El control de la transcripción tenía lugar gracias a la actuación de unas proteínas que se unían a secuencias específicas en la región reguladora de los genes que era el promotor regulador en los eucariotas y mediante esta unión de alguna manera trasladaban a la maquinaria de transcripción general o basal que se encontraba sobre el promotor, el centro promotor o núcleo promotor. En los eucariotas las secuencia pueden estar muy alejadas del centro promotor por lo que la única manera de que el efecto de las proteínas que se hayan unido a esta secuencia se traslade a la maquinaria de transcripción basal, es que haya una serie de proteínas “conectoras o comunicadoras” que se denominan co-activadores o co-represores, y mediadores. Además, hay otras proteínas que “doblan” el DNA y otras que van remodelando la cromatina para permitir que las proteínas necesarias accedan al DNA, como por ejemplo, algunas alejadas en la secuencia de nucleótidos se encuentren más cercanas en el espacio y puedan las proteínas contactar con el complejo de transcripción basal o general. ¿Cómo es el DNA al que se unen las proteínas? • Las secuencias que contribuyen a controlar la velocidad de transcripción de un gen se encuentran casi siempre en 5´ desde el núcleo o centro promotor (formado por las secuencias TATA Y NS) • Las secuencias que tienen un papel en el control de la transcripción se denominan “elementos de respuesta”, ya que permiten controlar la transcripción en respuesta a un efector determinado. • En organismos procariotas, dichas secuencias casi siempre son palindrómicas. En los eucariotas no tienen porque ser estrictamente palindrómicas, porque con la evolución parece que se pierde parte de la simetría de las secuencias, pero, lo importante, es que las posibilidades de interacciones atómicas entre el DNA y las proteínas, permanece. Las secuencias de nucleótidos concretas, que forman el promotor regulador de cada gen, median la velocidad de su transcripción regulada. Entre otras, pueden mediar: ‐Expresión del gen específica de un tejido: En algunas secuencias de nucleótidos podemos observar elementos de respuesta que están en la región reguladora de los genes, en ellos se puede mediar la expresión de un gen especifica de un tejido, es decir, no todo el genoma se expresa de igual manera en todos los tipos celulares porque sino solo habría un tipo celular, que daría lugar a las mismas proteínas los mismos genes... de manera que un gen se expresa en un tejido si y en otro no porque hay una secuencia que lo provoca. ¿Como es posible que en un tejido un elemento puede ejercer un papel, y ese mismo elemento en otro tejido no tenga ninguna función? Porque obviamente para que exista un efecto tiene que haber una secuencia y una proteína que se una a la secuencia, y esa proteína solo se va a expresar en un tejido determinado. -Expresión del gen en respuesta a choque térmico, -Expresión del gen en respuesta a la presencia de un metal ‐Expresión del gen en respuesta a una hormona ‐Expresión del gen en respuesta a un factor del suero ‐Expresión del gen en respuesta a un metabolito, etc. La región reguladora de los genes lo que tiene es un conjunto de secuencias, un conjunto de elementos, no todos los genes tienen el mismo conjunto de elementos, cada gen tiene un conjunto de elementos distinto y se regula en respuesta a efectores. Algunos de estos elementos son los que aparecen en la tabla, cuando estas secuencias aparecen sobretodo los nucleótidos que están subrayados es un elemento de respuesta, y el factor o la proteína que reconoce este elemento es un conjunto de factores que son una familia ( las proteínas de unión al DNA se agrupaban en familias cuando tenían homología de secuencia de aa) en este caso la secuencia de la izquierda es reconocida por secuencias de la familia C/EBP. Otra de las secuencias, la segunda, cuyo factor es el NF 1 (factor nuclear 1) es una de las primeras proteínas que se descubrió. La primera de todas las proteínas que se descubrió que se unía a una secuencia de DNA, la secuencia GGGCGG, es un factor que se llama Sp 1, lo descubrió R. Tjian en 1983 y describió la primera proteína en eucariotas que se unía a un elemento de respuesta en el DNA. Después tenemos otra secuencia en la cual hay nucleótidos específicos y nucleótidos que están como n minúscula ya que podría ser cualquier nucleótido, los importantes son los que aparecen en mayúsculas. Entre ellos si que se observa palindromía, por lo que en la ebra complementaria habría esta misma secuencia pero en el otro sentido. A esta secuencia se une el factor de transcripción de choque térmico, (media la respuesta al choque térmico). Para que haya respuesta a un choque térmico, tiene que haber esta secuencia y también es necesario el factor. Había una estructura proteica que eran los Dedos de Zinc que eran características del receptor de glucocorticoides, pues en esta tabla podemos observar que este receptor ademas de unirse a los glucocorticoides (receptor intracelular) es también, un factor regulador transcripcional. Podemos ver a la izquierda las secuencias a las cuales se unen los factores proteicos que están a la derecha, en esta secuencia podemos observar mayúsculas un poco más grandes (nucleótidos que son palindrómicos), además hay 3 nucleótidos que pueden ser cualquiera, pero vemos una cierta simetría, aunque la palindromía no es perfecta. Esta indicado con flechas, que estas secuencias su eje binario de simetría estaría ahí pero hay que contar también con la ebra complementaria que no esta escrita en la tabla. Esta secuencia, o elementos de respuesta a hormonas, lo llamamos con las siglas GRE (elementos de respuesta a glucocorticoides) PRE (elemento de respuesta a progesterona), MRE (elemento de respuesta a mineralocorticoides) ARE (elemento de respuesta a andrógenos) estrógenos, hormonas tiroideas TRE (tenía receptores intracelulares porque ellas encuentran al receptor intracelular se unen a el, después se localizan en el núcleo y encuentran las secuencias en los promotores reguladores de genes, se unen a ellas y después se produce la transcripción de los genes determinados que contengan estas secuencias. El receptor del Ácido Retinoico, RRE, molécula parecida a la Vit A, un poco más oxidada, y es una molécula que tiene también un efecto sobre la transcripción de genes. Por último, CREB, que es un elemento de respuesta al AMPc, porque aunque el AMPc es una molécula que se produce cuando hay una hormona que se une al receptor de membrana y de esta unión sigue un aumento en la actividad de la adenilato ciclasa y un aumento en la síntesis del AMPc y este es mediador intracelular en la respuesta a muchas hormonas. Se pensaba que esa respuesta intracelular a hormonas que iban a través del AMPc tenían efectos citosólicos y no nucleares, se ha demostrado que el AMPc puede tener un efecto a nivel nuclear y puede controlar la transcripción de genes a través del elemento CRE y de la proteína de unión a ese elemento que lo llamaríamos CREB (elemento de respuesta al AMPc y binding protein). A cada secuencia le corresponde una proteína, hay varias secuencias y todas ellas son reconocidas por varios receptores distintos. La especificidad ocurre cuando en un tejido se da la expresión de uno de esos receptores, y en otros tejidos se da la expresión de cualquier otro receptor, por ejemplo un tejido en el cual hay receptor de progesterona. Este receptor cuando se une la progesterona se va a unir a esa secuencia, si fuera el receptor de glucocorticoide, el glucocorticoide se uniría al receptor y posteriormente a la secuencia correspondiente. El efecto en el control de la transcripción de genes depende de que exista la secuencia en el gen y en segundo lugar de que haya una proteína que reconozca una de estas secuencias. IDENTIFICACIÓN EXPERIMENTAL DE ELEMENTOS DE RESPUESTA A nivel experimental, cuando nostras estamos estudiando un gen, y queremos saber como se controla ese gen, hay una serie de análisis que podemos hacer entre ellos están los siguientes: 1‐ Ensayos de huella o ¨footprinting¨: consisten en la identificación de secuencias, contenidas en promotores, que unan proteínas nucleares in vitro e in vivo. Dos reacciones, una que llevaba DNAasa y la otra que llevaba DNA con la proteína de unión y la DNAasa cortaba el DNA pero no lo podría cortar en los sitios donde hubiera DNA unido a proteínas. Así podemos saber si en una región concreta el DNA esta unido a proteínas o no. La parte del DNA que tiene un papel regulador, 5' y por tanto tiene proteínas, sabemos que esa parte tiene un papel regulador. 2‐ Comparación de la secuencia en estudio con las ya conocidas, recogidas en bases de datos. Secuenciamos la parte reguladora de un gen, marcamos esa secuencia y la analizamos, en una base de datos que analiza que elementos de respuesta tiene, dentro de los que ya conocemos, así podemos saber si ese gen es potencialmente regulable, y nos da una idea de como se puede controlar. 3‐ Ensayo de retraso en la movilidad electroforética de un oligonucleótido (radiactivamente marcado) sintético con la secuencia de nucleótidos del elemento de respuesta potencial. La secuencia de la región reguladora, con un elemento de respuesta potencial, diseñamos un oligonucleótido que tenga esa secuencia de nucleótidos del elemento que es regulador potencial y entonces lo marcamos radiactivamente, lo sometemos a electroforesis en presencia o en ausencia de proteínas nucleares, y si hay alguna proteína nuclear que específicamente reconozca y se una a ese oligonucleótido, lo que va a pasar es que la movilidad electroforética se va a desplazar. Porque no migra el oligonucleótido solo en el gen sino que migra unido a la proteína, migra como una molécula más grande. Es decir, las moléculas más pequeñas se separan más hacia el extremo exterior del gen, y las moléculas más grandes al pocillo. Ha aumentado el tamaño y da una banda de un tamaño mucho mayor que si el DNA estuviera solo. Aquí lo que observamos es el resultado de la unión de la proteína Sp1 a la secuencia correspondiente. Podemos ver las concentraciones crecientes de ese factor de izquierda a derecha, a los dos lados hay carriles delimitando este gel y vemos que las bandas son las mismas en el carril de la izquierda y la derecha. Abajo pone 0 por lo que el control es sin proteína Sp1. En los demás carriles intermedios va aumentando de izquierda a derecha la cantidad de proteína Sp 1 que se añade al DNA. Esta proteína se une a 6 regiones que hay en el DNA que estamos analizando. Lo que vemos es lo que denominábamos huella, han desaparecido determinados fragmentos, y esta desaparición va en aumento según aumentamos la cantidad de proteína Esto se produce porque no todas las secuencias tienen la misma afinidad por este elemento (Sp1). Este sería el resultado del ensayo de la huella. En un conjunto de células, (in vivo) en un cultivo, podemos saber si una determinada proteína esta unida a la parte reguladora de un gen. Para ello existe un ensayo que se llama inmunoprecipitación de la cromatina lo primero que hacemos es meter las células humanas en un cultivo, después añadimos una sustancia que en ese momento sorprende a todo lo que hay y lo que hace es unir las proteínas, provocando que no se puedan separar (eso es formo aldehído) y de alguna manera es como sacar la foto instantánea. Después el DNA se rompe con DNAasa se inmunoprecipita utilizando anticuerpos específicos contra ese factor que queremos analizar, o que queremos saber si in vivo esta unido al DNA. Posteriormente separamos la proteína del DNA, (ese DNA unido a la proteína precipitado utilizando un anticuerpo contra la proteína que queremos ver si esta unida al gel), ese fragmento de DNA ya separado de la proteína lo utilizamos para hacer una PCR. Aumentamos mucho su cantidad para después poderlo ver y analizar. La proteína frente a la cual tenemos un anticuerpo, que ha inmunoprecipitado por ese anticuerpo, si ha inmunoprecipitado conjuntamente con un DNA que luego hemos amplificado al separarlo, es que esa proteína estaba unida in vivo (en la célula viva que teníamos en el incubador) a ese DNA. Ensayos de actividad transcripcional in vitro Si queremos saber si una proteína se une no solo a un elemento de respuesta en una determinada célula, sino además que efecto tiene, y si amplifica mucho la transcripción o reduce mucho la velocidad de transcripción, para saber eso, normalmente: 1. Cogemos el gen, aislamos la secuencia reguladora de ese gen. 2. Subclonar la región reguladora del gen problema y la región codificadora de un gen testigo (reportero) en un vector o plásmido. 3. Si ese gen en la parte codificadora es una proteína, una enzima, después podemos ver actividad enzimática. Metemos en un vector la región reguladora, y la codificadora de la enzima y hacemos que el vector llegue a la célula eucariota, esto lo hacemos mediante transfección. 4. Una vez que esta dentro de la célula eucariota, cuantificamos la expresión del gen testigo o reportero en las células eucariotas, bajo distintas condiciones. Hay que esperar un tiempo para que el gen se transcriba, se traduzca en una proteína, y después rompemos las células y medimos las cantidades de enzima que hay. Cuanta más cantidad de enzima haya, más se a expresado, y más se a transcrito. Si hay muy poca actividad enzimática quiere decir que el vector que habíamos puesto no tiene un papel en la regulación del gen. Como ejemplo vemos un gen trimérico, y podemos saber si el gen cuya parte reguladora estamos estudiando se controla en respuesta a la hormona dependiente de AMPc. Tenemos que hacer llegar el vector a las células eucariotas, para que un plásmido se meta dentro de una célula eucariotica, teniendo en cuenta que la membrana es una bicaba lipidica y que el DNA es una molecula cargada negativamente. La técnica mediante la cual se consigue se denomina transfección, así el plásmido entra en la célula eucariótica, y continúa el proceso, transcribiéndose el gen que se encuentra en el plásmido, para lo cual este plásmido debería llegar al núcleo. Después sale del núcleo y se traduce en el citoplasma, traduciéndose en una proteína, que se pliega, adoptando una estructura y termina teniendo una actividad. Si medimos esta actividad, si la cuantificamos podemos relacionar la región reguladora del gen con la cantidad de proteína que se ha expresado. Entonces sabremos si la región reguladora a funcionado en respuesta al factor que hayamos puesto a la célula o no. Mapa de un vector, un plasmido que se llama pCAT-Basic y tiene el gen de resistencia a antinsulina: Sitios de restricción para clonación de promotores a estudiar, en 5´del gen CAT Un vector necesita 3 cosas para poder ser utilizado en clonación: – Gen de resistencia a antibiótico – Origen de replicación – Región de subclonación, donde hubiera sitios de rotura para cualquier enzima de restricción. En la imagen podemos observar todos ellos. Este vector, en la región que esta por delante de 5' en la secuencia codificadora de una enzima que se llama cloranfenicol acetil transferasa, delante de la región codificadora (donde hay un triplete de AUG que es de inicio de replicación) delante de esto podemos meter la región reguladora. Utilizamos esa enzima, porque si pusiéramos como gen reportero una enzima que se encontrara normalmente en las células eucariotas el resultado sería muy confuso, esta enzima es de procariotas (solamente es de bacterias), por lo que si se expresa en una célula eucariótica solamente puede proceder de la expresión de un plásmido. Esta imagen resume como hacemos posible que el DNA entre en la célula, mediante tranfección: Hacemos que el DNA precipite en cloruro de calcio, así muchas de las cargas negativas de los fosfatos del DNA se compensan con el Ca. Luego este precipitado del DNA con CaCl 2 se deposita en el medio de incubación de las células. Tenemos una placa donde están creciendo las células eucariotas, añadimos el DNA en el medio del cultivo, esperamos, la temperatura del incubador es como la de las células eucariotas. Añadimos medio fresco, lavamos el medio, retirando el DNA sobrante, esperamos un día a 37º. En ese tiempo tiene que haberse dado ya todo el proceso de traducción y transcripción del gen que estaba dentro del plásmido. Después retiramos las células de la placa, las ponemos en un tubo, lisiamos las células y hacemos el ensayo de la actividad enzimática que tuviera el gen que hemos puesto. En el caso de la cloranfenicol acetil transferasa, se puede hacer mediante cromatografía en capa fina. La única diferencia es que el cloranfenicol esta radiactivamente marcado. Y el cloranfenicol se acetila, una acetil transferasa une el acetil al cloranfenicol y tanto el cloranfenicol solo como el cloranfenicol acetilado estan radiactivamente marcados. En la cromatografía por capa fina vemos una mancha sola, y en el otro caso vemos una mancha de cloranfenicol y dos manchas que corresponden al cloranfenicol acetilado. Haciendo un escaneo de las manchas podemos cuantificar la actividad de la cloranfenicol acetil transferasa. Cuanta más cloranfenicol acetil transferasa encontremos, cuanto más producto de la reacción encontremos, más actividad de la cloranfenicol acetil transferasa habría, más cantidad de enzima habría, y más activo es el promotor que hemos puesto controlando la transcripción del gen. Si este experimento le hacemos en presencia de determinado efectores, en presencia por ejemplo de hormonas tiroideas, es decir, a las células del cultivo añadimos hormonas tiroideas y vemos la cantidad de cloranfenicol acetil transferasa y asi sucesivamente. Añadimos hormonas glucocorticoides a otra placa, que también tiene células, y vemos la cantidad de cloranfenicol acetil transferasa. Y vemos si la región reguladora del gen que estamos estudiando responde a estas hormonas, y si responde más a unas que a otras. BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS ELEMENTOS MOLECULARES y MAQUINARIAS Una vez que los RNAs de transferencia están maduros, vamos a ver como se produce la traducción. La traducción es un proceso complejo, que le lleva a cabo una maquinaria determinada que es capaz de traducir cualquier mensajero, lo primero que tiene que hacer es buscar un RNA que sea mensajera, por lo que hay que determinar cuales son las señales para que un RNA sea mensajero para que pueda ser reconocido por el ribosoma. • Consume el 80-90% de la energía de biosíntesis celular, es uno de los procesos mas caros que tiene la célula • Más de 100 moléculas implicadas (50% peso seco) no solo se utiliza en la biosíntesis de proteínas sino tambien en sintetizar toda la maquinaria proteica. • Paul Zamecnik (1950) diseñó los experimentos que le permitieron afirmar que las proteínas se sintetizan en partículas riboproteicas, que, posteriormente, se denominaron ribosomas. • Mas adelante, Zamecnik y Hoagland demostraron, que los aminoácidos han de estar activados como aminoacil-tRNA (unidos). Esta unión es muy especifica y tenia que ser llevada a cabo de manera catalizada. • Se descubrieron Aminoacil-tRNA-sintetasas: enzimas específicas que reconocen y unen específicamente tRNAs y aminoácidos. • El conocimiento de la composición molecular de los ribosomas ha merecido el premio Nobel de Química 2009 (59 años después de la descripción de su existencia). www.nobelprize.org Es muy importante las estructuras y las características de los ribosomas, ya que gracias a ellos, hemos podido diseñar nuevos antibióticos que se opongan a la vida de las bacterias y que no ataquen a la síntesis de proteínas de las células eucariotas. El ribosoma traduce el código de DNA en vida El premio Nobel de Química de 2009 reconoce los estudios de uno de los procesos centrales para la vida: la traducción de la información del DNA en vida por los ribosomas. Los ribosomas producen proteínas, las cuales, a su vez, controlan la química en todos los organismos vivos. Como los ribosomas son cruciales para la vida, son también una diana principal para nuevos antibióticos. El premio Nobel de 2009 galardona a Ventraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz y Ada E. Yonath por haber mostrado cómo aparecen los ribosomas y cómo funcionan a nivel atómico. Los tres han utilizado un método llamado cristalografía de rayos X para mapear la posición de todos y cada uno de los cientos de miles de átomos que forman el ribosoma. Entidades moleculares: El ribosoma no tiene forma de hamburgesa, hay una parte más grande y una más pequeña y tienen un peso molecular muy alto. Cada una de las dos partes esta compuesta de RNA y proteínas, una cantidad de polipéptidos que aumenta mucho desde los procariotas en la evolución hasta los eucariotas. El peso molecular casi se duplica en eucariotas, es una maquinaria ribonucleoproteica muy precisa y muy bien estructurada de manera que todos los polipéptidos y todos los RNA tienen una forma espacial y están todos ellos integrados unos con otros para dar lugar a la maquinaria activa. 1. Formación de ribosomas RIBOSOMAS: Formados por dos subunidades, y ambas por polipéptidos y rRNAs Las dos subunidades se forman en el núcleo, y se ensamblan en el citoplasma, al encontrar otros componentes. Los ribosomas reconocen y traducen cualquier mRNA: no tienen selectividad. Criomicroscopía electrónica del ribosoma Este es uno de los métodos utilizados para conseguir todos los datos que tenemos del ribosoma. Alrededor de 73.000 proyecciones del ribosoma 70S de E. coli unido a formil‐metionil tRNAf(Met) iniciador se utilizaron para obtener un mapa del complejo, a 11.5 Angstrom de resolución. (Con ME) Llegamos a la figura que tenemos arriba que se diferencia en dos partes, una un poco más azul, que queda como por arriba, y otra más tenue que queda por abajo. También la ultrasonografía de Rayos X nos ha proporcionado mucha de la información que tenemos ahora. Podemos observar en esta imagen, una estrictura del ribosoma bastante más realista, cada parte representada de un color. Cuando se juntan todas las partes tenemos la estructura completa. La estructura de cada uno de los RNAs, tanto la estructura de nucleótidos como la secuencia en el espacio, se conoce y se sabe el número de bucles. Forman estructuras secundarias por enganchamiento intracatenario antiparalelo, gracias a que se establecen bucles en la secuencia primaria. A esta estructura ribosomal de 16 S es a la que se va a unir una secuencia del RNA ribosomal es al que se va a unir una parte de la secuencia del RNAm que lo identifica como tal, y por lo que el ribosoma va a poder traducirlo. El ribosoma tiene que poder encontrar y reconocer ese mensajero. La señal de reconocimiento en los procariotas: Señal de reconocimiento para el ribosoma: En Procariotas: 5´GGAGG 3´‐N (una serie de nucleótidos) 3‐9‐AUG (Shine‐Dalgarno) esta secuencia es complementaria dirigida en sentido antiparalelo con la secuencia en 3´de rRNA 16 S. El RNA de 16 S entre otras cosas tiene el papel de reconocer identificar y unir los RNAs mensajeros que va a traducir. La señal de reconocimiento en los eucariotas: En Eucariotas: El capuchón en 5´ se identificaba como molécula a traducir por los ribosomas. Además del capuchón hay una secuencia : 5´‐G/ANAAUGG‐3´(Kozak) aumenta la eficiencia de traducción (unión a tRNAi) Si alineamos la secuencia de muchos promotores, para ver que cosas tenían en común, en la proximidad del sitio mas 1 de inicio de transcripción. Aquí podemos hacer lo mismo, alineamos la secuencia de nucleótidos en la proximidad del sitio de inicio de traducción AUG y observamos que muchos genes que se traducen tienen la secuencia Kozak, por lo que esta secuencia aumenta de alguna manera la eficiencia de la traducción, porque se a visto que se une al RNA iniciador. Un RNA que lleva metionina. No todos los mensajeros contienen secuencia Kozak. Si cogemos un gen in vitro y le ponemos la secuencia Kozak por delante del AUG estamos aumentando la eficiencia de la traducción. Es una manera de manipular y aumentar la eficiencia de la traducción in vitro. Lo que se traduce de un RNAm es la región codificadora, es decir la hilera de codones. Se traduce la región codificadora u ORF=hilera de codones no superpuestos contiguos que comienza y termina en sitios internos del mRNA: 5´AUG 3´ (UUG en algunos procariotas): codón de inicio que, además, especifica el primer aminoácido, metionina (formil‐metionina en procariotas). Esto quiere decir que todo el transcrito no es codificador, la parte que se traduce del transcrito empieza por el triplete de inicio de AUG, continua por todos los tripletes leídos uno a uno sin saltar ni repetir ninguno, en el orden en el que están colocados en el RNAm y por tanto en el gen del que procede ese RNA, y termina cuando aparecen secuencias de terminación, tripletes de terminación. Hay 3: 5´UGA 3´, 5´UAG 3´, 5´UAA 3´: codones de terminación y fin de ORF (Open Reading Frame). Estas 3 secuencias serán reconocidas por un factor de terminación. El transcrito del RNAm ya maduro tiene el ORF dentro de una secuencia más larga que continua tanto hacia 5' como hacia 3', estas secuencias no son ORF sino que son 5' UTR (regiones que no se traducen) generalmente están en los dos lados, 5' UTR o 3' UTR. Van a tener un importante papel regulador. Traducción en mitocondrias y cloroplastos Los efectos secundarios de algunos antibióticos que actúan a nivel de la traducción, se deben a que la traducción que ocurre en las mitocondrias se parece por la maquinaria y por el mecanismo a la que ocurre en los procariotas. Como hay muchos antibióticos y el efecto trata de inhibir la traducción en las bacterias, y las mitocondrias tienen un mecanismo parecido de traducción, pues también inhiben la traducción en los eucariotas, lo que da lugar a los efectos secundarios en el organismo humano de algunos antibióticos. Sintetizan las proteínas codificadas en su genoma. La maquinaria es heredada de procariotas, pero su existencia dentro del organismo eucariota ha hecho que se modifique hacia sistemas híbridos o intermedios.
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