1. Healthcare

Criterios para diseñar primers
Iván Ferrer Rodríguez, Ph.D.
Catedrático
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¿Qué es un primer?
 Es una cadena corta de nucleótidos, un oligonucleótido.
 Sirve como punto de partida para la replicación del DNA.
 La enzima que cataliza la síntesis del DNA (polimerasa de DNA)
tiene dos requisitos para comenzar la síntesis:
 Una región de doble hebra.
 Un terminal 3’.
 El primer (cebo o iniciador) provee ambas cosas.
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
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Diseño de primers
Longitud
 Típicamente se acepta un
rango de 17 a 22
nucleótidos.
 La longitud se relaciona a
la especificidad del
primer.
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Diseño de primers
Melting temperature (TM)
 La temperatura de disociación (TM) es la temperatura en la que
el 50% del primer se encuentra disociado.
 Es un buen indicador para establecer la temperatura de
hibridación en un experimento de PCR.
 Ambos primers deben tener TM similares o próximos.
 La diferencia debe ser menor de 3 °C.
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Diseño de primers
Características de la secuencia:
 El contenido de GC debe situarse entre el 40-60%.
 Influye en la estabilidad del híbrido.
 Se debe evitar la complementariedad de los últimos dos o
tres nucleótidos del terminal 3´ entre los primers.
 Ayuda a reducir la formación de dímeros.
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Diseño de primers
Características de la secuencia:
 El primer debe terminar el
G o C.
 Se debe evitar una T en el
extremo 3´ pues existe
mayor posibilidad de un
apareamiento erróneo.
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 Ejemplo:
Estrategias para diseñar primers:
 Si los análisis de los
primers reflejan formación
de dímeros, se debe tomar
en cuenta varios factores.
 Si el extremo 3´ es más
largo, la polimerasa no
podrá extender el DNA.
 Si el extremo 5´ es más largo,
la polimerasa podrá
extender el DNA.
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Estrategias para diseñar primers
Primer-inserto
Primer-primer
 La unión del primer con el
 La unión de los dímeros de


G debe ser < -3 kcal/mol
 Mientras más negativo,
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primers debe ser inestable.


inserto debe ser estable.
G debe ser > -3 kcal/mol
 Mientras más positivo,
más estable la unión
más inestable la unión
 Ejemplos: -3, -4, -5, etc.
 Ejemplos: >-3, -2, -1, etc.
Estrategias para diseñar primers
Hairpins
 Evitar la formación de
haipins.
 Considerar la estabilidad de
los mismos.
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Programas para diseñar primers
 Oligo
 NCBI
 Primer3
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
 Primer3 plus
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
 GeneFisher
http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/bibi/Tools_Primer_Design.html
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Programas para diseñar primers
 Es posible añadir lugares de restricción a los primers:
 Eco RI
 Bam HI
 Clonación direccional para expresión:
 Cotejar lugares de restricción de la secuencia
 Cotejar el ORF
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Cómo confeccionar el PCR
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Ciclo de amplificación
 2:30 min – 94 °C
 94 °C – 15 sec
 57 °C – 30 sec
 72 °C – 60 sec
 7 min – 72 °C
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}
30 cycles
Purificación
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Ligación
Cuánto DNA ligar?
ng of inserto = ng de vector X tamaño del inserto (kb) X razón molar inserto:vector
tamaño del vector (kb)
 inserto:vector: 3:1 1:3
 Enzyme Storage Buffer: T4 DNA Ligase is supplied in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM
KCl, 1mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50% glycerol.
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Ligación
Cuánto DNA ligar?
 Unit Definition: 0.01 Weiss unit of T4 DNA Ligase is defined as the amount of enzyme
required to catalyze the ligation of 95% of the Hind III fragments of 1µg of Lambda
DNA at 16 °C in 20 minutes.
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Secuenciación
 Ejercicio de práctica
 a
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Resumen
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Diseñando Primers en OLIGO
 Al entrar al programa Oligo:
 Introduce la secuencia
deseada:
 File
 New sequence
 Ctrl + V (Paste)
 Enter
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Diseñando Primers en OLIGO
 Para escoger la cantidad de nucleótidos:
 Change
 Current oligo length
 Para que el mismo programa te busque los primers:
 Search
 For primers and probes
 Search Range
 Establecer los parámetros
 Al escoger los set de Primers se analizan:
 Analyze
 Upper
 Lower
 Upper/Lower
 PCR
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Primers:
• F-4049 – R-5026: 994 bp
Upper: F-4049
Lower: R-5026
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Primers:
• F-4049 – R-5026: 994 bp
Upper/Lower
PCR
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Restricciones para el diseño de
Primer para proteínas:





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Tiene que estar en marco de lectura.
La distancia entre el “upper” y el “lower” no debe
ser menor de 200 bp, ni mayor de 500 bp.
No tener codones extraños

AGG

AGA

ATA

GGA
No Poly-A
No usar dominios transmembranales
Resumen
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