1. Food

IBNORCA
ANTEPROYECTO DE NORMA BOLIVIANA
APNB 38032
Azucares y derivados - Miel - Determinación de la actividad diastásica
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OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN
Esta norma establece el método de determinación de la actividad de la diastasa en miel.
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REFERENCIA
Las normas bolivianas contienen disposiciones que al ser citadas en el texto, constituyen
requisitos de la norma. Como toda norma está sujeta a revisión, se recomienda, a aquellos
que realicen acuerdos en base a ellas, que analicen la conveniencia de usar las ediciones
más recientes de las normas bolivianas citadas.
APNB 38024 Azucares y derivados - Miel - Muestreo.
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DEFINICIONES
3.1
Actividad diastásica en miel
A los efectos de esta norma, el tiempo de reacción determinado por el método descrito, en el
cual una masa definida de miel, degrada a una cantidad dada de almidón hasta un punto final
preestablecido. La actividad de la diastasa se indica como número de diastasa (ND).
3.2
Numero de diastasa
En las condiciones indicadas en este método la actividad enzimática, de 1 g de miel degradada
a 0,01 g de almidón, en un periodo de 1 h, a 40 °C ± 0,2 °C hasta llegar a un punto final
preestablecido.
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METODO BIANCHI
4.1
Principio
El sustrato de almidón tamponado se incuba con la muestra, produciéndose la hidrolisis
enzimática, que se determina por el agregado del reactivo yodo, el cual produce coloración con
el remanente de almidón no hidrolizado.
4.2
Reactivos
4.2.1 Buffer acetato pH 5,3 (1,59 M)



Acetato de sodio – 3 H2O
10,5 mL de acido acético glacial
500 mL de agua destilada c.s.p.
Disolver el acetato de sodio en 400 mL de agua, añadir el ácido acético disuelto en un poco de
agua y completar hasta 500 mL
Ajustar el pH a 5,3 con acetato de sodio o ácido acético según el caso utilizando un pH – metro.
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4.2.2


Solución de cloruro de sodio al 1% :
1 g de cloruro de sodio
100 mL de agua destilada c.s.p.
Disolver el cloruro de sodio p.a. en agua destilada hervida y completar a volumen. El tiempo de
conservación está limitado por la formación de mohos.
4 2.3


Solución de almidón:
0,050 g de cloruro de sodio
100 mL de agua destilada
Pesar el almidón soluble, en una balanza analítica, en un vaso de precipitación de 50 mL,
disolverlo en 10 mL con ayuda de agua destilada y llevar a volumen de 70 mL con agua
destilada caliente.
Someter a calentamiento y mantenerlo en ebullición por tres minutos.
Dejar enfriar espontáneamente y una vez frio, pasar a un matraz aforado de
completar a volumen con agua destilada.
Prepara una solución nueva días alternos.
4.2.4



100 mL y
Solución de yodo 0.1 N
20,0 g de yoduro de potasio
12,7 g de yodo
100 mL de agua destilada c.s.p
Se disuelve el yoduro de potasio libre de yodato p.a. en 30 + 40 mL de agua en un matraz
aforado de un litro, con tapa esmerilada.
Se pesa el yodo p.a. resublimado sobre el vidrio de reloj, empleando una balanza común y se
pasa, mediante un embudo pequeño y seco, al matraz aforado que contiene la solución
concentrada de yoduro de potasio.
Se tapa el matraz y se agita hasta que el yodo se haya disuelto.
Se deja la solución en reposo unos 20 min, para que tome la temperatura, se lleva a volumen
con agua destilada y se homogeniza.
La solución de yodo se conserva bien en frasco pequeño, en lugar frio y oscuro.
4.2.5


Solución de fluoruro de sodio:
2 g de fluoruro de sodio
100 mL de agua destilada c.s.p
Disolver el fluoruro de sodio en 30+40 mL de agua destilada y en un vaso de precipitación,
trasvasar a un matraz aforado de 100 mL y completar a volumen.
4.2.6 Solución de trabajo de yodo 0,01 N:

1 parte de solución de yodo
2

9 partes de solución de fluoruro de sodio
Mezclar ambas soluciones. Esta solución se conserva bien en un frasco pequeño y oscuro en
la heladera.
4.3







Materiales
balanza
baño maría
tubos de ensayo
gradilla para tubos de ensayo
pipetas
vaso de precipitación
instrumental de laboratorio
4.4
Preparación de la muestra
Pesar 2 g de la muestra de miel en un vaso de precipitación de 50 mL y añadir 1 mL de buffer
pH 5.3; mezclar con varilla de vidrio.
4.5
Procedimiento
Colocar en una gradilla 1 0 tubos de ensayo y agregarle a cada 1 mL de solución de cloruro de
sodio al 1%.
Agregar al primer tubo 1 mL de la muestra y mezclar por aspiración y expulsión con una pipeta.
Pasar luego 1 ml del primer tubo al segundo. Mezclar y continuar así, hasta el noveno tubo,
desechando el último mL
El tubo decimo sirve de testigo.
Colocar en cada tubo 1 mL de solución de almidón 0,050 % e incubar por 30 min a 37 °C.
Retirar, enfriar rápidamente y colocar una gota de solución de trabajo de yodo en cada tubo, y
agitar.
Observar la coloración
4.6
Cálculo y expresión de resultados
U.D. (dilución mayor que permanece incolora) x 2
4.6.1
Diluciones:
Tubo N° 1: dilución……………………………
Tubo N° 2: dilución……………………………
Tubo N° 3: dilución……………………………
Tubo N° 4: dilución……………………………
Tubo N° 5: dilución……………………………
Tubo N° 6: dilución……………………………
Tubo N° 7: dilución……………………………
Tubo N° 8: dilución……………………………
Tubo N° 9: dilución……………………………
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
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Ejemplo: si el tubo 5 es el último incoloro, se tiene 32x2 = 64 U.D.
Valor normal: no menos de 64 U.D.
4.6.2
Interpretación:
Normalmente los valores están entre 64 a 128 U.D.
Cantidades menores de 64 U.D. corresponden a una miel vieja, calentada, mal procesada o
adulterada. Existen mieles con bajo contenido natural de diastasa, por ejemplo, mieles de citrus
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METODO COLORÍMÉTRICO
5.1
Principio
Se calienta a 40 °C ± 0,2 °C, separadamente, volúmenes definidos de solucion de almidón y
solucion de muestra, en un recipiente de reacción adecuado, y se mezclan. Después se toman
del recipiente de reacción a intervalos regulares volúmenes iguales de la mezcla de reacción,
se mezcla con solucion de yodo y se la diluye adecuadamente con agua. Se miden con el
espectrofotómetro las absorbancias de las soluciones yodo-almidón. En la curva de reacción
absorbancia en función del tiempo, se lee el tiempo en el cual la mezcla de reacción alcanza la
absorbancia de 0,301.
5.2
Reactivos
5.2.1
Agua para análisis
5.2.2
Solución de cloruro de sodio de 2,9 g / 100 ml
5.2.3
Solución reguladora de pH 5,3 de acetato de sodio
Sé disuelven en agua 43,5 g de acetato de sodio trihidratado (CH3COONa · 3H2O) y se ajusta a
pH 5,3 con acido acético glacial (aproximadamente 5 ml). Se transfiere a un matraz aforado de
250 ml y se lleva a enrase con agua.
5.2.3
Solución de almidón
5.2.5
Masa seca de almidón
Se distribuye 2,5 g almidón seco al ambiente, en una capa fina en un pesafiltros de
aproximadamente 5 cm de diámetro y 3 cm de altura previamente limpio y seco. Se seca en
una estufa a 130 °C, durante 90 min. Se coloca el conjunto en un desecador durante 1h.
5.2.6
Preparación de la solución del almidón
Se pesa 2,0 g de almidón seco y se transfieren cuantitativamente a un erlenmeyer de 250 ml,
se agregan 90 ml de agua y se mezcla por agitación. Se calienta a ebullición la suspensión
obtenida. Agitando constantemente durante 3 min. Inmediatamente se enfría con rapidez bajo
una corriente de agua a temperatura ambiente, se transvasa a un matraz aforado de 100 ml y
se lleva a enrase con agua. Se mezcla por agitación.
Esta solución debe prepararse fresca en el momento de su uso. Para la preparación de la
solución de almidón sólo debe utilizarse almidón soluble que según el procedimiento descrito
en el apartado 8.5 proporcione una solución límpida, nítidamente azul a la densidad óptica
establecida.
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5.2.7
Solución de yodo (solución yodo-yodurada; solucion triyoduro de potasio)
Se disuelven 11,0 g de yodo resublimado y 22,0 g de yoduro de potasio en 30 ml a 40 ml de
agua y se llevan a 500 ml en un matraz aforado.
5.2.8
Solución de yodo diluida
Se disuelven 20,0 g de yoduro de potasio en agua, se añaden 2 ml de la solución de yodo (5.5)
y se lleva a 500 ml en un matraz aforado.
La solución de yodo diluida se preparara fresca en el momento de su uso y se protegerá de un
acceso excesivo de aire mediante el cierre inmediato del recipiente de reserva, luego de
extraerse de el las cantidades necesarias.
5.3 Equipos
El instrumental utilizado para efectuar la determinación y los recipientes para guardar los
reactivos estarán exentos de detergentes.

tamiz de acero inoxidable

recipiente de reacción (véase figura 1 del anexo A)

baño de agua con termostato, apto para mantener la temperatura a 40 °C ± 0,2 °C

cronometro

cubeta de 10 mm

espectrofotómetro o fotocolorímetro que permita efectuar mediciones a 660 nm

vaso de precipitado de 50 ml

matraz aforado de 50 ml

probetas de 50 ml con tapón

tubos de ensayo
5.4
Muestreo
La muestra se extrae según se indica en NB 38024.
5.5
Preparación de la muestra
5.5.1
Miel líquida o cristalizada sin impurezas
La muestra de laboratorio se homogeneiza suficientemente, mediante agitación por lo menos 3
min evitando la incorporación de aire.
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5.5.2
Miel líquida o cristalizada con impurezas
Luego de quitar las impurezas de mayor tamaño, se agita a temperatura ambiente hasta que
sea homogénea y se pasa por tamiz de apertura de 500 µm. Si se trata de miel cristalizada se
pasa por el mismo tamiz con ayuda de una espátula.
5.5.3 Miel en panales
En el caso de estar cerrados aun los panales, se desoperculan. Luego, con ayuda del tamiz, se
separa la miel de los panales sin calentamiento.
5.5.4
Preparación de la solucion de muestra
Se pesan 10 g de miel en un vaso de precipitado de 50 ml, limpio y seco y se disuelve sin
calentar en 20 ml de agua a la que se le agrego 5 ml de solucion reguladora de pH 5,3 de
acetato de sodio. Luego se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 50 ml que
contenga 3 ml de solución de cloruro de sodio y se lleva a volumen con agua (solución
muestra).
NOTA
Luego de la disolución de la miel en la solución reguladora de pH de acetato de sodio se agrega la solución de cloruro de sodio, ya
que la actividad diastasa en presencia de cloruro de sodio disminuye muy rápidamente en caso de valores de pH inferiores a 4,0. La
solución de muestra se conserva pocas horas sin alterarse, por lo que se recomienda prepararla inmediatamente antes de realizar la
determinación.
5.5.5
Calibración de la mezcla de reacción (ajuste al valor azul)
Se determina la cantidad de agua que deberá adicionarse para ajustar la densidad óptica de la
solución de yodo-almidón a una absorbancia de rango de 0,745 a 0,770.
Se introduce en cada una de seis probetas, respectivamente, 20 ml; 21 ml; 22 ml; 23 ml, 24 ml;
y 25 ml de agua y en cada una 5 mL de solución tipo yodo diluida. Se agrega, comenzando
desde la primera, 0,5 mL de una mezcla de 10 ml de agua y 0,5 ml de solución de almidón,
agitándolas bien y midiendo inmediatamente la absorbancia en una cubeta de 10 mm a 660 nm
empleando como blanco agua. Sucesivamente, se procede con las otras probetas de igual
modo, hasta obtener una absorbancia de A = 0,770 a 0,745. La cantidad de agua determinada
de este modo es la dilución estándar para todas las determinaciones realizadas con la solución
de almidón.
NOTA
Los intervalos entre la adición de la solucion de almidón diluida y la determinación de absorbancia serán lo más constante posible,
dada la variación de la intensidad de color con el tiempo, tanto en la calibración como en la determinación de la actividad de diastasa.
En el caso de que en la primera dilución (20 ml) se obtenga una absorbancia inferior a 0,745 o que en la última dilución (25 ml) la
absorbancia sea superior a 0,770, el almidón empleado no es apto para la determinación de la actividad diastasa mediante este
procedimiento.
5.6 Procedimiento
Se pipetean 10 ml de la solución de la muestra en el brazo principal del recipiente de reacción
(B) y 5 ml de solución de almidón en su brazo lateral (A). Se coloca el recipiente de reacción en
el baño de agua a 40 °C ± 0,2 °C, de modo que quede asegurado el calentamiento uniforme
de ambas soluciones, pero evitando el mezclado previo. Luego de 15 min, se retira el recipiente
de reacción por breve tiempo del baño de agua y se mezcla la solución de almidón que se
encuentra en el brazo lateral del recipiente de reacción con la solución de muestra, volcando el
recipiente de reacción cuatro o cinco veces y agitando vigorosamente a continuación.
Inmediatamente, se coloca el recipiente de reacción nuevamente en el baño de agua y
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poniéndose en marcha el cronometro simultáneamente con la iniciación del proceso de
mezclado (tiempo de reacción t = 0).
Luego de 5 min se extraen del recipiente de reacción 0,5 mL de mezcla de reacción a
intervalos periódicos, y se los agrega a 5 ml de solución de yodo diluida.
Se añade la cantidad de agua determinada según 8.5, se mezcla bien y se mide
inmediatamente la absorbancia de la respectiva solución en una cubeta de 10 mm a 660 nm
contra agua.
NOTA
Los intervalos de tiempo luego de la primera extracción del recipiente de reacción serán de una duración tal que se obtengan de 3 a
4 valores de medición en el rango comprendido entre A= 0,456 y A = 0,155.
Como valores informativos aproximados para los intervalos de tiempo entre las extracciones
del recipiente de reacción rigen:
A t = 5 min
Intervalo de tiempo
A > 0,658
10 min o más
0,658 > A > 0,523
de 5 min a 10 min
0,523 > A > 0,456
de 2 min a 5 min
Si fuera la absorbancia A t = 5 min inferior a, aproximadamente, 0,350 es recomendable reducir
el tiempo de ración para la primera medición.
5.6.1
Control mediante blancos
A 10 ml de la solución de la muestra obtenida según 8.4, se le agregan 5 ml de agua y se
mezcla vigorosamente.
Se pipetean 5 ml de esta mezcla en un tubo de ensayos que contiene 5 ml de solución de yodo
diluida. Luego de la adición de agua determinada de acuerdo con 8.5, se mezcla
enérgicamente, se mide la absorbancia en una cubeta de 10 mm a 660 nm contra agua. El
valor del blanco deberá deducirse de los valores de medición determinados de acuerdo con 9.
5.7
Cálculos y expresión de resultados
5.7.1
Evaluación grafica
Se registran en papel milimetrado los valores de la absorbancia de las soluciones de muestra
previa corrección por el blanco (véase 9.1), en función de los tiempos de reacción
correspondientes en minutos. Para los puntos de medición ubicados en el rango A = 0,155 a
0,456 se traza la recta de compensación, determinándose con su ayuda el momento tx para A =
0,301.
La escala para los ejes t y A se elegirá de modo tal que:


La leve curvatura de reacción en el rango A = 0,155 a 0,456 sea ampliamente compensada.
Sea posible una lectura suficientemente exacta del punto de intersección de la recta de
compensación con la línea A = 0,301.
NOTA
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En lugar de la evaluación gráfica, la recta de compensación y el momento para A = 0,301 puede determinarse mediante cálculo de
regresión (regresión lineal), en cuyo caso deben tomar en cuenta igualmente solo puntos de medición ubicados en el rango de A =
0,155 a 0 456.
5.7.2
Cálculo
La actividad de diastasa se calcula como número de diastasa (ND) de acuerdo con la formula
siguiente:
ND 
300
tx
donde:
tx
el tiempo de reacción en minutos, determinados según 10.1.
5.8
Expresión de resultados
El resultado se expresa como Numero de Diastasa (ND) sobre minutos (min) redondeado al
0,1
5.9
Informe del ensayo
El informe del ensayo debe incluir mínimamente:





6
El número o identificación de la muestra
La identificación del método: “NB 38032 Miel - Determinación de la actividad diastásica”
La fecha de entrada y la fecha del ensayo
El resultado del ensayo
Toda modificación introducida en el método
BIBLIOGRAFIA
INSTITUTO ARGENTINO DE RACIONALIZACIÓN DE MATERIALES - Norma IRAM 15939
Miel - Determinación de la actividad diastásica.
FAO – Control de calidad de la miel y la cera - Método BLANCHI
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Anexo A (Informativo)
Tolerancias generales de acuerdo con DIN 7168, Parte 1
Figura 1 - Ejemplos de recipientes de reacción para determinar la actividad de diastasa
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