar el fago de la bacteria
El ADN como sustancia genética
Hershey y Chase
ADN, no proteína, es el agente infeccioso
Claves para el experimento:
• azufre es exclusivo de proteínas
(sólo en cisteína/metionina)
• fósforo es exclusivo de ADN
Inicialmente:
• crecer dos lotes de fagos
• marcar el ADN con 32P
• marcar la proteína con 35S
Seguidamente:
• infectar un cultivo de bacterias
con los lotes radiactivos de fagos
y determinar si las bacterias se
han marcado con 32P ó 35S
Conclusión:
• sólo la radiactividad de 32P entró
a la bacteria. Por tanto, el ADN
fue el material transmisor
El ADN como sustancia genética
Objetivos
Griffiths, Avery, McCarty y MacLeod
1944
El ADN podía transformar una cepa de bacteria en otra.
Trabajaron con dos cepas de Streptococcus pneumoniae (patógena y no patógena). La
patógena tiene una cápsula que causa la muerte de ratones infectados. Vieron que el
ADN de células patógenas codifica información para transformar células no patógenas.
Hershey y Chase
1952
ADN, no proteína, es el agente infeccioso.
Los bacteriófagos son un tipo de virus que infectan bacterias. Se unen a la superficie
de la bacteria e inyectan su ADN a las células. Bioquímicamente es fácil separar el
fago de la bacteria.
En sus experimentos utilizaron los isótopos radiactivos 32P ó 35S que marcan ADN y
proteínas, respectivamente.
Estructura de los ácidos nucleicos
Apartados
Clases
Bases
Secuencia ADN/ARN
Nucleósidos
Doble hélice del ADN
Nucleótidos
Hélices A, B y Z
Uniones fosfodiéster
Estructura secundaria del ARN
Estructura de los ácidos nucleicos
Clases
• ADN Æ un tipo, un propósito
• ARN Æ 3 tipos, 3 propósitos
- ARN ribosomal Æ base de la estructura y
función de los ribosomas
- ARN mensajero Æ lleva el mensaje
- ARN transferente Æ lleva los aminoácidos
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
unidad monomérica
• ácidos nucleicos almacenan información
• compuestos de
• una base (la parte de información)
• un armazón para sostener la base
• un conector (para unirlo todo)
base
esqueleto
conector
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• Hay cuatro bases en el ADN.
• adenina (A) • timina (T)
• guanina (G) • citosina (C)
O
NH2
N
A
H
8
7
5
9
4
N
6
3
H
1N
2
H
N
O
N3
2
H
8
7
5
9
4
N
H
6
T
H
H
NH2
O
G
1
H3C
5
N
H
N
4
6
3
1N
2
N
H
NH2
N3
O
2
4
1
H
5
6
N
C
H
H
purina
pirimidina
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• hay cuatro bases en el ADN. Timina es reemplazada por Uracilo (U) en el ARN
• adenina (A) • timina (T)
• uracilo (U)
• guanina (G) • citosina (C)
O
NH2
N
A
H
8
7
5
9
4
N
6
3
H
1N
2
H
N
O
N3
2
H
8
7
5
9
4
N
H
6
H
U
H
H
NH2
O
G
1
5
N
H
N
4
6
3
N
purina
1N
2
H
NH2
N3
O
2
4
1
5
6
N
H
pirimidina
H
C
H
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• hay cuatro bases en el ADN
• todas tienen hidrógenos aceptores y dadores
O
NH2
N
A
H
8
7
5
9
4
N
6
3
H
1N
2
H
N
O
N3
2
H
8
7
5
9
4
N
6
T
H
H
NH2
O
G
1
H3C
5
N
H
N
4
6
3
1N
2
N
H
NH2
N3
O
2
4
1
H
5
6
N
H
C
H
H
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• hay cuatro bases
• todas tienen hidrógenos aceptores y dadores
• pares de base AT tienen dos puentes de hidrógeno, pares de base
GC tienen tres puentes de hidrógeno
O
NH2
N
A
H
8
7
5
9
4
N
6
3
H
1N
2
H
N
O
N3
2
H
8
7
5
9
4
N
H
6
H3C
T
H
H
NH2
O
G
1
5
N
H
N
4
6
3
N
1N
2
H
NH2
N3
O
2
4
1
N
H
5
6
H
C
H
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• El armazón es ribosa, un azúcar pentosa (cinco carbonos)
• ribosa es el azúcar armazón del ARN
O
5’
HOCH2
OH
1’
4’
H
H
H
H
3’
2’
OH
OH
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• El armazón es ribosa, un azúcar pentosa (cinco carbonos)
• 2’-desoxirribosa es el azúcar armazón del ADN
O
5’
HOCH2
OH
1’
4’
H
H
H
H
3’
OH
2’
H
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• la base se conecta a la posición 1’ (liberando agua)
• un conector de fosfato se añade a la posición 5’
PO4
base
O
5’
HOCH2
OH
1’
4’
H
H
H
H
3’
2’
H
OH
Estructura de los ácidos nucleicos
Bases
• La base se conecta a la posición 1’ (liberando agua)
• un conector de fosfato se añade a la posición 5’
• la estructura puede extenderse conectando el fosfato al 3’ de otro
azúcar
PO4
base
O
5’
HOCH2
OH
1’
4’
H
H
H
H
3’
OH
2’
H
Estructura de los ácidos nucleicos
Nucleósidos
• un nucleósido es la combinación química de base y azúcar
PO4
base
O
5’
HOCH2
OH
1’
4’
H
H
H
H
3’
2’
H
OH
nucleósido
Estructura de los ácidos nucleicos
Nucleótidos
• un nucleótido es la combinación química de base, azúcar y fosfato
PO4
base
O
5’
HOCH2
OH
1’
4’
H
H
H
H
3’
OH
2’
H
nucleótido
Estructura de los ácidos nucleicos
Uniones fosfodiester
• Cada fosfato se une a la posición 5’
de un azúcar y a la 3’ del siguiente:
enlace fosfodiester
Unión fosfodiéster
3’-5’
{
• el ADN es un polímero altamente
cargado, con una carga negativa en
cada fosfato
Uniones fosfodiester y estructura covalente de una cadena de ADN
Estructura de los ácidos nucleicos
Secuencia ADN/ARN
• la secuencia corresponde con la
secuencia de bases A,C,G,T/U
de la cadena
• dirección 5’ Æ 3’
• cadenas antiparalelas
Estructura de los ácidos nucleicos
Secuencia ADN/ARN
Estructura de los ácidos nucleicos
Doble hélice del ADN
• doble hélice
• enrollamiento a derechas
• esqueleto, azúcar + fosfato hacia fuera
• bases en el interior; unidas por puentes
de hidrógeno
• complementariedad de cadenas:
A = T
G ≡ C
Estructura de los ácidos nucleicos
Doble hélice del ADN
Surco
menor
Surco
principal
Estructura de los ácidos nucleicos
Doble hélice del ADN
En este gráfico se
observa ADN adsorbido
en
una
superficie
altamente cargada. Se
aprecia claramente
el surco principal.
Una medida sobre
el
plano
indica
alrededor de 3.4
nm, de modo que
el
ADN
se
encuentra en la
forma B.
Estructura de los ácidos nucleicos
Doble hélice del ADN
Características
• puentes de hidrógeno para emparejar bases
• apilamiento de los anillos aromáticos de la
bases confieren estabilidad
• los fosfatos en la cara externa están
asequibles para interaccionar con cationes
• surco principal y surco menor
• el grupo 2’-OH del azúcar en el ARN hace
que la doble cadena de ARN se una menos
fuertemente
Atributos funcionales
• los puentes de hidrógeno de las hebras hacen
más fácil el desenrollarse (separarse)
• las bases aun permanece accesibles (leíbles)
desde el borde
• Hay suficiente flexibilidad en en el armazón y
las bases para formar una doble hélice
Estructura de los ácidos nucleicos
Hélices A, B y Z
Comparación del ADN A, B y Z
• A: a derechas, corta y ancha, 2.3 A, 11 pb por vuelta
• B: a derechas, más larga, más fina, 3.32 A, 10 pb por vuelta
• Z: a izquierdas, la más larga, la más fina, 3.8 A, 12 pb por
vuelta
• H: triple hélice, estructura muy poco usual
Estructura de los ácidos nucleicos
Hélices A, B y Z
Estructura de los ácidos nucleicos
Hélices A y B
Estructura de los ácidos nucleicos
Estructura secundaria del ARN
Diferencias entre ADN y ARN
ADN
• ácido desoxirribonucleico
• no hidroxilo en 2’ del azúcar
• A, C, G, T
• timina lleva un grupo metil (CH3)
en la posición 5
• doble cadena
ARN
• ácido ribonucleico
• hidroxilo en 2’ del azúcar
• A, C, G, U
• uracilo tiene un átomo de hidrógeno
en la posición 5
• cadena simple o doble cadena
• El ARN adopta conformaciones globulares en las que se forman
regiones locales en hélice mediante puentes de hidrógeno
intramoleculares y apilamiento de bases dentro de la única cadena de
ácido nucleico
• Estas regiones se forman por complementariedad de una parte de
la cadena con otra.
• De ahí, la gran variedad de funciones del ARN en la célula
Estructura de los ácidos nucleicos
Estructura secundaria del ARN
Estructura de los ácidos nucleicos (I)
Objetivos
Bases
ADN: 4 bases, 2 purinas -adenina (A) y guanina (G)- y 2 pirimidinas -citosina (C) y
timina (T)-. ARN: la timina se sustituye por el uracilo (U).
Nucleósidos
Base + azúcar. ADN: desoxirribosa Æ desoxirribonucleósidos.
ARN: ribosa Æ ribonucleósidos
Nucleótidos
Base + azúcar + fosfato. NTPs & dNTPs: monómeros ARN & ADN
Uniones
fosfodiester
Secuencia
ADN/ARN
En polímeros de ác. nucleicos, los azúcares están unidos mediante un
fosfato entre la posición 5’ de uno y la 3’ del siguiente, formando una unión
fosfodiester 3’,5’. Los ácidos nucleicos consisten en un esqueleto
direccional azúcar-fosfato con una base unida en 1’ de cada azúcar. La
unidad de repetición es un nucleótido. Los ác. nucleicos son polímeros
altamente cargados con una carga negativa en cada fosfato.
La secuencia de ác. nucleios es la secuencia de bases A, C, G, T/U en la cadena
de ADN o ARN. La secuencia se escribe convencionalmente desde el 5’ libre al
3’ libre final de la molécula (5’-ATAGTC-3’ (ADN) o 5’-AUAGUC-3’ (ARN).
Doble hélice
del ADN
El ADN se presenta fundamentalmente como doble hélice. Dos cadenas
separadas y antiparalelas de ADN se enrollan una alrededor de la otra en
una hélice a derechas con el esqueleto azúcar-fosfato hacia fuera y las
bases, unidas por puentes de hidrógeno y apiladas una sobre otra, en el
interior. “A=T”, “G≡C”. Las dos cadenas son complementarias; una especifica
la secuencia de la otra.
Estructura de los ácidos nucleicos (y II)
Objetivos
Hélices
A, B y Z
Estructura
secundaria
del ARN
La hélice de ADN “estándar” (Watson-Crick) se conoce como la forma B, y es
la estructura predominante in vivo. Existen otras formas de hélice a derechas,
como la forma A, adoptada por secuencias de ARN in vivo; y formas a
izquierdas, denominadas hélice Z, que sólo se forma en secuencias de bases
especificas alternantes y no es importante in vivo.
La mayoría de moléculas de ARN son de simple cadena. Pueden plegarse en
una
conformación
compleja,
involucrando
regiones
locales
de
emparejamiento de bases intramoleculares y otras interacciones de puentes
de hidrógeno. Esta complejidad se refleja en la variedad de funciones del
ARN en la célula.
Propiedades físico-químicas de los
ácidos nucleicos
Apartados
Estabilidad
Viscosidad
Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos
Estabilidad
• especificidad Æ puentes de H
• estabilidad Æ interacciones hidrofóbicas y dipolo-dipolo entre las bases
apiladas
Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos
Viscosidad
El ADN celular es largo y fino
• 2 nm de diámetro
• longitud de μm, mm, cm (cromosomas eucarióticos)
• si el diámetro fuera el de un “spaghetti” Æ el
cromosoma de E. coli (4.6 millones de pb) mediría un km
de largo
• es rígido, como un “spaghetti” poco cocido
• Las soluciones de ADN son altamente viscosas
• Las moléculas largas de ADN pueden
fácilmente: mecánicamente o por sonicación
romperse
Propiedades físico-químicas de los
ácidos nucleicos
Objetivos
Estabilidad
Aunque podría parecer obvio que la doble cadena del ADN y la estructura del
ARN se estabiliza por puentes de hidrógeno, no es así. Las uniones de
hidrógeno determinan la especificidad del emparejamiento de bases, pero la
estabilidad es el resultado de interacciones hidrofóbicas y dipolo-dipolo
entre los pares de bases.
Viscosidad
El ADN es muy largo y fino, y las soluciones de ADN son muy viscosas.
Moléculas largas de ADN en solución pueden romperse mecánicamente. Este
proceso puede utilizarse para obtener ADN de una longitud media
específica.
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los
ácidos nucleicos
Apartados
Absorción UV
Cuantificación
Pureza del ADN
Desnaturalización térmica
Renaturalización
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos
Absorción UV
• Las bases aromáticas de los ác. nucleicos absorben luz UV
a λmax de 260 nm; las proteínas absorben a 280 nm
• El esqueleto azúcar-fosfato no contribuye apreciablemente
• Esta propiedad se utiliza para la detección, cuantificación
y cálculo de la pureza del ADN
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos
Cuantificación
• 1 mg/ml: ADN de doble cadena tiene A260 = 20; ARN y
ADN de cadena simple tienen A260 ≅ 25
• Estos últimos valores son aproximados porque:
- son la suma de las absorbancias de las diferentes bases
(purinas tienen mayor coeficiente de extinción que las
pirimidinas)
- el coeficiente de extinción depende del ambiente que
rodea a las bases de manera que:
A260 nucleótidos aislados > A260 ADN cadena simple o ARN
> A260 ADN doble cadena
- dependen del número de regiones de doble cadena
(estructura secundaria)
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos
Pureza del ADN
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos
Desnaturalización térmica
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos
Desnaturalización térmica
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos
Renaturalización
• La renaturalización tiene lugar enfriando la solución de
ADN
• Enfriamiento rápido sólo permite la formación de regiones
locales de doble cadena formadas por la unión de regiones
cortas complementarias
• Enfriamiento lento permite la complementariedad completa
de las cadenas de ADN, ya que da tiempo a que cada
cadena encuentre a la otra
• La renaturalización de regiones complementarias entre
cadenas de ácidos nucleicos diferentes se llama hibridación
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los ácidos nucleicos
Renaturalización
Propiedades espectroscópicas y térmicas de los
ácidos nucleicos
Objetivos
Absorción UV
Las bases aromáticas de los ác. nucleicos absorben luz a λmax de 260 nm
Cuantificación
Absorbancia a 260 nm se utiliza para determinar la concentración de los
ác. Nucleicos. 1 mg/ml y 1 cm de paso de luz: ADN de doble cadena tiene
A260 = 20; ARN y ADN de cadena simple tienen A260 ≅ 25. Estos últimos
valores dependen de la composición de bases y de la estructura
secundaria
Pureza del
ADN
La relación A260/A280 de una muestra de ADN de doble cadena puede
usarse para calcular su pureza. ADN puro Æ 1.8. Valores mayores de 1.8
sugieren contaminación de ARN, y menores, contaminación de proteínas
Desnaturalización
térmica
Renaturalización
El aumento de temperatura conlleva la desnaturalización del ADN
y ARN. El ARN se desnaturaliza gradualmente, mientras que el
ADN de doble cadena se “funde” cooperativamente para dar
cadenas simples a una temperatura determinada, Tm, la cual está
en función del contenido G+C.
El ADN renaturaliza por enfriamiento, pero sólo se formará
completamente la doble cadena nativa si se enfría lentamente para
permitir la unión de las cadenas complementarias