1. No category

Cómo investigar sobre la visión
Modelos de lesión retiniana como
herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Fundación de Estudios Médicos
de Molina de Segura
Salón de Actos. Colegio Paseo Rosales.
Molina de Segura
24 de abril, 2012. 18.00h-20.30h
Manuel Vidal-Sanz
Laboratorio de Oftalmología Experimental
Departamento de Oftalmología
Universidad de Murcia,
Murcia, España
Modelos de lesión retiniana como
herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Degeneración en la retina
Neuroprotección en la retina
Superior Colliculus
Modelos de lesión retiniana como
herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Degeneración en la retina
Neuroprotección en la retina
Laboratorio de Oftalmología Experimental, Universidad de Murcia
En la vía visual del roedor adulto hemos desarrollado técnicas para
estudiar cuantitativamente
La población de ganglionares, y amacrinas desplazadas
La población de conos S y de conos LM
El espesor de las capas de la retina
El volumen de la proyección retino-tectal
METHODS: (1) Labeling of RGCs with FG
S
Fluorogold
•P1-od-12-2wks
METHODS: Counting FG-labeled RGCs
s
Vidal-Sanz et al., Exp Neurol 1988; 102:92; Villegas-Pérez et al., J Neurosci 1988; 8:265. Peinado-Ramón et al., IOVS 1996; 37:489
Adult SD rats
S
T
N
I
Area =
45.24 mm2
FG-labelled RGCs = 76,390
Mean density = 1,689 cells/mm2
Total number of FG-labelled RGCs
90.000
SCi
ON
n = 37
n = 27
75.000
60.000
45.000
30.000
15.000
0
Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:115-126, Vision Res. 2009; 49:637-647
81,486±4,340 82,818±3,949
Adult Swis mice
Adult C57 mice
Total number of FG-labelled RGCs (Swiss)
SC
ON
50.000
40.000
30.000
20.000
10.000
0
n = 43
0
6250
48,733±3,954
N = 18
49,493±3,936
Salinas-Navarro et al., Vision Res (2009) 49:637-647
Brn3a AS A MARKER FOR NAÏVE AND LESIONED RAT RGCs
S
Total number of Brn3a+-RGCs
Total nubmer of FG+-CGR
T
N
90.000
Brn3a
FG
75.000
I
60.000
45.000
30.000
15.000
0
n = 14
0
3.500
n = 14
84,682±7,601 80,252±2,210
Nadal-Nicolás et al, Invest Opththalmol Vis Sci 2009;50:3860-3868; Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387
Brn3a AS A MARKER FOR NAÏVE AND INJURED MICE RGCs
S
Total number of Brn3a+-RGCs
Total number of OHSt+-RGCs
N
Brn3a
T
OHSt
45000
40000
35000
I
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
n= 9
n= 9
34,627±1,821 40,437±3,196
0
4.800
Nadal-Nicolás et al, Invest Opththalmol Vis Sci 2009;50:3860-3868; Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387
Brn3a+RGCs isodensity map
Brn3a+RGCs
RE control
96,061 Brn3a+RGCs
DAPI
Vidal-Sanz et al., Progr. Ret Eye Res. 2012:1-27
DAPI Isodensity map
240,345 DAPI nuclei
Brn3a+-RGCs and ipRGCs in SD rat retina
Left eye
Right eye
S
S
N
T
I
I
0
T
N
3.500
0-2
>21
Brn3a+-RGCs 78,423 ± 2,957 (n=10)
ipRGCs 2,046.50 ± 309.04 (n=10)
Morphometric and
Microscopic analysis
•500 píxeles
•P21
•P20
•150 μm
•P19
•P18
•P17
•P16
•P15
•P14
•P13
•P12
•Nervio óptico
•P11
•P10
•P9
•P8
•P7
•P3
•150 μm
•P4
•P5
•P6
•P2
•P1
•Magnificación x20
Authomatic detection of retinal layer limits to determine
its mean width
Total
INL
OPL
ONL
Histogram of the mean value of the width in several retinal
layers obtained manually and authomatically.
CNE automática
automática
CNE
CNE manual
manual
CNE
Espesor de las capas (m)
50
CNI automática
automática
CNI
CNI manual
manual
CNI
CPE automática
automática
CPE
CPE manual
manual
CPE
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 NO 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Puntos de muestreo
Ortín-Martínez et al., (2010) Invest. Opthahlmol. Vis. Sci. 51:3171-3183
Total number of LM- and S-cones in SD or PVG rats
250.000
SD
(n=14)
225.000
200.000
PVG
(n=12)
175.000
150.000
125.000
100.000
75.000
50.000
25.000
0
231,736
±14,51
41,028
±5,074
239,939
±6,494
27,316
±2,235
Cones LM
Cones S
Cones LM
Cones S
Ortín-Martínez et al., (2010) Invest. Opthahlmol. Vis. Sci. 51:3171-3183
Sprague-Dawley
OI
OD
S
S
T
N
I
S-cones
LM-cones
Piebald Virol Glax
OI
OD
65000
900
T
I
1300 0
Sprague Dawley
RGCs
LM Cones
Piebald Virol Glaxo
RGCs
LM Cones
Sprague Dawley
FG-RGCs
Conos-LM
Conos-S
OD
S
N
T
I
0
cells/mm2
78.514
3,500
243.394
0
cells/mm2
6,500
41.820
0
cells/mm2
1,300
TRAZADO ANTERÓGRADO DE LA
PROYECCIÓN RETINO-TECTAL
1. Inyección intravítrea de la subunidad
B de la toxina colérica (CTB)
2. Transporte anterógrado de la CTB a
lo largo de la proyección retino-tectal
3.- Corte seriado del cerebro medio.
Inmunocitoquímica para revelar la CTB
4.- Análisis densitométrico de áreas
intensamente marcadas con CTB
CTB
Avilés-Trigueros et al., Exp Neurol 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Control
Avilés-Trigueros et al., Exp. Neurol. 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Volume of the retino-tectal projection
1,2
Con 11 Vol = 2.350 mm
2
r = 0.985
3
1,0
area (mm2)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
depth (mm)
Avilés-Trigueros et al., Exp. Neurol. 2003;184:767-777; Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Estudios anatómicos de la vía retino-tectal
Estas técnicas modernas permiten la cuantificación de parámetros
biológicos.
Vidal-Sanz et al., Exp Neurol 1988; 102:92-101
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80.
Vidal-Sanz et al., J Neurosci 1987; 7:2894-2909.
Vidal-Sanz et al., Progr Brain Res 2002; 137: 441-450.
Avilés-Trigueros et al., Exp Neurol 2003; 184:767-777
Mayor-Torroglosa et al., IOVS 2005; 46:3825-3835
Vidal-Sanz et al., Eye 2007; 21:S42-S45
Sobrado-Calvo et al., J Comp Neurol 2007; 501:866-78.
Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:115-126
Salinas-Navarro et al., Vision Res 2009; 49:637-647
Nadal-Nicolás et al., IOVS 2009; 50:3860-3868
Ortín-Martínez et al., IOVS 2010; 51:3171-3183
Galindo-Romero et al., Exp. Eye Res. 2011; 92:377-87
Sánchez-Migallón et al., Exp. Eye Res. 2011; 92:260-267
Vidal-Sanz et al., Prog. Ret. Eye Res. 2012; 1-27
Modelos de lesión retiniana como
herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Degeneración en la retina
Neuroprotección en la retina
médula espinal
músculo
•http://faculty.washington.edu/chudler/chreflex.html
axón células gliales
Degeneración
retrógrada
Degeneración
anterógrada
Sistema nervioso periférico
Sistema nervioso central
Sistema nervioso periférico
Sistema nervioso central
Regeneración axonal
Re-extensión y arborización terminal
Diferenciación y sinaptogénesis
Reinervación funcional
Vidal-Sanz et al., J. Neurosci. 1987; 9:2894-2909
Keirstead et al., Science 1989; 246:255-257
Vidal-Sanz et al., J. Neurocytol. 1991; 20:940-952
Whiteley et al., Exp. Neurol. 1998; 154:560-572
Avilés-Trigueros et al., J. Neurosci. 2000; 20:361-372
Vidal-Sanz et al., Prog. Brain Res. 2002; 137:443-452
Modelos de lesión retiniana como
herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Degeneración en la retina
Neuroprotección en la retina
Degneración retiniana
Axón Células gliales
Degeneración
Retrógrada
Degeneración
Anterógrada
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. (1988) 8:265-280
Villegas-Pérez et al., J. Neurobiol. (1993) 24:23-36
Efectos de la seción del nervio óptico (SNO) en la
supervivencia de las CGR
Axotomía
Peinado-Ramón et al., IOVS (1996) 37:489-500
Sobrado-Calvo et al., J. Comp. Neurol. (2007) 501: 866-878
Supervivencia de CGR tras la SNO
2500
2000
Densidades (CGR/mm2) de CGR marcadas con FG (media±DS)
Control
*
SNO
1500
1000
500
0
Control n=20 4 días n=11 5 días n=6
7 días n=6
9 días n=6
12 días n=6
Peinado-Ramón y cols., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996; 37:489-500
Efectos del aplastamiento del nervio óptico (ApNO)
en la supervivencia de las CGR
Aplastamiento intraorbitario del nervio óptico
Supervivencia de CGR tras el aplastamiento del NO (ApNO)
Densidades (CGR/mm2) de CGR marcadas con FG (media±DS)
2000
*
Control
ApNO
1500
1000
500
0
Control n=41
5 días n=8
7 días n=5
9 días n=8
12 días n=5
Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res. 2009; 89:32-41.
SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES
TRAS SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO)
SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES
TRAS APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO)
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
Control n=20
5 días n=6
7 días n=6
9 días n=6
12 días n=6
Peinado-Ramón y cols, IOVS 1996;37:489-500
Control n=41
5 días n=8
7 días n=14
9 días n=8
12 días n=11
Parrilla–Reverter et al., Exp Eye Res 2009;89:32-41
DEGENERACIÓN DE LAS CÉLULAS GANGLIONARES INDUCIDA POR
AXOTOMÍA REALIZADA A LA MISMA DISTANCIA DEL DISCO ÓPTICO
EFECTO DEL MECANISMO DE LESIÓN (1 semana y 3 meses)
SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO
(SNO)
APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO
(ApNO)
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Axotomía 14 días, Ax14d1oi40
Cronología de los cambios degenerativos según el tipo de lesión
30 días después
SECCIÓN NERVIO ÓPTICO
(SNO)
APLASTAMIENTO NERVIO ÓPTICO
(ApNO)
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
90 días después
Degeneración Retiniana
Discretas variaciones en la distancia a la que se produce la
axotomía, resultan en diferencias sustanciales en el inicio, curso y
severidad de la degeneración de las células ganglionares.
El curso de la muerte inducida por axotomía depende, además de
la distancia y del tiempo transcurrido, del mecanismo de lesión
inflingida, esto es de si se ha producido sección o aplastamiento.
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80
Villegas-Pérez et al., J Neurobiol. 1993; ;24:23-36
Peinado-Ramón et al., IOVS. 1996; 42:2074-84
Vidal-Sanz et al., Neurotox Res 2000; 2:215-227.
Salvador-Silva et al., J Comp Neurol. 2000; 417:431-447.
Sobrado-Calvo et al., J Comp Neurol. 2007; 501:866-78.
Agudo et al., Mol. Vis. 2008; 4:1050-1063
Agudo et al., IOVS. 2009; 50:424-31.
Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41.
Parrilla –Reverter et al., Vision Res. 2009; 49:2808-2825.
Galindo-Romero et al, Exp Eye Res 2011;92:377-387
Sánchez-Migallón et al., Exp Eye Res 2011;92:260-267.
Modelos de lesión retiniana como
herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Caracterización de la vía retino-colicular
Regeneración en el sistema visual del mamífero adulto
Degeneración en la retina
Neuroprotección en la retina
Neuroprotección en la retina
SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO
SECCIÓN DEL NERVIO ÓPTICO E
INJERTO DE NERVIO PERIFÉRICO
(Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-280)
La población de CGR que sobrevive a la
sección del nervio óptico es mayor (2-4 veces)
cuando tras la sección se apone un injerto de
nervio periférico autólogo
GRAFTED
SURVIVERS
AXOTOMIZED
(Villegas-Pérez, MP., Vidal-Sanz M. et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-280)
Neuroprotección: Estudios experimentales
¿Cuál es el concepto de neuroprotección?
Se entiende por neuroprotección la posibilidad de
prevenir, ralentizar o disminuir el proceso de
muerte neuronal inducida por lesión o enfermedad.
¿Qué evidencia tenemos sobre la neuroprotección?
SUPERVIVIENCIA DE CÉLULAS GANGLIONARES
TRAS SECIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO) + BDNF
SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS GANGLIONRES TRAS
APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO) + BDNF
Lesión
Lesión
Degeneración secundaria
100%
80%
80%
60%
60%
40%
40%
Neuroprotección
Neuroprotección
20%
0%
0 días
Degeneración secundaria
100%
20%
2 días
4 días
6 días
8 días
10 días
12 días
14 días
Peinado-Ramón et al., IOVS 1996;37:489-500
0%
0 días
2 días
4 días
6 días
8 días
10 días
12 días
14 días
Parrilla-Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41
SUPERVIVIENCIA DE CÉLULAS GANGLIONARES
TRAS SECIÓN DEL NERVIO ÓPTICO (SNO) + BDNF
SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS GANGLIONRES TRAS
APLASTAMIENTO DEL NERVIO ÓPTICO (ApNO) +
BDNF
Control
SNO
BDNF
100
Control
ApNO
BDNF
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
Control
n=14
Axot-7d
n=6
BDNF-7d
n=7
SNO-7d
n=6
BDNF-9d
n=5
SNO-12d BDNF-12d
n=6
n=4
Peinado-Ramón et al., IOVS 1996;37:489-500
Control
n=14
ApNO-7d BDNF-7d ApNO-9d BDNF-9d ApNO-12d BDNF12d
n=14
n=7
n=8
n=7
n=11
n=5
Parrilla-Reverter et al., Exp Eye Res 2009; 89:32-41
Una semana tras la aplicación de FG
MÉTODOS: Sección intraorbitaria del NO
FG
BDNF
Supervivencia de CGR tras la axotomía
Densidades de CGR marcadas con FG o Brn3a-(media ±SD)
100
81,639
Brn3a
BDNF+IONT FG+RGCs
90
BDNF+IONT Brn3a+RGCs
80
70
VEHI+IONT FG+RGCs
60
VEHI+IONT Brn3a+RGCs
50
40
30
20
10
0
7 d (n=8)
9 d (n=8)
12 d (n=8)
Sanchez-Migallón et al., Exp Eye Res 2011; 92:260-267
0
3.500
83,891
Brn3a+RGCs
SNO+BDNF
9 days
7 days
80,406
61,923
12 days
48,454
SNO+VEH
40,388
0
21,475
3.500
16,856
Sanchez-Migallon et al., Exp Eye Res 2011; 92:260-267
LA LESIÓN DEL NERVIO ÓPTICO INDUCE CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LA RETINA
ApNO
Control
SNO
Control
VS
VS
Genes regulados por ApNO
Genes regulados por SNO
Genes regulados por ambas lesiones y específicos de cada tipo de lesión
Number of genes
overexpressed
2500
2000
1500
1000
IONC regulated genes
800
IONC regulated ESTs
600
IONT regulated genes
400
IONT regulated ESTs
200
1000
Genes
500
ESTs
0
SNO
SNO &
ApNO
ApNO
Number of genes
downregulated
Number of regulated sequences
Número total de genes y secuencias EST reguladas Número de genes sobre-regulados o infra-regulados
0
IONT&IONC regulated genes
-200
IONT&IONC regulated ESTs
-400
-600
ApNO
SNO &
ApNO
SNO
La SNO regula más secuencias que el ApNO
SNO induce principalmente la sobre-regulación mientras que el ApNO induce
principalmente la infra-regulación
Agudo et al., Mol. Vis. 2008;14:1050-63; Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009;50:424-31
Neuroprotección en la retina
Estos estudios documentan que el curso y magnitud de la muerte de CGR
inducida por axotomía se puede modificar con factores neurotróficos.
Los estudios moleculares indican que tanto el aplastamiento como la sección del
nervio óptico activan vías de muerte intrínsecas y extrínsecas.
Así, pues, las estrategias de neuroprotección deberían considerar agentes
capaces de modificar todas estas vías, de forma individual o en combinación
Villegas-Pérez et al., J. Neurosci. 1988; 8:265-80.
Villegas-Pérez et al., J. Neurobiol. 1993; 20:940-952
Peinado-Ramón et al., IOVS. 1996; 37:489-500.
Vidal-Sanz et al., Neurotox Res. 2000; 2:215-227
Agudo et al., Mol. Vis. 2008; 4:1050-1063
Agudo et al., IOVS. 2009; 50:424-31.
Parrilla –Reverter et al., Exp Eye Res. 2009; 89:32-41.
Galindo-Romero et al, Exp Eye Res. 2011; 92:377-387
Sanchez-Migallon et al., Exp Eye Res. 2011; 92:260-267
Universidad de Murcia
Universidad de Murcia
María Paz Villegas Pérez
Jaime Miralles de Imperial
Mercedes Salvador Silva
Paloma Peinado Ramón
Inmaculada Sellés-Navarro
Ana Mª Gómez Ramírez
Paloma Sobrado Calvo
Román Blanco Velasco
Lidia Coll Alcaraz
María Elena Rodríguez Gzlez
Marcelino Avilés-Trigueros
Antonio García Avilés
Mª Elena Aguilera Meseguer
José Alía Benítez
Sergio Mayor Torroglosa
María Lafuente López-Herrera
Marco A. Marco Gomariz
José Martínez Morales
Natalia Hurtado Montalbán
Amanda Ortíz Gomariz
Jose Manuel Bernal Garro
Guillermo Parrilla Reverter
Manuel Salinas Navarro
Marta Agudo Barriuso
Isabel Cánovas Martínez
Maria Isabel Soro Martínez
Mª Cruz Pérez Marín
Luis Alarcón Martínez
Francisco M. Nadal Nicolás
Manuel Jiménez López
Diego García Ayuso
Fco. Javier Valiente Soriano
Arturo Ortín Martínez
Luis Montalbán Soler
Caridad Galindo Romero
Sergio Rodríguez Llarena
Cómo investigar sobre la visión
Modelos de lesión retiniana como
herramientas para estudiar la plasticidad
neuronal
Fundación de Estudios Médicos
de Molina de Segura
Salón de Actos. Colegio Paseo Rosales.
Molina de Segura
24 de abril, 2012. 18.00h-20.30h
Manuel Vidal-Sanz
Laboratorio de Oftalmología Experimental
Departamento de Oftalmología
Universidad de Murcia,
Murcia, España