1. Healthcare

Antifungigrama de rutina:
¿Qué y cómo testear?
Dra. Cecilia Tapia P.
2014
¿Por qué es importante estudiar la susceptibilidad de
los hongos?
• Las infecciones fúngicas invasoras son muy comunes
en pacientes con alteraciones en su inmunidad (cada
vez hay más pacientes de riesgo)
• El espectro de patógenos fúngicos a su vez está
creciendo y las opciones terapéuticas son limitadas
(principalmente en hongos resistentes)
• La resistencia innata y
adquirida ha sido
demostrada in vitro e in
vivo.
Clin Microbiol Rev 1998; 11: 382-402
• El reconocimiento
temprano de especies
resistentes a uno o más
antifúngicos garantiza
un tratamiento óptimo
y un mejor resultado.
Garey K W et al. Clin Infect Dis. 2006;43:25-31
• Por otra parte, la resistencia continúa creciendo y evoluciona,
a pesar de la introducción de nuevos antifúngicos.
R en Aspergillus fumigatus
Mutación puntual t364a (L98H)
+ 2 repetidos de 34 pb
Azole resistance frequency in A. fumigatus by patient 1997–2009.
Bueid A et al. J. Antimicrob. Chemother. 2010;65:21162118
© The Author 2010. Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for
Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved. For Permissions, please e-mail:
[email protected]
Debido a mutaciones en el gen FKS
Temporal trends in antifungal resistance of Candida glabrata
isolates to anidulafungin (short dashed line with squares),
caspofungin (solid line with triangles), and micafungin (long dashed
line with circles) From Alexander et al.
Pfaller MA et al.
Resistencia en hongos
• Intrínseca: ningún miembro de la especie es sensible a un
antifúngico (insensibilidad a la droga) Ej: C. krusei y fluconazol
o S. prolificans a varios antifíngicos
Resistencia en hongos
• Secundaria: una cepa previamente
sensible adquiere resistencia al compuesto
tras haber entrado en contacto con él. Ej:
C. albicans y fluconazol /tratamiento
prolongado con la droga
Tests de susceptibilidad antifúngica
• La estandarización de los tests de
susceptibilidad antifúngica (AFST)
representan un gran avance en la
detección de resistencia en hongos
(desde los 90´s).
• Estándares disponibles: Clinical
Laboratory Standards Institute
(CLSI, USA) y European Committee
on Antibiotic Susceptibility Testing
(EUCAST-AFST, Europa)
www.clsi.org
www.eucast.org
Documentos disponibles para realizar tests de
susceptibilidad antifúngica
• CLSI-M27-A3: microdilución en caldo levaduras
(suplementos 3 y 4)
• CLSI-M44-A2: difusión en disco para Candida
spp. (suplemento 3)
• CLSI-M38-A2: microdilución en caldo hongos
filamentosos
• M51-A: difusión en disco para hongos
filamentosos no-dermatofitos (suplemento 1)
• EUCAST Definitive Document E.Def 7.1 (y
revisión 7.2): microdilución en caldo levaduras
fermentadoras.
• EUCAST Definitive document e.Def 9.1:
microdilución en caldo hongos filamentosos
Microdilución en caldo
• Es el «gold standard»
• 2 estándares tanto para levaduras (CLSI M27-A3 y
EUCAST- Definitive Document EDef 7.1 y 7.2) como
para hongos filamentosos (CLSI M38-A2 y EUCASTDefinitive document e.Def 9.1)
• Ambos estándares para microdilución en caldo,
tienen una alta reproducibilidad intra e
interlaboratorio y diferencian poblaciones con CIMs
bajas y altas.
Diferencias entre CLSI y EUCAST (levaduras)
Diferencias entre CLSI y EUCAST
(hongos filamentosos)
Hongos filamentosos (algunos detalles…)
• CLSI: determinación de CIM para para 1) hongos invasores:
Aspergillus sp, Fusarium sp, Rhizopus oryzae, Pseudalescheria
boydii (S. apiospermum), la forma filamentosa de Sporotrix
shenckii y otros hongos filamentosos 2) hongos cutáneos
(dermatofitos: Tricophytom, Microsporum y Epidermophyton
spp)
• EUCAST: fundamentalmente para Aspergillus spp.
• MEC o concentración efectiva mínima: que es la más baja
concentración de fármacos capaz de producir un crecimiento
hifal aberrante (en μg/mL). Permite mejorar la interpretación
de la CIM de Aspergillus a equinocandinas.
MECs
FIG. 1.(A) Visual or macroscopic caspofungin MECs of 0.12 to 0.25
μg/ml with M3 medium. Isolates tested: A. niger (rows 1 and 2 of the
microdilution plate), A. flavus, A. terreus, and A. fumigatus (rows 3 to
8). (B) Visual or macroscopic caspofungin MECs of 0.25 μg/ml with
standard RPMI. Isolates tested: A. fumigatus and A. flavus.
FIG.2. Microscopic MEC. Shown is a light micrograph of
caspofungin-induced morphological hyphal changes for an isolate
of A. fumigatus after 48 h of incubation.
Puntos de corte clínico (CBPs)
• Se han establecido en base a distribuciones de las CIMs,
farmacocinética y farmacodinámica (PK y PD) y a la respuesta
clínica de los pacientes (outcome).
Nuevos puntos de corte
• Recientemente se han revisitado los CBPs del CLSI y se han
establecido valores de acuerdo a la especie.
Resumen puntos de corte levaduras
Rangos de susceptibilidad de Candida spp
Rangos de susceptibilidad de hongos filamentosos
Resumen puntos de corte Aspergillus EUCAST
Concepto de cepas silvestres (wild-type)
WT
Valores de corte epidemiológicos (ECVs o ECOFFs)
• Estos valores separan cepas
«silvestres» de «no-silvestres» .
Son más sensibles para detectar
cepas que están adquiriendo
resistencia.
Base genética de las cepas no-silvestre (non-wild type)
Levaduras no fermentadoras
• Especies no fermentadoras:
Cryptococcus neoformans, C. gatti, C. albidus
Rodothorula spp.
Trichosporon spp.
Geotricum spp.
• Muchas de estas especies presentan susceptibilidad disminuida
o resistencia a los antifúngicos habituales.
• No existen CBPs . La mayoría de las cepas de Cryptococcus
aisladas, se inhiben con < 1ug/mL de AnfB y < 8ug/mL de 5FC
(CLSI)
Levaduras no fermentadoras
• Zaragosa et al., han establecido condiciones ideales para realizar
AST en estas levaduras: medio YNB, placas en agitación,
incubación por más de 48h, tamaño del inóculo 105 ufc/mL,
incubación a 30°C.
Levaduras no fermentadoras
• Recientemente se han establecido los ECVs para C. neoformans
y C. gatti.
Espinel-Ingroff et al. Antimicrob Agents Chemother. 2012 Mar 5. [Epub ahead of print]
Método de difusión en disco
•
•
•
•
Método conveniente
Simple
Económico
Estandarizado: documento M-44-A2,
CLSI
• Ha sido usado en Candida y
Aspergillus spp.
• Funciona muy bien para antifúngicos
hidrosolubles (FZ y VZ)
Método de difusión en disco
•
•
•
Medios recomendados para levaduras: Mueller-Hinton + 2% glucosa + 0,5 ug/mL de
azul de metileno (CLSI). También se ha usado RPMI 1640, 0,2% glucosa (levaduras).
Discos de 25 ug fluconazol, 1 ug de voriconazol y 5 ug de caspofungina
Puntos de corte:
Método de difusión en disco
• Un estudio reciente mostró poca concordancia en C. glabrata
n= 50
Baja concordancia en fluconazol y
voriconazol (8 y 14% respectivamente)
Método de difusión en disco
• Para Aspergillus spp., la correlación entre los diámetros y la
CIM es un tanto variable.
• Según estudio multicéntrico las recomendaciones para un
resultado óptimo son: 1) usar agar MH ; 2) incubación de 24 h
para A. fumigatus, A. flavus y A. niger 3) usar posaconazol 5
ug, voriconazol 1 ug, itraconazol 10 ug, caspofungina 5 ug y
anfotericina B 5 ug.
Interferencia de azul de metileno. A. terreus.
Método de difusión en disco
• Cepas control (M44A-2):
C. albicans ATCC 90028
C. parapsilosis ATCC 22019
C. tropicalis ATCC 750
C. krusei ATCC 6258
Metodos comerciales
• Tres productos han sido aprobados por la Food and Drug
Administration (FDA), de Estados Unidos, para medir
susceptibilidad antifúngica en Candida:
1) Sensititre YeastOne® colorimetric plate (TREK Diagnostic
Systems)
2) Vitek 2 yeast susceptibility test (bioMerieux, Inc.)
3) Etest (bioMerieux, Inc).
Metodos comerciales
• Representan modificaciones de los métodos de difusión en
agar y MCD.
• Ventajas: facilidad de uso, flexibilidad, estandarización y
rapidez de resultados.
• Estos métodos han sido cuidadosamente validados en
comparación con el método CLSI-MDC.
• Permiten evaluar susceptibilidad a anfotericina B, fluconazol,
voriconazol, 5FC y equinocandinas.
Etest
• Método cuantitativo de la CIM,
de difusión en agar.
• Muy dependiente del medio a
utilizar. Los agares basados en
RPMI, parecen ser más útiles.
• Se puede usar también agar MH
+ 2% glucosa + 0,5 ug/mL de
azul de metileno (mejora lectura
de los bordes del elipse).
• Adecuado para levaduras y
hongos filamentosos.
Agar casitona
Agar RMPI
Rev Méd Chile 2003; 131: 299-302
Etest
• Para C. glabrata es mejor leer a las
24 hrs (mayor concordancia cin
CLSI-MDC).
• Es un excelente método para
valorar susceptibilidad a
anfotericina B (da un rango mayor
de CIMs)
• Muy confiable en la lectura de MIC
a equinocandinas en Candida spp.
• Algunas cepas de Candida
producen «trailing» con agentes
fungiestáticos
Rev Méd Chile 2003; 131: 299-302
Aspergillus spp. y E-test
La lectura de la CIM a equinocandinas es más
complicada para Aspergillus spp.
Microcolonias y macrocolonias dentro del
elipse.
Sensititre YeastOne® colorimetric plate
• Panel colorimétrico
antifúngico.
• Fácil de interpretar
• Basado en microdilución
en caldo.
• Capaz de testear 9
antifúngicos a la vez.
• Lectura a las 24 h de
incubación.
• Permite testear Candida
sp., Cryptococcus sp y
Aspergillus sp.
Se ha utilizado ampliamente
con excelente exactitud y
reproducibilidad
Puntos de corte recomendados por el fabricante
Vitek® 2 (AF02)
• Método comercial
completamente automatizado.
• Estudios han demostrado
excelenteconcordancia esencial
(EA) y de categoría (CA) con los
métodos CLSI y Eucast de
microdilución en caldo.
¿Cuándo solicitar un test de susceptibilidad antifúngica?
Es esencial en:
• Cepas de infecciones invasoras
• Cepas aisladas de pacientes con profilaxis antifúngica
• Pacientes que no responden a tratamiento
Presenta utilidad además en:
• Casos en los que se ha aislado una especie poco frecuente de
la que desconoce su espectro de sensibilidad in vitro.
• Vigilancia epidemiológica: puntos de corte generales CLSI y
EUCAST, puntos de corte clínicos (CBPs) y epidemiológicos
(ECVs)
CLSI vs EUCAST
Ventajas
CLSI
•
•
•
•
EUCAST
•
•
•
•
•
Existencia de más documentos (difusión en
disco)
Puntos de corte para Candida spp y
caspofungina.
Puntos de corte para fluconazol,
voriconazol y caspofungina en difusión en
disco
Lectura a las 24 hrs (MDC)
Documentos disponibles online
gratuítos
Puntos de corte clínicos (CBPs) de
acuerdo a la especie
Lectura espectrofotométrica (MDC)
Lectura a las 24 hrs (MDC)
Puntos de corte para Aspergillus spp
Desventajas
•
•
•
Costo documentos: cada
documento es pagado ($)
Lectura visual (MDC)
Todavía no se establecen
algunos puntos de corte para
algunos antifúngicos que sí
están disponibles para CLSI.
Tests basados en microdilución
Vitek®
Ventajas
•
•
•
•
•
YeastOne®
•
•
•
•
•
Desventajas
Sistema totalmente automatizado.
Tiempo de resultado: desde 9,1 h para C.
albicans y 12,1 h para C. neoformans.
Literatura de respaldo.
Resultados concordantes con CLSI y
EUCAST.
Evaluados con los nuevos puntos de corte.
•
Nueve antifúngicos disponibles
(AnfoB, AND, CAS, MF, PZ, IZ, VZ, FZ)
Literatura de respaldo.
Resultados concordantes con CLSI y
EUCAST.
Evaluados con los nuevos puntos de
corte.
Permite evaluar Candida, spp, C.
neoformans y Aspergillus spp
•
•
•
•
Sólo cuatro antifúngicos
disponibles
actualmente(AnfoB, 5FC, FZ y
VZ).
Cautela en C. glabrata y FZ.
Hasta el momento sólo
susceptibilidad de levaduras.
Manual
Puntos de corte sugeridos por el
fabricante: suplemento S3 CLSI.
Nuevas metodologías
Conclusiones
• Cada método de susceptibilidad antifúngica tiene ventajas y
desventajas.
• CLSI y EUCAST (sobretodo microdilución en caldo) son
engorrosos y es difícil incorporarlos a la rutina de un laboratorio
de microbiología. Requieren drogas puras
Laboratorios de
referencia
• El método de difusión en disco es fácil de hacer y económico.
Actualmente hay puntos de corte para fluconazol, voriconazol y
caspofungina (Candida spp).
Conclusiones
• Los métodos comerciales aprobados por la FDA constituyen
alternativas válidas para uso en laboratorios de rutina.
• Las CIMs, pueden ser útiles para monitorizar el mejor antifúngico, sin
embargo, la CIM no es el único predictor de la respuesta clínica de los
pacientes.
• Es importante realizar el diagnóstico a nivel de especie para orientar
la terapia antifúngica.
Agradecimientos
Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina Universidad de Chile
Laboratorio Clínico Clínica Dávila: Ruby Troncoso, Ximena Ormazábal, Milenko Fuentes
Laboratorio Clínico Clínica Alemana: Dra. Lorena Porte e integrantes del laboratorio de
Microbiología.