1. Ciencia

Transferencia de embriones
Prefacio
Con la finalidad de incrementar la tasa reproductiva de la hembra bovina se desarrolló la transferencia
de embriones hace 20 años. La experiencia obtenida en ese tiempo indicó que el efecto de la
transferencia de embriones sobre la multiplicación de la descendencia es limitado, sin embargo permitió
el desarrollo de una nueva constelación de biotecnologías al permitir disponer de embriones en estadios
tempranos durante su tránsito uterino.
En la actualidad los embriones bovinos son congelados, divididos, clonados, microinyectados y
cultivados in vitro durante un tiempo más o menos prolongado. La necesidad de disponer de un gran
número de embriones en estadios más tempranos, durante su tránsito oviductal, motivó el estudio y
desarrollo de su pro-ducción in vitro.
Este libro fue escrito para médicos veterinarios, genetistas, biólogos, estudiantes de medicina
veterinaria y biología, interesados en los fundamentos básicos e implementación práctica de la
manipulación embrionaria como así también en los actuales métodos biotecnológicos de la
reproducción bovina y su impacto genético.
El contenido del mismo fue dividido en tres partes para su mejor desarrollo y comprensión. La primera
parte describe en detalle la información descriptiva, el modus operandi y los resultados obtenidos y
esperables con el empleo de la transferencia de embriones. Se dio especial importancia a la descripción
y discusión de los diferentes métodos y técnicas como así también a los tratamientos más empleados.
En la segunda parte se presentan las biotecnologías asociadas que son aplicadas en la práctica y las
que se encuentran aún en la fase experimental. De las técnicas aplicadas en la rutina médicoveterinaria los autores hacen referencia a las que fueron desarrolladas o aplicadas en sus laboratorios y
en los de otros autores. De aquellas sobre las que no existe aún información suficiente en la especie
bovina, se recurrió a la descripción en otras especies. En la tercera parte se hace referencia a las
aplicaciones de las biotecnologías descriptas en la producción animal, considerando estrictamente sus
efectos sobre el mejoramiento genético.
Es nuestro deseo que este libro contribuya a responder a las necesidades e interrogantes de
profesionales y estudiantes y con ello a desmistificar la técnica de la transferencia de embriones y sus
biotecnologías asociadas en la especie bovina.
G.A. Palma
G. Brem
Munich, enero de 1993
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Indice de autores
Indice de autores
Ricardo H. Alberio. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria, Prof. titular de la Cátedra de post-grado de
Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata. Técnico del
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Balcarce. Depto. de Prod. Animal, Unidad
Integrada FCA-INTA. C.C. 276. 7620 Balcarce, Buenos Aires. República Argentina.
Ulrike Berg. Farmacóloga, Dr. en Ciencias Naturales. Miembro del staff científico de la Cátedra de
Producción Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian, Munich. Lehrstuhl für Molekulare
Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universität, München. Veterinärstraße 13, 8000 München 22.
República Federal de Alemania.
Gottfried Brem. Med. Vet., Ing. Agr., Dr. en Medicina veterinaria. Prof. titular de la Cátedra de
Producción Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, República Federal de
Alemania Miembro ordinario de la Academia de Ciencias de Rusia. Prof. invitado de la Facultad de
Ciencias Veterinarias de la Universidad de Budapest, Hungría. Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht der
Ludwig-Maximilians-Universität, München. Veterinärstraße 13, 8000 München 22. República Federal
de Alemania.
Jorge Cabodevila. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. Adjunto de la Cátedra de Obstetricia y
Ginecología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Centro de la Pcia.
de Buenos Aires. Pinto 399, 7000 Tandil, Buenos Aires. República Argentina.
Annette Clement-Sengewald. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff científico de la
Cátedra de Producción Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad
Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro científico del Laboratorio para la investigación del clonado de
Bavaria. Bayerische Klonierungs-forschungsgesellschaft GmbH & Co KG. Hackerstraße 27, 8042
Badersfeld. República Federal de Alemania.
Peter Dovc. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Miembro del staff científico del Instituto de Producción
Animal de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, República Federal de Alemania. Institut für
Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universität München. Veterinärstrße 13, 8000 München. República
Federal de Alemania
Horst Kräußlich. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Prof. emérito de la Cátedra de mejoramiento Animal
y Director del Instituto de Producción Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Dr. honoris causa otorgado por la Universidad de Gödöllö,
Hungría. Dr. honoris causa otorgado por la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad
Ludwig-Maximilian de Munich, Alemania. Institut für Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universität,
München. Veterinärstraße 13, 8000 München. República Federal de Alemania.
Gustavo A. Palma. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. libre de la Cátedra de Anatomía y
Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata, Argentina.
Miembro de la carrera de investigador científico del Concejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Técnicas (CONICET), Argentina. Miembro del staff científico de la Cátedra de Producción Animal
Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro científico del Laboratorio para la
investigación del clonado de Bavaria. Bayerische Klonierungsforschungsgesellschaft GmbH & Co
KG. Hackerstraße 27, 8042 Badersfeld. República Federal de Alemania.
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Transferencia de embriones
Horst Reichenbach. Med. Vet., M.Sc., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff científico de la
Cátedra de Producción Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad
Ludwig-Maximilian de Munich. Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universität,
München. Hackerstraße 27, 8042 Badersfeld, República Federal de Alemania.
Gonzalo Rivera. Med. Vet., becario del Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
(CONICET), Argentina. Laboratorio de Reproducción y Lactancia (LARLAC, CONICET). CC. 855,
5500 Mendoza, República Argentina.
Sergio Torquati. Med. Vet. Centro Integral Bahía Blanca de Inseminación Artificial (CIBBIA). Ruta 35.
Km 9,5; 8000 Bahía Blanca, Buenos Aires. República Argentina.
Eckard Wolf. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff científico de la Cátedra de
Producción Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad LudwigMaximilian de Munich. Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universität,
München. Veterinärstraße 13, 8000 München 22. República Federal de Alemania.
Abreviaturas y símbolos
Abreviaturas y símbolos
AA
ADN
AMPc
ADNc
ARNm
B
Be
Bp
BSA
Bt
PT, BV
CE
CG
Cito B
CL
COB
COB
Cov
G
d
DMSO
E
E2
ec
eCG
EPE-HAP
ES
FD
FF
FIV
FSH
FSH-p
GH
G/L
GnRH
h
h2
HCG
HE
HMG
IA
IETE
IGFI
LH
LUV
M
Mt
MC
Mc
MCCG
MCCO
aminoácidos
ácido desoxirribonucleico
adenosin monofosfato cíclico
ácido desoxirribunucleico complementario
ácido ribonucleico mensajero
blastocisto
blastocisto expandido
blastocisto protruido
bovine serum albumin, albúmina sérica bovina
blastocisto temprano
padres de toros
ciclo estral
células de la granulosa
citocalasina B
cuerpo lúteo
células del oviducto bovino
complejo ovocito blastómero
covalencia
progreso genético
día
dimetilsulfóxido
embrión
estradiol
células embrionarias
equine corionic gonadotropin, gonadotrofina coriónica equina
extracto de pituitaria equina
célula embrionaria primordial totipotente
folículo dominante
fluido folicular
fecundación in vitro
follicle stimulant hormone, hormona folículoestimulante
follicle stimulant hormone porcine, hormona folículoestimulante de origen porcino
growth hormone, hormona de crecimiento, somatotrofina
intervalo generacional
gonadotropin realising hormone, hormona liberadora de gonadotrofinas
hemi
heredabilidad
human corionic gonadotropin, gonadotrofina coriónica humana
hemi-embriones
gonadotrofina menopáusica humana
inseminación artificial
International Embryo Transfer Society, Sociedad internacional de transferencia de
embriones
Insulin like growth factor I, factor de crecimiento similar a la insulina
hormona luteinizante
luz ultravioleta
mórula
mórula temprana
microcirugía
mórula compacta
medio condicionado con células de la granulosa
medio condicionado con células del oviducto
Palma & Brem
MCI
MFCZ
MOET
MP
MPM
MV, KM
OD
OI
OT
pb, pB
PBS
PBSS
P4
PCR
PEG
PGF2
PIV
PLFR
PMSG
PV, KV
RN
RS
SOTE
SFB
SVC
STH
TL
TE
VEM
VNTR
ZP
Transferencia de embriones y biotecnología
masa celular interna
medio de fusión celular de Zimmermann
multiple ovulation and embryotransfer, ver SOTE
membrana pelúcida
modified Parker's medium, medio Parker modificado
madres de vacas
ovario derecho
ovario izquierdo
oxitocina
pares de bases
solución fosfatada bufferada
solución fosfatada bufferada con suero
progesterona
polymerase chain reaction, reacción en cadena de polimerasa
polietilenglicol
prostaglandina F2
producción in vitro
restrictions-fragment-large polymerase
pregnancy mare serum gonadotropin, gonadotrofina sérica de yegua preñada
padres de vacas
reproducción normal
respuesta superovulatoria
superovulación y transferencia de embriones
suero fetal bovino
suero de vaca en celo
somatotropin hormone, hormona somatotrófica
tirodes lactato
transferencia de embriones
valor de la eficiencia de los mellizos
variable numberd tandem repeats
zona pelúcida
Biotecnología
1
BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMAL
A. Clement-Sengewald, G. Palma & G. Brem
Introducción
La mayor intervención del hombre en el pool genético de los actuales animales domésticos fue a través
de la domesticación. Ninguna otra medida productiva puede o podrá afectar el componente genético
poblacional en una forma tan completa. En los comienzos de la domesticación el hombre no produjo
cambios en la reproducción de los animales. De esta forma se mantuvo la selección natural.
Posteriormente se observó que la reproducción programada de los animales conducía a un
aceleramiento de la selección. A través del aprovechamiento de la variabilidad genética podían criarse
animales, que respondían mejor al fenotipo establecido, o sea aquellos que poseían las características
externas deseadas. Con el tiempo se establecieron programas de mejoramiento que no respondían
solamente al deseo de una persona sino de varias y más tarde al objetivo de agrupaciones de criadores.
El empleo de la genética poblacional como también de los métodos genético-estadísticos permitió, junto
con la aplicación de la inseminación artificial, el desarrollo de exigentes programas de selección y
evaluación de la descendencia. Con el desarrollo de la biotecnología se alcanzó un nivel, en el cual es
posible la manipulación dirigida del genoma o determinados genes con mayor rapidez. Es posible
además alcanzar la manifestación de algunas particularidades productivas, las cuales con la selección
natural o programas de mejoramiento serían difíciles de alcanzar.
Las técnicas reproductivas, mediante las cuales es posible afectar el genoma de los animales (cuadro
2), se diferencian de las técnicas génicas, las cuales se ocupan de los genes en forma individual
(cuadro 3).
Técnicas reproductivas
Las técnicas reproductivas abarcan la inseminación, la congelación de semen, la micromanipulación, la
producción in vitro, el clonado y la congelación de los embriones. Los tratamientos hormonales de
inducción y sincronización del celo de las hembras receptoras de semen y embriones como así también
de las donantes de embriones, garantizan en muchos casos que las mencionadas técnicas se cumplan
con éxito.
La técnica reproductiva de mayor aplicación es la inseminación artificial (IA) y con ella la congelación de
semen. A pesar de la resistencia presentada originalmente por razones éticas se reconoció rápidamente
una de las ventajas de la IA con la disminución de las enfermedades infecciosas transmitidas a través
de la cópula. Con la misma celeridad se observó que era posible obtener una mayor descendencia de
un solo macho dividiendo el semen de un eyaculado en porciones e inseminando con las mismas varias
hembras simultáneamente. De esta forma es posible aprovechar el potencial de los machos en forma
intensiva y mejorar así la estimación del valor genético de los reproductores, dado que las
particularidades heredables son mejor evaluadas con un gran número de hijos.
La conservación de semen congelado en nitrógeno líquido posibilitó su almacenamiento durante
décadas, sin que ello afecte la fertilidad del mismo. La IA juega, junto con la congelación de semen, un
rol de importancia en la producción bovina. La inseminación artificial en las especies ovina, porcina y
equina no alcanzó un significado equivalente al existente en la especie bovina. En las dos últimas es
necesario modificar aún los métodos empleados para mejorar los resultados. La técnica de
inseminación artificial por medio de laparoscopía en la especie ovina permite actualmente obtener
resultados satisfactorios, lo que abrió las posibilidades del comercio internacional de semen.
La transferencia de embriones es una técnica reproductiva en constante desarrollo. Su evolución es
observable particularmente en la especie bovina. La TE asociada a la superovulación de las donantes
(capítulos, II al VIII) puede aumentar considerablemente el número de la descendencia por donante y de
esta forma multiplicar el componente genético materno (capítulo XVII). En la tabla 1 se resume el
significado que tiene la transferencia de embriones actualmente en Europa. Lamentablemente se
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2
dispone de poca información de la TE en países sudamericanos aunque las actividades y
comercialización con embriones frescos y congelados son actualmente relevantes en Argentina (cuadro
1), Brasil y Paraguay.
Tabla 1: Transferencias de embriones en Europa durante el año 1991 (8th Scientific Meeting, A.E.T.E.,
Lyon, 11-12 sept. 1992)
Pais
Alemania
Bélgica
Francia
Holanda*
Inglaterra*
Checoslovaquia
Union Soviética*
Irlanda
España
Italia
Lavajes de
donantes (n)
4170
2169
7896
2521
2141
1507
4800
979
306
1060
Σ
9
8
8
s.i.
s.i.
7
10
7
7
9
Embriones por donante
Útiles
Transferidos
(n)
frescos %
5
62
5
54
4
59
6
32
3
43
4
71
6
49
5
50
3
50
6
63
Congelados
%
38
46
41
68
57
29
51
50
50
37
s.i.: Sin información; *: registros de la misma fuente del año 1990
Cuadro 1:
Producción de terneros por medio de transferencia de embriones durante un año (7.917.92) en la República Argentina (Memorias de la Sociedad Rural Argentina, 1992)
Raza
Descendencia (n)
Aberdeen Angus
804
Holando Argentino
704
Hereford
556
Limousin
129
Fleckvieh
83
Otras
121
Total
2897
A través de la TE es posible aumentar el progreso genético, porque a través del aumento del número de
embriones y terneros el potencial genético de la hembra puede reproducirse y emplearse con más
eficacia. Razas y animales exóticos pueden, según las necesidades, reproducirse rápidamente. La
eficiencia de los programas de selección y cruzamiento aumentan considerablemente con la aplicación
de la transferencia de embriones. Junto con la TE es preciso también mencionar la congelación de
embriones por medio del método estándar y vitrificación (capítulo IX).
El almacenamiento de los embriones congelados se lleva a cabo en nitrógeno líquido (-196oC). De la
misma forma que el semen los embriones pueden almacenarse durante décadas. Las ventajas que
ofrece esta técnica es una mayor eficacia y ahorro en el uso de las receptoras en un programa de TE,
facilidad en el transporte de los embriones y en consecuencia la posibilidad del comercio de material
genético. De esta forma los animales nacen en el lugar de destino y se adaptan al macro- y microclima
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de la región. La congelación de los embriones permite la formación de reservas genómicas en forma de
bancos de embriones. Ello tiene particular importancia en la conservación de razas en peligro de
extinción, cuya producción y mantenimiento en establecimientos ganaderos son sumamente costosos.
Cuadro 2:
Objetivos de las técnicas reproductivas en el bovino
- IA y Congelación de semen
Combate y disminuye enfermedades sexuales
Empleo intensivo del potencial genético del macho y mejoramiento de la
estimación del valor genético (prueba de la descendencia)
- Sincronización del celo inducción de la ovulación y el parto
Facilidad en el manejo reproductivo y productivo
Disminución de la mortalidad neonatal
- Superovulación, TE, congelación de embriones
Optimización del potencial de la hembra
Rápida reproducción de individuos exóticos o razas en peligro de extinción
Formación de bancos de reservas genómicas
Facilidad en la importación y exportación del material genético
- Manipulación y microcirugía de embriones para la producción de
mellizos monocigotas y quimeras
Aumento del número de animales nacidos por embrión recolectado
Optimización de la estimación del valor genético
Creación de modelos de investigación
- Determinación del sexo
Selección del sexo de acuerdo a los objetivos establecidos
- Producción in vitro de embriones
Ahorro de donantes
Producción de embriones de vacas donantes que no responden a los
tratamientos superovulatorios
- Clonado de embriones por medio de transferencia nuclear
Variabilidad libre de recombinaciones de genotipos individuales
Aumento del número de terneros por embrión
La TE posibilitó la microcirugía de los embriones, con la producción de mellizos monocigotas (capítulo
X) y quimeras a través de la combinación de mitades de embriones diferentes. Por medio de la división
de los embriones es posible aumentar el número de embriones producidos en un programa
convencional de TE de 0,6-0,7 a 0,9-1,2 terneros por embrión dividido. Los mellizos producidos de esta
forma constituyen modelos adecuados en producción animal e investigación. Las pruebas llevadas a
cabo con mellizos idénticos permite una mayor exactitud de la estimación del valor genético de los
padres, dado que la varianza de los mellizos es menor que las de los hermanos enteros y medio
hermanos (capítulo XX). Posibilita también la evaluación de la influencia ambiental sobre los
reproductores; si los animales idénticos se crían en medios diferentes su condición genética idéntica
facilitará la determinación de cada diferencia ambiental (foto 1).
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Foto 1: Mellizos monocigotas de la raza Fleckvieh producidos por medio de Micromanipulación (BREM,
capítulo X)
La producción microquirúrgica de quimeras puede llevarse a cabo de dos formas. En primer lugar a
través de la inyección de células en el blastocele de embriones, en este caso se espera que las células
inyectadas tomen parte en el desarrollo del embrión. Otro método es la producción de quimeras a través
del agregado de embriones o hemi-embriones diferentes en una misma zona pelúcida (figura 1). Las
dos o más mitades o embriones enteros a agregar son liberados de la membrana pelúcida y
posteriormente las combinaciones deseadas nuevamente transportadas a una zona pelúcida común. El
nuevo embrión, producto del agregado, se organiza rápidamente y se transfiere de acuerdo con el
programa convencional.
Embrión I
Embrión II
Embrión I
Embrión II
Fig. 1: Modelo de producción de quimeras a partir de varios embriones
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Si se emplea como marcador el color de piel, la presencia de la quimera se determinará por los
diferentes colores del pelaje (foto 2).
Foto 2: Quimera producida con las razas Fleckvieh y Murnau Werdenfelser (BREM, 1986)
Las quimeras se emplean en la investigación genética básica de mutaciones y fallas genéticas dado que
es posible establecer como se comportan dos líneas diferentes en un individuo y su efecto sobre el
desarrollo corporal. Intensos trabajos de investigación en los últimos 10 años hicieron posible la
producción in vitro (PIV) de embriones (capítulo XI) y de la misma forma su cultivo hasta estadios
transferibles en condiciones convencionales. Las ventajas de la PIV de embriones son numerosas:
disminución del costo de los embriones, disponibilidad de embriones en estadios tempranos de
desarrollo a bajos costos, dado que con la producción in vivo la recolección de los embriones del
oviducto se lleva a cabo por medio de cirugía. El número de donantes pude reducirse. La PIV de
embriones puede ser utilizada además en aquellos casos en los cuales una vaca no puede ser sometida
a los lavajes convencionales o debe ser sacrificada. Esto es particularmente importante cuando se trata
de animales de alto valor genético como así también razas en peligro de extinción (foto 3).
Foto 3:
Ejemplar de la raza Murnau Werdenfelser en peligro de extinción, obtenido por medio de la
producción in vitro de embriones (BERG, capítulo XI)
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Hace pocos años se emplea la técnica de transferencia nuclear en la producción de clones, esto es, la
posibilidad de producir varios embriones genéticamente idénticos (capítulo XII). Con ayuda del clonado
es posible transferir algunos embriones para probar los animales nacidos mientras otros tantos
permanecen congelados.
Si el resultado de las pruebas es positivo los embriones pueden descongelarse emplearse como
donantes de blastómeros en un reclonaje. En teoría se dispone de un número ilimitado de núcleos para
nuevos reclonados. Las aplicaciones de esta técnica son interesantes como numerosas: las pruebas de
evaluación con estos animales es más exacta por la menor variabilidad genética de los clones,
posibilitando una evaluación más precisa de las influencias ambientales. Ahorra animales de
experimentación y de prueba (por ejemplo, descendencia) frente a aquellos con un menor vínculo
familiar. Con la multiplicación de animales de alto valor genético puede acelerarse el progreso genético.
Además es posible destinar un embrión para diagnosticar el sexo del clon, lo que permite seleccionar
los animales producidos también por su sexo.
Técnicas génicas
Las técnicas génicas conocidas también como de ingeniería genética incluyen el clonado de genes, el
análisis de los mismos para el diagnóstico de determinadas variantes génicas, que llevan consigo
particularidades positivas o negativas y la transferencia génica (Cuadro 3).
Cuadro 3:
Objetivos de las técnicas génicas en producción animal
- Producción génica de productos a través de la transformación de células de
levaduras, de bacterias o de animales mamíferos con un ADN recombinante in vitro
- Formación de un banco de genes para la conservación de material genético
- Modificación génica de los microorganismos del rumen con el objeto de alcanzar
una digestión más eficiente y la disposición endógena de producir componentes
metabólicos esenciales
- Métodos analíticos (Análisis génico)
Ayuda en la orientación de análisis génicos posteriores
Estudio de la relación entre marcadores ADN e importantes características
productivas
- Diagnóstico
Estudio genético y diagnóstico de fallas genéticas
Determinación de variantes génicas definidas para características deseadas
Determinación de la identidad de la ascendencia de animales reproductores
("impresión digital ADN")
- Transferencia de genes
Mejoramiento de la calidad de productos animales
Producción de animales resistentes a enfermedades
Mejora de la eficiencia productiva
Producción de proteínas (Gene Farming)
En la técnica de producción génica de sustancias por medio de la transformación de células de
levaduras, de bacterias o de mamíferos se introduce un ADN recombinante en las células a fin de
capacitarlas en la producción de proteínas. De esta forma pueden producirse hormonas, vacunas y
otras sustancias en forma idéntica a la natural, pura y a bajos costos.
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El empleo de microorganismos ruminales modificados génicamente permitió reducir el nivel de hidrólisis
de nitrógeno, la proteólisis y la producción de lactato regulando la relación de acetato, propionato y
butirato. A través de los organismos ruminales modificados genéticamente se espera una digestión más
eficiente y una mejora de la disponibilidad de aminoácidos y vitaminas. Este método de técnica génica
se encuentra aún en la fase de prueba y sometido a discusión sobre su libertad de aplicación, dado que
los microorganismos del rumen son liberados también en el ambiente. El análisis genómico tiene el
objetivo de describir una especie animal en forma progresiva y completa con ayuda de métodos
celulares y génicos. El mismo pretende identificar los genes y analizar sus secuencias de nucleótidos
para aclarar finalmente el modo de efecto de genes o complejos de ellos (capítulo XV).
Contrariamente a la especie humana, sobre la cual se discute el conflicto ético de analizar la totalidad
del genoma, ese aspecto no juega rol alguno en producción animal. Un análisis completo significa, sin
embargo, costos y esfuerzos muy grandes, razón por la cual sólo se llevan a cabo análisis parciales.
Los conocimientos obtenidos en la especie humana, más avanzados que en otras especies, convierten
a la primera en una modelo adecuado para el análisis del genoma de los animales de interés
zootécnico. Una vez identificado el gen deseado pueden buscarse las variantes naturales del mismo y
emplear los animales portadores en programas de mejoramiento. El número de genes identificados en
animales de interés productivo no supera en la actualidad los 100. En el hombre se identificaron hasta
ahora más de 3000 genes.
El análisis genómico comprende 3 áreas:
-
Mapa génico
Análisis de acoplamiento
Caracterización individual de genes
El mapeo génico pretende determinar la localización de características heredables en los cromosomas y
establecer una relación lineal entre ellos. Entre los métodos de mapeo se incluyen el empleo de híbridos
celulares, la hibridación in situ, la microdisección cromosómica y la subordinación de una característica
al efecto conjunto de varios genes. Los mapas génicos sirven de orientación en el genoma. Cuanto más
exacto es el conocimiento de la estructura y localización individual de los genes, más exacto es el
reconocimiento de la totalidad del genoma. El análisis de acoplamiento genético pretende determinar la
distancia entre dos localizaciones génicas. En producción animal se intenta establecer una relación
entre marcadores ADN y características de importancia productiva. De esta forma el marcador ADN se
convierte en el punto de partida del segmento que contiene el gen de interés.
Actualmente se dispone de dos métodos de análisis de acoplamiento genético: polimorfismo del largo
del fragmento de restricción (restrictions-fragment-large-polimorphisms) PLFR y el VNTRs. El PLFR
basa su actividad en la capacidad de las enzimas de restricción de cortar una cadena de ADN sólo en
aquellas posiciones donde se encuentran las secuencias de bases que responden a la enzima de
restricción. Si se modifican sólo los pares de bases, se originan fragmentos de restricción de diverso
largo, que pueden separase con ayuda de electroforesis en gel. Si la característica en cuestión aparece
en una familia, se aisla el ADN de cada uno de los miembros y con ayuda de enzimas de restricción y
una sonda de ADN se producen muestras fragmentadas. Cuando el marcador genético se encuentra
ubicado lo suficientemente cercano al segmento de ADN que codifica la característica a estudiar, se
heredará siempre junto con él. Esto es, están acoplados.
El segundo método de acoplamiento es el conocido como "variable numberd tandem repeats" (VNTR).
Estas son pares de bases muy cortas ordenadas en tandem con diferente número de copias y que
pueden estar distribuidas en gran número sobre todo el genoma. La diferencia de largo se establece por
medio de PLFR. La diferencia se basa en que dada la frecuencia de su presencia con este método se
aumenta la posibilidad de establecer un acoplamiento.
El tercer campo de análisis genómico es el de la caracterización individual. Genes individuales de
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importancia para la producción animal son caracterizados en su estructura de secuencia ADN a fin de
establecer un cuadro exacto de los fenómenos hereditarios a nivel molecular. Un ejemplo de ello es la
aracnomegalia en la raza Braunvieh europea, gen letal con un índice endémico de 5%. Etiológicamente
se supone un defecto en los genes responsables de la producción del colágeno. Si ese gen fuera
identificado a nivel molecular podría ser evaluada su presencia en cada reproductor de forma tal de
eliminar a los portadores.
Con el diagnóstico génico se pretende en producción animal reconocer variantes génicas, que
influencian en forma positiva ciertas características de interés productivo. En la actualidad existen dos
métodos diagnósticos disponibles para determinar segura y rápidamente la presencia de esas variantes
génicas: hibridación y sonda de ADN o PCR (Polymerase-Chain-Reaction). La hibridación consiste en el
corte de la hélice de ADN en fragmentos por medio de enzimas de restricción, los fragmentos son
separados electroforéticamente. Genes individuales pueden ser identificados con ayuda de una sonda
génica, dado que ésta se deposita en el fragmento de ADN.
PCR permite obtener de un sólo fragmento de ADN varios millones de copias en un lapso de pocas
horas. Estas se hacen visibles con ayuda de una minielectroforesis, ahorrando el trabajoso método de
hibridación. Con ambos métodos de diagnóstico génico pueden identificarse variantes génicas aún
cuando se presentan en estado heterocigota. Un ejemplo de ello es la determinación del sexo de
embriones, que se lleva a cabo con PCR antes de la transferencia (capítulo XV). El principio del
fenómeno conocido como impresión digital ADN se basa en que si el genoma total de los animales fuera
cortado y evaluado con diferentes pruebas se observaría que ningún animal es idéntico a otro,
respondiendo al mismo principio de la impresión digital. A ello se lo denomina polimorfismo del lugar de
corte. El mismo está determinado por fenómenos de mutación natural y tiene como consecuencia
diferentes largos de fragmentos de restricción, lo que establece un modelo individual para cada animal.
En teoría puede identificarse cada animal sin riesgo de confusión.
Dado que el ADN se transmite a la descendencia y las mutaciones ocurren raras veces se emplea este
método para la determinación de la ascendencia, ya que los hijos portan sólo fragmentos de ADN que
están presentes en los padres.
La transferencia de genes (capítulo XIII) se estableció como técnica a partir de la década de 1980
transfiriendo, en primeras experiencias, secuencias recombinadas a ratones. A partir de 1985 se
informó sobre los primeros animales domésticos transgénicos. Para la transferencia génica es
importante que cada gen sea aislado, caracterizado y recombinado con elementos reguladores
adecuados. Ello ocurre gracias a la ayuda de métodos biológico-moleculares. La transferencia génica
debe llevarse a cabo en lo posible en estadios embrionarios tempranos, a fin de que la estructura génica
se integre en todas las células corporales. Por esa razón el mejor momento del desarrollo del individuo
es el estadio unicelular. Para llevar a cabo la transferencia de genes existen 3 técnicas disponibles: la
microinyección de ADN en el pronúcleo de los cigotos, la transferencia a través de vectores retrovirales
y a través de células totipotentes transformadas genéticamente.
El espectro de aplicaciones de la transferencia génica en producción bovina es grande. En primer lugar
pueden mejorarse la calidad o la composición de sus productos. Ejemplos de ello son: la producción de
leche libre de lactosa para aquellas personas que sufren de insuficiencia de lactasa, la mejora en la
composición cárnea de la res, la producción de animales resistentes a enfermedades, la producción de
proteínas importantes para el hombre en animales. En ese "gene farming" se acoplan promotores a
interesantes estructuras génicas (factores de la coagulación, por ejemplo) y transfieren a animales que
producirán la proteína deseada. Además se pretende modificar el equilibrio dinámico entre la biosíntesis
y degradación de determinados productos a través de enzimas claves para favorecer la producción de
ciertos productos de regulación compleja. La investigación y desarrollo de estas técnicas significan un
esfuerzo económico de magnitud y una inversión de tiempo muy grande. Es de esperar, sin embargo,
que los resultados brindarán importantes aportes a la producción animal.
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9
Alberio
MANEJO DE DONANTES Y RECEPTORAS
R.H. Alberio
Introducción
La producción de embriones por las donantes y la transferencia a receptoras es el trabajo básico de la
transferencia de embriones. El manejo de las donantes para maximizar la producción de embriones y el
de las receptoras para tenerlas disponibles en el momento oportuno y para que tengan una buena
fertilidad, forma parte de las tareas más importantes de la TE. La evolución hacia un sistema de manejo
eficiente toma tiempo y paciencia y varía ligeramente de situación en situación.
Donantes
El manejo de las donantes es uno de los puntos críticos. Si estas hembras no están reproductivamente
bien y en un adecuado estado de balance nutricional el programa puede fracasar antes de haber
comenzado. Sólo ocasionalmente se deberá trabajar con vacas que carezcan de una óptima historia
reproductiva o que tengan algún problema reproductivo determinado. Estos son casos especiales que
no siempre se pueden rechazar y en los cuales las probabilidades de éxito son menores. En tales casos
se debe prevenir al propietario sobre el mayor riesgo y el animal será tratado en relación con el
problema detectado.
El manejo de la donante debe comenzar bastante antes de entrar en el programa y en esta etapa se
deberá cumplir con el propietario para que comprenda y aprecie cómo debe ser manejada la vaca y cuál
es su responsabilidad en ello. Por ejemplo, si la vaca irá a un Centro de TE es importante señalar al
propietario la necesidad de establecer un seguro para la misma como se hace con un toro cuando va a
un Centro de IA. Si la vaca tiene un ternero al pie, es conveniente que el mismo sea destetado o dejado
con una vaca ama. Esto es particularmente importante si la donante es trasladada a un Centro de
transferencia. No sólo importa por la salud del ternero sino también para el mejor rendimiento de la
madre a quien, además del stress del cambio se suma el de la lactancia y cuidados del ternero.
Muchas vacas ciclarán en forma irregular en los dos primeros meses posparto si están bien nutridas y
luego comenzarán a ciclar más regularmente. Otras no ciclarán mientras tengan su ternero al pie aun
estando bien nutridas y esto no constituye una patología sino que es una respuesta natural en los
mamíferos.
Una alternativa de manejo cuando hay varias donantes con cría, es llevar a los terneros a mamar una o
dos veces por día. Algunas razas requieren esto más que otras por lo que sus necesidades se
establecerán en función del conocimiento que se tenga de la misma. Las vacas primíparas o las vacas
viejas representan un problema particular en estos casos. En general se debería disponer de una buena
historia reproductiva de una donante antes de incluirla en un programa de TE. Muchos productores no
hablarán fácilmente de sus vacas problema y un cuidadoso cuestionario permitirá detectar tales
situaciones. Es frecuente escuchar por ejemplo "la vaca está seca porque el ternero murió de diarrea" o
"que no ha parido este año porque fue preparada para una exposición". Lo que no se dice es que la
muerte del ternero o la exposición han ocurrido dos o tres años antes y que luego de ese período la
vaca no ha quedado nuevamente gestante.
Con respecto al estado nutricional, uno de los problemas importantes en TE es paradojicamente el
inverso al que ocurre en la vaca de cría; es decir el de las vacas demasiado gordas. El propietario
deberá ser advertido que este exceso de alimentación tiene un efecto negativo sobre la reproducción, la
lactancia y la longevidad.
Indicaciones referentes a las hembras que son trasladadas al Centro de transferencia
Si bien la mayoría de estas observaciones aparecen como obvias, es siempre conveniente hacer un
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Alberio
10
repaso de las mismas para asegurarse de su cumplimiento.
- Al llegar la vaca al centro, se deberán tomar todos los datos posibles tales como día, hora, nombre
del propietario y del transportista, tipo de animal, número de caravana o tatuaje, etc. Se determinará
el estado general del animal, presencia de golpes, lastimaduras, etc. con lo que se hará un informe
firmado por el transportista.
- Se pesará la vaca y su peso será registrado.
- Se hará una revisación completa del animal ya que, si bien el tracto genital es de particular interés,
también se deberá determinar la existencia de problemas de locomoción, ojos, abscesos, etc. los que
serán informados al propietario.
- Suele ocurrir que se envían vacas preñadas por descuido o por simple desconocimiento de su
estado. No hacer abortar a estos animales sin consultar a su propietario.
- Si la vaca se encuentra con alguna infección o problema especial, se establecerá un tratamiento
adecuado para el caso previniendo nuevamente al propietario.
- Cuando las vacas van a un potrero definitivo y reciben ración, es conveniente separarlas de acuerdo
a edad, tamaño, estado (seca o lactando), presencia o ausencia de cuernos. La ración como único
alimento o como suplemento de la pastura será balanceada para permitir el mantenimiento del peso
o ligeras ganancias de acuerdo con la edad, condición corporal y estado fisiológico. Un énfasis
particular debe ser puesto en lo correspondiente a la suplementación mineral. Se debe recordar
asimismo que los animales necesitan más energía en tiempo frío y húmedo que en cálido y seco.
La presencia de parásitos debe ser controlada cuidadosamente, ya que su incidencia es mayor en
sistemas con alta concentración de animales. Aproximadamente cada 60 días se deberá realizar un
tratamiento de rutina. La revisación y cuidados de los animales deben ser exhaustivos y en general, no
se cargan en los costos de mantenimiento.
Cuánto tiempo se debe mantener la vaca en el sistema?
En general esto es una decisión del propietario y no se la debe tomar por él, a menos que la vaca ya no
produzca embriones en cantidad que justifique continuar con los tratamientos o que haya aparecido
algún problema. En principio, una vaca de alto valor genético debe permanecer el mayor tiempo posible
en un programa de TE.
En cuanto a la producción de embriones en forma permanente, el tiempo de estadía varía en la mayoría
de los casos de una vaca a otra. Habrá hembras que luego de uno o dos tratamientos disminuyen su
producción y otras que la mantienen por años. En tanto una vaca produzca terneros cuyo precio
justifique los costos, ésta debería permanecer en el sistema.
Muchos productores se preocupan sin embargo por el retorno de la vaca al servicio luego de un tiempo.
Esto es correcto si sólo es necesario un número determinado de embriones, pero se deberá tener en
cuenta que al poner la vaca en servicio se perderá como mínimo un año en la producción de embriones.
En ese año la vaca puede morir, enfermar, quedar estéril o ser superada por otra vaca. Es necesario sin
embargo remarcar que desde un punto de vista biológico no hay problemas para preñar vacas que han
estado sometidas a TE salvo que tengan un problema reproductivo específico. Lo único que puede
ocurrir es que una vaca mantenida por largos períodos en un programa de TE necesite mayor número
de inseminaciones para concebir. Esto suele ocurrir cuando hay un gran apuro en dar servicio a la vaca
luego de la última recolección. Pero si se espera 2 ó 3 meses, al primer o segundo servicio concebirá
sin problemas.
Cuando una vaca está lista para retornar a su lugar de origen, se deberá hacer un chequeo clínico
completo y se elaborará un informe para el propietario. Cualquier problema observado durante la
estadía deberá ser protocolado e informado.
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Alberio
11
Receptoras
Las receptoras forman una parte esencial del programa de TE y también uno de los problemas más
serios. Las buenas receptoras son caras, su mantenimiento costoso y su estado de salud es crítico para
el éxito de la TE.
Ya sea que el programa se lleve a cabo en el campo o en un Centro, la obtención y mantenimiento de
las receptoras condicionarán el éxito o el fracaso del mismo.
Desde el punto de vista reproductivo una buena receptora es la hembra capaz de recibir un embrión y
llevarlo a término. Más aún, la receptora deberá ser capaz de parir sin grandes dificultades y luego
alimentar al ternero de manera que le permita expresar su potencial genético. En consecuencia, deberá
ser de buen tamaño, tanto general como reproductivamente sana y de buena capacidad lechera. Esto
no parece ser tan complicado, sin embargo tanto el tamaño como la producción de leche pueden tener
significados diferentes.
El tamaño de la receptora dependerá del tipo de animal (embrión) que se transferirá. De acuerdo con
las tendencias actuales, particularmente en las razas para carne, se busca un gran tamaño de ternero
con pesos al nacimiento de 40 ó 50 kg y aún más. Por lo tanto, no se deben tener dudas de elegir
hembras de gran tamaño.
La edad de la receptora es un aspecto importante en el cual sin embargo, no hay coincidencias entre
autores. En general se difiere en el criterio sí es mejor una vaquillona que una vaca que ya ha parido
alguna vez. Una forma de tomar el problema que puede resumir las diferentes posiciones es la
siguiente: la vaquillona permite obtener tasas de preñez ligeramente superiores, sin embargo los
problemas de manejo durante la gestación, el parto y la lactancia pueden producir resultados finales
inferiores a los de las vacas. El uso de vacas multíparas, con historia reproductiva conocida, que
garantiza en cierta manera su comportamiento futuro, sumado al hecho de tener menos problemas de
parto, hacen que éste sea finalmente el animal de elección.
Se debe recordar que el genotipo del embrión transferido es diferente al que la vaca hubiese tenido en
un servicio de la propia raza. Uno de los errores más frecuentes que se cometen al hablar de las
receptoras, es relacionar su tamaño con el tamaño al nacimiento del embrión transferido. Mucha gente
cree que a mayor tamaño de la receptora, mayor tamaño de la cría y viceversa. El largo de gestación y
el peso al nacimiento son determinados genéticamente y poco afectados por el ambiente uterino de la
receptora. Su genética no juega ningún rol en el tamaño o estructura del ternero resultado de una
transferencia. Este concepto no parece tener actualmente la certeza que se le asignaba años atrás. Si
bien es cierto que la genética de la receptora no influye en la genética del embrión, el ambiente uterino
(especialmente el espacio o tamaño) parece tener una interacción con el genotipo del feto mayor que la
supuesta. Algunos trabajos con animales de laboratorio han demostrado la magnitud de esta interacción
y la misma es coincidente con observaciones empíricas provenientes de trabajos en bovinos.
El punto importante es no poner embriones que darán nacimiento a terneros de gran tamaño en vacas
que son demasiado pequeñas y en general disponer de vacas grandes que minimizan los problemas y
permiten expresar el potencial de crecimiento fetal. De acuerdo con nuestra experiencia bajo
condiciones extensivas los resultados con vacas jóvenes (primera y segunda parición) han sido
superiores a los obtenidos con vaquillonas y los problemas de parto en las primeras son casi
inexistentes.
El programa de alimentación de las receptoras es vital en el éxito final de la transferencia. La hembra
gestará y amamantará a los terneros de mayor valor del establecimiento. Criará terneros que son
mayores a los que hubiera producido y deberá proveer nutrientes en forma suficiente para que se
exprese el potencial genético del ternero. Ante estas consideraciones, la receptora preñada no debe ser
tratada como cualquier otra vaca de cría sino, al menos, como lo son las donantes.
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Uno de los puntos críticos es dónde conseguir vacas receptoras. Lo ideal es obtenerlas del propio
establecimiento con el consiguiente conocimiento de su historia reproductiva. Estas vacas serán a su
vez portadoras de inmunidad a las bacterias y virus locales y la pasarán a sus crías. Su stress será
menor al haber sido criadas en el lugar. En general las tasas de preñez que se obtienen en este tipo de
receptoras suele superar en 10 a 15% a las obtenidas en animales recientemente incorporados.
Si la situación anterior no es posible, se deberán comprar receptoras. Desde el punto de vista
reproductivo, la mejor receptora es la vaca preñada o la que tiene un ternero al pie. Sin embargo, estas
vacas cuestan más y tienen mayores problemas de manejo que una vaca seca. Otra alternativa es
comprar vacas con preñez de 90 a 120 días, hacerlas abortar y usarlas como receptoras un mes más
tarde. Si bien esta metodología se lleva a cabo sin inconvenientes, la desconfianza que este manejo
implica hace que no sea aconsejable salvo que se esté muy seguro en su aplicación.
En general se tiende a comprar vacas secas o vaquillonas, es a veces una buena opción la compra de
animales lecheros de descarte por baja producción. El manejo de los animales en estas condiciones es
mucho más simple que con las vacas con cría. La compra de vacas exige precauciones y tratamientos
particulares según los casos. Una vaca preñada o con cría "habla por sí sola" y no requiere muchas
más información. Si se compra una vaca vacía, es importante saber si tuvo o no servicio, si el mismo
fue por medio de IA o natural, cuánto duró, etc. ya que en cada caso el problema puede ser diferente.
Otro aspecto de importancia en la compra de vacas vacías, es verificar este estado ya que es frecuente
encontrar una buena proporción de ellas en condición gestante.
Una vez conseguidos los animales, éstos serán sometidos a un exhaustivo examen clínico tanto general
como ginecológico en particular. Se tomarán muestras de sangre para determinar brucelosis y cualquier
otra enfermedad endémica en la región de compra. Se procederá a la correcta identificación de cada
animal estableciéndose una ficha individual. Si tienen preñez reciente se abortarán con prostaglandina.
Se harán las vacunaciones de rutina y se desparasitarán. Deberán ser alimentadas de manera tal de
ganar 500 a 600 g/día. Se detectará celo dos veces al día y si una vaca no ha sido vista en celo en 25
días, será palpada de nuevo y se procederá de acuerdo al diagnóstico. La sincronía de celos entre
donante y receptoras puede obtenerse de formas diferentes. Si la disponibilidad de receptoras es muy
alta (feed-lot) es probable que los animales en celo en un día determinado sean suficientes para los
embriones producidos ese día. Esto no es lo más frecuente. En general se procede a utilizar diferentes
esquemas de sincronización artificial de los celos. Esto implica en primer lugar que las hembras sean
cíclicas y en segundo lugar, que alrededor de sólo un 70% responderá al tratamiento. Los tratamientos
pueden seguir la rutina clásica de doble aplicación de PGF2 con un intervalo de 11 días o alternativas
de menor costo. Ejemplo: palpar un número mayor del necesario, elegir aquellas con cuerpo lúteo e
inyectar con PGF2alfa. Esta inyección se hará el día previo a la inyección de PGF2alfa que reciben las
donantes ya que en éstas últimas, la presentación de celo es más temprana y la ovulación se puede
extender durante un período que puede superar las 12 h.
Cada receptora podrá tener tres oportunidades "buenas" de quedar gestante. Esto significa haber sido
transferida correctamente con un buen embrión. Las tasas de gestación en la primera y segunda
transferencia son similares y disminuyen en la tercera oportunidad. Luego de esto la caída es alta y no
justifica el mantenimiento de esta vaca. La tasa de abortos en las receptoras preñadas puede ser
ligeramente superior a la de vacas servidas normalmente. Por ello nunca se deberá entregar una
receptora sin verificar previamente su estado de gestación.
En síntesis, el manejo de las receptoras incluye la elección de hembras de buena calidad que sean
reproductivamente aptas, que tengan un buen nivel de alimentación y estén libres de enfermedades.
Los sistemas para conseguirlas son tan variados como oportunidades aparezcan. No olvidar que las
receptoras constituyen uno de los puntos clave de la TE exitosa y por ello deberán ser tratadas en
consecuencia.
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Programa de TE
13
PROGRAMA DE TRANSFERENCiA DE EMBRIONES
J. Cabodevila
Introducción
La transferencia embrionaria puede ser llevada a cabo en Centros de TE o directamente en el campo.
Existen opciones intermedias, por ejemplo, que las donantes se encuentren en un Centro de TE donde
se efectúa la recolección de los embriones, las receptoras en un campo cercano, donde se llevan a
cabo las transferencias.
La organización del programa de TE es diferente en cada una de estas circunstancias. En todos los
casos, comienza con la selección de las donantes y finaliza con el diagnóstico de preñez efectuado a
los 60 días post-transferencia.
En general, la selección de hembras como donantes es responsabilidad del productor y al profesional le
queda la opción de aceptarlas o no después de:
1.
2.
Efectuar una anamnesis exhaustiva considerando especialmente los antecedentes de
superovulación.
Llevar a cabo un examen clínico a donde se considere el estado corporal y el estado de los
órganos genitales (ver planilla de anamnesis y examen clínico de donantes).
Teniendo en cuenta la variabilidad que existe en la respuesta a los tratamientos de superovulación y la
importancia económica que tiene la sincronización de las receptoras en la financiación de un programa
de TE, es conveniente efectuar el mismo, con un mínimo de 3 donantes.
Para ingresar a un programa de TE, las donantes seleccionadas deben cumplir los siguientes requisitos:
- Tener un período post-parto no menor a 60 días, habiendo registrado un ciclo
previo de duración normal.
- Haber transcurrido más de 50 días de un tratamiento superovulatorio anterior.
- Es conveniente que al efectuar el tratamiento la donante no se encuentre con
cría al pie.
Para facilitar la comprensión del programa se debe considerar en primer término, la sincronización de
celos en las donantes y luego en las receptoras.
Sincronización de celos en donantes
La forma más común de sincronizar el celo en las donantes es mediante la administración de PGF2alfa o
sus análogos sintéticos. Otra forma, es prolongar la fase luteal de manera artificial mediante la
administración de progesterona o progestágenos. Cuando se inyecta PGF2alfa, puede ocurrir:
- Que todas las donantes presenten celo inducido o natural en los próximos 5 días.
- Que no todas presenten celo. En ese caso, al administrar una segunda dosis de
PGF2alfa 11 días después, todas las donantes estarán en fase luteal.
Luego de la presentación del celo natural o inducido (día 0 -cero-), el tratamiento de superovulación
puede comenzar indistintamente entre los días 8 y 12 del ciclo estral. Es decir que, la inducción puede
comenzar en el mismo momento en aquellas donantes en las que la diferencia entre sus días 0 no sea
mayor de 4 días.
En el cuadro 1 se presenta un programa de TE donde la sincronización de celos entre donantes y
receptoras se lleva a cabo con PGF2 y la inducción a la superovulación con FSH-p. La sincronización
de celos en las donantes puede efectuarse también mediante el empleo de distintos dispositivos con
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Cabodevila
14
progesterona o progestágenos (PRID®), esponjas intravaginales, implantes subcutáneos (MAPLETOFT,
1987) o directamente inyectando diariamente progesterona durante 9 días (MAPLETOFT, 1982). La
utilización de progesterona o progestágenos tiene la ventaja de poder comenzar el programa de TE en
forma inmediata independientemente que la donante se encuentre en fase luteal.
Donantes
Receptoras
Día 0 (natural o inducido)
1a dosis
PGF2α
07h 5 mg FSH-p
Día 10±2
19h 5 mg FSH-p
07h 4 mg FSH-p
Día 11±2
19h 4 mg FSH-p
2a dosis*
PGF2α
07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α
Día 12±2
19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α
07h 3 mg FSH-p
Día 13±2
19h 3 mg FSH-p +
detección de celo
Día 14±2
detección de celo e IA
Día 15±2
IA
Recolección de embriones
método no quirúrgico
Detección
de celo
Día 0 = celo
inducido
Día 7±1
TE
Cuadro 1: Programa de TE donde la sincronización de celos entre donantes y receptoras se lleva a
cabo con PGF2alfa y la inducción a la superovulación con FSH-p.
* La sincronización de celos en receptoras puede efectuarse también administrando una sola dosis de
PGF2alfa a hembras seleccionadas, mediante palpación transrectal, por poseer un cuerpo lúteo.
En el cuadro 2 se describe un programa de TE donde la sincronización de celos en las donantes se
lleva a cabo con progesterona o progestágenos. La sincronización de celos en las receptoras no sufre
variaciones con respecto a lo descrito en el cuadro 1. Durante el período de detección de celo en
donantes y receptoras, cuadros 1 y 2, es conveniente efectuar 3 detecciones diarias (mañana,
mediodía, tarde) empleando el método visual, 30 minutos en cada oportunidad.
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Programa de TE
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Día 0 Colocación del PRID, esponja intravaginal o implante subcutáneo
07h 5 mg FSH-p
Día 7
19h 5 mg FSH-p
07h 4 mg FSH-p
Día 8
19h 4 mg FSH-p
07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α retiro del PRID, esponja
o implante
Día 9
19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2α
07h 3 mg FSH-p
Día 10
19h 3 mg FSH-p +
detección de celo
Día 11
detección de celo e IA
Día 12
IA
Día 18
Recolección de embriones
método no quirúrgico
Día 0 = celo
inducido
Cuadro 2: Programa de TE donde la sincronización de celos en las donantes se lleva a cabo
con progesterona o progestágenos
Sincronización de celos en receptoras
La transferencia de embriones puede efectuarse indistintamente sobre celo natural o inducido. Hay que
tener en cuenta que para obtener buenos resultados de preñez, el celo de las receptoras deberá tener
una sincronización no mayor a las 24 h con el de la donante, ver capítulo VIII, (ROWSON y col., 1972).
La sincronización de celos con PGF2 se describió en la Tabla 1.
Cuando se efectúa la administración de una sola dosis de PGF2 a hembras seleccionadas por poseer
un CL es necesario reservar un número mayor de receptoras por donante porque el diagnóstico de CL
mediante palpación transrectal tiene una eficacia que varía entre el 71 y el 96% (FORTIN, 1989). En
general, considerando que el promedio de embriones transferibles por cada donante es alrededor de 5,
se sincronizan 8 receptoras por donante dado que algunas deben ser descartadas antes de efectuar la
transferencia por razones diversas: quistes ováricos, celos anovulatorios, imposibilidad de cateterizar la
cérvix.
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16
Cabodevila
La donante presenta celo generalmente 48 h post primera administración de la PGF2alfa. Se efectúan 2
inseminaciones, la primera a las 8-12 h del comienzo del celo y la segunda IA, 12 h después de la
primera. En cada IA, se utiliza una dosis de semen de óptima calidad. Cuando la donante no presenta
celo, la decisión a tomar dependerá de cada situación en particular. Hay que tener presente que las
donantes que sufren un desfasaje en la presentación del celo o que directamente no presentan celo
generalmente tienen una respuesta superovulatoria pobre o nula. Toda la información relacionada con
donantes y receptoras se anota en las planillas respectivas.
Luego de la transferencia, en las receptoras se controla el no retorno. A los 14 días post-transferencia
puede extraerse una muestra de sangre para efectuar un dosaje de progesterona en plasma.
Finalmente, a los 60 días post-transferencia se hace la palpación transrectal.
Manejo de la hormona
El FSH-p se diluye en solución fisiológica estéril (la relación 1 mg = 1 ml, es la más práctica) y se
conserva refrigerada o congelada. Es conveniente fraccionarla de manera tal que la totalidad de la
hormona descongelada sea utilizada en el mismo momento. Caso contrario hay que refrigerarla sin
volver a congelarla. La hormona debe ser descongelada o calentada a temperatura ambiente.
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17
PROTOCOLO DE SUPEROVULACION
DONANTE N : ..........................
RAZA: ........................................
PROCEDENCIA: ......................
EDAD: ........................................
FECHA ÚLTIMO CELO: ................
OBSERVACIONES .................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................................
SUPEROVULACION:
DROGA: ....................................
DILUCION: .......................................
ESQUEMA DE TRATAMIENTO:
..................................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................................
.....................................................................................................................................................................
FECHA DEL CELO: ......................
INSEMINACION ARTIFICIAL:
1o I.A.:
2o I.A.:
OBSERVACIONES: .......................................................................................................
...............................................................................................................................................
TACTO PREVIO:
OVARIO DERECHO
OVARIO IZQUIERDO
FOLICULOS: .............................................
CUERPOS LUTEOS: ..................................
...........................................
...........................................
RECUPERACION DE EMBRIONES: DIA: ........
HORA: ...............
OBSERVACIONES: .......................................................................................................
. ............................................................................................................................................
EVALUACION MORFOLOGICA:
EMBRIONES VIABLES:
CLASIFICACION:
...........................................
EMBRIONES ANORMALES: ...........................................
OVOCITOS SIN FERTILIZAR:...........................................
TOTAL RECUPERADO:
CELO POST-SUPEROVULACION: ....................................
...........................................
firma del profesional
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Cabodevila
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TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
PROTOCOLO DE DONANTES
Donante N :
Procedencia:
Raza:
Edad:
Peso actual:
Fecha última participación en Exposición Rural:
Comentarios:
Número de partos:
Fecha del último parto:
Tipo de parto:
Para la última gestación cuántos Servicios
Recibió?....
1.Normal, 2.Distócico,
Ha sido repetidora?:
3.Ternero Muerto
Fecha del último celo:
4.Cesárea
Fecha último servicio:
REVISACION CLINICA
Estado Corporal:
Estado de los órganos genitales en general:
Estado de los ovarios en particular:
O.D.
O.I.
Tamaño:
..............
..............
Folículos:
..............
..............
Cuerpos Lúteos:
.............
..............
Semen que se utilizará:
Prueba de enhebrado con pipeta de I.A.:
Fecha:
1. Pasa sin Dificultad
2. Pasa con Dificultad
3. No pasa
Resultado:
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19
ANTECEDENTES DE SUPEROVULACION
PRIMER TRATAMIENTO
SEGUNDO TRATAMIENTO
Fecha:
Fecha:
Hormona:
Dosis:
Hormona:
Dosis:
Total de Ovocitos y Embriones
Total Ovocitos y Embriones
Recuperados:
Recuperados:
Embriones Transferibles:
Embriones Transferibles:
Preñeces:
Preñeces:
Terneros Nacidos Vivos:
Terneros Nacidos Vivos:
Semen utilizado:
Semen utilizado:
TERCER TRATAMIENTO
CUARTO TRATAMIENTO
Fecha:
Fecha:
Hormona:
Dosis:
Hormona:
Dosis:
Total de Ovocitos y Embriones
Total de Ovocitos y Embriones
Recuperados:
Recuperados:
Embriones Transferibles:
Embriones Transferibles:
Preñeces:
Preñeces:
Terneros Nacidos Vivos:
Terneros Nacidos Vivos:
Semen utilizado:
Semen utilizado:
Bibliografía
FORTIN, M. 1989. Sincronización de celos en bovinos con prostaglandinas. Aspectos prácticos. CABIA, 15: 29-39.
MAPLETOFT, R. 1982. Superovulation and recovery of ova from the bovine. Proc. Owners. Managers Workshop
IETS, 37-50.
MAPLETOFT, R.1987. Sincronization of donor cows and recipients. XI Jornadas de Reproducción Animal del
CIAVT. Venado Tuerto, Pcia. de Santa Fe.
ROWSON, L., LAWSON, R., MOOR, R., BAKER, A. 1972. Egg transfer in the cow: Synchronization requirements.
J. Reprod. Fert. 28: 427-431.
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Rivera
20
REGULACION NEUROENDOCRINA DE LA FUNCION OVARICA
G. Rivera
Introducción. Control de la secreción de gonadotrofinas
La secreción de gonadotrofinas hipofisarias (LH y FSH), es el principal factor que regula la función
ovárica. Neuronas hipotalámicas especializadas (decapeptidérgicas), producen y secretan la hormona
liberadora de gonadotrofinas (GnRH), que controla la función hipofisaria. A su vez, otros sistemas de
neuronas (catecolaminérgicas y opioidérgicas) integran la información del medio externo (luz,
temperatura, olores, interacciones sociales) e interno (concentración de esteroides), y convergen sobre
la neurona decapeptidérgica para regular su función (KALRA y KALRA, 1984). La GnRH es secretada
en forma de pulsos discretos (CLARKE, 1988), que -vía sistema porta-hipofisario- alcanzan la
adenohipófisis. Los pulsos de GnRH determinan la secreción típica de pulsos de LH/FSH.
Los esteroides ováricos afectan la secreción de LH/FSH a través de un mecanismo de retroacción
negativa (GOODMAN y KARSCH, 1980; CLARKE, 1988; PRICE y WEBB, 1988). La progesterona (P4)
inhibe la liberación de LH, que es secretada en pulsos característicos de baja frecuencia (1 c/6-8 h) y
gran amplitud durante la fase luteal (RAHE, 1980). Cuando se produce la luteólisis, la concentración de
P4 en sangre disminuye y aumenta la frecuencia de los pulsos de LH. Estos, estimulan la producción de
andrógenos tecales, que son convertidos a E2 en las células granulosas. El E2 estimula la secreción de
pulsos de LH de alta frecuencia, pero de baja amplitud (GOODMAN y KARSCH, 1980; KARSCH, 1987).
En el control de la secreción de FSH interviene, además de E2, la inhibina que es un péptido de origen
ovárico (FINDLAY y CLARKE, 1987).
Regulación endocrina de la función ovárica
El ciclo estral (CE) de la vaca tiene una extensión media de 21 días. El celo dura aproximadamente 18 h
y la ovulación tiene lugar 15 h después de la finalización del mismo. El CL se desarrolla y la secreción
de P4 aumenta entre el 4 y 12 día del ciclo y permanece constante hasta la luteólisis. La regresión del
CL es variable y ocurre entre el 15 -20 día del CE (HANSEL y ECHTERNKAMP, 1972; LUQUE y col.,
1983).
Con el objeto de hacer un análisis detallado de las interacciones endocrinas durante el CE, es
conveniente dividirlo en 3 etapas (HANSEL y CONVEY, 1983):
- fase folicular o de regresión luteal
- fase periovulatoria
- fase luteal
Fase folicular o de regresión luteal
Las concentraciones de P4 en sangre, decaen abruptamente a niveles 1 ng/ml entre las 24-36 h de
iniciada la luteólisis, ya sea en forma natural (DIELEMAN y col., 1986) o inducida por PGF2 (SCHAMS,
1987). La caída de las concentraciones de P4 por debajo de un determinado nivel "umbral", en presencia de concentraciones bajas de E2, elimina la retroacción negativa sobre la secreción de
gonadotrofinas. Consecuentemente, aumenta la frecuencia de la descarga de LH y, en menor grado, la
de FSH (SCHAMS, 1987). En esta fase, la hipófisis secreta aproximadamente 1 pulso de LH/FSH cada
60 min. El incremento en la frecuencia de pulsos de LH/FSH estimula el desarrollo de un folículo
grande, que secreta cantidades crecientes de E2. El E2 se secreta en forma de pulsos, que son
detectados en la vena cava (SCHAMS, 1987), concomitantes o inmediatamente después de los pulsos
de LH. El grado de desarrollo folicular al momento de la luteólisis determina el tiempo que transcurre
hasta que un folículo completa su crecimiento y es capaz de producir cantidades suficientes de E2 como
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Regulación neuroendócrina
21
para iniciar el celo y la onda preovulatoria de LH (IRELAND y ROCHE, 1987). DIELEMAN y col. (1986)
determinaron que un folículo con un diámetro <8 mm alcanza un tamaño preovulatorio (20 mm) durante
los 2,5 días previos a la onda de LH.
Fase periovulatoria
Durante este período se producen importantes fenómenos: inicio del celo, onda preovulatoria de
gonadotrofinas y ovulación. El intervalo entre el inicio de la luteólisis y el comienzo del celo es de 58-60
h aproximadamente (DIELEMAN y col., 1986). Los niveles de E2 aumentan desde la regresión luteal
hasta alcanzar un plateau el día previo al inicio del celo. Dicha elevación del E2 provoca el comportamiento propio del celo (HURNIK, 1987) y desencadena la onda preovulatoria de LH. Esta, tiene una
duración de 6-10h, se inicia junto con el celo y alcanza su valor máximo (pico) 4-5 h más tarde (RAHE y
col., 1980; DIELEMAN y col., 1986). Mediante la toma de muestras de sangre c/5 min se determinó que
el intervalo entre pulsos de LH/FSH previo a la onda gonadotrófica es de 38-40 min (WALTERS, 1984).
Durante la onda preovulatoria, tanto la descarga de LH (RAHE y col., 1980; WALTERS y
SCHALEMBERGER, 1984), como la de FSH siguen un patrón pulsátil (WALTERS y
SCHALEMBERGER, 1984).
El E2 actúa mediante los siguientes mecanismos para desencadenar la secreción preovulatoria de LH:
* Aumenta la sensibilidad hipofisaria al estímulo de la GnRH (KESNER y col., 1981).
* Aumenta el número de receptores para GnRH en las células hipofisarias (SCHOENEMANN y col.,
1985).
* Estimula la síntesis de gonadotrofinas, dado el incremento que se observa en el contenido de ARNm
para estas hormonas previo y durante la onda de LH (LANDEFELD, 1985).
* Aumenta el efecto "preparador" (self-primming effect) de la GnRH (KESNER y col., 1981;
PADMANABHAN y col., 1981), esto es, el proceso mediante el cual la GnRH incrementa la respuesta
hipofisaria a exposiciones sucesivas de esta hormona.
* Establece un mecanismo a nivel hipotalámico que culmina en la liberación de una onda de GnRH,
que a su vez induce la onda de gonadotrofinas (HANSEL y CONVEY, 1983). Las observaciones de
WALTERS y SCHALEMBERGER (1984) determinaron que las concentraciones de E2 disminuyen al
menos durante los 60 min previos al comienzo de la onda de LH y aumentan con su iniciación. Los
mismos autores propusieron que esta disminución en los niveles de E2 es la señal que dispara la
onda de LH, al remover su efecto inhibitorio sobre el hipotálamo.
Después de la onda preovulatoria, no se detectan pulsos de LH durante 6-12h (WALTERS y
SCHALEMBERGER, 1984), lo que refleja el agotamiento del contenido pituitario de esta hormona. Sin
embargo, la secreción de FSH continúa y se produce un segundo pico de la misma (HANSEL y
CONVEY, 1983; IRELAND y ROCHE, 1987; WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984), que parece
deberse a la remoción del feed-back negativo de la inhibina al destruirse su fuente de producción
(folículo) al momento de la ovulación.
Fase luteal
El CL se desarrolla completamente durante la primera semana post-ovulación y la concentración de P4
en plasma aumenta hasta alcanzar un pico al dia 10 del ciclo (HANSEL y col., 1973). Un segundo pico
de E2 se produce en este momento, cuyo origen es la presencia de folículos estrógeno activos en el
ovario (IRELAND y ROCHE, 1987). La secreción de LH continúa en forma de pulsos, que son menos
frecuentes a medida que avanza la fase luteal (WALTERS y col., 1984). Las concentraciones elevadas
de P4 determinan una pulsatilidad de LH de baja frecuencia y gran amplitud (RAHE y col., 1980).
Durante la fase luteal media la frecuencia de secreción de pulsos de FSH es mayor que la de LH
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Rivera
(WALTERS y col., 1984) y aquellos son seguidos por pulsos de P4. Esto indicaría que la FSH también
es un importante estímulo para la secreción de P4 en la vaca y que los esteroides ováricos modulan la
secreción de FSH en menor extensión que la de LH.
Función del cuerpo lúteo
El cuerpo lúteo ocupa una posición central en el proceso reproductivo de los mamíferos. La P4 es el
producto de secreción endocrino primario, aunque el CL secreta prostaglandinas (PG), una variedad de
hormonas peptídicas y proteicas (relaxina, oxitocina, vasopresina) y en algunas especies estradiol
(NISWENDER y NETT, 1988; SCHAMS y col., 1987). La P4 prepara el endometrio para la implantación
y mantiene la gestación. Si no hay fecundación la función luteal declina y se reanuda el ciclo ovulatorio,
lo que indica que una segunda función del CL es bloquear la ovulación.
El CL está formado por dos tipos de células esteroidogénicas; las células luteales grandes y las
pequeñas. Las primeras derivan de las células de la granulosa y las segundas de las células tecales
(HANSEL y DOWD, 1986; AULETTA y FLINT, 1988). No obstante se observa una población de células
grandes que derivarían de células pequeñas de origen tecal, dado que unen anticuerpos monoclonales
dirigidos contra antígenos tecales (ALILA y HANSEL, 1986).
Las características principales de cada tipo celular pueden resumirse como sigue (SMITH, 1986;
AULETTA y FLINT, 1988; NISWENDER y NETT, 1988): si bien ambos tipos celulares producen P4 in
vitro, las células pequeñas son más sensibles a la LH, poseen mayor cantidad de receptores para esta
hormona y la respuesta es mediada por el sistema AMPc-adenilato ciclasa. Las células luteales grandes
poseen menos receptores para LH (la mayor parte de los receptores son para PGF2 y E2) y producen
oxitocina (OT). A diferencia de las células luteales pequeñas, en éstas la producción de P4 sería
controlada (al menos parcialmente) por el sistema Ca++ - fosfatidil inositol quinasa C.
La regulación de la función luteal es un proceso complejo. En ella intervienen factores tróficos y líticos
que estan presentes en forma concurrente durante todo el ciclo estral y por lo tanto la estimulación o la
inhibición de la síntesis y secreción de P4 depende del balance entre estos factores.
Factores luteotróficos
Numerosos estudios in vivo e in vitro han demostrado que la LH es el factor luteotrófico más importante
en la vaca (HANSEL y CONVEY, 1983; SMITH, 1986; NISWENDER y NETT, 1988). La administración
de LH in vivo prolonga la vida del CL (DONALDSON y HANSEL, 1965; HANSEL, 1967) e in vitro
estimula la secreción de P4 (HANSEL; 1967), mientras que el suero anti-LH provoca luteólisis in vivo
(HOFFMAN y col., 1974).
En un estudio detallado de la fase luteal (WALTERS y col., 1984), se observó secreción de pulsos
adicionales de FSH (en relación a los de LH) que fueron seguidos por pulsos de P4. Por otra parte, se
ha descrito la presencia de receptores para FSH en el CL bovino (MANSS y col., 1984). En conjunto
estas observaciones demuestran que tanto la LH como la FSH ejercen una importante acción
luteotrófica en la vaca. A diferencia de los animales de laboratorio, la prolactina no tiene acción
luteotrófica en la especie bovina (HOFFMAN y col., 1974).
Algunos compuestos derivados del metabolismo del ácido araquidónico (AA) también tienen acción
trófica sobre el CL (HANSEL y DOWD, 1986). La metabolización del AA (MILVAE, 1986) produce -vía
cicloxigenasa- 3 compuestos principales: PGI2 (prostaciclina), PGF2 y tromboxano A2. A través de la vía
lipoxigenasa se generan diversos metabolitos, siendo los más importantes los leucotrienos y las
lipoxinas.
La PGI2 estimula la síntesis de P4 in vivo e in vitro (MILVAE y HANSEL, 1980b). El contenido y la
biosíntesis de PGI2 en el tejido luteal es mayor en los estadios tempranos del CE (MILVAE y HANSEL,
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1983). Además, la relación PGI2/PGF2alfa como la producción de P4 disminuyen con el envejecimiento
del cuerpo lúteo (MILVAE y HANSEL, 1983). La administración de indometacina, un inhibidor de la vía
cicloxigenasa entre los días 4-6 del ciclo estral, reduce la secreción de P4 y la vida del CL (MILVAE y
HANSEL, 1985). La información precedente demuestra que la prostaciclina es un importante regulador
de la función luteal. En forma directa, actuaría sobre las células luteales estimulando la producción de
P4 a través de un aumento intracelular en los niveles de AMPc (HANSEL y DOWD, 1986) indirectamente mediante su acción angiogénica y aumentando el flujo sanguíneo hacia el ovario (SMITH, 1986).
Factores luteolíticos
Aún no se conocen exactamente los mecanismos que provocan la luteólisis ni cuál es la señal que la
inicia. La regresión luteal es consecuencia de una compleja interacción entre receptores y hormonas,
donde intervienen por lo menos la PGF2alfa, la oxitocina y el E2 (AULETTA y FLINT, 1988).
La PGF2alfa parece ser el factor uterino endógeno que inicia la luteólisis en los rumiantes (INSKEEP y
MURDOCH, 1980; NISWENDER y NETT, 1988). El tratamiento de animales intactos con inhibidores de
la síntesis de prostaglandinas tales como la indometacina (TROXEL y KESLER, 1984) o la inmunización
pasiva contra PGF2 (FAIRCLOUGH y col., 1981; COPELIN y col., 1989) bloquea la luteólisis
espontánea en la vaca. ARMSTRONG y HANSEL (1959) observaron que la administración de oxitocina
entre los 2-6 d del ciclo estral provocó luteólisis y retorno al celo en vacas intactas pero no en animales
histerectomizados. En aquéllas con histerectomía unilateral la oxitocina indujo luteólisis sólo cuando el
cuerno uterino remanente era ipsilateral al ovario con CL (GINTHER y col., 1967), lo que sustenta la
hipótesis de un mecanismo de transferencia útero-ovárico local. No obstante, no hay evidencias
concluyentes sobre la presencia de tal mecanismo en la vaca. Si bien la administración de OT durante
la fase luteal temprana indujo un aumento en las concentraciones de PGF2 en la vena uterina y una
declinación en las de P4 en yugular, los niveles de PGF2alfa en la arteria ovárica permanecieron bajos y
fueron semejantes a los observados en circulación periférica (MILVAE y HANSEL, 1980a).
La luteólisis en la vaca es consecuencia de una interacción entre la secreción de OT luteal y la de
PGF2alfa endometrial (AULETTA y FLINT, 1988). La OT luteal es producida por las células luteales
grandes en el bovino (SCHALLEMBERGER y col., 1984; O'SHEA, 1987). La tasa de síntesis es mayor
en la fase luteal temprana y luego se almacena, de tal forma que el contenido de OT en el tejido luteal
aumenta en la fase luteal media-tardía. Al iniciarse la luteólisis la secreción de OT se incrementa en
forma paralela a los niveles de PGF2 (SCHAMS, 1987; PETER y col.1989).
La PGF2alfa estimula la secreción de OT luteal (SCHAMS, 1987) y ésta a su vez, induce la secreción de
PGF2alfa endometrial (MILVAE y HANSEL, 1980a). Este mecanismo de feed-back positivo es
responsable de la regresión del CL (AULETTE y FLINT, 1988). La sensibilidad del mecanismo
mencionado está condicionada por el medio esteroidal endógeno. En vacas ovariectomizadas el E2
estimula y la P4 deprime la secreción de PGF2 inducida por OT (LAFRANCE y GOFF, 1988). En
vaquillonas, las concentraciones de P4 no caen por debajo de 1 ng/ml hasta 32 h posteriores a la
aplicación de PGF2 durante la fase luteal media, mientras que durante la fase luteal temprana o tardía
la declinación se produce dentro de las 24 h (BERARDINELLI y ADAIR, 1989). SILVIA y TAYLOR
(1989), observaron una relación positiva entre la magnitud de la respuesta a OT y la tasa de E2/P4 en la
fase luteal temprana y tardía, pero no en la fase luteal media.
Aparentemente la variación en la respuesta a la OT está relacionada con la fluctuación en la cantidad de
sus receptores endometriales a lo largo del CE. Los receptores para OT alcanzan una concentración
máxima durante el celo, disminuyen a niveles casi indetectables durante la fase luteal media y aumentan nuevamente entre los días 18-19 del CE (SCHAMS y col., 1987). En ovejas el E2 induce la
formación de receptores para OT (Mc CRAKEN, 1984). Durante la fase luteal la P4 bloquea la
acumulación nuclear de receptores de E2 y en consecuencia, la capacidad de E2 para mantener la
síntesis de receptores para OT. Cuando la acción de la P4 sobre el útero comienza a disminuir (fase
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luteal tardía), el E2 estimula la síntesis de receptores para oxitocina. Las concentraciones basales de
ésta interactúan con sus receptores uterinos, lo que amplifica la liberación endometrial de PGF2alfa y
desencadena la luteólisis (Mc CRAKEN, 1984; SCHALEMBERGER y col., 1984; SCHAMS y col., 1987).
La PGF2alfa ejercería sus efectos luteolíticos a través de los siguientes mecanismos (AULETTA y FLINT,
1988; NISWENDER y NETT, 1988): disminución rápida del flujo sanguíneo luteal, desacople del
complejo receptor LH-adenilato ciclasa, y acción citotóxica sobre las células luteales. Numerosos
experimentos demuestran que el E2 es un potente factor luteolítico en la vaca (HANSEL y col., 1973). El
E2 administrado en forma sistémica durante la fase luteal media provoca luteólisis (ELEY y col., 1979) y
la destrucción folicular mediante irradiación X prolonga la función luteal (VILLA-GODOY y col., 1981). La
secreción de PGF2 aumenta en respuesta al suministro de E2 en forma local o sistémica (TATCHER y
col., 1984), lo que demuestra una interacción entre estas hormonas durante la luteólisis en rumiantes.
En relación a la luteólisis inducida por PGF2alfa intervienen dos factores principales en la variabilidad
asociada a la sincronización de celos: el estadio del ciclo estral al momento de la aplicación y la dosis
utilizada. BERARDINELLI y ADAIR (1989), demostraron la existencia de una interacción entre ambos
factores que puede sintetizarse así: con dosis bajas se observa una proporción creciente de vacas en
celo a medida que el estadio del CE avanza (envejecimiento del cuerpo lúteo), mientras que con dosis
altas la proporción de vacas en celo es mayor, aún en los estadios iniciales del ciclo y máxima en la
fase luteal tardía. La confluencia de los factores mencionados explicaría la variación observada en las
respuestas a los tratamientos de sincronización de celos con agentes luteolíticos.
Crecimiento y desarrollo folicular
Aspectos morfológicos
La gametogénesis en la hembra incluye dos procesos: ovogénesis y foliculogénesis. Durante la vida
fetal (50-130 d de gestación), se produce la multiplicación (mitosis) de las ovogonias. Aproximadamente
a los 80 días de la gestación los ovocitos inician la meiosis, deteniéndose el desarrollo (arresto meiótico)
en el estadio de dictiotene de la profase I (WASSARMAN, 1988). La meiosis se reanudará sólo en
algunos ovocitos, después de una onda preovulatoria de LH en cada CE (animal adulto).
La función primaria del folículo ovárico en mamíferos es la liberación de un ovocito apto para ser
fertilizado. La foliculogénesis puede ser definida como la formación de folículos maduros,
preovulatorios (de De GRAAF), a partir de una reserva de folículos primordiales (SPICER y
ECHTERNKAMP, 1986). La foliculogénesis comienza en la vida fetal con la formación de los folículos
primordiales. Este proceso consiste en: crecimiento del ovocito, diferenciación de una capa de células
granulosas (planas) y de una capa celular (teca interna) por fuera de la membrana basal (GREENWALD
y TERRANOVA, 1988). Se constituye así una reserva de folículos cuyo crecimiento se encuentra
detenido (nongrowing pool).
Los folículos primordiales entran a la reserva de folículos en crecimiento (preantrales y antrales) por
medio de un estímulo no identificado aún, que parece ser independiente de la presencia de las
gonadotrofinas (SCHAMS, 1987). Después de la reanudación del desarrollo, se forman los folículos
primarios, que se caracterizan por poseer una capa de células granulosas cuboidales y un mayor
desarrollo de la teca interna. Cuando el folículo presenta dos o más capas de células granulosas
cuboidales se denomina folículo secundario. Ambos, primario y secundario, son folículos preantrales.
El número relativamente constante de folículos preantrales presentes en el ovario a través del CE, se ha
descripto frecuentemente, como una evidencia de la independencia de su crecimiento en relación al
nivel de gonadotrofinas. No obstante, diversos estudios (GREENWALD y TERRANOVA, 1988)
demostraron que el número de folículos preantrales disminuye significativamente luego de la
hipofisectomía en varias especies (rata, hamster, oveja), lo que indica que el desarrollo folicular aún
desde sus estadios iniciales es influenciado por las gonadotrofinas.
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El paso siguiente en la foliculogénesis es la formación del antro, por medio de la coalescencia de
pequeñas gotas de fluido folicular (FF) secretadas por las células granulosas. El número de folículos
antrales o terciarios depende del nivel de gonadotrofinas. Un porcentaje inferior al 1% de los folículos
desarrollará hasta la fase preovulatoria, mientras que el resto sufrirá un proceso de regresión o atresia.
La atresia puede comenzar en cualquier estadio del desarrollo y se caracteriza por: picnosis y
fragmentación de las células granulosas, invasión leucocitaria, pérdida de contacto intercelular, aumento
de la permeabilidad de la membrana basal, hipertrofia de las células tecales y disminución de la
secreción de E2 (RYAN, 1981; GREENWALD y TERRANOVA, 1988).
Dinámica folicular. Su importancia
La producción económica del número máximo de embriones de excelente calidad es uno de los
objetivos clave para el éxito de los programas de transferencia embrionaria a nivel comercial. Esto tiene
una estrecha relación con la comprensión de los mecanismos que controlan el crecimiento y la maduración del folículo y del ovocito. Los procesos recurrentes de crecimiento folicular y ovulación, son
regulados por complejas interacciones entre hormonas, factores de crecimiento y sistemas de
comunicación intercelular. La amplia variabilidad observada en respuesta a los tratamientos
superovulatorios responde entre otros, a factores inherentes al animal (MAPLETOFT y MURPHY,
1987). Uno de ellos es el estadio del ciclo o "status" ovárico al momento de iniciarse el tratamiento. A
continuación se analiza la dinámica del crecimiento folicular a lo largo del ciclo estral.
Desarrollo folicular durante el ciclo estral
GOODMAN y HODGEN (1983), sugirieron el uso de los siguientes términos para describir la
folículogénesis:
* Reclutamiento: Etapa en la que un grupo o "cohorte" de folículos adquiere la capacidad de
responder a las gonadotrofinas y necesita de ellas para seguir creciendo.
* Selección: Proceso por el cual sólo "unos pocos" folículos reclutados escapan a la atresia y
continúan su desarrollo.
* Dominancia: Es el conjunto de mecanismos por los que un folículo alcanza un tamaño
marcadamente superior a los demás, es responsable de la mayor parte de la secreción de E2, puede
detener el crecimiento de otros folículos y/o adquiere la capacidad de continuar su desarrollo en un
medio hormonal adverso para el resto de los folículos.
Existe una amplia variación entre animales en cuanto a la distribución de los folículos antrales a lo largo
del ciclo estral. No obstante, mediante el examen histológico se ha observado la presencia de un
folículo único (>10mm de diámetro) por par de ovarios, en la mayoría de los días de un ciclo. Este
folículo posee varios mm de diámetro más que el que le sucede en tamaño. Usualmente lo acompañan
en la superficie ovárica, 2 a 4 folículos de 4-8mm de diámetro y 20-40 folículos de 1-3mm (IRELAND,
1987).
RAJAKOSKI (1960), fue el primero en sugerir la existencia de "dos ondas" de crecimiento folicular
durante el CE bovino. La primera, entre los días 3 y 12 del CE, culmina con el desarrollo de un folículo
de tamaño ovulatorio que generalmente sufrirá atresia. La segunda, desde la mitad del ciclo en adelante, termina con el desarrollo del folículo ovulatorio. No obstante, la evaluación estadística de los datos
que sustentan esta hipótesis ha sido cuestionada por SPICER y ECHTERNKAMP (1986), quienes
propusieron un modelo de desarrollo continuo en el que la tasa de entrada de folículos al crecimiento, la
tasa de crecimiento y la tasa de atresia se aceleran a medida que se acerca el momento de la
ovulación. Algunos estudios (DUFOUR, y col., 1972; MATTON y col., 1981) han determinado el
recambio (turnover) folicular durante el CE in vivo, mediante la inyección de tinta India en el estroma
que rodea a los 2 ó 4 folículos más grandes presentes en el ovario (mediante laparotomía). El folículo
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más grande marcado dentro de los 3 días que preceden al celo ovuló en 8/8 vaquillonas (DUFOUR, y
col., 1972). Cuando la marcación fue previa, algún otro folículo ovuló, lo que indica que el folículo
ovulatorio puede ser identificado confiablemente sólo dentro de los 3 días previos al celo. MATTON y
col. (1981), determinaron que uno de los 2 folículos más grandes por par de ovarios presentes al día 3
del CE, persistió hasta el día 13 y desapareció hacia el día 18. De los 10 folículos más grandes marcados el día 13, sólo uno permaneció como el 2 folículo de tamaño ovulatorio del CE. Estos datos refuerzan la hipótesis de las 2 ondas de crecimiento folicular propuesta por RAJAKOSKI (1960). Mediante las
técnicas mencionadas (histología, marcación in vivo), la mayoría de las observaciones son sólo
puntuales (en el tiempo y en el animal), lo que dificulta la obtención de un cuadro exacto de la dinámica
del crecimiento y regresión folicular en el ciclo estral.
Con el advenimiento de la tecnología del ultrasonido (ecografía), y con ella la posibilidad de realizar un
monitoreo diario sobre el mismo animal, se observó la presencia de 2-3 folículos dominantes durante el
ciclo estral (PIERSON y GINTER, 1988; SAVIO y col., 1988). El primer folículo dominante, fue detectado
en promedio en el dia 4 del ciclo estral y alcanzó un diámetro máximo (13-16mm) hacia el día 6-7.
Luego sobrellevó un período de estabilidad relativa entre los días 6-10, y comenzó a involucionar hasta
no ser detectable hacia el día 15 del CE. Los folículos medianos "no dominantes" de la 1 onda cesaron
su crecimiento cuando se desarrolló el FD. El segundo folículo dominante fue detectado hacia el día 10
cuando fue ovulatorio (KNOPF y col., 1989) ó 12 cuando no lo fue (SAVIO y col., 1988). En este caso
regresó y no pudo ser identificado hacia el día 19 del ciclo. El tercer folículo dominante (ovulatorio) fue
identificado en promedio el día 16, y alcanzó su tamaño máximo el día 21. El segundo folículo
dominante ovuló en los ciclos de duración más corta (GINTER y col., 1989), lo que sugiere que el
momento en que se produce la regresión del cuerpo lúteo, determina la presencia de 2 ó 3 FD durante
el CE.
SAVIO y col. (1988), observaron que la tasa de crecimiento fue mayor para el primero y tercero de los
folículos dominantes, lo que implicaría que durante la fase luteal media la velocidad de crecimiento
disminuye probablemente debido al feed-back negativo de P4 sobre las gonadotrofinas. Este momento
quizás sea el de mayor dificultad para estimular el crecimiento folicular, lo que tendría implicancias en
las respuestas a los tratamientos superovulatorios iniciados en dicho período.
Secreción de E2 durante el ciclo estral
Los cambios en la concentración de E2 en cada vena ovárica durante un CE, constituyen el mejor
marcador endocrino para describir los procesos de selección y dominancia (IRELAND y ROCHE, 1982).
En las especies mono-ovulatorias, la producción de E2 simétrica es indicativa del proceso de selección,
mientras que la secreción asimétrica de E2 lo es de la fase de dominancia. Algunas evidencias indican
que un folículo único es responsable de la mayor parte del E2 secretado durante el CE. Un folículo
estrógeno-activo, que posee varios mm más de diámetro que el que le sigue en tamaño, está presente
durante el estro, otro durante la fase luteal temprana y otro en la fase luteal media (31). Estos folículos
tienen concentraciones de E2 más altas que las de P4 y andrógenos (E2/P4+A) en el FF. En cambio, los
folículos 6 mm de diámetro que acompañan a los anteriores, son estrógeno-inactivos (atrésicos)
puesto que las concentraciones de P4+A son mayores que las de E2 en su fluido folicular. Los folículos
más grandes secretaron 500-1000 veces más de E2 que los pequeños cuando fueron removidos e
incubados in vitro (STAIGMILLER y ENGLAND, 1982).
A lo largo del ciclo estral se producen 3 picos de E2, tanto en circulación periférica como en venas
ováricas, que son coincidentes con los períodos de dominancia folicular (IRELAND y ROCHE, 1987).
Modelo para la foliculogénesis durante el ciclo estral (IRELAND y ROCHE, 1982; IRELAND, 1987)
Durante el CE se suceden períodos recurrentes de crecimiento y atresia folicular (turnover)
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independientemente de la presencia o ausencia de progesterona. La FSH desempeña un papel
fundamental en el proceso de reclutamiento folicular, en tanto que niveles basales de esta hormona son
suficientes para permitir el crecimiento de una "cohorte" de folículos de 4-8 mm y luego el desarrollo de
un folículo dominante. Este, suprime el crecimiento de los otros folículos medianos y grandes que lo
acompañan (atresia). Los folículos dominantes que desarrollan en presencia de un CL activo (primero
en ciclos c/2 folículos dominantes y segundo en ciclos c/3 FD) también sufrirán atresia, debido a la
ausencia de un patrón pulsátil apropiado de LH capaz de estimular la síntesis de andrógenos y en
consecuencia de estrógenos, suficientes como para desencadenar una onda de LH. El FD (no atrésico)
presente al momento de la luteólisis, recibirá una frecuencia de pulsos de LH adecuada (1 c/40-60 min)
que estimulará su maduración final, la secreción de E2, la descarga preovulatoria de LH y la ovulación.
Las etapas de selección y dominancia constituyen un proceso que involucra 3 componentes:
* Capacidad de respuesta del folículo preantral a las gonadotrofinas: determinado por el número de
células granulosas y/o tecales o bien por la cantidad de receptores para gonadotrofinas.
* Síntesis y secreción de factores inhibitorios por el folículo dominante: se ha demostrado que el
folículo produce factores hormonales y no hormonales que pueden controlar la selección modulando
la respuesta a las gonadotrofinas. Así, el folículo dominante inhibe el desarrollo de los otros folículos
que lo acompañan, pero no su propio desarrollo. Uno de los factores implicados es la PRF (proteína
regulatoria folicular), que bloquea la actividad aromatasa de las células granulosas in vitro. En la fase
de dominancia, el folículo secreta cantidades elevadas de proteína regulatoria, que inhibiría la
síntesis de E2 en los folículos no dominantes y provocaría su atresia.
* Establecimiento de un sistema feed-back entre el folículo dominante y la hipófisis: el FD posee en el
fluido folicular concentraciones de inhibina y E2 marcadamente superiores a las de otros folículos. Un
sistema de feed-back negativo largo clásico se establece entre el folículo dominante y la hipófisis a
través del cual disminuyen los niveles periféricos de FSH, lo que bloquea el reclutamiento de nuevos
folículos.
Mecanismos de acción de las gonadotrofinas
Los mecanismos de acción de las gonadotrofinas sobre las células granulosas y tecales han sido
revisados ampliamente (RICHARDS, 1980; IRELAND y ROCHE, 1982; NISWENDER y NETT, 1988).
Las células granulosas de los folículos preantrales poseen receptores p/FSH, mientras que los receptores p/LH sólo aparecen cuando se forma el antro. En cambio, las células tecales poseen receptores
p/LH desde el estadio preantral, pero nunca desarrollan receptores p/FSH. Durante la foliculogénesis, la
FSH induce la síntesis de sus propios receptores y luego los de LH en las células granulosas.
La teoría denominada "dos células, dos gonadotrofinas" (ERICKSON y col., 1985), es la que mejor
explica la biosíntesis de esteroides en el ovario. Las gonadotrofinas se unen a sus sitios receptores y
activan el sistema de respuesta adenilato ciclasa-AMPc. La adenilato ciclasa posee una subunidad
regulatoria (prot G) que es activada por nucleótidos de guanina. Posee además, una subunidad
catalítica que metaboliza ATP a AMPc cuando está unida a la prot G. Como resultado del incremento en
los niveles intracelulares de AMPc, se produce la activación de las proteín-quinasas que estimulan la
fosforilación de enzimas esteroidogénicas y en consecuencia, la síntesis de esteroides.
Durante la foliculogénesis las células de la teca responden a LH, principalmente mediante la activación
de la enzima que cliva la cadena lateral del colesterol (SCC) y las enzimas que intervienen en la
biosíntesis de andrógenos. Los andrógenos tecales atraviesan la membrana basal y son convertidos a
estrógenos (sistema aromatasa) en las células granulosas. El desarrollo de un sistema aromatasa
activo, regulado por la FSH, constituye un paso clave para la iniciación de la dominancia folicular. El E2
es un potente amplificador de los efectos de la FSH, aunque otros factores (esteroideos y proteicos)
modulan la acción de las gonadotrofinas. La acción de la LH sobre las células luteales involucra además
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del clásico sistema adenilato ciclasa-AMPc, un mecanismo donde interviene el metabolismo de fosfolípidos tales como el fosfatidil-inositol (HANSELy DOWD, 1986; SMITH, 1986; NISWENDER y NETT,
1988). Después de la unión de la hormona con su receptor, una enzima cliva el fosfatidil-inositol 4-5
difosfato en diacilglicerol (DG) y trifosfato de inositol (IP3). El IP3 libera Ca++ intracelular, mientras que el
DG activa una proteín-quinasa Ca++ dependiente (quinasa C) que desencadena una respuesta celular.
Luego de una serie de conversiones el IP3 y el DG se combinan para resintetizar el fosfatidil-inositol 4-5
difosfato. Este mecanismo parece tener mayor importancia en las células luteales grandes.
Otros mecanismos de regulación
Además del control endocrino, existen mecanismos de regulación paracrina y autocrina de la función
ovarica (HAMMOND y col., 1988). El sistema endocrino clásico involucra a diversas glándulas
endócrinas que secretan sus hormonas a la circulación (sanguínea o linfática) a través de la que son
transportadas hasta sus órganos blanco. Los mecanismos de regulación parácrina implican la difusión
local de factores de crecimiento o regulación a las células efectoras. Esta forma de comunicación
intercelular tiene gran importancia durante el desarrollo embrionario, previo al establecimiento del
sistema circulatorio. La regulación autócrina es un proceso a través del cual una célula secreta una
hormona, factor de crecimiento o regulación, para el cual posee receptores funcionales.
Diversas sustancias han sido caracterizadas como hormonas intraováricas (factores de regulación
paracrina y autocrina), bajo los siguientes criterios (TSAFRIRI, 1988):
a) ser encontrada en ovario sin existir evidencias de un origen extraovárico; y
b) demostración de su efecto biológico en el ovario in situ, in vitro o en preparaciones de células
ováricas in vitro.
En el FF tanto como en extractos ováricos se han aislado numerosos moduladores de la ovogénesis y
de la foliculogénesis (IRELAND y ROCHE, 1982; TSAFRIRI, 1988), entre los más importantes se
encuentran: inhibidor de la maduración ovocitaria (OMI); factores de crecimiento y mitogénicos: factor
de crecimiento epidermal (EGF); factor de crecimiento fibroblástico (FGF); factor de crecimiento de
origen plaquetario (PDGF); factores de crecimiento semejantes a insulina (IGF-I/II), proteína regulatoria
folicular (FRP), factores angiogénicos, péptidos semejantes a GnRH, etc. Para muchas de estas
sustancias se han determinado receptores en las células ováricas. Por ejemplo para el IGF-I, que
estimula la mitosis de las células granulosas y la esteroidogénesis in vitro (HAMMOND y col., 1988).
ECHTERNKAMP y col. (1990), demostraron que las vacas genéticamente seleccionadas por producción
de mellizos dicigóticos, poseen concentraciones de IGF-I en suero y en el fluido folicular más altas que
las no seleccionadas. El IGF-I participa en la regulación de la foliculogénesis y es aparentemente
mediador de un componente genético responsable de las ovulaciones múltiples en la vaca.
Conclusiones
El amplio desarrollo de las técnicas radioinmunológicas durante los últimos 20 años, ha posibilitado
conocer detalladamente los ritmos de secreción endocrina y las interacciones entre los componentes del
eje hipotálamo-hipófisis-ovario. El establecimiento de las bases fisiológicas del proceso reproductivo de
la vaca permitió el desarrollo de diversos métodos para el control del ciclo estral, de gran importancia
para el incremento de la eficiencia reproductiva y para los programas de mejoramiento genético.
Asimismo, el estudio de la función ovárica mediante la ecografía y las diversas técnicas de biología
molecular, contribuyó a una mejor comprensión de la foliculogénesis y de la regulación luteal.
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Regulación neuroendócrina
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A pesar de los esfuerzos realizados, aún se desconocen muchos mecanismos fisiológicos de la
actividad neuroendocrina del ovario, como por ejemplo:
I)
II)
III)
IV)
Factores que controlan la maduración ovocitaria
El ingreso de los folículos con crecimiento detenido al pool de folículos en crecimiento
La regulación de la secreción de FSH, inhibina y activina
Los mecanismos por los que un folículo dominante suprime el crecimiento de los demás folículos
durante la fase de dominancia y
V) Sistemas de comunicación intercelular que intervienen en el desarrollo folicular, la esteroidogénesis
y la regresión luteal.
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Superovulación
33
SUPEROVULACION
J. Cabodevila & S. Torquati
Introducción
El objetivo de la transferencia de embriones es obtener a partir de progenitores de alto mérito genético,
el mayor número posible de descendientes utilizando el útero de receptoras de menor valor económico
para llevar la gestación a término.
Para lograr dicho objetivo es necesario, en primera instancia, contar con un número elevado de
embriones transferibles. A tal fin, debe provocarse en la hembra donante una estimulación ovárica
adecuada mediante la administración de gonadotrofinas. Esto debe complementarse con un régimen
óptimo de insemina-ción artificial, utilizando semen de muy buena calidad.
DONALDSON (1984e), demostró que a pesar de que se cumpla con todos estos requisitos, la respuesta
superovulatoria (RS) resulta muy variable. En un estudio retrospectivo que incluyó 1263 donantes, el
autor encontró que solamente el 68% de las hembras inducidas a superovular produjeron embriones
transferibles. El 32% restante lo integraron:
-
7% de donantes en las que no se produjo estimulación ovárica.
7% de donantes en las que no se recolectaron ni ovocitos ni embriones.
17% de donantes en las que no se obtuvieron embriones transferibles.
1% de donantes en las que no se efectuó la recolección de embriones porque presentaron celo antes
de administrársele la prostaglandina F2 (PGF2 ) durante el tratamiento hormonal.
Estos porcentajes, con algunas variaciones, se repiten cada vez que se analiza la producción de
embriones de un número significativo de donantes superovuladas.
A continuación se analizan los factores responsables de la variabilidad en el RS y se aportan
recomendaciones prácticas tendientes a disminuirla.
Variabilidad de la respuesta superovulatoria
El análisis se efectúa en base a lo propuesto por MAPLETOFT y MURPHY, 1987) quienes consideraron
por un lado, la variabilidad debida a los tratamientos hormonales y por otro, la variabilidad inherente a la
donante y su medio ambiente.
Variabilidad debida a los tratamientos hormonales
Gonadotrofina empleada: La inducción a la superovulación se efectúa principal-mente con gonadotrofina
sérica de yegua preñada -PMSG- o con extractos de pituitaria porcina que generalmente se conocen
como FSH-p, a pesar de que en muchos casos contienen mayor cantidad de hormona luteinizante -LHque de hormona folículo estimulante -FSH-.
La PMSG, también denominada gonadotrofina coriónica equina -eCG-, es una glicoproteína producida
por los cálices endometriales y se comprueba biológica-mente entre los días 35 y 140 de gestación. La
relación FSH/LH de esta hormona varía durante la preñez. (GODKE y col., 1978; PAPKOFF, 1981)
La PMSG debido a su elevado peso molecular no atraviesa el filtro renal y por lo tanto, tiene larga vida
media en sangre. Esto permite inducir superovulación en la hembra bovina mediante la administración
de una dosis única entre los días 8 y 14 del ciclo estral (SAUMANDE y CHUPIN, 1984). Sin embargo, su
permanencia prolongada en sangre provoca un crecimiento folicular disperso, con niveles altos de
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34
Cabodevila & Torquati
estrógenos que afectan tanto la tasa de fertilización como la calidad embrionaria. Además de generar
procesos inmunitarios que hacen necesario, en tratamientos posteriores, emplear una mayor dosis de
hormona para lograr el mismo efecto (RAMAKRISHNA y RAMACHANDRAIAH, 1989).
BINDON y PIPER, (1977) informaron la utilización de un suero anti-PMSG para eliminar los efectos
indeseables de esta hormona, luego de inducida la superovulación. Distintas especies han sido
empleadas para obtener este suero: pavos (DHONT y col., 1978), cabras (KUMMER y col., 1980),
bovinos (KIM y col., 1987; SAUMANDE y CHUPIN 1981) y ovinos (KIM y col., 1987). Asimismo, se han
efectuado estudios in vitro e in vivo para determinar la efectividad de esos sueros (SAUMANDE y
CHUPIN, 1987). También se han hecho estudios comparando anticuerpos mono y policlonales
(DIELEMAN y col., 1987; GRASSO y col., 1989; MOYAERT y col., 1985).
El momento más oportuno para administrar el suero anti-PMSG es luego de producido el pico
preovulatorio de LH (ALFORAIJI y col., 1989; DIELEMAN y col., 1987); en la práctica, en el momento de
la primera o segunda IA (SAUMANDE y CHUPIN, 1984; WANG y col., 1987) debido a que el suero antiPMSG reacciona en forma cruzada con las gonadotrofinas hipofisiarias y puede interferir con el pico
preovulatorio de LH (DHONT y col., 1978).
La mayoría de los investigadores coincide en señalar que la administración del suero anti-PMSG
produce una mejora en los parámetros con los que se mide la RS, o sea: número de ovocitos y
embriones recolectados (KUMMER y col., 1980) y número de embriones transferibles (DIELEMAN y
col., 1987; 1989; KUMMER y col., 1980; SAUMANDE y CHUPIN, 1981). La misma puede atribuírse a un
incremento en las tasas de ovulación y fertilización (BOLAND y col., 1981; DHONT y col., 1978;
KUMMER y col., 1980). También se ha comprobado en los animales tratados con suero anti-PMSG,
menor duración del celo (DHONT y col., 1978; KUMMER y col., 1980; MOYAERT y col., 1985), menor
número de folículos mayores de 10 mm no ovulados (DHONT y col. 1978; MOYAERT y col. 1985;
SAUMANDE y CHUPIN, 1981) y una mayor normalidad en la esteroideogénesis folicular (KUMMER y
col., 1980; MOYAERT y col., 1985). Si bien en general el suero anti-PMSG mejoró los resultados de la
superovulación con esta gonadotrofina, también se registran casos en los que no ejerció ningún efecto
beneficioso (CHUPIN y PROCUREUR, 1988; ZEITOUN y col., 1988).
A los efectos de profundizar el conocimiento de los mecanismos de acción de la PMSG y del suero anti,
se han efectuado recientemente numerosos estudios endócrinos y de histología folicular (BEVERS y
col., 1988; CALLESEN y col., 1989a,b; DIELEMAN y col., 1988a,b, c, d, e). Estos estudios han
demostrado que la neutralización de la PMSG, pocas horas después de producido el pico de LH,
sincroniza la maduración folicular y acorta el período en el que ocurren las ovulaciones múltiples.
La FSH-p es la gonadotrofina más empleada en el pasado y el presente de la superovulación de
hembras bovinas. El tratamiento de superovulación con esta hormona se basa en la administración de
dos dosis diarias durante 4 ó 5 días (LOONEY y col., 1981), comenzando en general entre los días 9 y
13 del ciclo estral (DONALDSON, 1984). ELSDEN y SEIDEL, jr. (1990) emplean también el dia 14 del
ciclo.
En el cuadro 1 se presentan resultados de tratamientos efectuados para comparar la respuesta
superovulatoria a la PMSG y a la FSH-p.
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Superovulación
Cuadro 1:
35
Comparación de la respuesta superovulatoria después de tratamientos con PMSG y FSH-p
Ovocitos y embriones
recolectados
Embriones
transferibles
x ± DS
x ± DS
PMSG (2500 UI) +
anti PMSG
5
4
FSH-p1 (28 mg)
5
3
FSH-p2 (400 mg)
purificada
4
2
PMSG (3000 UI)
7±2
4±1
FSH-p (40 mg)
9±2
6±1
PMSG (2500 UI)
6±6
3±5
FSH-p (50 mg)
9±7
4±4
PMSG (300 UI)
NR
5a
Gonadotrofina
PMSG (3000 UI) +
anti PMSG
NR
9b
FSH-p (32 mg)
NR
5a
Autor/es
KIM y col. (1988)
MAPLETOFT (1980)
MONNIAUX
(1983)
y
col.
FOOTE y col. (1989)
1
Burns-Biotec, Oakland, CA 2 Folltropin®, Vetrepharm, Ontario
NR: no registrado. Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren significativamente (p <
0,05).
En menor medida, se han utilizado extractos de pituitaria equina -EPE- o -HAP-, ovina (FSH-o)
(ALBERIO y col., 1991b; DONALDSON, 1989) y una gonadotrofina aislada de la orina de mujeres
menopáusicas -HMG-. El extracto de pituitaria equina se administra en dosis diarias decrecientes
durante 3 ó 4 días. Fué utilizado a fines de la década del 70 obteniéndose resultados similares a los
logrados con PMSG (DANNER y col., 1979 y 1980). La utilización repetida induce la producción de
anticuerpos (ALWAN y col., 1988) y por consiguiente provoca una caída de la respuesta superovulatoria
(YIGEZU y col., 1988).
La HMG es un preparado altamente purificado de vida media muy corta. Requiere un esquema de
administración idéntico al de la FSH-p (LAURIA y col., 1982a; LINDSEN y col., 1986; Mc. GOWAN y
col., 1983; STORRING y col., 1976). Los resultados de superovulación con esta hormona son
comparables con los de la PMSG (ABDUL SAEED y col., 1989; NEWCOMB, 1980) y con los de la FSHp (CRITSER y col., 1982; LAURIA, y col., 1982b; MAPLETOFT y col., 1988a,b). ALCIVAR y col. (1984)
observaron con la HMG un porcentaje de preñez menor luego de la transferencia no quirúrgica de los
embriones con respecto al obtenido con la FSH-p.
A fin de evitar la gran variabilidad en las propiedades bioquímicas y biológicas que presentan las
gonadotrofinas, ha sido producida una FSH bovina (FSH-b) mediante recombinación de ADN
(BELLOWS y col., 1991; CHAPPEL y col., 1975; WILSON y col., 1988). Los resultados preliminares
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obtenidos son altamente satisfactorios (LINDSELL y col., 1988).
Dosis de gonadotrofinas
En los tratamientos de superovulación, la existencia de una relación dosis-respuesta ha sido
demostrada para distintas gonadotrofinas y en razas diferentes (DONALDSON, 1984b; 1985; Mc
GOWAN y col., 1983; PAWLYSHYN y col., 1986; SAUMANDE y CHUPIN, 1986b; WANG y col., 1988;
WU y col., 1988a; ZEITOUN y col., 1988). Esto significa que cuando la dosis se incrementa más allá de
lo óptimo, el número de ovulaciones no aumenta y el de ovocitos fertilizados y embriones transferibles
disminuye (ver Cuadro 2).
Los efectos negativos de altas dosis de gonadotrofinas se relacionan con los fenómenos de
sobreestimulación ovárica que serán considerados cuando se trate la influencia de la edad de la
donante. En los animales sobreestimulados, generalmente se obtiene también una menor tasa de
recolección (ovocitos y embriones recolectados/cuerpos lúteos palpados y observados). Se han
adjudicado para ello distintas razones:
a) Retención de ovocitos en los folículos luteinizados y en los CL (MONNIAUX y col., 1983).
b) Retención de ovocitos y/o embriones en los oviductos (Mc GOWAN y col., 1985).
c) Niveles muy altos de estrógenos producidos por los grandes folículos no ovulados que bloquearían la
capacidad de captación de las fimbrias con la consiguiente caída de ovocitos en la cavidad
abdominal (BOOTH y col., 1975).
A pesar de que en la práctica, cuando una donante no responde a la dosis inicial de FSH-p
(generalmente 28 a 40 mg Armour) es común incrementar la misma para un segundo tratamiento; el
análisis de la información disponible revela que este aumento de la dosis de gonadotrofina no es útil en
el tratamiento de donantes "problema". Además, al incrementar la dosis de gonadotrofina aumenta el
porcentaje de recolecciones en las que no se obtienen embriones transferibles (DONALDSON, 1984;
ver Cuadro 3).
Relación FSH/LH de la serie de gonadotrofina: En los mamíferos, la foliculogénesis depende tanto de la
FSH como de la LH. Las gonadotrofinas utilizadas para inducir superovulación tienen relaciones
FSH/LH diferentes.
Las preparaciones hormonales producidas en un momento determinado y bajo las mismas normas de
procesamiento presentan igual número de serie. La relación FSH/LH de cada serie de gonadotrofina es
distinta (MURPHY y col., 1984). En el caso de la PMSG, la diferencia se debe a variaciones individuales
entre donantes y también al momento de la gestación en el que es obtenida la hormona (GONZALEZMENCIO y col., 1978). En la FSH-p las variaciones se relacionan fundamentalmente con la dificultad
para separar ambas hormonas a partir de extractos hipofisiarios (LINDSELL y col., 1989). Únicamente la
HMG se caracteriza por poseer cantidades equivalentes de FSH y LH que además, permanecen
constantes.
Se han hecho numerosos estudios para establecer relaciones FSH/LH óptimas para la superovulación
de hembras de razas distintas, productoras de carne o leche (ALBERIO y col., 1989; 1991a;
CABODEVILA y col., 1989; CHUPIN, y PROCUREUR, 1984; 1985; DONALDSON, 1987; HILL y col.,
1984; 1985; LAURIA y col., 1983; LINDSELL y col., 1986a, b; MAPLETOFT, 1980; SHMIDT y col.,
1988). CHUPIN y col., (CHUPIN y PROCUREUR, 1985) observaron que las donantes de razas lecheras
son más sensibles que las productoras de carne, a cantidades excesivas en la preparación hormonal. A
fin de corroborar esta información, ALBERIO y col. (1991) trataron vacas Holando Argentino con una
FSH-p cuya relación FSH/LH fue 10. Las mismas donantes fueron tratadas alternativamente de manera
diferente: En un caso, se mantuvo la relación FSH/LH 10 constante y en el otro, se le incorporó a la
FSH-p cantidades crecientes de LH pura a partir de la 3ra. inyección.
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Superovulación
Cuadro 2:
37
Respuesta superovulatoria obtenida con distintas dosis de gonadotrofinas
Hormona
Dosis
Embriones
obtenidos
FSH
24 mg
12 ± 11
28 mg
HMG
FSH-p
FSH-p**
Transferibles
(%)
Autor/es
5±6
57 ± 37a
DONALDSON
15 ± 12
6±6
45 ± 35a
(1984)
38 mg
11 ± 9
5±6
52 ± 34a
40 mg
12 ± 11
5±6
43 ± 42a
50-52 mg
7± 7
4±5
47 ± 36a
60 mg
7± 8
3±4
40 ± 38b
25%
50%
1 ± 0,5b
4 ± 1b
1 ± 0,4
3±1
NR
NR
MAURER
y col.
100%+
14 ± 2a
7 ± 1b
NR
(1985)
200%
15 ± 3a
2 ± 0,7a
NR
15 mg
5b
3
55
PAWLYSHYN
30 mg
19a
6
34
y col.
45 mg
25a
5
20
(1986)
60 mg
15a
0,2
1
5 mg
10 mg
0,8
6
0,3
3
38
52
15 mg
8
3
40
20 mg
8
3
41
25 mg
8
3
35
30 mg
9
3
33
40 mg
6
2
40
1500 UI
3
NR
43
ZEITOUN
3000 UI
5
NR
25
y col.
6000 UI
3
NR
15
(1988)
WU y col.
(1988)
NR: no registrado; *: equivale a 1050 UI de actividad de FSH como de LH. **: FSH-p con bajo contenido de LH, 20
mg = 35 mg FSH standard NIH. Todas las FSHs están expresadas en unidades Armour. Los valores con letras
diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p < 0,05).
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38
Cuadro 3:
Porcentaje de recolecciones en las que no se obtuvieron ovocitos ni embriones en relación
a la dosis de FSH-p (DONALDSON, 1984)
Dosis de FSH (mg)
35
35-42
42
393
533
180
Sin ovocitos y embriones
recolectados
12%a
17%a
21%b
Sin embriones transferibles
27%a
30%a
44%b
No de recolecciones
Los valores con letras diferentes dentro de una misma línea difieren estadísticamente (p < 0,001).
La respuesta superovulatoria en ambos tratamientos fue similar. Sin embargo, cuando se incorporó la
LH se obtuvo una respuesta menor en el 50% de las donantes siendo afectada de manera significativa
la tasa de recolección.
Una cantidad excesiva de LH en la preparación hormonal provoca:
- menor tasa de ovulación (DONALDSON y WARD, 1987; FAROOKI, 1981).
- menor tasa de fertilización (DONALDSON, L. y col. 1986).
- menor número y porcentaje de embriones transferibles (CHUPIN y PROCUREUR, 1984;
DONALDSON y col., 1986; DONALDSON y WARD, 1987.
El número de ovulaciones se vería disminuido al alterarse la relación andrógenos-estrógenos que es
crítica para evitar la atresia de los folículos antrales (FAROOKI, 1981). Las donantes tratadas con
preparaciones hormonales con un contenido excesivo de LH presentan niveles altos de progesterona en
el momento del celo. Este hecho se debería a una acción luteotrófica ejercida por la LH sobre los
folículos preantrales y los grandes folículos luteinizados. El aumento en los niveles de progesterona,
acelera el transporte de los ovocitos (CRISMAN, y col., 1980) y de esta manera, sería el responsable de
la menor tasa de fecundación. El menor número y porcentaje de embriones transferibles también podría
estar relacionado con el desequilibrio endócrino que producen las preparaciones hormonales con una
cantidad excesiva de LH (MAURER y ECHTERNKAMP, 1982; MULLINS y col., 1980). En el Cuadro 4
se presenta un resumen de tratamientos de superovulación efectuados con FSH-p con diferentes
relaciones FSH/LH.
Dosis y frecuencia de administración de la PGF2 durante la inducción
Durante el tratamiento de superovulación, independientemente de la gonadotrofina que se emplee, a las
48-72 h de haber comenzado la inducción, se debe administrar PGF2 o alguno de sus análogos
sintéticos (PERRY y DONALDSON, 1984).
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Cuadro 4:
39
Resultados de tratamientos superovulatorios efectuados con FSH-p con diferentes
relaciones FSH/LH.
Relación
FSH/LH
Ovocitos y embriones
recolectados
x + DS
Embriones transferidos
n (%)
Autor/es
2000
4a
2a (52a)
DONALDSON
500-3000
10b
6b (55)
y WARD
140
5a
2a (35)
(1987)
8,2
11 ± 10
3±4
100
12 ± 10
6 ± 7 (47 ± 35)
0,1
0,5a
0,5a(NR)
CHUPIN
0,5
3a
2a (NR)
y col.
8,7
7b
5b (NR)
(1984)
0,02
4±5
3 ± 5 (68)
ALBERIO
3,9
4±3
3 ± 2 (62)
y col. (1989)
Comercial A
10
7 (NR)
BECKERS
Comercial B
6
6 (NR)
(1987)
0,2
6
4 (76)
CABODEVILA
3
6
4 (76)
y col.
3,9
4
3 (69)
(1989)
100
6
0,8(NR)
SCHMIDT
10
9
5 (NR)
y col.
5
8
5 (NR)
(1988)
1,25
4±1
2 ± 0,7
HASLER
2,5
9±2
3 ± 0,7
(1983)
5
5±1
2 ± 0,7
DONALDSON
y col. (1986)
NR: no registrado
Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p< 0,05).
La regresión completa del CL durante la inducción tiene vital importancia dado que influye sobre:
a)
b)
el porcentaje de donantes que presentan celo -muy importante si se tiene en cuenta que la
presentación de celos- se correlaciona positivamente con el grado de estimulación ovárica
(DONALDSON, 1984).
el número de ovocitos y embriones recolectados y
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40
c) el número de embriones transferibles (PHILLIPPO y ROWSON, 1975).
La dosis, el número de veces en que ésta se divide y la vía de administración, dependen de la PGF2 o
del análogo que se utilice. En el caso de la PGF2alfa, se ha observado que es más importante el número
de veces que se administra que la dosis total (DONALDSON, 1983; LOONEY y col., 1985). La
información disponible sobre el efecto de la aplicación intravenosa o intramuscular sobre el número de
embriones transferibles es contradictoria (ALMEIDA, 1987; PERRY y DONALDSON, 1984).
Para el Cloprostenol, la utilización de una dosis doble a la necesaria en un tratamiento luteolítico
standard, dividida en dos aplicaciones, ha tenido un efecto beneficioso sobre la respuesta
superovulatoria. Resta confirmar si el mismo se debió al empleo de una dosis mayor o a la
administración fraccionada (HUTTER y col., 1988). Sin embargo, en Francia (G.I.E. Nord Est Embryo,
comunicación personal) utilizaron la doble dosis de Cloprostenol por varios años y en la actualidad,
emplean una única dosis sin observar variaciones en la respuesta superovulatoria.
En estudios comparativos, el Delprostenate tendió a producir un número mayor de embriones
transferibles que el Cloprostenol y el Tiaprost (CABODEVILA y col., 1989). En cambio, no se registraron
diferencias entre PGF2alfa, Cloprostenol (DONALDSON, 1984f; PERRY y DONALDSON, 1984) y
Fenprostaleno (PERRY y DONALDSON, 1984).
Modificaciones en los esquemas de tratamiento
Las modificaciones en los esquemas de tratamiento se limitan exclusivamente a la FSH-p. Entre las
innovaciones menores, se destaca la introducida por CHUPIN y PROCUREUR (1982) quienes
comprobaron que la respuesta superovulatoria era mayor, administrando dosis diarias decrecientes en
lugar de dosis constantes, durante los 4 ó 5 días de tratamiento.
La utilización de dosis decrecientes no resultó en una mejora en la respuesta superovulatoria cuando se
utilizó FSH-p con bajo contenido de LH (MAPLETOFT, 1988).
Teniendo en cuenta que el actual esquema de aplicación de la FSH-p representa un problema desde el
punto de vista práctico, se han implementado distintas modificaciones con el objeto de resolverlo:
a)
Reducción en la duración del tratamiento.
A diferencia de lo ocurrido cuando se redujo la duración del tratamiento de 5 a 4 días, el acortamiento a
3 días produjo una disminución de la respuesta superovulatoria (GARCIA y col., 1982; MAPLETOFT,
1988). La administración de FSH-b durante 3 días ha permitido (BELOWS y col., 1991; JONES y
WILSON, 1992) obtener una respuesta superovulatoria mayor a la que se registra con los tratamientos
clásicos con FSH-p.
b)
Administración de una sola inyección.
Otra forma de simplificar el régimen, fue reducir las 2 dosis diarias, con 12 h de intervalo, a una sola
inyección por día (Mc Farland y col., 1985). Se utilizó un vehículo gelatinoso a los efectos de retardar la
liberación de hormona a sangre (LOONEY y col., 1981; WARFIELD y col., 1986). A pesar de haberse
obtenido resultados preliminares similares a los de los esquemas tradicionales, esta innovación fue
dejada de lado.
DEMOUSTIER y col., 1988 observaron que la FSH no es detectable en plasma a partir de 10-12 h postinyección. A pesar de ello, recientemente se ha insistido con esta innovación, obteniéndose con una
sola inyección diaria, una respuesta superovulatoria similar a la que se registró con un tratamiento
clásico (CAMPARA, comunicación personal).
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c)
41
Cambios en la vía de administración.
La FSH-p generalmente se administra por vía intramuscular en solución salina. Las modificaciones en
este sentido se han orientado por un lado, a utilizar la infusión continua por vía intra-arterial
(GUILBAULT y col., 1987) o intravenosa (GODKE y col., 1978; WARREN y col., 1978) tratando de
mantener un nivel de hormona constante en sangre y por otro, en emplear la vía subcutánea bajo la
forma de un implante en vehículo gelatinoso (LOONEY y col., 1982; SCHALLEMBERGER y col., 1988;
WUBISHET y col., 1986b). En todos los casos, se han obtenido respuestas superovulatorias menores
que con los tratamientos tradicionales. GUILBAULT (1990) cree que cuando se utilizan las vías intraarterial o intra-venosa se produce una saturación de los receptores a FSH. BO y col. (1991) indicaron
que administrando 400 mg NIH de FSH-p (Folltropin®) en una inyección subcutánea de 20 ml el primer
día de tratamiento, es posible obtener una respuesta superovulatoria comparable con la del esquema de
inyecciones múltiples. Recientemente el mismo grupo de investigación (HOCKEY y col., 1992) logró
obtener 9 embriones transferibles (15 recolectados) aplicando igual dosis y de la misma forma a
donantes de razas productoras de carne. Dosis mayores condujeron a una disminución del número de
embriones recolectados y transferibles.
Combinación de las gonadotrofinas con otras hormonas
La asociación más importante es la que se efectúa con progesterona o progestágeno a los efectos de
sincronizar los celos de las donantes que ingresan a un programa de TE.
Cuando se utilizan progesterona o progestágeno y a diferencia de lo que ocurre con la PGF2 , el
programa puede comenzar en forma inmediata independiente-mente de que las donantes se
encuentren en fase luteal. Además, puede inducirse la superovulación en donantes que se encuentran
en anestro post-parto (DONALDSON, 1984).
Se utilizan implantes subcutáneos con progestágenos y dispositivos intravaginales con progesterona
(PRID®) o progestágenos (esponjas) durante 9-11 días, comenzando el tratamiento de superovulación
48 h antes del retiro del implante o del dispositivo (ALBERIO y col., 1991e); ELLINGTON y col., 1987).
La información sobre administración de FSH-p y PMSG en el curso de un tratamiento con
progestágenos es muy abundante (PERRY y DONALDSON, 1984; SHEA y col., 1984; HILL y col., 1984;
KIM y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS, 1987; LOONEY y col., 1988; HERRLER y col., 1989). En
muchos casos, se obtuvo una respuesta superovulatoria menor que la registrada con los tratamientos
iniciados sobre ciclos naturales o inducidos con PGF2 (ALMEIDA, 1987a; 1987e; SCHALLEMBERGER
y col., 1988).
ALBERIO y col. (1991e) partieron de la hipótesis que la respuesta superovulatoria de los animales
cíclicos depende del momento del ciclo estral en que se induce la superovulación. Para demostrarlo,
colocaron esponjas intravaginales en distintos momentos del ciclo. El tratamiento superovulatorio
comenzó siempre 7 días después de haber colocado las esponjas. Se utilizaron 32 mg Armour de FSHp divididos en 8 dosis decrecientes, administradas cada 12 horas en 8 dosis decrecientes,
administradas cada 12 horas. Las esponjas permanecieron durante 9 días, al retirarlas se administró la
1ra. PGF2alfa. Como control, se utilizó un grupo de vacas que recibieron el mismo tratamiento
superovulatorio, comenzando el día 9 del ciclo estral. El esquema utilizado y los resultados obtenidos se
presentan en la tabla 1.
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42
Tabla 1
Respuesta superovulatoria de donantes tratadas previamente con progestágeno en
diferentes momentos del ciclo estral (ALBERIO y col, 1991e)
Grupo
Colocación de la
esponja, dias
CL
n
O/ER
n
ETr
n
I **** n= 12
0-6
6±4
5±4
4±3
II **** n= 12
7-13
7±4
5±5
4±5
III **** n= 12
14-20
4±3
2±4
2±3
Control
IV **** n= 12
8-12
7±6
8±6
5±5
*: FSH-p; *: FSH-p + PGF2 + retiro de la esponja
CL: cuerpos lúteos palpados
O/ER: Ovocitos y embriones recolectados
ETr: Embriones transferibles
Cuando la superovulación fue inducida en el curso de un tratamiento con progestágenos la respuesta
superovulatoria resultó inferior, especialmente cuando comenzó a administrarse la FSH-p al final del
ciclo estral (Grupo III).
GARCIA-WINDER y col. (1988) utilizaron implantes y no administraron estradiol en el momento de su
colocación. Obtuvieron una respuesta semejante a la de los controles no implantados pero la tasa de
recolección resultó inferior. Adjudicaron este hecho a desbalances endocrinos que pueden haber
afectado el transporte de los gametos. Esta observación no fue corroborada por otros investigadores
(WU y col., 1988b). PATTERSON y col. (1992) superovularon donantes de raza Aberdeen Angus
jóvenes (alrededor de un año de edad) provocando el celo con progestágeno administrado en forma
oral. La tasa de embriones transferibles (19-29%) no fue diferente estadísticamente entre los grupos
tratados con progestágeno y prostaglandina respectivamente. A pesar de la inconveniencia de
superovular hembras que presentan baja fertilidad o ciclos estrales irregulares, la asociación de
progesterona o progestágenos con gonadotrofinas puede ser útil para lograr en estas donantes una
mayor sincronía y reducir el número de ovocitos sin fertilizar y embriones degenerados (ALBERIO y col.,
1991e; ELSDEN y col., 1983).
La aplicación de hormona liberadora de gonadotrofinas GnRH o gonadotrofina coriónica humana -HCGen hembras inducidas a superovular, tiene por objeto provocar el pico preovulatorio de LH en el
momento adecuado y producir así, una ovulación más sincrónica.
La GnRH o su análogo sintético buserelina, se han administrado en el período comprendido entre las 48
hs. pos-inyección de la PFG2 y las 24 h de iniciado el celo. Estos tratamientos generalmente no
modificaron la respuesta superovulatoria (FAROOKI, 1981; PRADO DELGADO y col., 1984; 1989;
VOSS y col., 1989). Sin embargo, WUBISHET y col., 1986a) obtuvieron una mayor tasa de fecundación
y un mayor número de embriones transferibles. La administración de HCG no modificó
significativamente ninguno de los parámetros con los que se mide la respuesta superovulatoria
(KUNKEL y col., 1987).
En trabajos experimentales, la FSH-p ha sido combinada con estrógenos y la PMSG con antiesteroides
ováricos. La suplementación con estrógenos tuvo por objeto aumentar el número de folículos antrales
pequeños que alcanzan el estado preovulatorio (SAVAGE, MAPLETOFT, 1984). Normalmente llegan a
este estado únicamente los folículos que tienen un alto tenor de estrógenos lo que les permite sintetizar
receptores a LH en las células de la granulosa, siendo éste un requisito imprescindible para el proceso
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de foliculogénesis.
La administración de 17ß estradiol o cipionato de estradiol, 36 h después de la PGF2 , no mejoró la
respuesta superovulatoria (ELLINGTON y col., 1987; SAVAGE y MAPLETOFT, 1987). Por el contrario,
el cipionato de estradiol disminuyó el número de embriones transferibles en vaquillonas (ELLINGTON, y
col., 1987).
En estudios efectuados en animales hipofisectomizados se comprobó que la secreción de
gonadotrofinas tiene dos mecanismos de control. Al feed-back ejercido por la inhibina se le suma un
sistema local mediado por esteroides ováricos (BINDON y PIPER, 1977; CAHILL, 1984). En primera
instancia, se trató de incrementar la tasa de ovulación provocando directamente la inmunización activa
contra estos esteroides, los resultados fueron negativos. Posteriormente, a vacas inmunizadas contra
testosterona se las indujo a superovular con PMSG obteniéndose en un caso, un número mayor de
ovulaciones que en el grupo control no inmunizado (BOLAND y col., 1985) y en otro, ningún beneficio
sobre la respuesta superovulatoria (G.I.E. Nord Est Embryos, comunicación personal).
Variabilidad inherente a la donante y su medio ambiente: Las diferencias individuales y de medio
ambiente son la mayor fuente de variación de la respuesta superovulatoria (SUITOYUS y VASHKAS,
1989; XU y col., 1988).
Estado del ovario en el momento del tratamiento
Los folículos primordiales, formados durante la vida intrauterina comienzan paulatinamente, durante la
vida reproductiva, su proceso de desarrollo. En éste, los folículos primordiales se convierten
sucesivamente en preantrales (primarios o secundarios) y antrales, siguiendo luego la atresia (en la
gran mayoría de los folículos) o la ovulación (IRELAND y ROCHE, 1983).
El motivo por el cual los folículos primordiales comienzan a desarrollar convirtién-dose en preantrales no
es conocido. La formación del antro folicular es independiente del nivel de gonadotrofinas, sin embargo
el número de folículos que alcanzan tal desarrollo sí depende del nivel de éstas. Cuando se efectúa un
tratamiento superovulatorio, la administración de gonadotrofinas tiene por objeto incrementar el número
de folículos preantrales que se convierten en antrales y reducir a su vez el número de folículos antrales
que sufren atresia.
MOOR y col. (1984) demostraron que las gonadotrofinas exógenas provocan la ovulación de folículos
antrales de tamaño mediano. Una mayor proporción de estos folículos se encuentran en los ovarios
entre los días 0-5, y 9-13 del ciclo estral. Esto hizo suponer una mejor respuesta superovulatoria a
tratamientos efectuados en esos días.
LINDSELL y col. (1985 y 1986b) compararon tratamientos de superovulación que comenzaron en
diferentes días del ciclo estral. Observaron un número inferior de ovulaciones y de embriones
recolectados en las que comenzaron el día 3 con respecto a las que lo hicieron el día 9 (ver Cuadro 5).
Surgió entonces la hipótesis de que la respuesta superovulatoria depende de otros factores, además del
número de folículos receptivos a las gonadotrofinas presentes en un momento determinado del ciclo
estral. Entre estos factores estarían:
.- la presencia o no de un folículo dominante no ovulatorio (GRASSO y col., 1989a).
.- la concentración de hormonas esteroideas en el fluido y el número de receptores a las
gonadotrofinas presentes en las células de la teca y de la granulosa (IRELAND y ROCHE, 1983).
.- los niveles de aromatasa en la células de la granulosa (Mc. NATTY y col., 1984).
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Cuadro 5:
Producción de embriones en vaquillonas superovuladas en cuatro días diferentes del ciclo
estral (LINDSELL y col., 1986).
Día del ciclo
estral
CL palpados
Ovocitos y embriones
recolectados
Embriones
transferibles
x ± DS
x ± DS
x ± DS
3
9 ± 2b
10 ± 2
3±1
6
11 ± 2ab
11 ± 3
4±2
9
16 ± 1
17 ± 3
7±1
12
12 ± 2b
12 ± 4
4±2
Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p< 0,05).
El tratamiento de superovulación puede comenzar en días diferentes dentro del período comprendido
entre los días 9 y 13 del ciclo estral, sin que se modifique la respuesta superovulatoria (CABODEVILA y
col., 1989; DONALDSON, 1984a; LERNER y col., 1986).
Con el objetivo de tener un mayor número de folículos receptivos a las gonadotrofinas en el momento
del tratamiento, se ha administrado al comienzo del ciclo estral fluido folicular o FSH-p en baja dosis.
Los resultados han sido dispares (ALBERIO y col., 1991b; GUILBAULT y col., 1987; LUSSIER y
CARRUTHERS, 1987a; 1989; RAJAMAHENDRAN y col., 1987; TOTEY y col., 1989; 1990; GRASSO y
col., 1989b).
Efecto de la edad
El efecto que tiene la edad de la donante sobre la respuesta superovulatoria ha sido muy estudiado en
ganado lechero. HASLER y col. (1981) y HARRISON y col. (1982) obtuvieron un número mayor de
embriones transferibles en las donantes de 3 a 6 años que en las vaquillonas y las vacas mayores de 10
años. En otro trabajo de los mismos investigadores no se repitieron tales diferencias (HASLER y col.,
1981).
LERNER y col. (1986) sostienen que existe una interacción entre la edad de la donante y la dosis de
gonadotrofina (ver Figura 1). Según su interpretación, cuando animales jóvenes son tratados con dosis
elevadas de gonadotrofinas, se produce una sobreestimulación ovárica donde muchos folículos
comienzan a desarrollar pero pocos son capaces de ovular y la mayoría sufre luteinización o se
atresian. Los motivos serían un insuficiente aporte sanguíneo a determinados folículos debido a
limitantes físicas del ovario para albergar tantos folículos en crecimiento y por otro lado, alteraciones
endocrinas con excesiva producción de esteroides ováricos que interfieren con el propio desarrollo
folicular y la ovulación. En su trabajo, observaron que al aumentar la edad de la donante disminuyeron
el número de ovulaciones, la tasa de fertilización y la calidad embrionaria. La disminución en el número
de ovulaciones se debería a una menor disponibilidad de folículos capaces de responder a las
gonadotrofinas exógenas. Al haber menos folículos en crecimiento, los niveles de inhibina bajarían y
habría un aumento de la FSH endógena que haría que en estos animales, en cualquier momento del
ciclo estral, los folículos en crecimiento estuvieran en un estado de desarrollo más avanzado que
aquellos folículos en los animales más jóvenes. Al comenzar el tratamiento con gonadotrofinas, los
folículos más maduros serían los primeros en producir grandes cantidades de estrógenos. Por lo tanto,
los ovocitos dentro de estos folículos, estarían expuestos a altas concentraciones de estrógenos por
largos períodos antes de la ovulación, comparándolos con los ovocitos dentro de los folículos menos
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desarrollados. Esta exposición a alta concentración de estradiol podría ser la causa de la disminución
en la tasa de fertilización y en la calidad embrionaria. El aumento de la tasa de fertilización y de
embriones transferibles observado por estos autores cuando incrementaron la dosis de FSH-p en los
animales viejos, se debería a un aumento en la proporción de folículos relativamente menos maduros
que fueron estimulados a desarrollar rápidamente.
Coincidentemente con ello PATTERSON y col. (1992) obtuvieron sólo un 20% de embriones
transferibles (2,4/120) de vaquillonas prepúberes sincronizadas con prostaglandina y superovuladas con
40 mg de FSH-p.
Basado en estas observaciones, resulta claro que para lograr un alto número de embriones
transferibles, la dosis de gonadotrofina debe ajustarse a la edad de la donante. Manteniendo una dosis
de gonadotrofina constante, el número de ovocitos y embriones recolectados debería aumentar con la
edad en los animales jóvenes (debido a una disminución en el grado de sobeestimulación ovárica) hasta
alcanzar un pico y luego disminuiría con la edad en las vacas más viejas (debido a una menor
disponibilidad de folículos en crecimiento). En razas productoras de carne, se observó que con el
transcurrir de los años si bien se mantuvo el número de ovulaciones, la tasa de fertilización y la calidad
embrionaria disminuyeron (DONALDSON, 1984a). Esto no pudo ser corregido aumentando la dosis de
FSH-p (MOOR y col., 1984).
Figura 1: Número de embriones producidos en función de la edad de la vaca y la dosis de FSH
(LERNER y col., 1986)
Efecto del estado nutricional de la donante
El estado nutricional de la donante puede influenciar tanto las tasas de ovulación y de fecundación
como la viabilidad embrionaria. En la mayoría de los estudios realizados, se ha considerado únicamente
la importancia de la nutrición en animales inducidos a tener ovulaciones dobles para que gesten
mellizos. En estos trabajos, tanto la respuesta ovárica a los tratamientos hormonales como la tasa de
fecundación no han sido modificadas por variaciones en el peso diario de ± 500 g (DUN, 1980).
El efecto del stress nutricional sobre la viabilidad embrionaria, en los estadios preimplantatorios, no ha
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sido estudiado en el bovino pero si muy extensamente en el ovino con resultados contradictorios
(CUMING y col., 1975; EDEY, 1966; 1970a, b, c; GUILBAULT y col., 1990).
Teniendo en cuenta que la alimentación con raciones con alto contenido energético, eleva los niveles
plasmáticos de ácido propiónico y glucosa, se ha hipotetizado que este aumento de la glucemia podría
estimular a los centros hipotalámicos y consecuentemente incrementar la actividad ovárica
(HOWALAND y col., 1966). En base a esto, se han efectuado trabajos en animales superovulados,
suplementándole la ración con monensina sódica. Se ha registrado un aumento en la ganancia de peso
diaria y en el número de CL (ORTUNO y CARSON, 1985), sin embargo no se ha modificado el número
de embriones transferibles (SAUMANDE y CHUPIN, 1986a). Como la respuesta resultó variable, queda
por definir aún la condición corporal más adecuada para lograr un mayor efecto. La suplementación con
monensina puede constituirse en una alternativa de interés en la superovulación de vaquillonas, si se
repite lo observado por (HARRISON y col., 1982) quienes lograron en los animales suplementados, una
mayor respuesta a bajas dosis de FSH-p administradas para inducir ovulaciones dobles. Esto permitiría
utilizar tratamientos de superovulación con dosis bajas de gonadotrofinas evitando así, los fenómenos
de sobre estimulación ovárica.
Historia reproductiva: Deben considerarse aquí dos situaciones totalmente diferentes, por un lado, la TE
ha demostrado ser un método alternativo útil para el diagnóstico y tratamiento de aquellos casos en que
la infertilidad no se debe a problemas intrínsecos del embrión sino al medio ambiente uterino o algún
otro factor materno (BOWEN y col., 1978; MAPLETOFT, 1980). Por otro lado, existen estudios en los
que se observó claramente que las donantes que ingresan a Programas de TE con antecedentes de
infertilidad tienen una menor producción que aquellas donantes consideradas sanas (GUNN y col.,
1972). Los problemas de fertilidad incluyen anormalidades detectables por palpación transrectal (quistes
ováricos, adherencias e infecciones uterinas) y otras no diagnosticadas por palpación y aún por
laparoscopía como por ejemplo, obstrucciones oviductales.
En un estudio comparativo (HASLER, y col. 1981), se demostró que en las donantes infértiles el número
de embriones transferibles es menor y que los porcentajes de preñez son más bajos. Además, una
mayor proporción de estas donantes, en el momento de efectuar la recolección, no produjeron
embriones transferibles (ver Cuadro 6).
Cuadro 6: Efecto de la historia reproductiva sobre la respuesta a la primera superovulación (HASLER y
col., 1983)
Estado reproductivo
Parámetros
Fértil
Infértil
No de animales
666
318
x de ovocitos y embriones
recolectados/donante
10
6
x de embriones
transferibles/donante
6a
2b
Donantes sin embriones
transferibles
14a
51b
No de embriones transferidos
3707
604
Receptoras preñadas %
68a
58b
Los valores con letras diferentes dentro de una misma línea difieren estadísticamente (p< 0,05).
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En otro estudio con resultados similares, ELSDEN y col. (1978) dividieron para su análisis a las
donantes infértiles según la etiología fuese o no conocida (ver Cuadro 7). En el grupo de donantes con
infertilidad diagnosticada y que se trataron previamente a la superovulación, los autores encontraron
diferencias en la respuesta según las distintas etiologías. La respuesta en las vacas con quistes
ováricos fue inferior a la de las donantes con adherencias. Las tratadas contra infecciones uterinas se
colocaron en un nivel intermedio dado que la respuesta ovárica fue buena pero hubo un alto porcentaje
de ovocitos sin fertilizar debido probablemente a modificaciones en el medio uterino que resultaron
perjudiciales para los espermatozoides.
Cuadro 7:
Superovulación de donantes infértiles (ELSDEN y col., 1979).
Estado reproductivo
Adherencias
3
8ab
Parámetros
Número de tratamientos
CL/tratamiento
Infección uterina
11
10a
Quistes ováricos
16
4b
Embriones
transferidos/tratamiento
2ab
4a
0,2b
Preñeces/tratamiento
1ab
3a
3
Σ de preñeces
12
10
3
Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadísticamente (p< 0,05).
Efecto de los tratamientos sucesivos
El efecto que tienen los tratamientos sucesivos sobre la respuesta superovulatoria no puede ser
separado del que ejercen la edad de la donante y la dosis de gonadotrofina. La mayoría de los
investigadores coincide en que la respuesta superovulatoria disminuye con los tratamientos sucesivos.
Algunos sostienen que el número de embriones transferibles declina a partir del cuarto o quinto
tratamiento (BASTIDAS y RANDEL, 1987b; HERRLER y col., 1988), otros ubican esta declinación a
partir del tercer tratamiento (DONALDSON y PERRY, 1984a; WARFIELD y col., 1986). Este criterio no
es compartido por DONALDSON, y PERRY, 1983) quienes no encontraron variaciones en la respuesta
superovulatoria a lo largo de diez tratamientos sucesivos. Es conveniente que los tratamientos estén
separados por un período mínimo de 60 días dado que este lapso es el que tardan los folículos
primarios en alcanzar el estado preovulatorio (ALI DINAR y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS,
1987). Si no se respeta este período mínimo, la respuesta superovulatoria se afecta notoriamente (ver
Cuadro 8).
Cuadro 8: Promedio de embriones transferibles según el intervalo entre tratamientos (SHALOVILO y
col., 1989)
Embriones transferibles
1o
tratamiento
2o
tratamiento
3o
tratamiento
4o
tratamiento
80-90 días
4
5
3
6
45-60 días
1
3
2
-
Intervalo entre
tratamientos
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SAUMANDE y CHUPIN (1977) concluyeron que las respuestas pobres a un primer tratamiento
superovulatorio tienen alta repetibilidad. Esto fue corroborado por LAMBERSON y LAMBETH (1986)
quienes informaron un 64% de repetibilidad para las respuestas pobres al primer tratamiento y
aproximadamente un 45% para las medias o altas.
Efecto de la raza
Las donantes que ingresan en Programas de TE presentan diferencias en su estado nutricional,
sanitario y reproductivo, como también en el número previo de tratamientos de superovulación. Por lo
tanto, no cabe considerar la producción de estas hembras como totalmente representativa de la raza.
En un estudio retrospectivo sobre 1596 tratamientos de superovulación efectuados en donantes de 13
razas distintas productoras de carne, DONALDSON (1984e) encontró que la raza de la donante es un
factor de variación en aspectos tales como:
- número de ovocitos y embriones recolectados
- número de embriones transferibles
- porcentaje de embriones transferibles
- número de preñeces/recolección
- porcentaje de preñez
La proporción de hembras que presentaron celo y el momento de aparición del mismo fue diferente en
las distintas razas. Sin embargo, este factor no fue considerado por no ser determinante del número de
preñeces/recolección como los porcentajes de preñez fueron influenciados por la raza de las receptoras,
siendo imposible discriminar estos efectos de los de la raza de la donante.
La comparación de estos resultados con otros de donantes de raza Holstein, ubica a esta raza en un
término medio en lo que respecta al número de ovocitos y embriones recolectados, mejorando su
performance cuando se considera el porcentaje de embriones transferibles (HASLER y col., 1981;
WALTON y STUBBINGS, 1986).
En un estudio retrospectivo hecho en donantes de razas lecheras y productoras de carne, se observó
en la raza Jersey una mayor proporción de donantes con respuesta ovárica excesiva, sin aumentar el
número de embriones transferibles/ recolección (HOLM y col., 1987).
En ganado Bos indicus, independientemente del grado de respuesta ovárica, los resultados pueden ser
alterados por las características propias del tracto genital de estas hembras que ofrece dificultades para
efectuar la recolección (ELSDEN y col., 1979).
Efecto estacional
En algunos trabajos realizados en Canadá y EE.UU. no se demostró un efecto estacional sobre la
respuesta superovulatoria (CRITSER, y col., 1980; MASSEY y ODEN, 1984). Sin embargo, un menor
número de embriones transferibles ha sido observado durante el invierno en Texas, EE.UU. (ALMEIDA,
1987b) y en verano, en Israel y Arabia Saudita (BOLAND y col., 1981; GORDON y col., 1987).
En un trabajo experimental, PUTNEY y col. (1988) sometieron a las donantes a elevadas temperaturas
en el período comprendido entre la IA y la recolección y observaron que el calor produce una mayor
proporción de embriones degenerados y retardados. Se puede concluir que la respuesta superovulatoria
puede ser alterada por situaciones climáticas extremas (NEWCOMB, 1980), dependiendo éstas si
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ocurren en invierno o verano según la ubicación geográfica del lugar donde se realiza el tratamiento.
Conclusiones
A pesar de los avances que se han registrado en el conocimiento de la fisiología reproductiva de la
hembra bovina en los últimos diez años, la variabilidad en la respuesta superovulatoria permanece en
niveles similares a lo observado a fines de la década del setenta (ELSDEN y col., 1978).
Para reducir tal variabilidad es necesario en primer lugar, optimizar las preparaciones hormonales y
luego efectuar el tratamiento en hembras fértiles, en el momento adecuado y en un ambiente propicio.
Los tratamientos hormonales deben producir un número elevado de embriones transferibles y ser de
fácil aplicación. Hasta ahora, para cumplimentar el primer requisito se ha insistido en encontrar una
relación FSH-LH adecuada. Sin embargo, la respuesta superovulatoria se modificó únicamente cuando
las relaciones fueron muy dispares. Posiblemente, la purificación de los extractos hipofisiarios sea más
importante para evitar que lleven incorporados otras hormonas que para encontrar una relación definida.
BECKERS y col., (1988) sostienen que los extractos poco purificados pueden ir acompañados por
hormonas tales como la de crecimiento -STH- que podrían competir con las gonadotrofinas por los
receptores ováricos.
La simplificación de los tratamientos puede conseguirse empleando PMSG, si se logra mantener el nivel
de resultados alcanzado en algunos trabajos en los que se utilizó con el anti suero correspondiente
(DIELEMAN y col., 1987). Con el mismo objetivo y debido a las ventajas prácticas que ofrece, debe ser
motivo de mayor investigación la combinación de gonadotrofinas con dispositivos o implantes con
progesterona o progestágenos. Si los resultados preliminares obtenidos con la FSH-b se confirman, la
producción de hormona por recombinación de ADN resolverá el problema de la variabilidad debida a los
tratamientos.
La inducción a la superovulación debe efectuarse en presencia de un cuerpo lúteo funcional y evitando
la acción de los folículos dominantes no ovulatorios (GORDON y col., 1987). La mejor forma de
determinar la presencia de un CL funcional es, de manera indirecta, a través del dosaje de
progesterona. A tal fin, ha comenzado a utilizarse la medición en plasma empleando la técnica enzima
inmunoensayo (ELISA) (ALI DINAR y col., 1987; ALLEN y FOOTE, 1987) o leche, mediante un
procedimiento colorimétrico (HERRLER y col., 1988). Del mismo modo, la ecografía es considerada la
técnica más idónea para el seguimiento de la dinámica folicular (SAVIO y col., 1988).
Recomendaciones finales
En base a experiencias personales recogidas y a los datos obtenidos de otros autores, se hacen
algunas recomendaciones prácticas tendientes a disminuir la variabilidad en la respuesta
superovulatoria:
1.
Elegir como donantes hembras fértiles.
2.
Inmediatamente antes de comenzar el tratamiento de superovulación, controlar la funcionalidad de
los ovarios. En caso de no poder recurrir al dosaje de progesterona y a la ecografía, utilizar la
palpación transrectal.
3.
Utilizar extractos hipofisiarios purificados.
4.
Adecuar la dosis de gonadotrofina a la relación FSH/LH del preparado hormonal, a la raza de la
donante y a su edad. También deben tenerse en cuenta los antecedentes de tratamientos
superovulatorios previos.
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5.
En el caso de hembras superovuladas por primera vez:
a) Tratar con una dosis media (32-36 mg Armour).
b) Si no responde, efectuar otro tratamiento empleando la misma dosis y si nuevamente no
responde, descartar esta hembra como donante.
c) Si en el primer tratamiento se registra una respuesta baja, aumentar la dosis a 40 mg Armour.
d) Si la respuesta al primer tratamiento es alta, con embriones de mala calidad, bajar la dosis a 2830 mg Armour.
6.
Dejar transcurrir un mínimo de 50 días post-parto hasta efectuar un trata-miento superovulatorio.
Entre tratamientos, debe transcurrir un período mínimo de 60 días.
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RECOLECCION DE LOS EMBRIONES
G. A. Palma
Introducción
Los embriones bovinos, destinados a un programa de TE pueden ser obtenidos del útero por medios no
quirúrgicos. Su recolección y transferencia con éxito dependen de varios factores. En primer lugar de la
resistencia de éstos para sobrevivir y llegar a término después de ser recolectados del tracto genital,
evaluados in vitro y transferidos a un genital receptor, con cambios de medio y temperatura. En
segundo lugar depende de que la técnica de obtención no ponga en peligro la integridad del tracto
genital, a fin de poder repetirla tantas veces como sea deseable y conveniente. La primera técnica de
recolección de embriones bovinos usada hace aproximadamente dos décadas, fue quirúrgica. La misma
requería anestesia general, inducida por medio de barbitúricos y mantenida por medio de inhalación
(halotano). Por medio de una incisión de 15 cm de longitud en la línea media, por delante de la glándula
mamaria, se extraían los cuernos uterinos con los ovarios. El lavaje de los cuernos y oviductos se
llevaba a cabo el día 5-7 introduciendo catéteres de goma a través de la pared dorsal del cuerno uterino
y en la ampolla del oviducto. Cada cuerno era lavado con volúmenes variables de 40-60 ml de una
solución buffer (M 199). La manipulación quirúrgica del útero y de los ovarios conduce a lesiones que
provocan formación de fibrina y adherencias. Para minimizar ese efecto fue necesario trabajar con
buenas condiciones de asepsia, lavando el útero y los órganos adyacentes con solución fisiológica
estéril, conteniendo heparina. Con estas precauciones era posible llevar a cabo el lavaje a una vaca
sólo tres veces como máximo, lo que constituye una seria limitante en el uso repetido de esta técnica.
La tasa de éxito varió entre 50 y 70% de embriones y ovocitos obtenidos, en función del número de
cuerpos lúteos presentes. Otra variante de la recolección quirúrgica fue el by-pass propuesto por
TESTART y GODARD-SIOUR (1975), colocando la sonda a través de la pared uterina por medio de
vaginotomía (Fig. l) bajo anestesia epidural.
Fig. 1: Método transvaginal
GODARD SIUR, 1975)
(TESTARD
y
Después de la colocación, el catéter de goma era fijado por medio de un balón inflable. El útero era
lavado con 50-70 ml de medio. Esta técnica permitió obtener 40-50% de embriones. Las infecciones y
adherencias en los cuernos uterinos y oviductos constituyeron las desventajas que limitaron, como en el
caso anterior, la repetibilidad de la recolección e impidieron su difusión en la práctica. Ello provocó uno
de los mayores cambios en la técnica de transferencia de embriones de la década del `70. Aunque las
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Recolección de los embriones
59
primeras experiencias con la recolección no quirúrgica de embriones se remontan a la década del
cuarenta (ROWSON y DOWLING, 1949), recién a partir del trabajo de SUGIE y col. (1972) se
obtuvieron resultados satisfactorios y repetibles (SEIDEL y col., 1977).
Métodos no quirúrgicos de recolección
La posibilidad de colocar en la especie bovina la sonda a través de la cérvix abrió nuevas posibilidades
a la recolección de embriones, simplificando el procedimiento y disminuyendo el trauma uterino. Para
ello se crearon diferentes modelos de catéteres: rígidos (SUGIE y col., 1972), semirígidos (RASBECH,
1976) y flexibles (DROST, 1976; NEWCOMB y col., 1978; HAHN, 1978). Los mismos podían tener 2
vías, una para insuflar el balón de goma e inmovilizar el catéter y la segunda para inyectar y recolectar
el medio. RASBECH desarrolló en 1976 un sistema semirígido de recolección, a partir de una sonda
Foley de 2 vías. El volumen de aire a insuflar oscilaba entre 12-15 ml. La inyección de medio se llevaba
a cabo con una jeringa de 60 ml. La sonda Foley era introducida en un tubo rígido, quedando libre el
extremo anterior, a partir del balón para el aire y el extremo posterior. Los resultados obtenidos por el
autor (tabla 1) indican el éxito de la técnica propuesta, que constituyó el punto de partida de los
catéteres flexibles de 2 vías, empleados actualmente. Las experiencias y recomendaciones de
RASBECH siguen aún vigentes.
Tabla 1: Resultados obtenidos con la recolección no quirúrgica de embriones con el catéter semirígido
de RASBECH (1976)
CL
(n)
Vaca
Nr.
Ovocitos/embriones
recolectados (n)
Medio de lavaje
recolectado (%)
izq.
der.
izq.
der.
izq.
der.
1
7
6
7
4
86
96
2
2
3
2
3
100
100
3
9
7
7
4
100
100
4
6
3-4
5
3
100
100
Los catéteres de 3 vías permiten inyectar el medio por la segunda vía mientras la tercera conduce el
líquido fuera del útero. En la actualidad se emplean catéteres rígidos y flexibles, de 2 y 3 vías, y 3
métodos de recolección (PALMA y col., 1991):
Circuito cerrado con flujo continuo
Circuito cerrado con flujo discontinuo
Circuito abierto con flujo discontinuo
Circuito cerrado con flujo continuo
Con este método (ELSDEN, 1976; GREVE y col. 1977) se emplean catéteres de 3 vías, rígidos
(CASSOU, 1984, Foto 1) o flexibles (BRAND y col., 1978). Una vía, destinada a la inyección del medio
de lavaje, se conecta al frasco que contiene la solución por medio de una tubuladura de goma látex o
silicona. La solución
puede inyectarse por gravedad, colocando el frasco con el medio a
aproximadamente 1 m por encima del frasco recolector o con una jeringa, con el mismo procedimiento
que el método de flujo discontinuo (Fig. 2 y 3). Por la segunda vía se inyecta aire o medio para llenar el
balón y por medio de una tercera vía se recolecta la solución de lavaje, sin interrumpir la descarga.
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Fig. 2: Esquema del circuito cerrado con flujo continuo adaptado de ELSDEN (1976)
Circuito cerrado con flujo dicontinuo
Con este método se usa el catéter de 2 vías (Foto 3, Fig. 3a), una jeringa de 50-60 ml (Fig. 3b), una
válvula automática o manual (Fig. 3c), una unión de vidrio o plástico en forma de T o Y (Fig. 3d) y las
tubuladuras (Fig. 3 I y II). La válvula, que se coloca a la salida del frasco (Fig 3 c), permite extraer el
medio e inyectarlo en el interior del cuerno uterino. Luego de la inyección de un volumen variable de
medio (30-50 ml) se interrumpe el flujo de llenado para proceder a la segunda maniobra; el cuerno es
vaciado por la misma vía. Al ocluir la tubuladura de inyección (Fig. 3) la unión de vidrio en Y desvía el
medio a la segunda tubuladura (Fig. 3 II) que lo conduce al frasco recolector.
Fig. 3: Esquema de circuito cerrado con flujo discontinuo (adaptado de
BRAND y HOOGEKAMP, 1986)
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61
Circuito abierto con flujo discontinuo
Inyección y recolección con una jeringa.
Esta técnica se emplea con los catéteres flexibles de 2 vías (Fotos 3, 4, 5 y 7) y no requiere de
tubuladuras (Fig. 4). El medio se inyecta y recolecta por la misma vía y con la misma jeringa (50 ml).
Con ésta se descarga un volumen de medio fijado por el operador (Fotos 1 y 2) quien, como en el caso
anterior, debe palpar el cuerno uterino determinando y controlando su llenado a fin de evitar lesiones de
la pared uterina por exceso de medio. Las maniobras siguientes variarán de acuerdo al tipo de técnica
de lavaje que se aplique. Algunos operadores fijan y masajean el útero durante la inyección del medio.
Esta operación es particularmente importante cuando el animal no está fijado con una elevación del tren
anterior, que facilite el retorno del líquido de lavaje. Las dimensiones y peso del útero requieren que
éste sea elevado por el operador. Cuando la donante es fijada con una elevación anterior algunos
operadores no manipulan los cuernos uterinos, sólo verifican una vez el llenado. Luego retiran el brazo
del recto y continúan con la inyección de medio hasta completar el volumen preestablecido de líquido.
La recolección de los embriones en esta posición facilita el lavaje en animales con pariciones múltiples,
aun cuando se emplee además el masaje de útero. Esta forma es aplicada en los Centros de TE donde
ya se cuenta con la infraestructura necesaria. Presenta la ventaja que la manipulación no irrita al animal
y facilita la operación. Mientras se descarga la jeringa en el frasco recolector el catéter es ocluido con
una pinza hemostática o un clamp.
Fig. 4: Esquema del circuito abierto con flujo discontinuo. Inyección y recolección con una jeringa
Foto 1: Recolección por medio del sistema del sistema abierto. El operador inyecta el medio de lavaje
regulando el volumen de inyección y masajeando suavemente el cuerno uterino
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Foto 2: La recolección del medio inyectado se lleva a cabo aspirando el medio con ligera presión
negativa y elevando simultáneamente el cuerno uterino por su pared ventral
Ventajas y desventajas de tres métodos de recolección
Todas las técnicas, con sus diferentes modificaciones, como así también los catéteres mencionados se
emplean en la práctica con el mismo éxito. Por lo tanto, las diferencias entre ellos, como así también las
ventajas y desventajas observadas, no constituyen elementos de juicio excluyentes de uno u otro. El
operador será el que determine, en función de su experiencia, medios e infraestructura disponible, qué
técnica es la más adecuada para su modus operandi. Independientemente de esos factores, su
destreza es el factor más importante en la tarea de obtener los embriones.
El sistema de circuito cerrado con flujo continuo (fig. 5) permite, en su concepción teórica, un lavaje más
aséptico frente al método de inyección y extracción con jeringa, ya que el medio es conducido desde el
útero hasta el filtro o el frasco de recolección sin solución de continuidad. Ello es particularmente
importante cuando los lavajes se llevan a cabo en lugares abiertos. Sin embargo la tubuladura no es
fácil de lavar y secar, lo que puede provocar en la práctica, contaminaciones bacterianas, como
consecuencia de un lavado insuficiente o químicas, provocadas por un mal enjuagado o por la
deposición de sustancias esterilizantes (dióxido de etileno) en los restos de humedad.
Fig. 5: Circuito cerrado de 3 vías (Cassou, IMV, Francia)
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Recolección de los embriones
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El sistema de circuito abierto con jeringa no emplea tubuladuras y las jeringas son descartables o de
fácil lavado y esterilización, razón por la cual el riesgo de falta de limpieza e insuficiente secado es
mínimo. Con este sistema se debe tener siempre la precaución de obturar el catéter a fin de no perder
el líquido que pueda quedar en el útero mientras la jeringa con el medio recolectado es descargada en
el frasco recolector. Esta maniobra es sencilla y rápida si la donante es un animal manso y/o está bien
preparado (anestesia epidural, tranquilizante etc.). Sin embargo debe repetirse entre 14 y 20 veces por
animal, de acuerdo al volumen de lavaje empleado. Ello, en una vaca indócil o intranquila puede
conducir a complicaciones con pérdida de medio. Los programas de TE ambulantes constituyen una
limitante adicional para este método, dado que la infraestructura disponible en condiciones extensivas
es muy variable y en muchos casos inadecuada para la recolección de los embriones.
El sistema de circuito cerrado con flujo continuo, como ya fue mencionado, facilita el lavaje por que la
entrada y salida del medio se realiza en forma automática y continua, disminuyendo el tiempo de lavaje.
El riesgo de pérdida de medio como consecuencia de movimientos bruscos de la donante es
considerablemente menor. El sistema de circuito cerrado con catéteres rígidos (3 vías) es tan costoso
que no se emplea uno por animal sino el mismo para varios lavajes sucesivos. Ello aumenta el riesgo
de contaminación bacteriana siendo esa, posiblemente, la razón por la cual su uso no está extendido.
Por otra parte el catéter es de acero y permanece en el cuerno uterino durante el lavaje. Su empleo es
especialmente riesgoso en animales indóciles o intranquilos por peligro de lesiones de la pared uterina.
La vía destinada al retorno del medio posee orificios de reducida dimensión. Para evitar que ésta pueda
taparse con el mucus cervical se recomienda inyectar 10-20 ml de medio cuando el catéter atravesó la
cérvix. Otra forma que además evita el pasaje del mucus cervical al útero es aspirando el mucus con
una pipeta de inseminación por medio de una jeringa antes de introducir el catéter de recolección. La
sonda puede también taparse con coágulos de sangre o restos de mucosa, como consecuencia de la
laceración del endometrio, lo que impide el retorno del medio. En ese caso se deberá conectar una
jeringa a la tubuladura de esa vía para destaparla mediante la inyección del líquido de lavaje. El
circuito cerrado con flujo discontinuo tiene menos riesgos de taparse al disponer de una vía común
de inyección y recolección. El catéter de doble vía que se emplea para ello dispone además de orificios
considerablemente mayores. Si éstos se taparan con mucus o coágulos, la siguiente inyección de
medio los liberará.
Los catéteres, disponibles en el mercado, constituyen también un tema per se en cuanto a sus precios.
El catéter de 3 vías de acero es el más costoso. Su precio pone en duda su empleo si el profesional
destina un catéter por donante como lo dispone la Asociación Internacional de Transferencia de
Embriones. Los catéteres flexibles de 2 vías, que se ofrecen específicamente para TE (Foto 3), son más
accesibles que los primeros, pero constituyen una inversión de importancia de acuerdo a la cantidad
que se disponga. El catéter armado a partir de una sonda Foley (Foto 4) reduce los costos
sensiblemente sin disminuir el éxito de recolección con respecto a los anteriores.
SUBRAMANIAN y DEVARAJAN (1991) presentaron un método "vagino-cornual" de recolección para las
vaquillonas donantes cruza Bos indicus x Bos taurus. El mismo tiene como objeto mejorar la recolección
de los embriones de donantes que por la edad o la raza (Bos indicus) permiten obtener tasas de éxito
menores que vacas adultas y razas europeas. La colocación del catéter se lleva a cabo por medio de un
by-pass a través de la pared antero-lateral de la vagina (fornix) a los cuernos uterinos (antes de la
bifurcación), con una vaina rígida, que permite atravesar las paredes vaginal y uterina según el método
de TERSTARD y GODARD-SIUR. La recolección se lleva a cabo con un catéter flexible. Los autores
concluyen en la aplicabilidad de la técnica para el tipo de donantes descrito, acentuando la ausencia de
un efecto negativo sobre la fertilidad de las mismas. Sin embargo recomiendan el entrenamiento en la
práctica de la técnica antes de aplicarla en animales de valor. Queda por establecer la repetibilidad de
la misma teniendo en cuenta las perforaciones de la pared uterina.
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Foto 3: Catéter flexible de 2 vías, modelo Minitüb, Alemania
Foto 4: Catéter flexible de 2 vías, armado a partir de una sonda Foley (LAMPETER, 1977)
Foto 5: Punta metálica (según LAMPETER) de un catéter flexible. Antes del lavaje debe controlarse la
integridad del balón
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Preparación de la donante, anestesia epidural
La preparación del animal dependerá de varios factores, entre los que se encuentran la infraestructura
disponible de acuerdo al tipo de establecimiento ganadero (producción intensiva o extensiva), la
docilidad del animal como así también la destreza y experiencia del operador.
Antes de la operación de lavaje es necesario vaciar el contenido rectal, precisar la posición y
dimensiones del útero y la respuesta ovárica al tratamiento superovulatorio (No de cuerpos lúteos,
presencia de folículos). El vaciado del recto y la toilette de la región peri anal son las primeras
maniobras. Usualmente se continúa con la tranquilización y anestesia local de la donante (PETERS y
BALL, 1986; MAPLETOFT, 1986).
A fin de contar con una buena relajación del recto se puede aplicar anestesia epidural baja (HALL,
1974; LUMB y JONES, 1979), administrando 4-6 ml de Lidocaina (2%), en el espacio comprendido entre
la primera y segunda vértebra coccígea. La cánula se coloca en una posición de 90o para atravesar la
piel. Luego en un ángulo de 45o desde la piel hacia craneoventral. Cuando la aguja ingresa al canal
medular circula aire en su interior, que provoca, en algunos casos, un ligero zumbido. Una prueba más
segura es la aplicación de unas gotas de anestésico en la entrada de la aguja, que serán aspiradas al
interior del canal vertebral, si ésta está bien colocada. Si la aguja llegase a topar una superficie ósea
significa que llegó al piso de la 1o vértebra coccígea. En ese caso retirar la aguja aproximadamente 0,5
cm (WESTHUES y FRITSCH, 1960). La inyección debe aplicarse lentamente y sin resistencia alguna.
El inicio del bloqueo sensitivo y motor se hace evidente por la flaccidez de la cola, por la falta de
respuesta del esfínter anal y de la vulva al pellizco. A pesar que la relajación de la cola es inmediata, la
acción anestésica sobre el recto y el esfínter del ano requiere 10 minutos aproximadamente. Por otra
parte puede producirse un efecto anestésico incompleto, con una buena anestesia de la cola (flaccidez)
pero insuficiente anestesia de los órganos de interés, causado por lo general por una incorrecta
administración. En ese caso deberá suplementarse o repetirse la dosis. Es importante destacar que una
insuficiente anestesia epidural puede ocasionar el fracaso del lavaje en animales indóciles.
Al levantar la cola para inmovilizarla, después de la administración del anestésico, ocurre -en algunos
casos- el ingreso de aire al recto. Ello constituye una seria complicación por que el mismo pierde
sensibilidad y capacidad de expulsar el aire. Si este fuera el caso se recomienda hacer caminar al
animal a fin de que la prensa abdominal ejerza presión sobre el recto y expulse el aire retenido. Otra
alternativa es eliminar el aire por medio de aspiración con un tubo flexible (RUBIN, 1991), para lo cual
se emplean una bomba aspirante de pequeño poder. Levantar y fijar la cola sólo después que el
operador introdujo el brazo en el recto. La vulva y la región que la rodea deberán ser lavadas,
desinfectadas (iodo povidona, alcohol 70%) y secadas.
Cuando se trabaja con hembras indóciles es conveniente emplear una combinación tranquilizante y
relajante de 100-200 mg de clorhidrato de ketamina y 0,5-1,5 ml de xilazina (0,1%) totales, según el
peso del animal. También es posible la administración de sólo uno de ambos productos. Después de su
aplicación es importante dejar a la vaca tranquila durante 10-20 minutos, a fin de que los ruidos y el
contacto con el animal no perjudiquen el efecto de los medicamentos. Por esta razón el tranquilizante se
aplica en general después de la rectalización y antes del resto de los preparativos (toilette perianal,
anestesia epidural, materiales etc.)
Previo a la introducción del catéter de lavaje se puede aspirar el mucus cervical con una pipeta de
inseminación y una jeringa de 20 ml y aumentar la luz cervical con ayuda de un dilatador de acero
inoxidable (foto 6). Este instrumento es, además, de utilidad para determinar el diámetro de la luz
cervical a través del grado de dificultad para atravesar la cérvix. Los operadores, que adecuan
diferentes modelos y/o tamaños de catéteres según el diámetro del cuello del útero, podrán determinar
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con ayuda del dilatador cual será el instrumento más adecuado para el lavaje. Si la cérvix presentó
resistencia al pasaje, el dilatador se deja colocado en la luz cervical -no en el cuerpo del útero - durante
2-5 minutos. Mientras tanto se puede llevar a cabo la palpación diagnóstica del útero y los ovarios, a fin
de determinar dimensión, forma, y respuesta superovulatoria (No de cuerpos lúteos y folículos), datos
de importancia para el protocolo de cada donante. Algunos operadores no emplean el dilatador y otros
lo hacen cuando el grado de oclusión cervical es tal que no permite la introducción del catéter de lavaje.
La desventaja de esta forma de trabajo es la extracción del catéter de la vagina con el riesgo de
arrastrar impurezas en el segundo intento. No es necesario esterilizar el dilatador ni el mandril, bastará
con un buen lavado y posterior tratamiento con un desinfectante de superficie (alcohol etílico 70%,
isopropílico 70%, etc.).
Foto 6: Dilatador cervical
Colocación del catéter y lavaje del útero
Antes de colocar el instrumento, éste debe ser enjuagado con la misma solución destinada el lavaje
(PBS + 1% SFB). Ello contribuirá a lubricar y eliminar las impurezas que pudieran haber quedado
después de una esterilización con gas (óxido de etileno).
El catéter es introducido en el vestíbulo de la vulva, separando sus labios. Los catéteres de goma o
silicona, a diferencia de los de acero, requieren para ello un mandril. Para atravesar la cérvix el
operador debe fijarlo por delante de la punta del catéter modificando su posición hacia arriba y abajo
como así también en forma lateral sucesivamente, empujando suavemente el instrumento hacia craneal
simultáneamente. Al llegar al último anillo se deberá presentar el cuerno uterino, ligeramente elevado,
frente a la punta del catéter. En este momento es imprescindible tener especial precaución de controlar
la fuerza que se ejerce sobre el catéter, a fin de no atravesar bruscamente la cérvix y perforar la pared
uterina. Cuando el instrumento alcanzó el cuerno del útero, éste último se endereza levantándolo de su
cara ventral mientras se avanza el catéter muy suavemente hasta el 1/3 medio del órgano.
No deberá existir resistencia alguna, si así ocurriera se debe retroceder el instrumento, presentar el
cuerno uterino (estirarlo suavemente) y avanzar nuevamente.
El ligamento intercornual, la curvatura uterina y el extremo anterior del cuerno deben ser puntos de
referencia permanente del grado de avance del catéter. Una vez alcanzada la posición próxima a la
deseada (por ejemplo borde del ligamento intercornual) se libera el catéter del mandril, se desplaza este
último unos centímetros hacia caudal y se deslizan ambos suavemente hacia craneal, unos 5 cm.
Repetir la operación un par de veces hasta comprobar una óptima colocación del catéter en el cuerno
uterino. De esta forma es posible colocar el catéter sin manipular excesivamente los cuernos. Después
de esta maniobra se procede a inyectar con aire el balón del catéter. El volumen de inyección varía en
función del diámetro de esa porción del útero y esto depende de la edad y tamaño del animal, como así
también de las pariciones previas. En general el volumen varía entre 15 y 20 ml. El operador es el que
determinará, por medio de la palpación, el volumen a inyectar. Se debe tener en cuenta que su exceso
produce aplastamiento de la mucosa endometrial con hemorragias, y en casos más graves, desgarro de
la pared uterina.
Con el catéter ya fijado, el operador deberá comprobar la correcta posición del instrumento. Si fuera
necesario se retirará el aire del balón de goma y se avanzará más hacia craneal. Suele ocurrir que el
operador inexperto cree fijar el catéter en un cuerno y no recolecta medio con las sucesivas inyecciones
de medio. Ello ocurre cuando el instrumento fue fijado en el cuerpo del útero y el líquido fluye a ambos
cuernos o si el balón desgarró la pared uterina. En ambos casos se podrá comprobar por palpación la
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ubicación del balón de goma o de la punta del catéter (si ésta es de acero, modelo LAMPETER, 1977a
y b). Si el balón se encuentra en el extremo anterior del cuerno uterino y éste no se ingurgita al inyectar
la solución significa que el exceso de aire del balón desgarró la pared uterina o que ésta fue perforada
con la punta del catéter. El medio es expulsado en dirección a la cavidad abdominal, en algunos casos
sólo un reducido volumen sanguinolento es recuperado.
La presencia de la herida no significa que se deba renunciar al lavaje del cuerno, particularmente si se
trata de embriones de gran valor. Resolver este problema requiere, sin embargo, destreza y sobre todo
mucha delicadeza para trabajar con el útero perforado y no agravar la lesión. Ello constituye una seria
limitante sobre todo si se tiene en cuenta que esos problemas son producto de la inexperiencia. El
operador deberá decidir de acuerdo a su criterio cual será la actitud a tomar. El catéter debe ser
colocado delante de la lesión, si es que su ubicación lo permite. Ello requiere buena sincronización
entre el operador y su asistente.
Dado que la lesión sólo puede ser determinada por crepitación en el momento de la inyección del medio
de lavaje, junto con la baja o nula recuperación del líquido ya mencionadas, no es posible fijar su
posición después que el balón fue desinflado. En consecuencia el operador deberá estar preparado
para avanzar con el catéter cuando el asistente vacíe el balón. El instrumento deberá ser colocado por
lo menos 5 cm por delante de la lesión (de acuerdo al tipo de catéter), para evitar el aumento de la
lesión de la pared del útero al inflar el balón. En los casos en que el catéter no pueda avanzar más
(genital muy largo o posición anterior de la lesión provocada por el extremo anterior del catéter) se
recomienda renunciar a ese cuerno para evitar complicaciones de gravedad.
Si la rápida evaluación indica que el catéter está bien colocado se procede a inyectar el medio de
lavaje. El volumen de líquido a inyectar varía de acuerdo a la dimensión del cuerno y en función con la
proximidad del catéter a la unión útero-tubárica. En consecuencia, la cantidad de medio debe ser
regulada cuidadosamente por el operador, a fin de inyectar la suficiente cantidad para producir en el
interior del cuerno uterino, la presión de retorno sin que su exceso provoque dolor, que intranquiliza al
animal, o lesiones. El volumen a inyectar varía entonces entre 30-50 ml. El volumen total empleado para
cada cuerno uterino variará según el criterio del operador entre 500, 700 (MUNAR y col., 1989) y 1000
ml (KÖNIG y ROMMEL, 1987). Este puede ser recolectado en diferentes tipos de recipientes y filtrado
durante o después de la recolección. La recuperación óptima no es inferior al 90% del volumen
inyectado. Algunos autores sostienen que la mayor parte de los embriones y ovocitos se obtienen
después de haber recuperado 200 ml. La temperatura del medio de lavaje debe ser de 37-39o C, los
frascos a tal fin deben mantenerse en baño María (foto 10). Una vez terminado el lavaje se repite la
misma operación en el otro cuerno uterino.
De acuerdo al grado de flexibilidad del catéter es posible cambiarlo de cuerno uterino sin sacarlo del
tracto genital. Para ello es conveniente retirar el catéter flexible hasta la cérvix e introducir lentamente el
mandril. El modelo LAMPETER (1977, foto 4 y 7), con punta metálica (foto 5), se adecua muy bien a
esta operación, por que cuando el mandril llega a la punta se produce un chasquido (LAMPETER,
1978). Catéteres muy flexibles (goma látex) son deformados por los anillos de la cérvix, lo que impide la
colocación del mandril, razón por la cual es necesario sacarlos del tracto genital, al menos hasta el
segundo anillo de la cérvix, para introducirles el mandril.
Una exitosa maniobra de lavaje no garantiza siempre la recolección del número esperado de
embriones/ovocitos en función de la cantidad de CL palpados. Las razones que motivan estas
diferencias cuantitativas pueden ser variadas y no se conocen con exactitud. No siempre es posible
explicarse este fenómeno a través de un mayor número de ovocitos no fertilizados, embriones
retardados o degenerados que pueden quedar atrapados en el oviducto o ser reabsorbidos. La falta de
experiencia puede ser una razón válida, como así también problemas de lavaje aún en grupos
experimentados. La repetición del lavaje el mismo día (6-12 h después) o al día siguiente (LANDSVERK
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y col., 1991) ha dado, en algunos casos, buenos resultados para aumentar la tasa de recolección, razón
por la cual debe tenerse en cuenta un segundo lavado.
Foto 7:
Catéter de 2 vías con punta metálica según Lampeter, Minitub®, Alemania
Formas de obtención y búsqueda de los embriones
Luego del lavaje por medio de las técnicas no quirúrgicas, la aislación de los embriones de los grandes
volúmenes de medio se puede hacer por medio de sedimentación o filtración del medio recuperado.
Para la sedimentación de los embriones se emplean recipientes con forma de embudo y un cierre
hermético en su fondo, probetas o frascos de 0,5-1,0 l. Los recipientes deben estar a una temperatura
constante de 37 C ó 20 C (baño María, foto 11, o temperatura ambiente) y protegidos de la luz solar
directa. La sedimentación de los embriones requiere 20-30 minutos. Cumplido este tiempo se elimina el
sobrenadante por medio de un tubo flexible (tipo sondas pediátricas nasogástricas) que, por capilaridad
elimina lenta y progresivamente (de arriba hacia abajo) el volumen recolectado, a fin de evitar
turbulencias que hagan ascender a los embriones. El tiempo necesario para eliminar el sobrenadante
varía, en función de su volumen y del tamaño de la sonda, entre 15-25 minutos. La forma y velocidad de
eliminación del medio de lavaje es por goteo rápido.
Para acortar el tiempo que demandan las 2 operaciones mencionadas se emplean actualmente filtros
estériles con malla de acero inoxidable o plástico de 60-90 m de diámetro de poro. Estos se pueden
presentar en recipientes con forma de embudo (foto 8) donde se vuelca el medio recolectado del frasco
(después del lavaje) o directamente del catéter (durante el lavaje). Por medio de este último
procedimiento el filtro se va vaciando por su parte inferior a medida que se llena con el medio
recolectado, ahorrando de esta forma el tiempo de sedimentación, dado que los embriones quedan
contenidos en el recipiente filtrante. Otros dispositivos de filtración están unidos a un tubo de silicona, se
colocan en el recipiente con el medio recuperado (probetas) y eliminan el sobrenadante por capilaridad
(foto 9). Los embriones quedan, de esta forma, retenidos en la probeta por medio de su malla filtrante
intercambiable. La firma que los comercializa recomienda sin embargo un tiempo de sedimentación de
20 minutos. Recientemente fue presentado un nuevo filtro (Genetro, México, foto 10) que presenta la
particularidad de recolectar el medio de lavaje, la filtración y la búsqueda de los embriones sin pasos
intermedios. Su base plana y transparente permite retirar los embriones bajo observación microscópica
con el ahorro consecuente de tiempo.
El volumen de solución conteniendo los embriones (40-50 ml) se vuelca en 4-5 vidrios de reloj o en 2-3
placas de Petri (de 130 mm de diámetro) con divisiones. Para garantizar una completa observación
visual de la superficie total de la placa, la búsqueda deberá hacerse en forma de guarda griega, tanto en
el sentido de las abscisas como de las ordenadas (orientándose de acuerdo a la disposición de los
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cuadrados, Fig. 6). Para ello existen en el mercado placas cuadriculadas como la de la figura. El
cuadriculado puede trazarse, además, en las placas plásticas con un marcador fino indeleble o una
aguja hipodérmica, en la parte externa del piso como también en la tapa, colocando ésta bajo la placa
durante la búsqueda.
Foto 8: Filtro plástico en forma de embudo, Em-com EE.UU.
Los embriones encontrados deberán ser transportados a una placa de Petri más pequeña (3 mm) o a
una placa de cuatro celdas Nunc, con medio enriquecido con suero. Esta operación deberá repetirse a
fin de "lavar" los embriones antes de la transferencia o de la congelación, según lo establecido en el
reglamento de la IETS.
Foto 9: Filtro plástico con malla intercambiable (Minitüb, Alemania), combinado con una probeta
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Foto 10: Filtro Malinche I (Genetro, México)
Fig. 6: Procedimiento de búsqueda de los embriones
El pasaje de los embriones entre las placas se realiza con distintos tipos de tubos v capilares. Algunos
microcapilares (50 µl, Unopette®) se emplean con jeringas de 1 ml (Foto 12), otros (5-20 µl) con
micropipetas especiales (Transferpettor®, Foto 13) o simplemente tubos de vidrio estirados con el fuego
de un mechero Bunsen. En todos los casos se deberá tomar la precaución de redondear, con la llama
de un mechero, los bordes del tubo que toman contacto con el embrión, a fin de evitar lesiones de la
zona pelúcida o de su masa celular. Una vez que los embriones fueron lavados se puede llevar a cabo
la evaluación morfológica de los mismos.
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Foto 11: Baño María transportable
Foto 12: Capilar hecho con ayuda de un mechero Bunsen (1) y Unopette® (2) combinado con una
jeringa de 1 ml
Foto 13: Transferpettor® de 5 µl, Brand, Alemania
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Foto 14: La búsqueda y evaluación de los embriones no sólo requiere de microscopios con buenas
ópticas sino también con una buena superficie de apoyo, a fin de evitar accidentes con las
placas. Microscopio Zeiss con mesa diseñada por Palma y Hoffmann (1992)
Material necesario para efectuar un lavado y seis transferencias
Lavaje
Dilatador cervical
Catéter recolección de embriones
Mandril
Jeringa 60 ml
20 ml
Clamps
Botella para el medio de recolección
Tubo de recolección del medio, con peso y adaptador
Filtro
Recipiente de vidrio 500 ml
Lubricante
PBS
Suero fetal bovino
Toallas de papel
Agujas 18 descartables x 11/2
Baño de agua con temperatura controlada portátil
Incubadora portátil
Procaína al 2%
Maleato de acepromacina
Clorhidrato de xilaxina
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1
2
2
2
2
2
3
2
2
3
1l
2l
6
1
1
10 ml
2 ml
1 ml
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Agua destilada
Frasco estéril con tapón de goma, 20 m
Prostaglandina F2
Alcohol
Algodón
Tijera
Balde y fuentón de material plástico
Etiquetas
Marcadores
20 ml
1
1 dosis
Aislación de los embriones
Lupa estereoscópica
Pipetas para manipulación de embriones
(Capilar, Unopette o Transferpettor®)
Filtros 0,22 µm de poro, tamaño: 26 mm
Cajas de Petri
130 mm diámetro,
35 mm "
o vidrios de reloj
Jeringas descartables:
1 ml
5 ml
10 ml
Marcadores
Etiquetas
2
6
5
6
2
3
2
Transferencia
Catéteres de transferencia
Vaina protectora
Minipajuelas (pajillas) 0,25 ml
Guantes de tacto
Procaína al 2%
Tijera
Lubricante
Toallas de papel
Desinfectante
6
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EVALUACION MORFOLOGICA DE LOS EMBRIONES
G. A. Palma
Desarrollo embrionario. Nomenclatura
Después de su liberación, el ovocito es "atrapado" por las fimbrias del infundibulum y dirigido al interior
del oviducto a través de la actividad ciliar. El ovocito bovino, fertilizado o no, es una célula de 150-190
m de diámetro (LINDNER y col. 1983), incluyendo a la zona o membrana pelúcida, una capa acelular
glicoproteica (NODEN y NAHUNTA, 1985) de 12 a 15 m de espesor producida por el ovocito (DIETL,
1986). En la ampolla del oviducto la fecundación desencadena el comienzo del desarrollo previo a la
nidación del embrión. Pocas horas después de la fusión nuclear el cigoto comienza a dividirse. La
división nuclear es mitótica y las nuevas células se denominan blastómeros. El desarrollo del embrión
hasta los 8 días ocurre dentro de la zona pelúcida. En los primeros 6 días de desarrollo no se manifiesta
aumento de tamaño, sólo el incremento del número de blastómeros.
La edad del embrión es establecida a partir del día del estro (d0). Al d1 le corresponde la ovulación. De
esta forma entre 24 y 36 h después de la fertilización el cigoto de una célula se divide en 2 células
ovales (d2, Fig. 1); 24 h más tarde (d3) el embrión cuenta ya con 4 células. La división de los
blastómeros puede cumplirse en forma asincrónica, razón por la cual es posible observar en estadios
tempranos un número impar de células. El intervalo entre la división más temprana y la más tardía es
de alrededor de 4h (PEDERSEN, 1988). Hasta el estadio de 8 células (d4) el cigoto es transportado a
través del oviducto. El día 5 -aproximadamente- se produce el ingreso al cuerno uterino en estadio de
16 células, momento a partir del cual es posible obtener el embrión en forma no quirúrgica y evaluarlo
de acuerdo a su estadio y calidad. Dentro del 5o dia el cigoto continúa su desarrollo a 32 blastómeros y
su forma es similar a la de una mora, razón por la cual se lo denomina mórula temprana (Foto 1), en la
cual es posible distinguir individualmente a los blastómeros. Su masa celular ocupa casi todo el espacio
perivitelino.
Mórula compacta Mc, d 5-6, aprox. 32-64 blastómeros. Sus blastómeros están unidos y constituyen
una masa compacta que ocupa sólo el 60-70% del espacio perivitelino (Foto 2). La compactación es
considerada como uno de los signos de diferenciación embrionaria (PEDERSEN, 1988), aunque los
blastómeros conserven su capacidad totipotente.
Blastocisto temprano Bt, d7 100-200 células. Se caracteriza por el comienzo del transporte de fluido
en las células trofoectodérmicas y por la formación de una cavidad (blastocele) en el interior del
embrión, dando la apariencia de un anillo de sello (LEIBO, 1985). El Bt ocupa 70-80% del espacio
perivitelino. Es posible diferenciar el trofoblasto de la masa celular interna (Foto 3).
Blastocisto B, d 7-8, 100-200 células. Existe una marcada diferenciación entre las células del
trofoblasto, que constituyen una pared -que se adosa a la zona pelúcida- y la masa celular interna (o
disco embrionario) más oscura (Foto 4).
Blastocisto expandido Be, d 7-8, más de 200 células. El diámetro aumenta considerablemente (1,2 a
1,5x), con el consecuente adelgazamiento de la zona pelúcida a 1/3 de su espesor original (Foto 5). La
presión creciente del blastocisto en crecimiento provoca la ruptura de la zona pelúcida, a través de la
cual comienza su protrusión (foto 5, 6, y 7). Los embriones recuperados en este estadio se pueden
colapsar temporalmente, esto se caracteriza por una pérdida completa o parcial del blastocele.
Blastocisto protruido Bp, d 8-9, 200-800 células. Los embriones han abandonado la zona pelúcida. Su
forma puede ser esférica, con un blastocele bien definido ("burbuja") o colapsado. La identificación en
este estadio puede ser dificultosa para el operador inexperto (Foto 8). Los Bp pueden ser igualmente
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Evaluación morfológica de los embriones
77
transferidos, sin embargo, los embriones desprovistos de la zona pelúcida son extremadamente frágiles
y pegajosos, razón por la cual se acostumbra a transferir estadios de Mt a Be.
En condiciones naturales, el ovocito liberado y fertilizado sigue el desarrollo mencionado anteriormente.
Sin embargo, los ovocitos producidos por hembras superovuladas, en muchos casos, no son liberados
simultáneamente sino en un período de varias horas (LINDNER, 1983, ver tabla 3), CALLENSEN y col.
(1986) observaron que vacas superovuladas comenzaban a ovular 24h después del pico de LH
prolongándose la ovulación aún 33h después del mismo. En consecuencia, los ovocitos liberados no
son fertilizados en el mismo momento. También puede ocurrir que el desarrollo de los ovocitos,
fertilizados al mismo tiempo, no sea sincrónico. La consecuencia práctica de estos fenómenos es que
los embriones obtenidos de una vaca donante se encuentren en diferentes estadios de su desarrollo
(mórulas y blastocistos). Estas diferencias pueden ser encontradas en una donante como también entre
donantes, son dependientes del tipo de tratamiento hormonal y no son consideradas como anómalas
siempre que la asincronía no exceda los valores preestablecidos (ver Tablas 1, 2 y 3).
Las donantes difieren en su respuesta superovulatoria por factores que dependen de sus cualidades
genéticas, edad, estado fisiológico y salud reproductiva. Todos estos factores se traducen en
diferencias cuanti- y cualitativas. Las últimas son importantes de reconocer para determinar qué
embriones están en condiciones de desarrollar y concluir en un ternero vivo, qué embriones están
degenerados y cuáles presentan anormalidades que permiten tener solo reducidas expectativas de
sobrevida (SHEA y col., 1976).
Tabla 1: Cronograma normal del desarrollo de los embriones d6-9 después de un tratamiento
superovulatorio con PMSG (eCG), KAUFFOLD y col. (1985)
Estadios de desarrollo
Tipo de desarrollo
d6
d7
d8
d9
Normal
Mt
Mc
B
Bt
Be
Bp
Be
B
Ligeramente
retrasado (24 h)
16 blastómeros
Mt
Mc
B
Bt
Be
Mt
Bt
Retardado (48 h)
8 blastómeros
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16 blastómeros
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Palma
78
Fig. 1: Desarrollo y tránsito embrionario en el tracto genital
Evaluación morfológica
Criterios
La evaluación morfológica de un embrión considera los siguientes criterios sobre las estructuras y
cualidades de un embrión de excelente calidad:
Forma esferoide
Simetría de los blastómeros
Apariencia clara y neta de los blastómeros.
Tonalidad oscura y uniforme
Uniformidad de la membrana celular
Proporcionalidad entre el embrión y el espacio perivitelino.
Integridad de la zona pelúcida
Ausencia de vacuolas en el embrión y bridas celulares en el espacio
perivitelino
Ausencia de detritus celulares adheridos a la zona pelúcida
Compactación de los blastómeros entre si
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Evaluación morfológica de los embriones
Foto 1: Mórula temprana d 5 (Mt GII)
Foto 3: Blastocistos tempranos d 7 (Bt G I)
79
Foto 2: Mórulas compactas d 6 (Mc GI-II)
Foto 4: Blastocistos d 7 (B GI)
Foto 5: Blastocistos expandidos protruyendo d8 Foto 6: Blastocisto expandido protruyendo d 8 (Be
(Be GI)
GI)
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Palma
80
Foto 7: Blastocistos expandidos d 8-9 (Be GI-II)
Foto 8: Blastocisto protruido y zona pelúcida 8-9
(Bp GI)
Foto 9: Blastocistos protruido d 8-9 (Bp GI y III), 16x
Foto 10: Blastocisto protruido (Bp GI) d 9-10 y
embrión degenerado (GIV)
Grados de calidad
La determinación del grado de calidad del embrión permite caracterizar en términos (más o menos)
cuantitativos las posibilidades de desarrollo y posterior nacimiento de un ternero a partir del embrión
obtenido (tabla 4). Los diferentes grados de calidad son determinados por medio de la observación
microscópica de la morfología con ayuda de una lupa estereoscópica (0,7-6,4x). Existen distintas
escalas de calidad embrionaria, desarrolladas por distintos equipos de trabajo. Tanto la observación per
se, como la diferenciación entre un grado y otro es subjetiva y depende, en gran parte, de la experiencia
del operador.
G I: Excelente, el desarrollo corresponde al día de la recolección. No existen defectos visibles. Los
blastómeros son claramente visibles, de color y estructura uniformes, simétricos, de forma
esferoide y la zona pelúcida está intacta (Fotos 2, 5-8 y 10)
G II: Bueno, el embrión tiene muy pocos blastómeros desprendidos de la masa celular y/o posee una
pequeña cantidad de detritus celulares. Su forma puede ser ligeramente irregular (Foto 2, 9).
G III: Regular, el embrión posee varios defectos: detritus celulares, forma irregular, de color muy oscuro
o muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona pelúcida (Foto 11).
G IV: Malo, el embrión posee muchos defectos: los correspondientes al G III más desarrollo retardado,
seria ruptura de la zona pelúcida -el embrión puede encontrarse parcialmente fuera de ella-,
forma muy asimétrica, tendencia a la desintegración como granulación o vacuolización de los
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Evaluación morfológica de los embriones
81
blastómeros. Incluye también a los estadios hasta 8 células y la clara degeneración. Esta
categoría es considerada como no transferible (Foto 12).
Ovocito sin fertilizar (Foto 13)
KUZAN (1988) califica a los embriones en 6 categorías. Las primeras 3 coinciden con las del cuadro
superior. La 4. caracteriza a los embriones de baja calidad que aún son considerados transferibles, la 5.
a los degenerados y la 6. a los ovocitos sin fertilizar o a las zonas pelúcidas vacías. Un bajo número de
blastómeros libres no afecta la capacidad de desarrollo del embrión, sin embargo más de 5 blastómeros
separados de la masa celular o degenerados disminuyen su capacidad de sobrevivencia (KUZAN,
1988).
Foto 11: M G III
Foto 13: Ovocito sin fertilizar
Foto 12: M G IV
Foto 14: Existen, como en este caso embriones,
sobre los cuales el criterio y experiencia
determinarán si son transferibles. Las necesidades y
disponibilidad de receptoras, sin embargo, sí se
transferirán
El éxito de la TE depende, entre otros factores, de una intensa experiencia en la evaluación y
manipulación del embrión. Embriones clasificados como excelentes o buenos tienen una alta
probabilidad de alcanzar la preñez (60-70%). Embriones calificados como dudosos pueden ser
cultivados durante unas horas (2-4) -para evaluar su desarrollo- o transferidos, según el criterio del
operador y los medios disponibles (No de embriones obtenidos, No de receptoras, etc.). No obstante la
correcta evaluación de los embriones obtenidos, es importante tener en cuenta que existen casos en los
cuales embriones calificados excelentes luego de una perfecta transferencia no concluyen en una
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preñez mientras que embriones de muy baja calidad y transferidos con dificultad, concluyeron en
preñeces y nacimientos normales (ELSDEN y SEIDEL, 1990).
Tabla 2: Cronograma de desarrollo embrionario (%) en varios momentos después del celo con PMSG
(n = 3301 embriones, KAUFFOLD y col., 1985)
Estadio
Dias después del celo
6
7
8
2-8 células
29,9
9,8
8,0
16 células
11,0
2,0
0,7
Mt
42,6
8,5
6,2
Mc
15,8
32,9
9,5
Bt
0,3
26,4
16,6
19,1
45,4
0,9
0,8
0,4
12,4
B
Be
0,4
Bp
Desarrollo
retardado
ligeramente
subnormal
normal
Tabla 3: Estadios de desarrollo de embriones recolectados en distintos momentos después del estro
(LINDNER y col., 1983).
Estadio de desarrollo embrionario
(% del total de embriones recuperados)
n= 1043 embriones
Días después
del estro
M
Mc
Bt
B
Be
Bp
5
16
células
10
55
35
-
-
-
-
total
embriones
20
6
5
20
67
8
-
-
-
79
7
-
3
37
30
23
6
1
274
8
-
-
14
21
24
36
5
499
9
-
-
-
7
22
4
28
171
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Evaluación morfológica de los embriones
Tabla 4:
83
Tasas de preñez (n) obtenidas en 5 estudios diferentes con embriones clasificados
morfológicamente en distintas categorías. Revisión de BETTERIDGE y col. (1989)
ELSDEN & col.,
1978
SHEA,
1981
LINDNER
& WRIGTH, 1983
HASLER & col.,
1987
HASLER &
col., 1987
A
63
(173/275)
71
(5/7)
45
(130/292)
73
(4073/5521)
83
(451/542)
B
58
(88/152)
56
(576/672)
44
(128/292)
60
(181/304)
75
(307/408)
C
31
(13/42)
44
(57/130)
27
(40/149)
41
(31/76)
63
(135/214)
D
12
(5/42)
Calidad*
20
(10/50)
46
(6/13)
* Las clasificaciones varían entre autores. A es excelente y D malo
La evaluación morfológica de los embriones es uno de los pasos más importantes para el éxito de un
programa de transferencia de embriones. Determinar la transferencia de un embrión exclusivamente a
través de sus cualidades morfológicas es, sin embargo, una equivocación. Otros factores como el valor
del embrión en particular y también la disponibilidad de receptoras son importantes en la decisión.
Es conveniente además acentuar que una estricta selección de los embriones por medio de su
evaluación morfológica aumenta la tasa de gestaciones por transferencia pero, al mismo tiempo,
disminuye la tasa de preñez por cada donante (BETTERIDGE y col., 1989).
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Transferencia de los embriones
85
TRANSFERENCIA DE LOS EMBRIONES
G.A. Palma
Introducción
El desarrollo de la transferencia de embriones fue paralelo al de la recolección. Cuando los embriones
fueron recolectados 5-7 días después del estro por medio de cirugía y bajo anestesia general, las
receptoras fueron preparadas para la transferencia bajo las mismas condiciones que las donantes.
En un esfuerzo por eliminar los problemas asociados con la anestesia general, sin alterar la eficacia de
la recolección quirúrgica, algunos grupos cambiaron hacia el uso de la anestesia local. Esta variante fue
aplicada inmediatamente a las receptoras. Su empleo exitoso permitió que se siga utilizando en la
práctica. Los resultados obtenidos empleando la transferencia no quirúrgica se aproximan a los
obtenidos con el método quirúrgico, razón por la cual esta última técnica tiene actualmente pocos
usuarios.
Transferencia quirúrgica
La primera transferencia quirúrgica con éxito en bovinos fue lograda por WILLET y col. en 1951. Los
autores practicaron la cirugía bajo anestesia general, con el animal en posición decúbito dorsal y por la
línea media. El cuerno uterino ipsilateral al ovario con cuerpo lúteo era presentado para ser punzado.
Una pipeta -conteniendo el embrión- era introducida a través del punto de punción y el embrión era
expulsado en la luz uterina en un volumen mínimo de medio (0,2 ml). AVERY y col. (1962) simplificaron
la técnica quirúrgica transfiriendo los embriones a la receptora en pie y por el flanco. A fin de determinar
a priori qué cuerno era el ipsilateral a la ovulación, se procedió a palpar previamente a las receptoras.
La elección del flanco a incidir lo determina el ovario ovulado. Esta laparotomía lateral es adoptada en la
actualidad para una parte de las transferencias de embriones. La anestesia local puede ser
complementada con una paravertebral (60 ml de Procaina 2% en plano). La transferencia es practicada
a través del borde dorsal en el tercio anterior del cuerno. Los problemas de esta técnica lo constituyen:
la dificultad de exteriorizar el cuerno uterino sin causar traumas en el tracto genital, especialmente en
vaquillonas, vacas muy grandes y gordas (ELSDEN y SEIDEL, 1990)
El embrión puede ser transferido con una pipeta Pasteur o pajuela plástica (0,25 -0,50 ml). La sutura se
hace según los métodos de rutina. La preñez con esta técnica varía entre 70-80%, con embriones
frescos (BAKER y col., 1984; TAKEDA y col. 1986) y aproximadamente 10% menos con embriones
congelados.
Una variante quirúrgica posible es la extracción del cuerno por el fondo de la vagina. Se practica una
incisión con un bisturí oculto en la pared dorsal del fondo de la vagina entre su pared dorsal y la cérvix.
Esta zona tiene escasa irrigación. Se debe empujar la cérvix hacia abajo antes de punzar para evitar
lesionar el recto. A través de la incisión se extrae el cuerno uterino llevándose a cabo la deposición del
embrión.
Transferencia no quirúrgica
Es la técnica de elección en la actualidad. La primera transferencia no quirúrgica con éxito en bovinos
fue lograda por MUTTER y col. en 1964, atravesando la cérvix con una pipeta de inseminación. El éxito
fue precedido, sin embargo, de muchos fracasos como consecuencia, aparentemente, de infecciones y
contracciones uterinas provocadas en el intento. Los envases para los embriones y los instrumentos
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86
empleados en la transferencia son de diverso material y tamaño. En la actualidad los catéteres de
transferencia están adaptados a las pajuelas de 0,25 ml (Foto 1), que sirven como envases para los
embriones. Los catéteres son metálicos o de material plástico. El catéter metálico es de acero
inoxidable (Foto 2), su punta atraumática posee un orificio lateral, por donde es expulsado el embrión.
El tubo del catéter está dividido en dos partes unidas a rosca, a fin de introducir la pajuela en su interior.
La rigidez de este catéter permite introducirlo más fácilmente a través de la cérvix de vaquillonas que
los de plástico. Estos últimos son más finos que los metálicos, debido a su flexibilidad de elección para
vacas multíparas, se presentan estériles y son descartables.
Foto 1: Pajuelas de 0,25 ml empleadas para la transferencia
Foto 2: Cateter de transferencia metálico MT con punta metálica
destornillable, Minitüb, Alemania
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Transferencia de los embriones
87
Foto 3: Cateter metálico con puntas metálicas, plásticas,
estériles y descartables. Minitüb, Alemania
Al comienzo de la década del '80 se estableció como el lugar óptimo para la transferencia quirúrgica del
embrión el tercio anterior del cuerno uterino (NEWCOMB y ROWSON, 1980), basado en que los
embriones d7-8 se localizan en el útero a 5-6 cm de la unión útero-tubárica (STRAßBERGER, 1982).
Esto no es posible en la transferencia no quirúrgica con un catéter rígido, como consecuencia de la
curvatura uterina (NEWCOMB, 1982). Trabajos posteriores no encontraron diferencias en el éxito de la
transferencia comparando el tercio anterior con el medio y estimaron que el intento de transferir los
embriones por delante del tercio medio con un catéter rígido podía conducir a traumatismos de la
mucosa uterina con muerte embrionaria (SREENAN y DISKIN, 1987). El lugar de elección para obtener
resultados aceptables es por delante del ligamento intercornual (MITCHELL WEST y DONALDSON,
1984).
El procedimiento de la transferencia no quirúrgica tiene la desventaja frente al quirúrgico de requerir
destreza, experiencia y particularmente mucho cuidado en la manipulación del catéter en el cuerno y el
cuerpo del útero. El trauma provocado, especialmente en el endometrio, puede provocar la liberación de
prostaglandinas. Estas pueden causar respuesta inflamatoria, disminución de los niveles de
progesterona y aumento de la contractilidad uterina, que interfieren con la vida media del cuerpo lúteo y
en consecuencia con la sobrevida del embrión. Con el aumento del tiempo de manipulación también se
incrementa el efecto traumático de la transferencia, cuando la maniobra de transferencia dura más de 3
minutos (GORDON, 1976) o si es llevada a cabo con torpeza se provoca irritación del endometrio, que
puede conducir a una disminución del éxito de la transferencia (BOLAND, 1976). TERVIT y col. (1980)
observaron que la preñez tendió a ser afectada linealmente por el tiempo necesario para la
transferencia entre 0.7 a 6.3 minutos con un promedio de 1.8 minutos. La diferencia fue significativa (p<
0,10).
Aunque algunos autores sostienen que la cérvix no es susceptible a los efectos traumáticos (CHUPIN,
1988), es conveniente, sin embargo, no subestimar su insensibilidad con una brusca manipulación. Las
lesiones pueden provocar la interrupción de la fase luteal con el acortamiento consiguiente del ciclo a
menos de 16 días como consecuencia de la liberación de PGf2alfa (TERVIT, 1980). Un trauma
mecánico puede provocar, además, ingreso bacteriano en la luz uterina, causando endometritis
subclínica -favorecida por el nivel de progesterona de la fase diestral-, que interfiere también con la vida
del embrión. La receptora retorna al celo entre 24-39 días después de la transferencia.
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Para evitar el efecto traumático de la manipulación sobre el endometrio se pusieron a prueba drogas
para inducir la relajación de la musculatura lisa del útero (relajantes uterinos) y/o anestésicos locales
(anestesia epidural, capítulo V). Los relajantes uterinos se emplearon por primera vez en la estación de
inseminación artificial y transferencia de embriones de Neustadt a.d. Aisch, Alemania (HAHN y col.
1975) y son empleados en la actualidad por algunos grupos de trabajo (HAHN, 1990). Los resultados
obtenidos por otros grupos de trabajo no apoyan los obtenidos por HAHN y col. (1975) y HAHN (1990).
Por el contrario otros autores encontraron que el empleo de Clenbuterol (Planipart®, Bohringer) no
incrementó la tasa de preñez de las receptoras (tabla 1). WENKOFF (1986) observó, en un ensayo
realizado con 4796 receptoras, una disminución del 10% de preñez cuando aplicó una dosis de 10 ml
i.m. de Clenbuterol 60-90 minutos antes de la transferencia. Esa diferencia no fue significativa pero sí
fue considerada como una tendencia importante (WENKOFF, 1986). Las posibles causas de la menor
tasa de gestación fueron asociadas a la dilatación de la vagina y recto como consecuencia del ingreso
de aire y la distención de la vejiga con orina, que dificultaron los procedimientos de la transferencia. Ello
estaría apoyado por el efecto positivo del tratamiento, aplicado 30-180 minutos previo a la transferencia
quirúrgica (MAPLETOFT y col. 1986). En la actualidad se aplica el relajante uterino aproximadamente 5
minutos antes de la transferencia (LEIDING, 1991), a fin de evitar dichos efectos negativos. Sin
embargo ese tiempo es reducido para que la droga tenga efecto.
El componente psicológico de éxito o fracaso establece una presión
considerable sobre el operador principiante y en consecuencia puede actuar
negativamente sobre las posibilidades de éxito. Una medida preventiva es
realizar las transferencias sólo si existen buenas condiciones para ello.
Particularmente tranquilidad de los animales (uso de tranquilizantes si fuera
necesario) y una buena anestesia epidural. Estas medidas son más
importantes si se trabaja con animales nerviosos y/o indóciles.
Foto 4: Quicklock® ET de acero inoxidable, soporte de las vainas
descartables estériles Transfit®. Minutüb, Alemania
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Tabla 1: Efecto del Clenbuterol sobre la preñez (%) de receptoras con diferentes dosis y tiempos de
efecto en minutos (min) en 5 estudios diferentes
dosis
5 ml
min
20
10 ml
30
10 ml
5
10 ml
30 a 180
10 ml
5
P r e ñ e z*
clenbuterol
control
166/262
87/149
(63)
(58)
13/28
12/22
(46)
(55)
104/189
99/185
(53)
(53)
108/213
150/307
(49)
(51)
13/34
15/38
(38)
(39)
*( ) = %
Autor
COULTHARD (1982)
SREENAN (1983)
BARNES y FIRST (1985)
MAPLETOF y col. (1986)
GREGORY y RODRIGUES (1986)
Procedimiento
El embrión se carga en la pajuela de 0,25 ml. La pajuela es cargada en primer lugar con medio de
cultivo (aprox. 3,5 cm de su longitud), se deja un espacio con aire (1,0 cm) y luego se carga el embrión
contenido en el medio. Posteriormente la segunda columna de aire y la última nuevamente con medio.
La columna con medio de cultivo (PBSS), ubicada en el extremo abierto de la pajuela, limpia a ésta en
el momento de la descarga. La presencia de las columnas con aire impiden el desplazamiento de la
columna central que contiene el embrión. La última garantiza la descarga del embrión por efecto de
arrastre (Fig. 2). La pajuela es colocada en el catéter de transferencia estéril o conservada en un termo
seco con temperatura constante a 20o-37oC. El catéter de transferencia será cubierto por una envoltura
plástica (camisa sanitaria), vaina plástica rígida o por su envoltura original. Las dos primeras son
adecuadas para la transferencia. La camisa sanitaria (IMV, Francia) permite, dada su finura y
elasticidad (foto 5), introducir el catéter en el interior de la cérvix. La vaina plástica rígida (Minitüb,
Alemania, foto 6) se puede introducir sólo hasta la porción cervical de la vagina. Ello representa una
ventaja para la camisa sanitaria que permite mantener el catéter libre del contacto con las secreciones y
exudados vaginales, como es el caso de las receptores tratadas con el espiral PRID®. Hasta la
transferencia el catéter puede ser conservado a temperatura ambiente (20ºC). El traslado al lugar de
transferencia debe hacerse evitando cambios de temperatura y en posición horizontal.
Foto 6: Vaina protectora plástica estéril, Minitüb, Alemania
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Palma
90
Aire
Medio
Aire
Embrión
en medio
Medio
Figura 2: Cargado de la pajuela
Antes de la transferencia deberá ser evaluada la presencia de un cuerpo lúteo. Parece razonable
considerar la calidad del CL, a partir de su tamaño y consistencia, como un factor asociado al éxito en la
selección de receptoras (DONALSON, 1985; HASLER y col., 1987), cuadro 1.
Cuadro 1: Criterios de clasificación de un CL normal de 7 días
- Su tamaño equivale a 1/3 a 1/2 del volumen ovárico
- Su masa es elástica
- Su fijación no es fuerte, son fácilmente enucleables
- Si el cuerpo lúteo se encuentra en el interior del ovario:
comparar el tamaño del ovario con el contralateral.
La diferencia deberá corresponder a la relación
mencionada
Los criterios de evaluación de la calidad de los cuerpos lúteos son variables, sin embargo los esfuerzos
por aumentar de esta manera el éxito de la transferencia no arrojaron los resultados esperados. No fue
posible establecer una relación entre la calidad del cuerpo lúteo y la preñez de una recepetora
(DONALSON, 1985; HASLER y col., 1987, tabla 2; LIEBRICH, 1991; tabla 3).
Foto 4: Camisa sanitaria IMV, Francia
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Transferencia de los embriones
91
Tabla 2: Efecto de la calidad del CL sobre la tasa de preñez después de la transferencia de embriones
(HASLER y col., 1987).
Calidad del CL
Transferencias
n
Preñez
n
1
1193
911
76
2
348
251
72
3
58
46
79
%
Una explicación para ello es que la apariencia del CL a la palpación no indica su capacidad de producir
progesterona ni predice su comportamiento futuro.
Tabla 3: Relación entre la calidad del cuerpo lúteo y la preñez de las receptoras después de la
transferencia de embriones producidos in vitro (LIEBRICH, 1991)
Calidad del CL
Animales
Preñez (d 35
n
%
n
Muy buena
155
76
49
Buena
78
40
51
Regular y mala
98
51
52
∑
331
167
50
La relación entre los niveles sanguíneos de progesterona y la tasa de sobrevida embrionaria tampoco
pudo ser definida con éxito (SREENAN y DISKIN, 1987) por que no pudieron observarse diferencias
entre la concentración sérica de progesterona previa a la transferencia de las receptoras que
posteriormente permanecían preñadas de las que no lo hacían (HAHN y col., 1977; HASLER y col.,
1980; ELLINGTON y col, 1992). LIEBRICH (1991) no pudo establecer relaciones válidas entre la calidad
del cuerpo lúteo y los niveles de progesterona (tabla 4).
Tabla 4: Relación entre la calidad del cuerpo lúteo y los niveles de progesterona de las receptoras 2
días antes de la transferencia (LIEBRICH, 1991)
Calidad del CL
Receptoras
n
Nivel de progesterona
ng/ml
Muy buena
150
1,37
1,02
Buena
75
1,30
0,85
Regular a mala
88
1,15
0,90
n.s
Los intentos por establecer una terapia suplementaria de progesterona, como así también incrementar
el efecto luteotrófico con HCG (CHRISTIE y col., 1979) como medidas profiláticas no lograron mejorar la
probabilidad de gestación. Estudios realizados con HCG indicaron la formación de cuerpos lúteos
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accesorios, que sin embargo no tuvieron un efecto diferente sobre la tasa de preñez ni sobrevida del
embrión (CHRISTIE y col., 1980; DE LOS SANTOS-VALADEZ y col., 1982; GREVE y col., 1982;
LOONEY y col., 1984; HEYMAN, 1985). No obstante las reiteradas referencias VESELINOVIC (1990)
logró aumentar hasta un 14% la tasa de preñez administrando 1500 UI de HCG después de la
transferencia, lo que indica la contradicción de las experiencias realizadas. ELLINGTON y col. (1992)
evaluaron el efecto de la Buserelina, un análogo sintético de la hormona liberadora de gonadotrofinas
(GnRH). Los autores no encontraron un efecto luteotrófico de la hormona que mejorara la tasa de
preñez del grupo tratado frente al control (tabla 5). De forma similar que con el CL no se conoce aún
con exactitud un nivel circulante de progesterona próximo o en el momento de la transferencia (d6-8)
que caracterice a una buena receptora (SREENAN y DISKIN, 1987).
Tabla 5: Tasa de preñez asociada con la aplicación de Buserelina (Receptal®, Hoechst) en distintos
momentos de la transferencia (ELLINGTON y col., 1992)
Buserelina
Receptoras
(n)
Control
a la transferencia
4-7 días después de la transferencia
68%
(175/258)
72%
(183/154)
66%
(167/252)
n.s
Introducción del catéter de transferencia
Una vez realizada la palpación genital y el vaciado del recto un asistente deberá lavar y secar la vulva y
la zona perineal. Para los animales indóciles se recomienda la administración de anestesia epidural
(Lidocaina 2%, 4-7 ml) para impedir las contracciones rectales y poder manipular el útero eficazmente.
Para introducir el catéter en la vagina se deben separar los labios de la vulva a fin de colocar éste
directamente en el vestíbulo. A veces es necesario empujar el instrumento en dirección cráneo-dorsal.
Si los pliegues de la mucosa vaginal impiden el avance del catéter es posible evitarlos estirando la
cérvix hacia craneal. Cuando la punta del catéter está frente a la cérvix (ésto es verificable palpándola
con el dedo meñique) es importante que el asistente tome los bordes de la camisa sanitaria y tire ésta
hacia atrás para liberar el catéter. Si se emplea la vaina protectora plástica (Minitüb®), el procedimiento
es similar, sólo que puede realizarlo el mismo operador. El catéter es introducido en la cérvix, su
penetración debe hacerse manipulando el órgano siempre por delante del instrumento. Los movimientos
son similares a los de la inseminación artificial, de dorsal a ventral y viceversa y a ambos lados mientras
se empuja, simultáneamente, el catéter. La presión debe ser suave y sobre todo controlable. Un exceso
puede provocar que, al presentar correctamente el último anillo cervical, el catéter penetre con tanto
impulso que perfore el cuerpo del útero. Antes de atravesar el último anillo es importante que el
operador incline su atención al útero, estableciendo nuevamente su posición, tamaño y grado de
curvatura para determinar con mayor precisión la longitud a recorrer y su grado de complejidad
(curvatura).
Con los cuernos en la posición adecuada, el operador podrá atravesar el último anillo cervical e ingresar
al cuerno uterino ipsilateral a la ovulación. Para ello se deberá tomar suavemente el cuerno y
presentarlo frente a la punta del instrumento, algo más levantado que la cérvix. Si la mano que fija la
cérvix es la opuesta al cuerno a transferir, el órgano contralateral puede ser usado para facilitar la
penetración. Sosteniendo a éste en su segmento medio-ventral se fija el cuerno uterino, estirándolo y
empujando ligeramente el catéter hacia craneal. La operación debe repetirse introduciendo el catéter en
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93
el cuerno lo necesario para superar la línea transversal que establece el ligamento ancho y tan
profundamente como sea posible sin resistencia alguna. Si la mano es la del mismo lado que la del
cuerno ipsilateral, la fijación se puede realizar también en el ligamento lateral, operando de igual forma
que en el caso anterior.
Es importante tener en cuenta que la manipulación del cuerno uterino deberá hacerse con cuidado
Resultados de la transferencia
Existen tantas formas de interpretar los resultados de un Programa de transferencia de embriones como
factores que lo afectan. En ese sentido es interesante recordar lo afirmado por ELSDEN y SEIDEL
(1990): "El éxito es una manifestación estadística, ésta permite resumir los resultados de un grupo de
donantes pero no puede ser extrapolada a una sola vaca. El siguiente ejemplo representa una situación
típica de 12 donantes que fueron superovuladas. El lavaje uterino fue llevado a cabo en 10 donantes
porque una no tuvo respuesta en un ovario y la segunda no presentó celo. Después de la recolección se
obtuvieron embriones de buena calidad de sólo 8 vacas y a la palpación rectal de las recipientes sólo 7
donantes produjeron embriones que terminaron en una preñez. De 30 gestaciones los resultados de la
transferencia de embriones pueden ser representados de la siguiente manera: 1) 2,50
preñeces/donante, considerando las 12 donantes; 2) 3,00 preñeces/donante, considerando los 10
lavajes realizados; 3) 3,75 preñeces/donante, considerando las 8 donantes de buenos embriones y
finalmente 4) 4,29 preñeces/ donante, considerando las 7 vacas que condujeron a una preñez". Ello
conduciría a pensar que los altos resultados presentados por algunas empresas comerciales no
necesariamente son mejores que los bajos resultados obtenidos en general por centros de investigación
sin fines de lucro.
Tasa de preñez
Actualmente la tasa de preñez con esta técnica varía entre 60-70% con embriones frescos y de buena
calidad (SCHNEIDER y col., 1980; McEVOY y SREENAN, 1990), 50-60% con embriones producidos in
vitro (LIEBRICH, 1991) y obtenidos in vivo congelados/descongelados. La diferencia de preñez del 1020%, entre esta técnica y la quirúrgica, podría ser explicada por las infecciones provocadas al introducir
el catéter de transferencia, vía vagina, en el útero, particularmente susceptible de infecciones entre el
día 6-8 del ciclo (WRIGHT, 1981). El grado de sincronización que se establece entre la donante y las
receptoras se sumó a la lista de factores que condicionan el éxito de una transferencia. Cuando el
intervalo entre la ovulación y el lavaje de la donante es igual al comprendido entre la ovulación y la
transferencia de la receptora, se habla de una transferencia sincrónica. Este se mide en términos
positivos (+) o negativos (-). Si, por ejemplo, el intervalo ovulación-transferencia en la receptora es un
día mayor que el intervalo ovulación-lavaje de la donante, se habla de un asincronismo de +24 h. Por el
contrario -24 h significa que el intervalo de la receptora es un día más corto que el de la donante. Para
la transferencia de embriones LINDNER y WRIGHT (1983) toleraron hasta 48 h de asincronismo,
actualmente el grado de asincronismo no debe superar las 24 h.
Sincronicidad donante/receptora y embrión/receptora
La sincronicidad entre el momento del ciclo de la receptora y el estadio en que se encuentra el embrión
parece constituir un índice más válido de las posibilidades de éxito de la transferencia (LINDNER y
WRIGHT, 1983, Tablas 6 y 7), razón por la cual deberá ser tenido en cuenta al hacer la transferencia.
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Tabla 6: Código de desarrollo embrionario según LINDNER y WRIGTH (1983)
Código de desarrollo
(estimado en días)
5
6
7
7
8
9
Estadio
Mt
Mc
Bt
B
Be
Bp
Tabla 7: Efecto de la sincronicidad del ciclo de la donante con la receptora y de la receptora con el
estadio de desarrollo embrionario sobre la tasa de preñeza (LINDNER y WRIGTH, 1983)
Sincronicidad
donante/receptora
preñeces
n
n
%
Sincronicidad
receptora/embrión
preñeces
n
n
%
+2
27
11
(41)
76
20
+1
87
41
(47)
148
73
0
158
64
(41)
204
107
-1
l75
86
(49)
98
45
(52)d
(46)d
-2
137
56
(41)
58
13
(22)c
Sincronicidad
días
a:
c,d:
(26)c
(49)d
Sólo fueron incluidos embriones de excelente y buena calidad
Porcentajes en la misma columna con diferente letra difieren estadísticamente (p<0,001)
La probabilidad de gestación depende también del estadio en que se encuentra el embrión en el
momento de la recolección. La transferencia de mórulas tempranas, por ejemplo, alcanzó una tasa de
preñez significativamente inferior (p<0,05) frente a otros estadios más desarrollados (tabla 8,
SCHNEIDER y col., 1980). Incluso se observó una tendencia creciente en la tasa de gestación a
medida que avanza el desarrollo del embrión. Una posible explicación para ello sería que las mórulas
tempranas se encontraron retardadas en su desarrollo de acuerdo al momento de la recolección al 6o8o días de la recolección (ELSDEN y col., 1978; HASLER y col., 1987). Una segunda explicación
posible es que los defectos morfológicos son más fáciles de observar en estadios embrionarios
avanzados (HALLEY y col., 1979).
Tabla 8: Efecto del estadio del embrión sobre la tasa de preñez (SCHNEIDER y col., 1980)
Preñez
Estadio
Mt
Embriones
transferidos
586
n
%
359
Mc
1178
792
61a
67b
Bt
600
402
Be
139
99
67b
71c
a,b tasas de preñez con diferente letra son significativamente diferentes (p<0,05)
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Estas observaciones se repiten en el desarrollo de los embriones producidos in vitro. El hecho que un
embrión haya alcanzado el estadio de morula temprana no significa que esté en condiciones de
alcanzar el estadio inmediato superior. Un estadio más avanzado significa una posibilidad mayor de
prosperar en una gestación. La presencia de grandes blastómeros y la falta de otras estructuras
diferenciadas en una morula temprana dificultan una evaluación eficaz, comparada con la que se lleva a
cabo con los otros estadios superiores, por falta de más puntos de referencia. Los criterios y
particularmente las grados de calidad en la evaluación morfológica son subjetivos y varían entre grupos
de trabajo. Si bien dichos criterios muestran en muchos casos diferencias significativas en el éxito de la
transferencia (HASLER y col., 1987; tabla 9) se ha observado en el cultivo de embriones recolectados in
vivo que aproximadamente el 60% de los embriones calificados como aparentemente degenerados
continuaban su desarrollo (SREENAN y DISKIN, 1987). Estas observaciones se verifican en el cultivo
de los embriones producidos in vitro, clonados o microinyectados con genes, cuya apariencia
morfológica está afectada por su origen o los tratamientos. Particularmente en los primeros, con los
cuales ya existe experiencia en la práctica, se acentúa la necesidad de adecuar los criterios de
evaluación morfológica al tipo de embrión, producto de la fecundación y cultivo in vitro, a fin de no
eliminar los embriones que pueden continuar con una gestación.
La tasa de preñez de los embriones producidos in vitro es similar a la de los obtenidos in vivo
(LIEBRICH, 1991, tabla 10) aunque la apariencia morfológica de los primeros dista de responder a los
criterios establecidos para los segundos.
La transferencia de un sólo embrión se lleva a cabo en el cuerno ipsilateral de acuerdo a la relación
establecida entre el cuerpo lúteo y el cuerno uterino adyacente. La transferencia de más de un embrión
es posible llevarla a cabo en forma bilateral. Esto significa que un embrión deber ser colocado siempre
en el cuerno ipsilateral a la ovulación. La transferencia de un solo embrión en el cuerno contralateral
provoca una alta mortalidad embrionaria dado que las señales luteotróficas y antiluteolíticas del embrión
fallan en alcanzar el CL del lado opuesto a la transferencia (SREENAN y DISKIN, 1987).
Tabla 9:
Efecto del tipo de calificación y calidad del embrión sobre la preñez después de la
transferencia (HASLER y col., 1987)
Calidad del embrión
Años 1980-1983
Transferencia
n
Buena
5521
Receptoras preñadas
n
%
4037
73a
Regular
304
181
Mala
76
31
1
542
451
2
408
307
3
214
135
4
13
6
60b
41c
Años 1985-1986
83a
75b
63c
46c
a,b,c calidad de los embriones con diferentes letras comprendidas en el mismo grupo de años difieren
estadísticamente (p<0,01)
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Tabla 10: Preñez obtenida después de la transferencia de embriones de diferentes calidades
producidos in vitro (LIEBRICH, 1991)
Calidad
Transferencias
Preñez (d 35)
n
n
%
54a
Muy buena
61
33
Buena
41
21
Regular y mala
27
7
51
26b
129
61
47
a,b diferentes estadísticamente, p<0,05 (t-test)
El empleo reiterado de receptoras abre el interrogante sobre cuántas veces puede repetirse la
transferencia a una misma receptora. LIEBRICH (1991) no encontró diferencias estadísticas entre
receptoras que quedaron preñadas después de la primera transferencia de las que lo hicieron después
de la tercera (tabla 11) empleando embriones producidos in vitro. La tasa de preñez tendió, sin
embargo, a disminuir con el aumento del número de transferencias en la misma receptora.
Tabla 11: Tasas de preñez (n) después de la 1o, 2o y 3o transferencia de embriones producidos in vitro
a la misma receptora (LIEBRIECH, 1991)
Transferencia
1o
2o
3o
Receptoras
n
183
108
40
Preñez
n
102
50
15
%
56
46
37
La transferencia de los embriones obtenidos o producidos constituye el último paso de la técnica, su
éxito dependerá del grado de idoneidad y experiencia, requeridos también para el resto de las
actividades. La tasa de preñez obtenida no será sólo el producto de la transferencia per se sino de la
suma de los actividades realizadas hasta el momento y de los factores dependientes de la donante, el
semen, el embrión y la receptora. La competencia profesional en ejecutar con éxito cada uno de los
diferentes pasos permitirá alcanzar resultados óptimos y repetibles.
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Conservación de embriones
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CONSERVACION DE LOS EMBRIONES
J. Cabodevila
Introducción
Los embriones bovinos son recolectados en una solución salina buffer fosfato (PBS Dulbecco)
suplementada con 1% de suero o 0,1% de albúmina sérica (PBSS). A medida que los embriones son
localizados bajo la lupa estereoscópica, se los coloca en PBSS con un porcentaje mayor de suero (10 ó
20%) o albúmina 4%. Permanecen en este medio, a la temperatura del laboratorio 20-25ºC hasta que
se realiza la transferencia o se lleva a cabo otra manipulación.
La manipulación de los embriones in vitro se lleva a cabo siguiendo las disposiciones establecidas por
la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS) a fin de prevenir la transmisión de
enfermedades (Manual de la Soc. Int. de Transferencia Embrionaria, cap. XVI)
Una evaluación morfológica detallada, a mayor aumento, considerando estadios de desarrollo y
cualidades estructurales permite determinar que embriones están en condiciones de ser transferidos
(LINDNER y col., 1983). La transferencia en fresco debe ser realizada dentro de las 3-4 hs postrecolección (GARCIA y col., 1986).
Los embriones pueden ser conservados in vitro para su posterior transferencia mediante: Cultivo a 37o
C, refrigeración entre 0o C y 4o C o congelación a -196oC (TROUNSON y col., 1976).
A continuación, se analiza en detalle cada una de estas técnicas:
Cultivo a 37oC
Los embriones bovinos pre-implantados generalmente son recolectados entre el sexto y octavo día de
vida, empleando el método no quirúrgico. El cultivo es utilizado para evaluar el resultado de distintas
manipulaciones (congelación, micromanipulación, etc.) que se efectúan con los embriones pero no
como un paso previo a la transferencia. Esto obedece a dos razones principales: En primer lugar, a que
los embriones continúan desarrollando durante el cultivo, por lo tanto, esta técnica no puede ser
utilizada para conservar un embrión hasta que una receptora asincrónica alcance el sincronismo óptimo
(WRIGHT, 1976). Por otra parte, se ha observado que los porcentajes de preñez disminuyen cuando se
transfieren embriones que han sido cultivados (WHITTINGHAM, 1975 y 1976; HEYMAN, 1984).
ELSDEN (1984), sostiene que la viabilidad embrionaria se ve seriamente disminuida cuando la
extensión del cultivo es mayor de 24 horas.
El cultivo de embriones se realiza en medios cuyo pH oscila entre el 7,2 y 7,6 y cuya osmolaridad varía
entre 270 y 310 mOsm.
El PBSS modificado por WHITTINGHAM (1971) es el medio utilizado comúnmente cuando el cultivo no
se extiende por más de 24 horas. Los medios conteniendo bicarbonato, tal es el caso del Ham F-10 y
del B2 de Menezo, son más apropiados para el cultivo de embriones pero requieren una atmósfera
controlada, con presencia de CO2 para mantener el pH fisiológico. Estos medios son utilizados en
cultivos cuya duración es mayor de 24 horas
(RAJAMAHENDRAN y col, 1985).
Al medio de cultivo, al igual que al de recolección, se le incorpora una fuente de proteínas. Esta se
efectúa con la suplementación del medio de cultivo con 10% de suero ó 0,4% de albúmina.
La suplementación proteica tiene distintos fines, los más importantes son:
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- Reducir la tensión superficial para favorecer la sedimentación de los embriones y evitar que estos se
adhieran a algún elemento utilizado para su manipulación.
- Incorporar sustancias promotoras del crecimiento que favorecen el desarrollo embrionario.
- Absorber e inhibir metales pesados tóxicos que pueden estar presentes en el medio.
El medio de cultivo se esteriliza por medio de filtración a través de membranas de 0,22µm de diámetro
de poro. Además, se le adicionan antibióticos, generalmente penicilina, estreptomicina y kanamicina.
La temperatura corporal de la especie embrionaria en cuestión es la ideal para el desarrollo de los
embriones in vitro. Sin embargo, cuando las condiciones de cultivo dejan de ser ideales -ocurre
fácilmente cuando se utilizan soluciones salinas balanceadas- es conveniente que la temperatura del
cultivo esté debajo de la corporal (no más de 4ºC). De esta manera, los efectos tóxicos del medio son
menos pronunciados y también es menor la evaporación (HEATH, 1990).
Refrigeración 0-4oC
La refrigeración se efectúa vehiculizando los embriones en PBSS envasados en pajuelas de 0,25 ml y
colocadas en un refrigerador (común o portátil) Se utiliza hielo y agua para regular el descenso de la
temperatura, de manera similar a como se realiza la estabilización durante la congelación de semen.
En los últimos años, con la transferencia no quirúrgica de embriones refrigerados durante uno a tres
días, se han obtenido porcentajes de preñez que oscilan entre el 44 y el 50% (Tabla 1). Estos
resultados superan claramente a los obtenidos previamente (BON DURANT y col., 1982; BOUYSSOU y
CHUPIN, 1982; LIDNER y col., 1982). A partir de los avances registrados, la refrigeración de embriones
puede ser considerada como una alternativa interesante cuando no sea posible recurrir a la
congelación. Por ejemplo, puede ser utilizada para enviar embriones a ser transferidos en lugares
distantes de donde se encuentran las donantes (LEIBO y WINNINGER, 1986, REFSDAL y col., 1988).
También puede emplearse esta técnica para conservar embriones hasta que receptoras asincrónicas
alcancen la sincronización adecuada.
Tabla 1: Resultados obtenidos con la transferencia no quirúrgica de embriones refrigerados.
Duración de la
refrigeración
Embriones
transferidos
Receptoras
preñadas
Autor/res
24h
19
9 (47)
REFSDAL y col. (1988)
48h
16
8 (50)
BEZUGLY y col. (1988)
hasta 72h
222*
98 (44)
LINDNER (1985)
*De 227 embriones refrigerados, 5 fueron descartados en la evaluación morfológica realizada antes de la
transferencia.
Congelación a -196ºC
Es la técnica de elección para conservar embriones in vitro. Se considera que los embriones pueden ser
mantenidos a -196ºC durante doscientos años o más, sin afectar sus viabilidad y sin causarles cambios
genéticos (SCHNEIDER y MAZUR, 1986). Este hecho, convierte a la congelación de embriones en una
herramienta insustituible para el comercio internacional de reproductores.
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El empleo de los embriones congelados, entre otras cosas, posibilita:
- Utilizar eficientemente donante y receptoras.
- Incorporar progreso genético a bajo costo, comparando los valores del
embrión y el de su transporte frente a los animales en pie.
- Transferir algunos embriones y conservar el resto hasta poder analizar los
registros de producción de la descendencia.
- Controlar enfermedades exóticas, reemplazando la importación de
animales en pie por la de embriones congelados libres de ellas.
- Conservar razas en vías de extinción.
- Crear bancos de germoplasma de valor pecuario
LEIBO (1989) resume la congelación de embriones en cuatro etapas fundamentales comunes a los
distintos métodos utilizados. Ellas son:
- Exposición de los embriones a agentes crioprotectores.
- Enfriamiento desde temperaturas fisiológicas hasta temperaturas lo
suficientemente bajas como para causar un virtual cese de todas las
reacciones químicas inducidas térmicamente.
- Calentamiento desde la temperatura de conservación (-196oC) a
temperaturas fisiológicas.
Si bien el resultado de la congelación depende fundamentalmente de la forma en que se llevan a cabo
estos procedimientos, está condicionado previamente por dos factores. Ellos son: la calidad del embrión
y el tiempo que transcurre desde la recolección hasta que comienza la congelación. Cuando se
congelan embriones de calidades muy buena y buena (grado I y II) se obtienen mejores resultados que
cuando se congelan aquellos de calidad regular (grado III) (KENNEDY y col., 1983; LEIBO, 1984;
HUMBLOT y col., 1987). Por su parte, los porcentajes de preñez resultantes de la transferencia de
embriones congelados son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recolección
hasta el comienzo de la congelación (WRIGHT, 1985). La viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho período es mayor de 3 h (PETIT, 1985).
Los embriones pueden ser conservados a -196oC utilizando el método de congelación standard, la
vitrificación o el método de congelación rápida. La principal diferencia que tiene el método de
congelación standard con respecto a los otros es que en él, el descenso de temperatura se efectúa de
manera controlada utilizando equipos programables (fotos 1 y 2). A continuación, se analiza más
detalladamente cada uno de estos métodos:
Método de congelación standard
Este método posibilitó a WILMUT y ROWSON (1973) obtener el primer ternero nacido de la
transferencia de un embrión congelado. Al método standard se le han efectuado desde entonces
distintas modificaciones tendientes a su simplificación (CABODEVILA y col., 1991). En la actualidad, los
embriones son congelados y descongelados de manera rápida. Esto hace necesario deshidratarlos
parcialmente antes de la congelación a fin de evitar la formación de cristales que lesionan los
blastómeros (MAZUR, 1977). La deshidratación parcial de los embriones se logra incorporando un
agente crioprotector al medio de congelación (SCHNEIDER y MAZUR, 1986).
En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores:
1. Permeables: glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etanol y otros alcoholes.
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2. Impermeables: polivinilpirrolidona (PVP), sucrosa, glucosa, y otros azúcares.
El glicerol, en una concentración 1,4M (10%), es el más utilizado en la congelación de embriones
bovinos. La exposición de los embriones al medio de congelación (PBSS + glicerol) debe realizarse a la
temperatura del laboratorio (25o C), en un sólo paso, de 10 a 30 minutos de duración (CHUPIN y
PROCURER, 1984; NIEMANN, 1985). Este período incluye el envasado de los embriones,
generalmente en pajuelas plásticas.
Las pajuelas o pajillas de 0,25 ml constituyen el envase de elección porque tienen menor tamaño,
paredes más delgadas y menor volumen que las ampollas y los tubos. Estas propiedades permiten
realizar más rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o "seeding". Es ésta,
una maniobra clave para evitar que la viabilidad embrionaria sea afectada durante la congelación
(MAURER, 1978). Pueden ser colocadas en el equipo de congelación a la temperatura a la que se
efectúa el seeding (aproximadamente -7o C). Es conveniente en este caso que transcurran cinco
minutos para que se equilibre la temperatura de las pajuelas con la del equipo de congelación. Algunos
equipos de congelación utilizan nitrógeno líquido como agente refrigerante. En otros más económicos,
el refrigerante es etanol u otro alcohol enfriado por medio de un compresor (foto 1). NIEMANN (1985)
efectuó un estudio comparativo entre ambos sistemas obteniendo porcentaje de preñez similar.
Foto 1: Equipo de congelación por medio de baño de alcohol
HAAKE Mess-Technik GmbH u. Co., Kalsruhe, Alemania
Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (período de
estabilización) y luego se la desciende a una velocidad que oscila entre 0,3 y 0,5o C hasta -30 ó -35o C.
En ese momento, las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelación y sumergidas en
nitrógeno líquido (LEHN-JENSEN y GREVE, 1982). Se considera que entre -30 y -35º C se establece
un adecuado balance entre deshidratación y formación de hielo intracelular (NIEMANN, 1985). No
obstante ello, PETIT (1985) recomendó reducir la velocidad de congelación a 0,1 C/min entre -35 y 38ºC antes de retirar las pajuelas del equipo. WRIGHT (1985) por su parte, prefiere detener la
congelación a -30 ó -35º C y mantener la temperatura constante durante quince minutos antes de
sumergir las pajuelas en nitrógeno.
La descongelación se efectúa de manera rápida, sumergiendo las pajuelas en un baño María a 30-35º
C durante 20-30 segundos. RALL y MAYER (1989) informaron que exponiendo las pajuelas al aire a 20º
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C durante 10 segundos antes de colocarlas en el baño María, disminuye el número de embriones que
sufren rotura de la zona pelúcida.
La extracción del glicerol puede efectuarse luego de retirar el embrión de la pajuela o dentro de la
misma. En el primer caso, se la lleva a cabo en una sola etapa utilizando sucrosa o en forma
escalonada, empleando concentraciones decrecientes de glicerol o una mezcla de glicerol y sucrosa en
PBSS (HEATH, 1990). En la elección de una de estas opciones generalmente priva el criterio personal
dado que cada una de ellas tiene ventajas relativas. El embrión descongelado es evaluado
morfológicamente para eliminar aquellos con daños provocados por los procedimientos utilizados. Con
esta técnica de extracción del glicerol se obtienen porcentajes de preñez que generalmente superan el
50% (NIEMANN, 1985). LEIBO (1982) y RENARD y col. (1982) desarrollaron dos técnicas similares que
permiten extraer el glicerol dentro de la pajuela. Esta modificación es conocida como método "one step",
en realidad no se trata de un método distinto del standard sino de una modificación introducida en la
técnica de extracción del crioprotector.
Para utilizar esta técnica, es necesario envasar los embriones tal como se indica en la Figura 1.
embrión
Compartimiento
Superior
Medio
Inferior
Extracción del crio-protector fuera de la
pajuela
1,4 M glicerol
en PBSS
1,4 M glicerol
en PBSS
1,4 M glicerol en
PBSS
Extracción del crio-protector dentro de la
pajuela (LEIBO, 1982)
0,24 M
sucrosa en
PBSS
1,4 M glicerol
en PBSS
0,25 M sucrosa
en PBSS
Extracción del crioprotector dentro de la
pajuela (RENARD, 1982)
Medio B2 de
Menezo
1,4 glicerol en
PBSS
0,25 M sucrosa
en PBSS
Figura 1: Disposición de las distintas soluciones en la pajuela, según la técnica de extracción del
crioprotector utilizada
Una vez efectuada la descongelación, la pajuela debe ser agitada vigorosamente para desplazar el aire
hacia los extremos y permitir que las soluciones se mezclen. La solución de sucrosa isoosmolar con el
medio de congelación, provoca que el glicerol salga del embrión. Esta técnica permite transferir
embriones congelados a campo sin necesidad de equipos y laboratorios costosos (MUNAR y col.,
1988). Se obtienen tasas de preñez que oscilan entre el 30 y el 50% (NIEMANN, 1985). Al prescindirse
de la evaluación morfológica, es lógico que los porcentajes de preñez resulten inferiores a los que se
obtienen con el método standard convencional.
El medio B2 de Menezo es más nutritivo que el PBSS. RENARD y col. (1982, 1983) lo utilizan para
extraer algún resto de glicerol que pudiese haber quedado en el embrión, una vez que este se
encuentra en el útero de la receptora. A pesar de que las diferencias no fueron significativas, CHUPIN y
col. (1984) obtuvieron con esta técnica un mayor porcentaje de preñez que con la propuesta por LEIBO.
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Cuando el glicerol es extraído dentro de la pajuela, la viabilidad embrionaria puede ser afectada si no se
logra mezclar homogéneamente las distintas soluciones (NIEMANN, 1985). Para evitar tener que
realizar esta maniobra, MASSIP y col. (1987) utilizaron como medio de congelación una solución mixta
de glicerol y sucrosa en PBSS. A pesar de haberse obtenido porcentajes de preñez aceptables, esta
técnica no ha alcanzado difusión aún.
Protocolo de congelación y descongelación (según Niemann)
Congelación
1. Preparar la solución de glicerol (1,4 M), colocar 3-4 ml de la solución, esterilizada por medio de
filtración, en una placa de Petri pequeña (35 mm) y conducir a la misma temperatura de los
embriones.
2. Los embriones deben ser clasificados estrictamente y lavados por lo menos 5 veces (para la
exportación 10 veces) y finalmente en una solución de tripsina 0,25%.
3. Los embriones son colocados a posteriori directamente en la solución 1,4 molar de glicerol. Se deja
un tiempo de equilibración de 20' aproximada-mente sobre una platina térmica.
4. Durante ese tiempo identificar las pajuelas con marcador indeleble.
5. Cargado de los embriones en las pajuelas con la solución de glicerol.
6. Conducir las pajuelas al baño de alcohol a -5 C. Esperar 1-2 minutos. Efectuar luego el seeding e
iniciar el programa de congelación a una velocidad de 0,5 C/min hasta -35 C.
7. Colocar las pajuelas en el contenedor con nitrógeno líquido.
Descongelación
1. Mezclar partes iguales (p.e. 2 ml + 2 ml) de las soluciones de glicerol (1,4 M) y sucrosa (1,4 M). De
ello resulta una concentración de 0,7 M de ambas soluciones. Esterilizar por medio de filtración y
conducir a temperatura ambiente.
2. Preparar una solución de sucrosa 0,7 M.
3. Preparar una solución de cultivo con 1% de BSA.
4. Descongelación de las pajuelas a temperatura ambiente (demora aprox. 60-90 segundos).
5. Secar la pajuela, separar el stick y colocar el embrión, con ayuda de una jeringa de tuberculina con
unión de goma, en la solución de glicerina y sucrosa (0,7 M).
6. Esperar 5 min y colocar los embriones en la solución de cultivo durante 10 min para su reexpansión.
7. Evaluación morfológica, colocación en el catéter de transferencia y transfe-rencia a una receptora.
Sustancias necesarias: PBS + antibióticos (p.e. gentaminicina 80mg/l) y 1% BSA.
Glicerol para análisis, puro (98-100%) libre de agua.
Sucrosa para análisis
Albúmina bovina (BSA), fracción V (96-99% de albúmina)
Vitrificación
Es un proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos y tejidos y más recientemente
embriones (FAHY y col., 1984; RALL y FAHY, 1985).
El medio de vitrificación lleva incorporado crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriado no
cristaliza sino que se torna viscoso y pasa del estado líquido a un estado sólido no estructurado similar
a un vidrio, de ahí toma este método la denominación de vitrificación.
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La solución de vitrificación debe tener alta concentración de uno o más crioprotectores permeables.
Para vitrificar embriones bovinos, se ha utilizado una solución mixta de glicerol y 1-2 propanodiol en
PBSS. La elección del 1-2 propanodiol se debió fundamentalmente a que es estable y a que tiene poca
tendencia a cristalizar durante el enfriamiento (BOUTRON y KAUFMANN, 1979).
En primera instancia, los embriones son expuestos al medio de vitrificación intracelular (10% glicerol +
20% 1-2 propanodiol) durante 10 minutos. Luego, se los envasa en el medio de vitrificación extracelular
(25% glicerol + 25% 1-2 propanodiol). Si la pajuela se completa con una solución 1M de sucrosa en
PBSS, posibilita transferir los embriones a campo de manera similar a lo que ocurre en el denominado
método one step. Inmediatamente después de cerrada, la pajuela debe ser introducida lenta y
progresivamente en el nitrógeno para que se produzca simultáneamente la vitrificación de los
compartimientos extra e intracelular.
Utilizando las soluciones anteriormente descriptas, se han vitrificado con éxito mórulas, obteniéndose
porcentajes de preñez de alrededor del 50% (MASSIP y col. 1987; DOUCHI y col., 1990). Para vitrificar
blastocistos y obtener un porcentaje aceptable de supervivencia fue necesario agregar sucrosa al medio
de vitrificación (VAN DER ZWALMEN y col., 1989).
Recientemente, KASAI y col. (1990) han utilizado un medio de vitrificación que lleva incorporado ficoll
en su formulación. Este medio es menos tóxico que el anterior, si se repiten en otras especies los
resultados obtenidos con embriones de ratón, su aplicación resultará de sumo interés.
Método de congelación rápida
Este método fue desarrollado por CHUPIN en el año 1986. A diferencia de lo que ocurre en la
vitrificación, en la congelación rápida se produce la cristalización del agua intra- y extracelular.
Los embriones son deshidratados parcialmente tal cual ocurre en el método standard. Luego, se los
deshidrata nuevamente colocándolos en una solución mixta de glicerol y sucrosa en PBSS. Esta
segunda deshidratación, deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rápidamente.
Las pajuelas son colocadas en el cuello del contenedor de nitrógeno líquido. Existe un lugar óptimo para
colocar la pajuela según el nivel de nitrógeno existente en el contenedor, para que la cristalización
ocurra espontáneamente sin producirse la elevación de temperatura relacionada con el cambio de fase.
Las pajuelas, luego de permanecer cinco minutos en el cuello del termo, son sumergidas en el
nitrógeno.
El método de congelación rápida ha sido utilizado con éxito para congelar embriones de animales de
laboratorio (TAKAHASHIA y KANAGAWA, 1990; ZUH y col., 1990). En bovinos, se lo ha evaluado
únicamente cultivando los embriones descongelados in vitro, los resultados obtenidos fueron dispares
según el estadio de desarrollo del embrión congelado (CHUPIN, 1986). Para unificar los resultados, fue
necesario modificar el tiempo de exposición a la segunda solución deshidratante o variar la temperatura
a la que ésta ocurría (CHUPIN, 1987).
Conclusiones
Cuando se hace la evaluación morfológica, puede ocurrir que sea difícil definir si algunos embriones son
o no transferibles. En ese caso, puede resultar útil cultivarlos por algunas horas para observar su
evolución. Es ésta, la única aplicación práctica que tiene el cultivo en los programas de TE que se
desarrollan en la actualidad.
En algunos países, se han montado recientemente centros de producción de embriones en gran escala,
utilizando la fecundación in vitro (GORDON, 1990). El desarrollo de esta técnica, fue acompañado por el
de sistemas de cultivo que permiten que el embrión producido por esta vía alcance los estadios de
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mórula o blastocisto in vitro. De esta manera, es posible transferirlos utilizando el método no quirúrgico,
que resulta simple y práctico, ver capítulo XI.
Teniendo en cuenta que en los centros de TE es difícil poder alojar el lote de receptoras, la refrigeración
puede resultar útil para transportar los embriones hasta donde éstas se encuentren, especialmente si se
trata de lugares distantes.
Antes de refrigerar embriones hasta que receptoras asincrónicas alcancen el sincronismo óptimo, será
necesario comparar la pérdida de viabilidad que ocasiona
la transferencia asincrónica con respecto a la que causa la refrigeración.
Los embriones bovinos, en los estadios de mórula y blastocisto, son congelados exitosamente utilizando
el método standard obteniéndose un porcentaje de preñez promedio del 50%. La vitrificación y el
método de congelación rápida no han alcanzado aún un grado de desarrollo que permita utilizarlos en
programas comerciales de transferencia de embriones.
El advenimiento de técnicas tales como: la producción in vitro, el clonado y el diagnóstico del sexo de
embriones, la transferencia de genes, etc., hace necesario centralizar esfuerzos para lograr la
congelación de estadios tempranos de desarrollo como así también de embriones micromanipulados,
con un éxito similar al obtenido con las mórulas y los blastocistos.
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Producción de mellizos idénticos
109
PRODUCCION DE MELLIZOS IDENTICOS POR MEDIO DE MICROCIRUGIA
G.A. Palma & G. Brem
Introducción
La transferencia de embriones constituye para la hembra un progreso reproductivo equivalente a la
inseminación artificial para el macho. Per se permite aumentar el progreso genético a través del
incremento de la capacidad reproductiva de la hembra bovina. El desarrollo biotecnológico posterior, a
partir de la manipulación de los embriones recolectados, convirtió a esta técnica en una valiosa
herramienta para la producción de una cantidad supernumeraria de embriones y su retorno al ambiente
uterino. A partir de la década de 1980 se inició en Cambridge (WILLADSEN, 1981) una nueva fase con
el desarrollo de la microcirugía de embriones (MC) con la producción de mellizos idénticos. Esta
comprende la micromanipulación de embriones en estadio de mórula o blastocisto, obtenidos por
lavajes no quirúrgicos, con la división en 2 partes iguales (hemi-embriones). Sus particularidades la
convierten en una técnica interesante no solamente por aumentar la eficiencia reproductiva de un
individuo o factor determinado (por ejemplo, ausencia de cuernos en la raza Fleckvieh), sino también
por permitir la disponibilidad de animales idénticos en un programa de TE como así también para ser
empleados como modelo de investigación (BREM, 1986), cuadro 1, capítulo XX. Esta técnica fue
rápidamente adoptada y es aplicada actualmente en los programas convencionales de TE en países
con alta disponibilidad tecnológica (GRAY y col., 1991, KIPPAX y col., 1991; LANGE y col., 1991).
Existe sin embargo escasa información sobre la aplicabilidad de esta técnica en países bajo
condiciones extensivas de producción y con el empleo de receptoras de razas productoras de carne o
sus cruzas, cuya rusticidad las hace más adecuadas a esos sistemas de producción que las razas
lecheras, pero cuya capacidad de gestar y criar dos individuos constituye un interrogante. En el
presente capítulo se presentarán, junto con los resultados obtenidos en la micromanipulación
(rendimiento embrionario) y sobrevivencia de las mitades producidas, aquellos logrados a partir de
embriones bovinos de raza para producción de carne (Aberdeen Angus): tasa de parición después de
una transferencia uni- o bilateral de los hemi-embriones producidos (HE) a receptoras cruza Aberdeen
Angus x Criollo como así también el efecto de una gestación doble sobre la supervivencia y desarrollo
corporal de los terneros producidos.
Cuadro 1: Particularidades de los mellizos homocigotas producidos por medio de microcirugía frente a
los mellizos naturales (BREM, 1986).
Particularidades según el modelo de aplicación
- Disminución de la varianza
- Aumento del progreso genético en la línea madre-hija
- Aumento de la exactitud del valor genético
- Aumento de la eficacia de los núcleos de producción (MOET)
- Aumento del número de terneros (30-50%) producidos en un programa de TE
- Disminución de los costos de la TE
Particularidades metodológicas
Ventajas
Desventajas
- Libre elección de los padres
- No requiere estudios diagnósticos
- Permite planear el momento de la
producción de los mellizos
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- El éxito de la manipulación no puede
ser previsto individualmente
- Requiere de personal calificado en
micromanipulación y transferencia
- La organización es compleja
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110
Palma & Brem
Técnicas microquirúrgicas
Existen diversas técnicas para dividir los embriones. La mayoría de ellas emplean micromanipuladores
(WILLIAMS y col., 1983; BREM y col., 1983; MASSIP y col., 1985; STEINMEYER, 1986; SEIKE y col.,
1989), otras no los requieren (PINTER y col., 1986). Los micromanipuladores se emplean en un número
que varía entre 2 (WILLIAMS y col., 1982; 1983) y 4 (BREM y col., 1983; 1987) y se colocan a ambos
lados de la lupa estereoscópica o del microscopio, foto 1.
Con un manipulador (foto 1, 5) es posible, con ayuda de una micropipeta de vidrio, fijar el embrión por
aspiración de la zona pelúcida. El micromanipulador del lado opuesto (foto 1, 3) está provisto del
instrumento cortante que puede ser una micropipeta de vidrio, un trozo de hoja de afeitar o un escalpelo
para cirugía ocular. Los manipuladores suplementarios (LEITZ, fotos 1, 2) pueden estar equipados con
microinstrumentos adicionales que permiten diferentes manipulaciones del embrión y las mitades como
así también su desplazamiento en la placa. Una microaguja permite seccionar o separar aquellas
mitades que no fueron divididas en su totalidad por el microescalpelo. Un brazo de mortero permite
desplazar los embriones denudados sin provocar traumatismos. Una micropipeta, en forma de gancho
permite abrir la zona pelúcida para extrar el embrión de su interior, fig. 1. Los instrumentos, con
excepción del microescalpelo, deben ser confeccionados a partir de finos tubos de vidrio con ayuda de
un estirador de pipetas (foto 5), este instrumento permite producir micropipetas con diámetro interno
deseado. La microfragua (foto 6) posibilita el corte exacto como así también las curvaturas de las
pipetas puede, además, redondear los bordes de las pipetas (de sostén) a fin de hacerlas atraumáticas.
La lijadora (foto 8) permite pulir los bordes de la pipeta en los ángulos deseados.
A pesar que la unidad de micromanipulación con un número de 4 micromanipuladores y 5
microinstrumentos (BREM, 1983) simplifica las maniobras operativas, su uso no se ha difundido porque
su costo aumenta de la misma forma con el creciente número de micromanipuladores sin mejorar los
resultados obtenidos con el empleo de dos micromanipuladores con dos microinstrumentos. Además es
más engorroso transportar y armar esta unidad de micromanipulación en un laboratorio ambulante de
TE. El éxito de la técnica dependerá fundamentalmente de la pericia del operador, razón por la cual no
existe un modelo, número de manipuladores o técnica de elección.
División
La división de los embriones se lleva a cabo con una lupa estereoscópica (120 x, foto 1) o un
microscopio invertido. Los embriones pueden seccionarse fijados con la pipeta de sostén (foto 2) o
adheridos al fondo de la placa. Para ello se coloca, en primer lugar, el embrión en un medio
conteniendo suero (20% SFB) y luego en el medio de micromanipulación sin suero. La carga eléctrica
del embrión, producida por las proteínas séricas, lo fijarán al fondo de la placa. En este caso se requiere
de mayor destreza que con la ayuda de una pipeta de sostén. Sin embargo no requiere del uso de
micropipetas. La microcirugía del embrión, fijado con la pipeta de sostén, con un microescalpelo de
cirugía ocular o un trozo de hoja de afeitar se lleva a cabo conformando un ángulo de 90 entre la pipeta
y el microescalpelo. En el caso de dividir el embrión con una micropipeta esta se dipone en el mismo
sentido que la pipeta de sostén (foto 3a). Una vez abierta la zona se extrae el embrión con ayuda de la
microaguja o del brazo de mortero. De esta forma el embrión puede ser dividido fuera de la zona
pelúcida (foto 3b). Una forma más simple es la división del embrión y de la zona pelúcida
simultáneamente. Esta variante se practica en aquellos casos en los que el embrión se adhiere al fondo
de la placa de Petri.
La manipulación de los embriones puede llevarse a cabo en PBS + 20% de SVE. De la misma forma
puede emplearse el mismo medio para el posterior cultivo de los embriones durante algunas horas, a fin
de evaluar la evolución de los mismos y establecer si son transferibles.
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111
1
2
3
5
4
Figura 1: Tipo y distribución de los microinstrumentos según BREM (1986)
1= pipeta de sujeción, 2= microescalpelo, 3= punta, 4= brazo de mortero, 5= gancho
1. Pipeta de sostén: los bordes de la punta son redondeados con ayuda de la microfragua (Fonbrune),
externo 110 µm, interno 25-30 µm
2. Microescalpelo: escalpelo para cirugía ocular o fragmento de hoja de afeitar con la punta afinada por
medio de lijado, en la punta 1-2 µm aproximadamente
3. Pipeta tipo estilete: 2 µm
4. Brazo de mortero: varilla de vidrio con una bolilla de vidrio en su extremo. Radio de la bolilla 20 m
aproximadamente.
5. Gancho: micropipeta de vidrio doblada, radio de 40 µm
Los microinstrumentos se confeccionan con fraguas, piedras de lijar y estiradores ad hoc (fotos 5,6 y 8).
Sin embargo es posible también hacerlas a mano (BREM, 1986), aspecto que debe ser considerado
particularmente en la aplicación de la técnica en razas cuyo valor agregado no compensen los costos.
Foto 1: Unidad de micromanipulación transportable con 4 micromanipuladores. 1: lupa estereoscópica
Wild M8, 2 = micromanipulador Leitz, 3: micromanipulador a control remoto AM3M, 4: control
remoto ST1, 5: micromanipulador mecánico, 6: jeringa con tubo de goma para la pipeta de
sostén (BREM, 1986).
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Foto 2: Mórula fijada con la pipeta de sostén. La zona pelúcida es abierta con un microcapilar recto
Foto 3a: División de la mórula fuera de la zona pelúcida
Foto 3b: División de la mórula fuera de la zona pelúcida
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113
Foto 4: Hemi-embriones después de la división. La pérdida de algunos blastómeros es inevitable
Factores que afectan el éxito de la división
La calidad de los embriones influye sobre el éxito de la división. Embriones de buena y muy buena
calidad alcanzan el 80% de sobrevivencia y el 25% de mellizos idénticos. Embriones de calidad media y
regular 43% y 15% respectivamente. De la misma forma se observó una sobrevivencia superior de los
HE de muy buena y buena calidad frente a los de calidad media y regular (tablas 1 y 2).
Foto 5: Estirador automático de pipetas, Bachofer, Alemania
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Tabla 1: Influencia de la calidad de los embriones de raza Fleckvieh sobre la gestación y producción
de mellizos (BREM, 1986)
Calidad del
embrión
Embriones
Fetos
Pares
muy buena
buena
mediana
regular
(n)
26
78
45
5
(n)
23
67
21
2
(%)
88,5
85,9
46,7
40,0
(n)
5
21
7
-
(%)
19,2
26,9
15,6
-
Σ
154
113
73,4
33
21,4
Tabla 2: Influencia de la calidad de hemi-embriones de raza Fleckvieh sobre la taza de preñez (BREM,
1986)
Calidad de las
mitades
muy buena
buena
mediana
regular
HE
(n)
21
116
98
73
308
Fetos
(n)
16
45
34
18
113
(%)
76,2
38,8
34,7
24,7
36,7
Estos resultados indican la necesidad de destinar a la micromanipulación sólo aquellos embriones de
buena a excelente calidad. La sección de los embriones provoca una pérdida celular embrionaria de
aproximadamente 10%, que segura-mente compromete la sobrevivencia de los embriones de calidad
inferior (McEVOY and SREENAN, 1990).
El rendimiento de un tratamiento superovulatorio, expresado en la relación de embriones
dividibles/recolectados es variable y depende de la calidad de la reacción superovulatoria. En buenas
respuestas superovulatorias es posible destinar más de la mitad de los embriones a la
micromanipulación (tabla 3). En este caso 64% de los embriones obtenidos fueron calificados como
dividibles. Sólo 39% conservó una calidad apropiada para ser transferido (13/33). Es interesante
señalar, sin embargo, que la división hubiese permitido aumentar la eficiencia de la TE, realizando 34
transferencias (26 HE + 8 E transferibles pero no divisibles), sin tener en cuenta los HE de calidad III,
que por razones experimentales no fueron incluidos en el ensayo.
Tabla 3: Número de cuerpos lúteos (CL), Embriones (E) y hemi-embriones (HE) producidos de raza
Aberdeen Angus (PALMA y col., 1991)
n
5
%
Vacas superovuladas
CL palpados
36
100
E obtenidos
33
91,6
100
E divididos
29
80,5
87,9
Pares de E producidos
13
36,1
61,9
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%
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Las tasas de preñez obtenidas con la transferencia de HE variaron con el desarrollo de la técnica y los
autores desde 16,6% (LAMBETH y col., 1983) hasta 79% (WILLADSEN y col., 1981). En general la tasa
media de preñez con la transferencia de HE varía entre 50-60% (LEIBO y RALL, 1987; TAKEDA y col.,
1987) y es necesario dividir 3-4 embriones para producir un par de mellizos idénticos (BREM, 1986). Es
decir que entre 25 y 30% de los pares de h-embriones transferidos darán lugar a mellizos idénticos. La
exactitud en la división microquirúrgica se verifica a través de la relación entre el tamaño de las mitades
obtenidas. Por esa razón fueron puestos a prueba diferentes microinstrumentos para dividir a los
embriones. Los resultados obtenidos con la microaguja no difirieron con los obtenidos con el
microescalpelo cuando fueron divididos embriones en estadio de mórula, (BREM, 1986; AGRAWALA,
1987). En el caso particular de los blastocistos no se observaron diferencias significativas entre ambos
microinstrumentos, pero si mayor simplicidad en la operación con el uso del microescalpelo y una
tendencia a obtener mayores tasas de preñez particularmente con blastocistos tempranos y medianos
(BREM, 1986, tabla 4). Las posibles razones serían que en los blastocistos (temprano y mediano) las
estructuras celulares (trofoblasto y masa celular) se pueden diferenciar con ayuda del microscopio. La
unión celular de las células de los blastocistos, mantiene a las mitades compactas después de la
división. Por último el microescalpelo es más filoso que la micropipeta, y permitiría un corte más preciso
del botón embrionario de los blastocistos.
Cuando la diferencia de tamaño, entre las mitades obtenidas, no existe (relación 50-50%) o ésta es muy
pequeña (relación 55-45%) es de esperar una óptima tasa de preñez (80%). Si la relación se desvía en
20% la preñez disminuye consecuente-mente (60-18%).
Tabla 4: Resultados obtenidos con la división de embriones por medio de microescalpelo (BREM,
1986)
Estadio
Embriones
n
n
Fetos
%
n
Pares
%
M
Bt
B
Be
102
27
19
6
62
28
19
4
61
104
100
67
12
13
7
1
12
48
37
17
Σ
154
113
73
33
21
La ausencia de zona pelúcida de los hemi-embriones no afecta la gestación (tabla 5, Agrawala, 1987).
Esta particularidad contribuyó a simplificar la técnica, de forma tal que en la actualidad éstos pueden ser
transferidos sin membrana pelúcida. Los 2 h-embriones obtenidos pueden ser transferidos en forma
bilateral y no quirúrgica a una receptora o separados: cada mitad al cuerno ipsilateral al ovario c/cuerpo
lúteo de una receptora. WILLADSEN y col. (1981) lograron una preñez de 79,0% después de la
transferencia bilateral de las 2 mitades de un embrión dividido, BREM (1986) alcanzó 96,3% con la
misma técnica. OZIL (1983) y LAMBETH y col. (1983) obtuvieron una marcada diferencia con la
transferencia de una mitad (45,4 y 16,6% respectivamente) y 2 mitades (72,7% y 62,5%
respectivamente) a una receptora.
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Foto 6: Microfragua de Fonbrune, Alemania
Tabla 5: Tasa de preñez obtenida con hemi-embriones transferidos con y sin zona pelúcida
Transferencia de
las mitades
Con zona pelúcida
Embriones
divididos
n
19
Sin zona pelúcida
10
20
8
40
Sin zona pelúcida
21
21
10
48
23
13
57
23
23
57
Con zona pelúcida
Receptoras
Receptoras
preñadas
n
36
n
18
%
50
46
Sin zona pelúcida
Autor
AGRAWALA,
1987
McEVOY y
SREENAN,
1990
KIPPAX y
col., 1991
Luego de la transferencia de los HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criolla
parieron 9 de 17 receptores (52,9%), de las cuales 7 fueron simples y 2 dobles (tabla 6). No se
encontraron diferencias en la parición entre diferentes estadios de los embriones divididos (Mc 7/8,
87,5%; B 4/5, 80.0%)
Tabla 6: Preñez después de la transferencia de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen
Angus x Criolla (PALMA y col., 1991)
HE
transferidos
(pares)
13
(n)
17
Receptoras
paridas
(n)
9
(52,9%)
Nacimientos
simples
dobles
(n)
(n)
7
2
(77,9%) (22,2%)
Teniendo en cuenta el tipo de transferencia, se observó una mayor tasa de preñez con la transferencia
bilateral (66,6%) frente a la unilateral (37,5%) aunque no fueron encontradas diferencias significativas
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117
(tabla 7). No se registraron nacimientos de mellizos después de la transferencia unilateral, posiblemente
debido al reducido número de pares transferidos. De los HE transferidos en forma bilateral el 22,2%
fueron mellizos homicigotas. En este trabajo no se alcanzaron los resultados logrados por WILLIAMS y
col. (1984); BREM (1986); AGRAWALA (1987); SEIKE (1989); quienes alcanzaron una tasa próxima al
30%. Se determinó, sin embargo, la presencia de 3 gestaciones dobles (33,3%), en la palpación rectal
realizada a los 70 días post transferencia. Por razones no determinadas una de ellas no llegó a término,
lo que motivó los resultados de parición mencionados.
Tabla 7: Tasa de parto con transferencia uni- o bilateral de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras
Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col., 1991)
Tipo de
transferencia
(n)
Unilateral
8
Bilateral
9
Receptoras
total paridas
(n)
3
(37%)
6
(67%)
Pares de
mellizos
(n)
0
2
(22%)
El rendimiento de la división microquirúrgica, expresado a través de los terneros nacidos por embrión
empleado fue próximo a 1,0 (tabla 8).
Tabla 8: Eficacia de la producción de mellizos idénticos de raza Aberdeen Angus con receptoras
Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col, 1991)
Tipo de
transferencia
Embriones
transferidos
(n)
Terneros
obtenidos
(n)
ET/tn1
Unilateral
Bilateral
4
9
3
8
0,75
0,88
Total
13
11
0,86
1 ET/Tn= relación embrión empleado ternero nacido
LAROCCA y col. (1992) observaron un aumento significativo de la muerte embrionaria cuando las dos
mitades fueron transferidas en un solo cuerno uterino.
Nacimientos simples y dobles
No hubo problemas de parto ni retención de placenta en las receptoras AA x Criollo que parieron
mellizos (foto 7). El análisis de los pesos fue realizado en los terneros del mismo sexo, para no
introducir ese factor de variación en el bajo número de animales estudiados. Se estudió el peso inicial y
su evolución en 5 terneras nacidas de gestaciones simples y 4 productos de gestaciones dobles. El
peso al nacimiento fue de 26±3,9 Kg para las primeras y de 21±1 Kg para las segundas (p>0,05). La
falta de una diferencia estadística significativa entre los pesos medidos pudo estar dada por la variación
observada en los pesos de los animales nacidos de gestaciones simples. Por el contrario, la ganancia
de peso observada durante los primeros 5 meses de vida fue diferente (0,758±0,07 kg y 0,637 ± 0,025
kg/día para los nacimientos simples y dobles respectivamente, (p<0,01). Los pesos a una edad próxima
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al destete tendieron a ser diferentes (135±12,5 kg los simples y 118 ± 3,3 Kg los dobles) a favor de las
gestaciones simples, sin embargo se obtuvo una mayor cantidad total de Kg de ternero destetado (236
Kg. vs. 135) con las receptoras melliceras. Por otra parte, con respecto al peso individual, es de esperar
una recuperación del peso de los mellizos después del destete suficiente como para alcanzar a los
simples antes del año de edad (MAULEON y col., 1970).
Foto 7: Dos pares de mellizos idénticos de la raza Aberdeen Angus producidos por medio de
microcirugía (PALMA y col. 1991)
Foto 8: Piedra de lijar micropipetas y microescalpelos
Conclusiones
La producción de mellizos idénticos por medio de micromanipulación permite aumentar de 0,6-0,7 a 1,01,1 terneros por embrión obtenido, incrementando la eficacia de un programa de TE entre 30-40%,
disminuyendo sus costos y posibilitando la obtención de mellizos idénticos. En la actualidad, la
transferencia doble de embriones se efectúa en receptoras de gran tamaño (razas lecheras y de doble
propósito) que cuentan con mayor capacidad uterina para albergar dos gestaciones. Las receptoras
Aberdeen Angus x Criollo no respondieron de la misma forma a las características mencionadas,
pudiendo este hecho haber afectado los resultados obtenidos. Es necesario, en consecuencia, realizar
más estudios para aclarar la importancia de la receptora en el éxito de esta técnica. Las receptoras para
producción de carne, por otra parte, no incorporan problemas adicionales al no presentarse dificultades
de parto ni alterarse la crianza de los terneros.
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Berg & Reichenbach
PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES
U. Berg & H. D. Reichenbach
Introducción
Los primeros trabajos sobre maduración in vitro de ovocitos bovinos fueron publicados por EDWARDS
en el año 1965. El primer ternero producto de la FIV nació en el año 1981. De esta forma BRACKETT y
col. (1982) comprobaron el éxito de la fertilización in vitro con ovocitos madurados in vivo. El cultivo in
vitro de los ovocitos fecundados constituyó un problema metodológico, con los medios de cultivo
habituales se desarrollan los cigotos hasta un determinado "block", que varía según las especies. En la
especie bovina el desarrollo se interrumpía en el estadio de 8-16 células. Para superar el desarrollo
temprano insuficiente se emplearon medios de cultivo in vivo, en los cuales los cigotos o embriones de
2 células fueron cultivados en oviductos de oveja (CRISTER y col., 1986; EYESTONE y col., 1987; LU y
col., 1988a), de coneja (BOLAND, 1984; SIRARD y col., 1985; FUKUI y ONO, 1988) o de vaquillona (XU
y col., 1987) durante 4-6 días. La desventaja de ese método, además de la complejidad de la técnica,
es la pérdida de hasta un tercio de los embriones transferidos.
Un nuevo camino para superar la interrupción del desarrollo embrionario fue encontrado con el empleo
de cultivos celulares. A través del co-cultivo con determinadas células somáticas es posible alcanzar las
condiciones adecuadas para lograr un desarrollo embrionario normal.
La producción in vitro de embriones comprende 3 etapas:
- Maduración in vitro de los ovocitos obtenidos de ovarios por medio de punción folicular
- Fecundación in vitro de los ovocitos madurados
- Cultivo in vitro de los embriones
Recolección de los ovarios y maduración in vitro de los ovocitos
Los ovocitos son en general obtenidos en el matadero a partir de ovarios de vacas y vaquillonas no
preñadas aunque hasta el momento no existe evidencia que la producción de ovocitos a partir de
ovarios con un CL de gestación sea diferente. Los ovarios contienen un gran número de ovocitos en
diferentes estadios de desarrollo.
El transporte hasta el laboratorio se lleva a cabo en una solución PBS a temperatura ambiente. YANG y
col. (1990) señalaron la posibilidad de conservar los ovarios a 24-25o C durante 11 h sin disminuir la
capacidad fecundante o el desarrollo posterior de los embriones. Ello significa para su aplicación
práctica, que un prolongado tiempo de transporte desde el matadero hasta el laboratorio no afecta
negativamente los resultados esperados. Temperaturas de 37o y 4o C son, sin embargo, inadecuadas
para una larga conservación de los ovarios.
Después de lavar los ovarios 3 veces en medio de transporte se procede a la obtención de los ovocitos
por medio de un aparato de punción, que opera con una presión negativa de 100mm Hg. En caso de no
contar con un aparato de estas características es posible también aspirar los ovocitos con una jeringa.
La aguja en ambos casos es de 0,9 mm Ø. Se puncionan todos los folículos terciarios visibles que
posean un tamaño comprendido entre 2-6 mm de Ø. El líquido folicular con los ovocitos se deja
sedimentar aproximadamente 15 minutos antes de aislar los complejos cumulus-ovocito. Luego de
lavarlos 2 veces es posible clasificar a los ovocitos morfológicamente en 3 categorías. Se destinan a la
maduración aquellos ovocitos que posean un cumulus oophorus denso que cubra la totalidad del
ovocito y un citoplasma uniformente granulado y oscuro (SÜSS y STRANZINGER, 1987; foto 2). El
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Producción in vitro de embriones
121
segundo grupo lo constituyen los ovocitos cubiertos sólo parcialmente con el cúmulus algo distendido
(foto 2) y el tercero carece de células del cúmulus. La presencia de un cúmulus completo con un mínimo
de 5 capas tiene importancia en el desarrollo de los ovocitos inmaduros, que se contactan con las
células somáticas por medio de prolongaciones citoplasmáticas de las células de la granulosa o "gap
junctions" (foto 1). Esas uniones le permiten al ovocito ingresar aminoácidos y otros nutrientes, que en
forma pasiva no atraviesan la zona pelúcida (MOOR, 1983). Los resultados obtenidos por varios grupos
de trabajo indican que sólo los ovocitos que cuentan con un cumulus completo y compacto poseen la
capacidad de completar la maduración in vitro (LEIBFRIED y FIRST, 1979; SÜSS y MADISON, 1983) y
alcanzar el completo desarrollo esperado (STAIGMILLER y MOOR, 1984).
Foto 1: Zona pelúcida atravesada por largas prolongaciones citoplasmáticas (ZA) de las células de la
granulosa (Gap-junctions), en íntimo contacto con la membrana ovocitaria, corte semi fino
Con el aumento del tamaño folicular disminuye el número de complejos cumulus-ovocitos. Al mismo
tiempo aumentan los signos de degeneración en el ovocito como así también cambios en la estructura
del cumulus, que se asemejan a los observados in vivo, provienen en su mayoría de folículos terciarios
atrésicos (SÜSS, 1990).
Por animal se obtienen en promedio entre 15 (PALMA y col., 1993) y 18 ovocitos, de los cuales entre
57% (BERG y col., 1991a) y 70% (PALMA y col., 1993) responden a los criterios morfológicos para una
exitosa maduración in vitro.
Un medio de maduración adecuado es el medio de cultivo celular 199, el cual fue modificado (PAVLOK,
1988, comunicación personal) a través del agregado de piruvato de sodio (2 mM), lactato de calcio
(2,92), FSH (10 g/ml; Burns Biotec), gentamicina (50 g/ml) y una combinación de buffers Hepescarbonato (33,9mM carbonato de sodio, 4,43mM Hepes). Como fuente proteica se emplea suero de
vaca en celo inactivado por medio de calor. En comparación con otros sueros éste posee altas
concentraciones de LH y prolactina (YOUNIS y col., 1989). El efecto de las gonadotrofinas durante la
maduración de los ovocitos es variado. Bajo su influencia se produce la expansión de las células del
cumulus tanto in vivo como in vitro (foto 4) cuyo significado en la especie bovina podría ser interpretado
como la mayor facilidad con que las fimbrias de la ampolla del oviducto pueden atrapar el ovocito cuyo
cumulus se encuentra expandido y adherente (EYESTONE y FIRST, 1990).
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Foto 2: Ovocito con un cumulus oophorus Foto 3: Ovocito con cumulus oophorus incompleto
denso y compacto
Foto 4: Ovocito con cumulus oophorus expandido
después de 24h de la maduración
Un cumulus no expandido constituye una barrera impenetrable para los espermatozoides durante la
fecundación. La FSH y LH posibilitan al mismo tiempo una caída del AMPc en el ovocito y con ello
cambios en la síntesis proteica completando la meiosis. Las gonadotrofinas participan paralelamente en
la maduración del citoplasma, que desempeña un rol de importancia en la fecundidad del ovocito. De
esta forma, la presencia de cumulus expandidos y pegajosos, permite estimar la presencia de un citoplasma maduro. La maduración se lleva a cabo a 39oC con 5% CO2 durante 24h con máxima humedad
ambiente. Alrededor del 80% de los ovocitos que se encontraban en el momento de la punción folicular
en estadio vesicular, reinician la meiosis y alcanzan el estadio de metafase II al cabo de 24h, lo que
corresponde al momento de la ovulación (fig 1).
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Producción in vitro de embriones
AG
CG
0h
REL
M
≅21-22 h
≅ 9-12 h
REL
≅ 19 h
≅ 15 h
Fig 2: Esquema de las fases de maduración nuclear y citoplásmica de ovocitos bovinos, según
HYTTEL y col. (1989):
Los eventos se describen cronológicamente a partir del comienzo del cultivo: 0 h ovocito inmaduro
antes del cultivo: células del cumulus oophorus compactadas, el núcleo redondeado con
condensaciones dispersas de la cromatina, mitocondrias (M), aparatos de Golgi (G) y los cumulos de
gránulos corticales (GC) localizados en la periferia. ~9-12 h El contacto entre las proyecciones
citoplasmáticas de las células de la granulosa y el ovocito se encuentra casi totalmente interrumpido. El
núcleo del ovocito adopta una forma convolutada y la cubierta nuclear se diferencia en retículo
endoplásmico liso (REL). En el núcleo la cromatina está condensada y adyacente al mismo aparecen
densas áreas y microtúbulos. ~15 h El cumulus está expandido y sus proyecciones citoplasmáticas
están completamente interrumpidas. En el ovocito se inicia la metafase de la primera división meiótica
en una densa área del ooplasma. Las mitocondrias migraron en todo el citoplasma con una distribución
más o menos uniforme. ~19 El primer cuerpo polar es expulsado y se inicia la segunda división meiótica
en forma similar a lo descrito. ~21-22 h Los gránulos corticales migraron a la periferia a lo largo del
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Berg & Reichenbach
oolema. Los aparatos de Golgi se encuentran dispersos en todo el ooplasma y el REL forma
conglomerados. En este momento el ovocito maduró e ingresa en un estado de quiescencia.
Selección y capacitación espermática (swim-up)
De la misma forma que el ovocito, los espermatozoides llevan a cabo con la capacitación su
maduración, que in vivo se desencadena a través de las secreciones del tracto genital femenino.
Aunque el mecanismo exacto de la capacitación no es claro aún, se conoce que conduce a cambios en
la composición lipoproteica de la membrana espermática, a un aumento del metabolismo y de la
motilidad del espermatozoide (hipermotilidad). La unión de los espermatozoides a los receptores de la
membrana pelúcida ocurre gracias a la presencia de proteínas de unión, que permiten una fecundación
específica para cada especie. Antes y después que la célula espermática toma contacto con la
membrana pelúcida se desencadena la reacción acrosómica (fig. 3). Durante la reacción se funden dos
tercios de la membrana plasmática con la membrana externa del acrosoma formando vesículas, de esta
forma se liberan las enzimas acrosomales. Esas enzimas líticas abren el camino al espermatozoide a
través de la zona pelúcida (WASSARMAN, 1990).
Fig 3: Esquema de la reacción acrosómica según HYTTEL y col. (1989): 1. cabeza espermática antes
de la reacción acrosómica (N) núcleo, (A) acrosoma, (MAI) membrana acrosómica interna,
(MAE) membrana acrosómica externa y (MP) membrana plasmática. Nótese la posición del
segmento ecuatorial (SE). 2. cabeza espermática durante la reacción acrosómica sobre la
membrana pelúcida (MP). La fusión de la membrana plasmática con la membrana acrosómica
externa resulta en la formación de vesículas. El segmento ecuatorial no fue afectado por la
reacción acrosómica.
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Producción in vitro de embriones
125
La importancia de una completa capacitación para la reacción acrosómica y la fecundación se observó
en los primeros ensayos de fecundación in vitro, que condujeron a muy bajas tasas de penetración.
Recién después del descubrimiento y aplicación de glicosaminoglicano, cuyo más activo representante
es la heparina, se lograron mejoras en los resultados. El origen cervical y uterino de la heparina fue el
primer punto de partida para concluir que su presencia juega un rol de importancia en la preparación de
los espermatozoides para la fecundación. Hoy se sabe que la heparina a través de la reacción
acrosómica permite el ingreso del espermatozoide en el ovocito (PARRISH y col., 1986). De forma
similar ocurre con la catecolamina adrenalina (1 µM) y el aminoácido hipotaurina (10 µM), los cuales a
través de la activación de la capacitación conducen a una mayor tasa de penetración (BALL y col.,
1983; GREVE y col., 1987; LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1987). La fecundación in vitro en la especie
bovina se puede llevar a cabo con semen fresco o congelado/descongelado después que es llevado a
cabo el swim-up (PARRISH y col., 1986). Este tratamiento permite establecer condiciones similares a
las fisiológicas. El semen a tratar es colocado en el fondo de un tubo cónico conteniendo 1 ml de medio
de capacitación y sometido a baño María a 39oC durante 1h. En la actualidad se conoce que durante
este tiempo la capacitación sólo se inicia. El proceso concluye en el medio de fecundación durante el
co-cultivo de los espermatozoides con los ovocitos. Durante el swim-up los espermatozoides mótiles
migran en el medio de capacitación, liberándose del plasma seminal que queda en el fondo del tubo
cónico. Después de 60 minutos de incubación son retirados 850µl del medio de capacitación
sobrenadante con los espermatozoides mótiles y centrifugado a 200 g durante 10 minutos. Después de
la centrifugación el sobrenadante es retirado y el "pellet" resuspendido. Después de una segunda
centrifugación se retira el sobrenadante hasta un volumen de 100µl y se evalúa la concentración
espermática a fin de colocar una concentración de 1 millón de espermatozoides por ml de medio donde
se encuentran los ovocitos.
Fecundación in vitro
La fecundación comprende una serie de procesos cuyo punto final está representado por la fusión de
los núcleos de ambas gametas y la formación del genoma del nuevo individuo. El medio de fecundación
es un medio Tirodes-Lactato modificado, al que se le agregan heparina (30 µl de la solución final),
adrenalina e hipotaurina, 15 µl de la solución final, (BALL y col., 1983). El tiempo de fecundación es de
20-24h bajo las mismas condiciones de cultivo que durante la maduración de los ovocitos. La
penetración del espermatozoide (fig 4) desencadena la segunda parte de la división meiótica con la
expulsión del segundo corpúsculo polar. Simultáneamente se cumple la descondensación de la cabeza
espermática y la formación del pronúcleo masculino. Este proceso es dependiente de la presencia de
factores de crecimiento del pronúcleo masculino en el citoplasma del ovocito (BALL y col., 1984). Para
la síntesis de esos factores de crecimiento es necesaria la presencia de esteroides y catecolaminas
durante la maduración del ovocito.
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Berg & Reichenbach
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4
Fig 4: Esquema de la penetración del espermatozoide en el ovocito según HYTTEL y col. (1989):
1) espermatozoide después de la reacción acrosómica, (N) núcleo, (MAI) membrana acrosómica
interna, (MA) membrana acrosómica externa y la membrana nuclear (MN) en el espacio perivitelino
sobre la superficie del ovocito. Las microvellosidades contactan el segmento ecuatorial, que no es
afectado por la reacción acrosómica. Obsérvese la distribución de los gránulos corticales localizados a
lo largo del oolema. 2) La fusión de las membranas ocurre entre las microvellosidades y el segmento
ecuatorial. 3) La zona ecuatorial está extendida abarcando la totalidad del segmento ecuatorial y parte
de la región acrosómica posterior. Los gránulos corticales comienzan a liberarse. 4) El espermatozoide
comenzó a penetrar en el ooplasma. Para evaluar la fecundación los ovocitos pueden ser fijados y
coloreados con una solución de orceína. La fecundación es considerada por la presencia de los dos
pronúcleos y, en estadios tempranos, la cola del espermatozoide.
La tasa de penetración y la tasa de polispermia también pueden ser determinadas en el marco de la
evaluación de la fecundación. En estudios propios la tasa de fecundación con un toro seleccionado para
la PIV fue 68% y 74% de penetración, esto es, 6% de los ovocitos sufrieron polispermia (BERG y
BREM, 1989). Este último valor, alto comparado con las tasas de polispermia observadas in vivo, podría
ser explicado a través de una incompleta o demorada reacción de la zona de los ovocitos madurados in
vitro. En condiciones normales después que el espermatozoide penetró en el ovocito se unen los
gránulos corticales con la membrana y vuelcan el material enzimático en el espacio perivitelino. En los
ovocitos madurados y fertilizados in vitro la secreción de los gránulos corticales se observa
frecuentemente como estructuras no dispersas en invaginaciones del oolema, posiblemente como
consecuencia de una demorada migración a la periferia (HYTTEL y col., 1989; fig. 6). Los cambios
posteriores del lado interno de la membrana pelúcida actúan como bloque a la polispermia
(WASSARMAN y col., 1990). Una concentración espermática elevada, por encima de los valores
establecidos puede conducir igualmente a los mismos problemas de polispermia. El éxito de un
programa de PIV depende además de la calidad de los ovocitos del toro empleado (LEIBFIED-
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Producción in vitro de embriones
127
RUTLEDGE y col., 1989) y no tiene relación conocida con los resultados obtenidos con el mismo toro in
vivo, como por ejemplo el índice de no retorno.
Fig 6: Esquema de los fenómenos asociados con la migración periférica y liberación de los gránulos
corticales in vivo e in vitro según HYTTEL y col. (1989)
Cultivo in vitro. Tasas de desarrollo
Después que el desarrollo de los embriones cultivados en los medios convencionales se detenían en
estadios específicos según las especies, se intentó aproximar el cultivo in vitro a las condiciones
fisiológicas con el empleo de células denominadas "colaboradoras". Los co-cultivos celulares más
empleados son aquellos con células del oviducto (FUKUI y ONO, 1988; LU y col., 1988b; EYESTONE y
FIRST, 1989), células granulosas (GOTO y col., 1988; BERG y BREM, 1989) y fibroblastos uterinos
(VOEKEL y col., 1985; WIEMER y col., 1987) como así también el co-cultivo con vesículas trofoblásticas
(CAMOUS y col., 1984; HEYMAN y col., 1987). En ensayos propios se empleó el método de co-cultivo
con células del oviducto, con el cual se habían logrado buenos resultados en el cultivo in vitro de
embriones ovinos (GANDOLFI y MOOR, 1987; REXROAD y POWELL, 1988). Para ello se lavan
oviductos con PBSS. Las células que forman el sedimento se resuspenden en el medio Ham's F 10 con
el agregado de 10% de suero de vaca o en el medio 199 modificado que se empleó para la maduración
de los ovocitos. Después de un corto tiempo se forma una capa de células que cubren al cabo de 10-14
días, el fondo de la placa. Una alternativa para el co-cultivo con células somáticas lo constituye el
empleo de las células granulosas a partir del cumulus de los ovocitos fecundados. Como medio de
cultivo se emplea el medio 199 modificado con el agregado de 20% de suero de vaca (BERG y BREM,
1989). A través de la disminución de la concentración de O2 a un 5% se observa una mayor tasa de
desarrollo y una mejor calidad de los embriones producidos. La explicación para ello sería que una
atmósfera reducida de oxígeno impediría la formación de peróxido que afecta negativamente al embrión
en desarrollo.
Resultados comparativos indicaron que la presencia de células granulosas ofrece mejores condiciones
para el desarrollo de los embriones frente al co-cultivo con células del oviducto. El desarrollo de mórulas
y blastocistos empleando las células del cumulus es el doble. Aproximadamente un tercio de los
ovocitos cultivados pueden transformarse en embriones transferibles (BERG y BREM, 1990a; tablas 1 y
4; PALMA y col., 1992, tabla 2 y figura 9).
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Tabla 1: Tasas de desarrollo de ovocitos madurados y fertilizados in vitro en 3 sistemas de cultivo
diferentes (BERG y BREM, 1990a)
Co-cultivo con:
Medio de cultivo
Condiciones
Desarrollo 162 h
después de FIV
Mórulas
Blastocistos
Σ
a:b = p <0,01 ( Test de χ2)
células del
oviducto
células del
oviducto
células de la
granulosa
Ham's F10 + 10%
FKS
5% CO2/aire
MPM + 20%
SVE
5%CO2/5%O2/
MPM + 20%
SVE
5%CO2/5%O2/90%
90%N2
N2
n
112a
n
157a
n
160b
10 (8,9%)
3 (2,7%)
21 (13,4%)
6 (3,8%)
35 (21,9%)
16 (10,0%)
13 (11,6%)
27 (17,2%)
51 (31,9%)
La primera evaluación morfológica puede llevarse a cabo 90h después de la FIV, coincidiendo con la
liberación de los embriones del exceso de células del cumulus. En ese momento se encuentran 43% de
los embriones en estadio de 6-12 células (foto 5). Comparando esa tasa de división con el desarrollo
posterior de los embriones se puede comprobar que 3/4 del total de ovocitos fertilizados pueden superar
el "block" de 8-16 células (foto 6).
Otra alternativa exitosa para el cultivo de los embriones es la aplicación de medios condicionados. El
empleo de medios libres de células cobra importancia en el cultivo de embriones, cuya zona pelúcida
fue abierta por medio de manipulación.
En nuestros ensayos fue evaluado un medio, producido a partir de células del cumulus obtenidas de
ovocitos fecundados después de 7 días de cultivo en medio 199 modificado. En ensayos conducidos a
evaluar la congelabilidad del medio, como un aspecto de implementación práctica, no se observaron
diferencias en las tasas de desarrollo. Aparentemente la actividad embriotrofa del medio condicionado
permanece estable después de la congelación/descongelación (BERG y BREM, 1990b). Estos
resultados coinciden con los obtenidos por EYESTONE y FIRST (1989) con medio condicionado a partir
de células del oviducto.
Foto 4: Embriones en estadio de 6-12 células 90h Foto 5: Mórulas y blastocistos 7 días después de
después de la FIV
la FIV
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Producción in vitro de embriones
Foto 6: Blastocistos expandido y protruido 9 días
después de la FIV
En la mayoría de los trabajos experimentales descriptos en la producción in vitro de embriones bovinos
se trabajó con ovarios de numerosas vacas en forma de pool. Para el empleo de esta técnica con
determinados objetivos productivos, es de interés producir embriones de reproductoras en forma
individual. Dado que es conocido que el éxito de la fecundación depende del semen que se emplee
(LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1989) quedaba por responder en que medida es posible prever la
producción de embriones transferibles a partir de los ovocitos de un animal.
Los resultados indican que la tasa de desarrollo varía ampliamente entre animales (tabla 3). En 22
casos se produjeron un promedio de 2 (±1,9) mórulas y 1,9 (± 2,6) blastocistos, esto es, 28% (± 21%)
de los ovocitos empleados se desarrollaron hasta estadios viables para la transferencia. Los valores
extremos en las tasas de desarrollo se encontraron entre 0% y 75%. El mayor número de embriones
obtenidos de un animal fueron 12 mórulas y blastocistos.
Tabla 2: Desarrollo de embriones producidos in vitro en dos sistemas de cultivo (PALMA y col., 1992b)
Ovocitos
% de embriones producidos (n)
Co-cultivos
n
Mórulas
Blastocistos
Total
CO
135
12,5 (17)
0,7a (1)
13,2 (18)
CG
190
5,2 (10)
17,8b (34)
23,0 (44)
CO: Células del oviducto, CG: células de la capa granulosa, a,b: p<0,05
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Tabla 3: Tasas de desarrollo (TD) de ovocitos inmaduros a los estadios de mórula (M) y blastocisto (B)
162h después de la fecundación in vitro (BERG y BREM, 1991)
Animal
No
Ovocitos
n
M
n
B
n
M+B/
animal
TD
1
13
2
4
6
46
2
16
2
10
12
75
3
25
3
0
0
12
4
19
5
0
5
26
5
10
1
0
1
10
6
20
5
0
5
25
7
10
0
1
1
10
8
11
1
4
5
45
9
12
0
5
5
42
10
12
0
6
6
50
11
11
0
0
0
0
12
15
2
2
4
27
13
9
1
2
3
33
14
15
5
1
6
40
15
8
0
0
o
0
16
16
6
1
7
44
17
15
0
0
0
0
18
13
3
2
5
38
19
24
2
0
2
8
20
14
4
4
8
57
21
9
1
0
1
11
22
12
2
0
2
17
Σ
309
45
42
87
x ± DS
14±5
2±2
2±2
4+/-3
28±21
El co-cultivo con células del oviducto proporcionó una tasa desarrollo de blastocistos significativamente
menor que con células de la granulosa. PALMA y col. (1992) concluyeron que el efecto positivo del cocultivo con las células del oviducto de vaca con los embriones clonados no se verifica en el cultivo de
embriones producidos in vitro y que ello podría estar provocado por el mayor número de embriones
cultivados por microgota comparado al número reducido de embriones clonados cultivados en el mismo
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Producción in vitro de embriones
volumen y/o requerimientos diferentes de ambos tipos de embriones. Por otra parte los autores son de
la opinión que la obtención y producción de suspensiones de células del oviducto requiere de destreza,
a fin de obtener un cultivo estéril con alto porcentaje de células vivas. Ello convierte al cultivo en CO en
una técnica engorrosa en su desarrollo.
La producción de embriones en forma individual comparada con aquella en pool no fue diferente
estadísticamente (tabla 4).
Tabla 4: Producción in vitro individual y en pool de mórulas (M) y blastocistos (B), BERG y BREM,
1991b
Producción
Ovocitos
M
B
% M+B
Individual
309
45
42
28
Pool (control)
332
47
66
34
Pool (total)
1702
295
262
33
Trabajos realizados por otros autores señalaron una sensible disminución en la producción de
embriones cuando los ovocitos empleados eran madurados, fecundados y cultivados en pequeños
grupos (n= 5, SÜSS y col., 1990). Para evaluar el efecto del cultivo en pequeños grupos sobre la
producción y el desarrollo de embriones bovinos, se dividieron los ovocitos madurados y fecundados (n
= 710) en grupos de 30 COCsf/400 µl para su cultivo en 3 grupos con un número decreciente de
embriones por gota (PALMA y col., 1992). Al 7o día de cumplida la fecundación la tasa de blastocistos y
mórulas producidos se redujo significativamente con la disminución del número de COCsf cultivados
(p<0,01) como consecuencia de una significativa disminución del número de blastocistos producidos
(p<0,01). El desarrollo hasta el estadio de mórula no mostró diferencias significativas.
Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio coinciden con los obtenidos por SÜSS y col. (1990) y
FERRY y col. (1992) y explicarían la tendencia a obtener menos embriones cuando el número de
complejos cumulus-ovocitos fecundados cultivados, varía entre 10-25 (tablas 2 y 3). Los mismos
indicarían además que el número de embriones cultivados tiene un efecto per se sobre el desarrollo de
los ovocitos fertilizados. Aspecto que deberá tenerse en cuenta en los programas individuales de PIV,
clonado o embriones transgénicos, en los cuales el número de embriones a cultivar excepcionalmente
alcanza el óptimo. FERRY y col. (1992) recomiendan una relación de 1 embrión/µl de medio de cultivo,
como una vía adecuada para adaptar el medio de cultivo al número de COCsf cultivados. Sin embargo
sus resultados óptimos no superan aquellos que se obtienen en nuestro laboratorio (26-32% de
blastocistos, PALMA y col. (resultados no publicados) con una relación 1 embrión/1µl de medio de
cultivo.
Tasas de desarrollo embrionario empleando ovocitos de hembras impúberes
No existe suficiente información que describa el grado de éxito de la producción in vitro de embriones
empleando ovocitos de hembras impúberes. Sin embargo este aspecto gana particular importancia
debido a su trascendencia en el mejoramiento genético (ver capítulo XIX). KAJIHARA y col. (1991)
obtuvieron ovocitos de terneras Holstein de 4 meses de edad (n= 509), después de la faena o
quirúrgica-mente luego de una tratamiento con FSH, con el objeto de evaluar el efecto del tiempo de
maduración sobre el desarrollo de los embriones producidos. Los autores obtuvieron 8-12% de
blastocistos (Bt, B y Be) y 1-4% de blastocistos protruidos, concluyendo en la factibilidad de producir
mórulas y blastocistos in vitro con ovarios de terneras. Lamentablemente los autores no contaron con
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Berg & Reichenbach
un grupo control de ovocitos de animales púberes a fin de comparar sus resultados. Coincidentemente
con ello se observó en nuestro laboratorio una marcada disminución de las tasas de recolección,
maduración y desarrollo embrionario con el empleo de estos ovocitos comparado con los obtenidos de
hembras púberes (PALMA y col., 1993). Los resultados obtenidos fueron ineficaces (tabla 5) pero
superiores a los alcanzados por KAJIHARA y col., hecho que despertaría expectativas en el uso de esta
categoría de animales. PALMA y col. suponen que los ovocitos obtenidos de los animales impúberes
estudiados (raza Fleckvieh, 90-130 Kg p.v) requieren otras condiciones para su obtención y
especialmente maduración. El uso de 20 µg/ml de FSH logró mejorar significativa-mente la tasa de
producción de blastocistos protruidos frente al grupo control tratado con la mitad de la concentración
(PALMA y col., 1993 resultados no publicados). Será necesario llevar a cabo más estudios para
optimizar los resultados de un programa de PIV con material de animales impúberes.
Tabla 5: Rendimiento individual de terneras y vacas en un programa de PIV de embriones (PALMA y
col., 1993)
Categoría
de animal
Recolecció
n Oo./anim.
aptos para
IVF Oo./anim.
Maduración
Oo./anim.
Embriones*
/animal
B/animal
Terneras
(42)
13
8
(63)a
3
(37)c
2
(16)e
1
(16)g
Vacas
(202)
15
10
(67)b
6
(65)d
3
(34)f
2
(22)h
χ2; *Embriones = mórulas y blastocistos; ( ) = %
a, b p< 0,05; c, d p< 0,001; e,f p< 0,001; g, h p< 0,001
Sistemas, medios y condiciones de cultivo
Frente a los numerosos sistemas, medios y condiciones de cultivo - algunos de ellos presentados en
este punto- se hace dificultosa una comparación de los resultados de los diferentes grupos de trabajo.
Nosotros consideramos, en función de los resultados presentados, al sistema de co-cultivo con células
de la capa granulosa como el más simple y exitoso en la producción in vitro de embriones. El
nacimiento de 120 terneros y una tasa de preñez similar a la obtenida con la transferencia de
embriones, producto de la superovulación, son considerados como una prueba de la calidad de los
embriones producidos con este sistema.
Tasas de preñez
El objetivo de nuestro trabajo fue determinar qué tasas de preñez son esperables con la transferencia
de embriones producidos in vitro, como así también evaluar el grado de sincronicidad más adecuado
para obtener óptimas tasas de gestación. Las transferencias se llevaron a cabo a vacas sincronizadas
con una sola aplicación de 500µg de cloprostenol (Estrumate®, Coopers), en presencia de un CL, o
inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID®, Ceva) durante 12 días.
Los embriones fueron transferidos entre los días 5 y 8 de desarrollo (estro = día 0). La tasa de preñez
obtenida con una asincronía embrión/receptora de -1 día fue significativamente mayor a la obtenida con
una relación de +1 (REICHENBACH y col., 1991, tabla 6).
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Producción in vitro de embriones
Tabla 6: Tasas de preñez con transferencia sincrónica y asincrónica de embriones producidos in vitro
(REICHENBACH y col., 1992)
Sincronicidad
Embrión/Recipiente
Transferencias
n
Preñeces
n
Preñez
%
+1
30
9
30a
0
47
22
47
-1
52
31
60b
-2
4
2
50
Σ
133
64
48
Valores con distintas letras difieren significativamente (p< 0,01)
Los resultados obtenidos combinando el grado de sincronicidad embrión/receptora con la calidad del
embrión transferido indican que la preñez esperable con embriones de calidad inferior es
significativamente más baja (REICHENBACH y col., 1992; tabla 7). Estos resultados son similares a los
que se encuentran con la transferencia de embriones obtenidos in vivo.
Tabla 7: Tasa de preñez con embriones producidos in vitro según su calidad y sincronicidad con la
receptora (REICHENBACH y col., 1992)
Sincronicidad embrión/receptora
Calidad del
Embrión
-1
%
0
%
+1
%
Σ
Muy buena
63
(19/30)
47
(9/19)
38
(3/8)
53
(33/61)a
Media
65
(11/17)
50
(7/14)
30
(3/10)
51
(21/41)
Mala
20
(1/5)
38
(3/8)
25
(3/12)
26
(7/27)b
χ2, a,b: p< 0,05
Con el objeto de producir gestaciones melliceras se compararon las tasas de preñez obtenidas con la
transferencia de 2 embriones en forma uni- y bilateral (BERG y col., 1991b). El celo de las receptoras
(vaquillonas) fue sincronizado con una sola aplicación de 500µg de cloprostenol (Estrumate®, Coopers)
en presencia de un CL o inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID®,
Ceva) durante 12 días. Mórulas y blastocistos fueron transferidos el día 6 ó 7 no quirúrgicamente en
forma unilateral (n = 55) o bilateral (n = 94). No fueron encontradas diferencias entre las dos formas de
transferencia posiblemente por que uno de los dos embriones empleados para la transferencia doble
fue siempre de inferior calidad, con la intención de mejorar sus posibilidades de gestación (Tabla 8). En
el grupo transferido en forma unilateral se observó una mayor tasa de aborto (p<0,05).
Tabla 8: Tasas de preñez después de la doble transferencia uni- y bilateral de embriones producidos in
vitro (BERG y col., 1991b)
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Preñeces
Abortos
Gestaciones
D36-250
%
dobles
Transferencias
P4>1,4ng/ml
D21
n
%
D35
%
%
Unilateral
55
55
(33)*
49
(27)
33
(9)
33
(9)
Bilateral
94
62
(58)
53
(50)
14
(7)
42
(21)
*( ) = número de animales
Congelación de los embriones producidos in vitro. Tasas de preñez
La congelación de los embriones producidos in vitro no parece arrojar los mismos resultados de preñez
que cuando se emplean embriones producidos in vivo (LIEBRICH, 1991; tabla 9).
Tabla 9: Preñez obtenida después de la transferencia de embriones
congelados/descongelados con dos métodos (LIEBRICH, 1991)
Tratamiento
Embriones
descongelados
d6-7
n
transferidos
d7
n
%
producidos
vitro
Receptoras
preñadas (d35)
n
%
A
109
36
33
16
44
B
139
29
21
12
41
Embriones
frescos
-
-
31
60
52
in
El grupo A fue sometido directamente a una solución de PBS, suplementada con 0,4% de BSA y
conteniendo 1,37M de glicerina. Después de 20 minutos de equilibración a temperatura ambiente los
embriones fueron envasados en pajuelas (0,25 ml) y éstas colocadas en un baño de alcohol a -7o C,
momento en que se llevó a cabo el seeding. La curva de congelación se describió a 0,3o/min. hasta 32o C. La descongelación se llevó a cabo por medio de exposición de la pajuela al aire durante 5 seg.,
ésta fue sumergida posteriormente en baño María a 25o C durante 10 seg. más. En el grupo B la
adición del crioprotector se hizo en 3 pasos: 0,34M, 0,69M y 1,37M de glicerina en PBS-BSA. Los
procedimientos de congelación y descongelación fueron los mismos que para el grupo A con la
diferencia que la glicerina fue extraída en 3 pasos: 0,90M glicerina + 0,30M sucrosa, 0,45M glicerina +
0,30M sucrosa y 0,30M sucrosa en PBS-BSA. La viabilidad obtenida en ambos grupos fue baja (2030%), sin embargo con los embriones descongelados, que fueron seleccionados para la transferencia,
se alcanzaron tasas de preñez satisfactorias (40-44%).
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Producción in vitro de embriones
135
Conclusiones
El método descrito de producción in vitro de embriones permite disponer de un gran número de
embriones bovinos en diferentes estadios de desarrollo, como lo indican los resultados en gran escala
publicados actualmente (PALMA y col., 1993b). Los embriones producidos pueden ser destinados a la
investigación, comercialización o ser sometidos a modernas técnicas de interés productivo como la
producción de animales transgénicos y/o clonados. Frente a la obtención de embriones bovinos in vivo,
por medio de superovulación, el método in vitro permite la estandarización de la producción,
disminuyendo sensiblemente las variaciones en la producción de embriones. Posibilita la reducción del
número de animales de experimentación y una permanente observación del proceso de desarrollo
embrionario. El método abre además la posibilidad de producir embriones de vacas de alto valor
genético, que por diversas razones son enviadas al matadero. En combinación con las exitosas técnicas
de congelación se presentan nuevos aspectos en la conservación de reservas genéticas de razas de
alto valor genético o en vías de extinción (capítulo XIX).
Los primeros ensayos llevados a cabo por ARMSTRONG y col. (1991) y en nuestro laboratorio indican
que es posible obtener ovocitos de vacas y terneras con ayuda de laparoscopia y producir a partir de
ellos embriones transferibles. De esta forma es posible acortar el intervalo generacional
considerablemente.
La técnica de punción de los folículos con ayuda de sonografía o endoscopía transvaginal permite,
desde hace poco tiempo, obtener ovocitos inmaduros de vacas con ciclos normales con intervalos de
varios días. PIETERSE y col. (1991) lograron llevar a cabo hasta 3 punciones durante un ciclo estral.
Ello indicaría la posibilidad de reducir el intervalo de obtención de embriones de manera considerable.
REICHENBACH y col., (1993) reportaron la recolección de ovocitos por medio de aspiración folicular
endoscópica. Los autores obtuvieron un promedio de 5-6 ovocitos por vaca y 3-4 por vaquillona
semanalmente y una eficacia en el éxito de la recolección de 60-70% y 50-65% para vacas y
vaquillonas respectivamente. De los ovocitos recolectados se obtuvo 20% de mórulas y blastocistos
(PALMA y col., 1993, resultados no publicados), una tasa considerablemente menor comparada a la
obtenida con ovocitos obtenidos de ovarios de vacas faenadas. La diferencia radica en que los ovocitos
obtenidos in vivo no son seleccionados de acuerdo a su apariencia morfológica como en los programas
convencionales de PIV. La repetibilidad con éxito y eficacia de la técnica de punción como así también
una eficaz producción de embriones con los ovocitos recolectados aumentaría el número de embriones
producidos (van der SCHANS y col. 1991) y se constituiría en un interesante complemento de los
programas convencionales de núcleos de producción.
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Clement-Sengewald
CLONADO DE EMBRIONES
A. Clement-Sengewald
Introducción
En microbiología y biología celular un clon es una población de organismos con una unidad genética.
En ingeniería genética se define como vector clon, aquellos vectores que portan un gen extraño. Es
importante destacar que en el origen y replicación de un clon no ocurren variaciones genéticas (v.G.
mutaciones somáticas) y que sólo se establecen replicaciones del ADN y divisiones nucleares mitóticas.
En organismos multicelulares se emplea el término "clon" cuando éstos son genéticamente idénticos.
Particularmente en el reino vegetal los clones son un fenómeno difundido, la papa es un ejemplo actual
de una población clon.
En el campo de la zoología se encuentran clones en forma natural tanto en organismos inferiores como
en especies altamente desarrolladas como los mamíferos, aunque con limitaciones, dado que el número
de individuos idénticos en estos casos es en general relativamente pequeño (mellizos o trillizos
monocigotas, entre otros). En las especies vegetales los clones se originan a través de reproducción
vegetativa. En las plantas, p. e. a través de los tallos, las yemas o regeneración de sus partes. En los
mamíferos no existe esa via, sólo estadios embrionarios pueden constituir el punto de partida de los
individuos monocigotas.
De acuerdo a lo definido para el término clon se entiende el concepto clonar como:
- En biología celular la unificación de las células con la posterior producción de cultivos celulares a
partir de una sola célula.
- En ingeniería genética la incorporación de un fragmento de ADN (gen) en un vector-clon y su
reproducción clonada en una célula receptora adecuada.
- En embriología la producción de embriones con idéntico genotipo.
En el último caso y para los métodos empleados en los animales domésticos es preciso diferenciar
entre:
- División microquirúrgica de estadios embrionarios tempranos y el posterior desarrollo de las mitades
obtenidas en fetos o individuos.
- Combinación por medio de micromanipulación de estadios embrionarios asincrónicos, con el objeto
de respaldar el desarrollo de blastómeros de estadios más avanzados con blastómeros de estadios
más tempranos. A través de esta vía se pretende aumentar la producción de cuatrillizos hasta 5-8
individuos idénticos (quimera-clon).
- Transferencia de núcleos y células embrionarias nucleadas (blastómeros) en células enucleadas
para producir con un reclonado exitoso, en teoría, un número ilimitado de embriones e individuos
idénticos (clonado embrionario).
Experimentos en el campo del clonado se realizan hace más de 35 a os. La motivación en desarrollar
esta línea de investigación básica resulta de la fascinación ante la posibilidad de lograr la llave de los
conocimientos sobre la totipotencia celular y los procesos de desarrollo embrionario como así también
el significado de esos factores sobre los efectos recíprocos entre el genotipo y el ambiente.
Junto con ese interrogante básico de las ciencias genéticas y biológicas se encuentra también, desde la
década del 80, el creciente interés de la genética animal en aquellos métodos y aplicaciones del
clonado en los animales. Una de las razones del por qué los genetistas incluyen el clonado en sus
proyectos se apoya en el problema que la evaluación genética, especialmente en rodeos bovinos, se
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Clonado de embriones
141
lleva a cabo con varios años de intervalo generacional y un número relativamente reducido de
descendientes hembras. La variabilidad de la descendencia, a través de la recombinación génica, como
producto de la reproducción sexuada, conduce en muchos casos a un potencial de selección
heterogéneo y útil. La reproducción clonada permitiría sin embargo, variar los genotipos seleccionados
como sobresalientes en forma directa y sin modificaciones.
Técnicas de clonado
División de los embriones
Cuando estadios embrionarios tempranos son divididos, se desarrollan las mitades producidas con un
determinado porcentaje de nacimientos. Las mitades que se desarrollan presentan, sin embargo, en
estadio de blastocisto claramente menos células que aquellos embriones no divididos. Ello significa que
la pérdida de masa celular no puede ser compensada, dado que no se continúa con un crecimiento
compensatorio. La razón para ello es que a partir del momento de la fertilización de un ovocito se
establece el plan de desarrollo, en el cual el número de divisiones celulares es establecido hasta
alcanzar el estadio de blastocisto. Un embrión dividido tendrá en consecuencia tantas divisiones como
las que hubiese tenido en su estado original. Si h-embriones son divididos para producir 4 embriones
idénticos, el posterior desarrollo embrionario hasta el nacimiento se verificará sólo en casos
excepcionales como consecuencia de la pérdida de masa celular. Parece evidente la existencia, en
desarrollos embrionarios tempranos, de la conocida como masa celular crítica y que ésta no debe ser
superada. Un blastocisto funcional puede continuar su desarrollo cuando esa característica está
presente en su masa celular. Si esto no es así se originan vesículas trofoblásticas que se asemejan a
los blastocistos, pero que carecen de la capacidad de desarrollarse, como consecuencia de una falla en
la MCI.
A través de la división de los embriones se logró producir en muchos casos descendencias con éxito.
Sin embargo el número de individuos idénticos, a partir de un embrión, se mantiene limitado por las
razones ya mencionadas, a 2 y en casos aislados a 4 como máximo. Por esa razón el método de
división de embriones no es adecuado para producir un mayor número de embriones (BREM, 1986).
El aislamiento y cultivo de blastómeros obtenidos de embriones en estadios tempranos puede también
conducir al desarrollo de individuos idénticos. La tasa de desarrollo es sin embargo menor cuanto más
avanzado es el estadio del embrión utilizado (MOORE y col., 1968), dado que el número de células del
embrión producido es muy reducido.
Clonado quimérico
Para contrarrestar la reducción de la masa celular en el clonado se llevaron a cabo ensayos
experimentales en las especies murina y ovina agregando un blastómero temprano a uno en estadio
avanzado de desarrollo (blastómeros asincrónicos). Los blastómeros se desarrollan juntos en un
blastocisto normal. Con la asincronía se pretendió formar el embrioblasto a partir del blastómero más
desarrollado. Los blastocistos producidos de esa forma implantaron y se desarrollaron en forma normal
(STERN y WILSON, 1972; FEHILLY y col., 1984; WILLADSEN, 1985). WILLADSEN y FEHILLY (1983)
lograron producir quintillizos con ayuda del clonado quimérico en la especie ovina.
Transferencia de núcleos en embriones
La transferencia de núcleos celulares a partir de un embrión multicelular, a varias células receptoras
posibilita la producción de embriones unicelulares que poseen el mismo genoma. Una condición para
ello es que esa información genética sea empleada en la célula receptora (activación) y la división se
inicie como en un ovocito fertilizado. Esta fase se denomina reprogramación. De esta forma, la división
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celular no continúa en el punto en que se detuvo el embrión donante sino nuevamente en el mismo nivel
de un ovocito fertilizado. Núcleos de embriones tetraploides fusionados fueron obtenidos para producir
embriones diploides y luego transferirlos a células receptoras. Los resultados mostraron una capacidad
de desarrollo inferior de los embriones producidos, caracterizando ese tipo de clonado como ineficiente
(CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1990).
BRIGGS y KING llevaron a cabo en 1952 los primeros experimentos de transferencia nuclear en
organismos multicelulares (anfibios) y observaron que una reprogramación de núcleos celulares de
blástula, a través de ovocitos, es posible. Estudios posteriores indicaron que por medio de procesos de
diferenciación avanzados del núcleo celular la reprogramación se pierde (GURDON y col., 1975).
Como células receptoras de los núcleos celulares embrionarias en los mamíferos se adecuan ovocitos
sin fertilizar -madurados in vivo o in vitro- que hayan alcanzado la metafase II de la 2. división meiótica
separando el cúmulus que los rodea. En esas células, contrariamente a lo que ocurre con ovocitos
fertilizados, pueden ser reprogramados núcleos indiferenciados de estadios embrionarios más tardíos.
Para los trabajos experimentales en clonado de embriones bovinos se adecuan tanto los ovocitos
madurados in vivo como in vitro. Por otra parte el empleo de ovocitos madurados in vitro es
técnicamente más simple y económico, dado que los mismos son obtenidos de ovarios de matadero.
La aplicación de diferentes clases de ovocitos madurados in vitro, uniformemente oscuros o
uniformemente claros resultó en las mismas tasas de fusión y desarrollo embrionario (CLEMENTSENGEWALD y col., 1992a, tabla 1).
Tabla 1: Resultados de fusión, activación y cultivo en 3 clases de ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y
col., 1992a)
clase
pulsados
fusionados
n
%
cultivados
n
activados
n
%
1
262
194
74,0
187
74
2
63
546
73,0
45
22
3
89
76
85,3
74
33
39,5
a
48,8
b
44,5
m.+b.
%/C
%/A
14
7,4
18,9
4
8,8
18,1
4
5,4
12,1
C: cultivados; A: activados; m. + b.: mórulas y blastocistos; a,b p<0,05
Dado que el ovocito no fertilizado cuenta con un número haploide de cromosomas, éste podría
conducir, en interacción con el número diploide de cromosomas del núcleo, a la formación de embriones
triploides. En consecuencia el genoma del ovocito debe ser separado del plasma celular. El mismo
puede ser conducido junto con una mitad de la masa citoplásmica al interior de una zona pelúcida vacía
(WILLADSEN, 1986). Los ovocitos resultantes, con o sin el ADN se emplean como células receptoras.
Con este método se pueden desarrollar, sin embargo, sólo la mitad de los ovocitos como máximo, como
consecuencia de la imposibilidad del desarrollo posterior del embrión triploide. Por otra parte la gran
pérdida de citoplasma puede tener un efecto negativo sobre la continuidad del desarrollo del embrión
producido (BONDIOLI y col., 1990). La particularidad que el ADN del ovocito madurado se encuentra
próximo al corpúsculo polar, permite a través de un método de extracción mecánico, eliminar el genoma
citoplásmico. El mismo se lleva a cabo aumentando, en primero lugar, la elasticidad celular con
citocalasina B y aspirando el corpúsculo polar y el citoplasma contiguo (fotos 2 y 3) con una
micropipeta. A través de esta operación es eliminado el ADN endógeno en la mayor parte de los
ovocitos (92%, STICE y ROBL, 1988). La tabla 2 presenta los resultados obtenidos con la transferencia
nuclear por medio de micromanipulación con ovocitos madurados in vitro.
Tabla 2: Resultados de la manipulación de los ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1991)
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Clonado de embriones
143
Ovocitos
metafase II
Enucleación
Intactos
Degenerados
Transferencia nuclear Intactos
Degenerados
n
597
585
12
582
3
(%)
100
98,0
2,0
99,5
0,5
A través de la coloración del ovocito con el colorante para ADN (HOECHST 33342) es posible, bajo
observación visual, controlar la enucleación y lograr una eficacia del 100% (PRATHER, 1989). Como
donantes de blastómeros se emplean embriones con estadios de 4 células hasta mórulas. Junto con el
empleo de embriones ex-vivo (obtenidos de un lavaje uterino) se emplean también ovocitos madurados
in vitro (MI) en forma creciente como donantes de blastómeros (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1990;
SIMS y col., 1991). Hasta el momento se obtienen tasas similares de fusión y activación empleando
ovocitos obtenidos in vivo o madurados in vitro. Sin embargo las tasas de desarrollo de los embriones
clonados con ovocitos madurados in vitro es aún inferior a los ex vivo (CLEMENT-SENGEWALD y col.,
1992b, tabla 3). En los ensayos de WHITESELL y col. (1992) fue posible producir embriones in vitro de
dos vacas sacrificadas. Los embriones producidos fueron empleados como donantes de blastómeros.
Los autores pudieron producir 8 embriones de una vaca y de esos, 8 preñeces después de la
transferencia nuclear. El clonado de 9 embriones de la segunda vaca resultó en 21 preñeces.
Tabla 3: Comparación entre ovocitos madurados in vitro y obtenidos in vivo para su empleo en el
clonado (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992b)
Embrión
donante
COBs
a
fusionados
b
b/a
cultivados
c
divididos
d d/c
Σm+b
e e/c
c/d
in vitro
182
130 (71)
102
60 (59)
10 (10)
(16,6)a
in vivo
112
81
81
37 (46)
16 (20)
(43,2)b
(72)
a,b p<0,01 COBs: complejos ovocitos/blastómeros, m+b: mórulas y blastocistos
La aislación de los blastómeros, conteniendo un núcleo cada uno, puede llevarse a cabo por medio de
disgregación del embrión con un medio libre de Ca2+y Mg2+ (STICE y ROBL, 1988), con la previa
separación de la zona pelúcida por medios químicos o mecánicos. La aislación de los blastómeros se
realiza sin dificultades por medio de aspiración con una pipeta. Además es posible aspirar el núcleo de
un blastómero sin lesionar la membrana celular. De esta forma se obtiene una vesícula, rodeada por
una membrana celular (carioplasto), conteniendo un núcleo (Mc GRATH y SOLTER, 1983a). En la
actualidad el método de obtención del núcleo más empleado es la aspiración de un blastómero
completo de un embrión multicelular (fotos 4 y 5). Para ello se emplea una pipeta con punta afilada a fin
de atravesar la zona pelúcida (PRATHER y col., 1987). El empleo de pipetas de punta roma es posible
si se practica una incisión en la zona a fin de facilitar el paso de la pipeta en el interior del espacio
perivitelino hasta el blastómero (TSUNODA y col., 1986). La pipeta conteniendo el carioplasto es
introducida en el espacio perivitelino de un ovocito previamente enucleado (fotos 6-7). Con ayuda de
una ligera presión positiva se deposita el blastómero. En nuestros ensayos la transferencia de núcleos
fue exitosa en 582 de 585 casos (99,5%). Después de la transferencia se provoca la fusión de las
membranas. A través de la fusión se induce la formación de poros en las membranas celulares, de tal
forma que se establecen pequeños canales entre el ovocito y el blastómero. A través de éstos puede
circular el contenido de ambas células. Luego de la fusión de ambas membranas en contacto se
incorpora el núcleo transferido en el citoplasma del ovocito receptor (fotos 10-12). La fusión puede ser
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144
provocada también por el virus Sendai inactivado (OKADA y col., 1957), que se inyecta en el espacio
perivitelino junto con el blastómero. Este método fue utilizado hasta el momento en experimentos de
transferencia de núcleos celulares en ratón (Mc GRATH y SOLTER, 1983b), ovino (WILLADSEN, 1986)
y bovino (ROBL y col., 1987). La tasa de fusión en animales domésticos fue muy reducida. Otro método
de fusión del blastómero con el ovocito es la electrofusión. Con pulsos eléctricos muy cortos e idénticos
se provoca la desintegración de pequeñas porciones de la membrana celular en la zona de contacto
entre el ovocito y el blastómero y en consecuencia la fusión de ambas membranas (ZIMMERMANN y
VIENKEN, 1982; CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1989). En comparación con el método de fusión
con el virus Sendai, la electrofusión se presenta como un método más efectivo, con una tasa de fusión
de 90% frente a 50% en la especie ovina y 80% frente a 8% en la bovina.
Nuestros ensayos de electrofusión indicaron que las tasas de fusión de los blastómeros obtenidos de
embriones producidos in vitro son iguales a las obtenidas con blastómeros de embriones obtenidos in
vivo (tabla 4).
Tabla 4: Resultados de la fusión de blastómeros con ovocitos receptores por medio de pulsos
eléctricos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991)
Donantes de
núcleos
COB
n
Fusionados
n
%
No fusionados
n
%
In vitro
312
230
73,7
38
12,2
44
14,1
In vivo
249
189
75,9
38
15,3
22
8,8
Suma
561
419
74,6
76
13,6
66
11,8
Degenerados
Otra ventaja de la electrofusión es la activación del ovocito, mediante la cual se inicia la división celular.
El mecanismo de esa activación es hasta el momento desconocido. Se supone, sin embargo, que la
despolarización de la membrana del ovocito es similar a la que ocurre durante la fertilización normal y
que la concentración intracelular de calcio es alterada como consecuencia de la formación de poros en
las membranas plasmáticas (COLLAS y col., 1989). La tasa de activación es altamente dependiente de
la edad del ovocito y del número, intensidad y duración del pulso eléctrico empleado, como así también
del intervalo entre pulsos (COLLAS y col., 1989; KONO y col., 1989; WARE y col., 1989).
Los embriones producidos luego de la micromanipulación son cultivados in vitro o in vivo hasta el
estadio de M o B, para ser transferidos a hembras receptoras. El cultivo in vitro permite controlar el
desarrollo del embrión. Para el cultivo in vivo se emplean hembras de la misma o diferente especie
(conejo, ovino). Para el cultivo de embriones ovinos se emplean con frecuencia hembras de la misma
especie.
Los embriones recubiertos con agar son colocados en el oviducto (ROBL y col., 1987) y después de 5-6
d de cultivo son recuperados. Con el cultivo de los embriones bovinos en oviducto de coneja se
obtienen los mismos resultados (WESTHUSIN y col., 1989). Dado que ese método es engorroso y caro
los esfuerzos se concentran en el cultivo exclusivamente in vitro de los embriones producidos
(CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991). Para el cultivo in vitro se emplean sistemas
de co-cultivo con células del oviducto (CO, CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991),
células de la granulosa (CG) o medios condicionados con células de la granulosa (MCCG, CLEMENTSENGEWALD y col., 1991; tabla 5). Los resultados indican que hasta el momento, el co-cultivo con
células del oviducto parece ser el más adecuado. De los embriones cultivados 7% alcanzaron los
estadios de mórula y blastocisto, cuando embriones producidos in vitro fueron empleados como
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145
donantes de blastómeros. Cuando fueron empleados blastocistos de embriones obtenidos in vivo se
alcanzaron tasas de 16%.
Tabla 5: Resultados del cultivo de embriones producto de la electrofusión con diferentes medios
(CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991)
Donante de
blastómeros
Sistema de
cultivo
Cultivados
n
In vitro
CCO
149
70a
46,9
11e
7,3
CCG
73
28
38,3
2
2,7
MCCG
298
99b
33,2
19
6,3
CCO
113
51c
45,1
18f
15,9
CCG
79
19d
24,0
5g
6,3
In vivo
Activados
n
%
M+B
n
%
McLAUGHLIN y col,. (1992) alcanzaron 20% de mórulas y blastocistos (28/128) cultivando los
embriones clonados en un medio sintético (SOFM) sin sistema de co-cultivo. Después de la
transferencia nació un ternero. Coincidentemente informaron NORTHEY y col., (1992) similares tasas
de desarrollo de embriones clonados a las obtenidas con el co-cultivo con células de oviducto (20% y
28% respectivamente).
El desarrollo de los embriones después de la transferencia nuclear permite emplearlos como donantes
estableciendo un reclonado. A través del reclonado es posible en consecuencia, disponer teóricamente
de un número ilimitado de núcleos celulares idénticos, si los embriones obtenidos son siempre
empleados como donantes. En la práctica debe considerarse, sin embargo, que la tasa de desarrollo de
los embriones producidos disminuye con el aumento creciente del reclonado (BONDIOLI y col., 1990;
STICE y col., 1991). La razón de esto es desconocida, aunque posiblemente el motivo sea la falta de
una óptima manipulación y de adecuadas condiciones en los cultivos.
Fotos 1: pipetas de sostén (PS) y de inyección (PI)
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Foto 2: fijación del ovocito
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Clement-Sengewald
Foto 3: Extracción del corpúsculo polar y del Foto 4: Aspiración del blastómero
citoplasma adyacente
Foto 5: Aspiración del blastómero
Foto 6: Colocación de blastómero en el ovocito
receptor
Foto 7: Colocación de blastómero en el ovocito Foto 8: Bastómero del embrión donante en el
receptor
esapacio perivitelino
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147
Experimentos de clonado en animales de interés zootécnico
Conejo
BROMHALL informó en el año 1975 por primera vez sobre los ensayos de transferencia nuclear
llevados a cabo en embriones de conejo. El genoma de los ovocitos receptores no fue extraído,
produciendo embriones triploides. Los embriones donantes fueron mórulas. Sólo el 2,6% de los
embriones producidos continuaron su desarrollo hasta el estadio de mórula. STICE y ROBL (1988)
informaron el nacimiento de 6 conejos a partir de la transferencia de núcleos de embriones de 8 células
a 164 ovocitos receptores enucleados. La tasa de sobrevivencia de los embriones logrados fue de
3,7%. Los 6 animales fueron gestados en 6 diferentes hembras. HEYMANN y col. (1990) informaron el
nacimiento de 6 clones, en ese ensayo la tasa de sobevivencia fue de 3,9%, comparable con los
resultados de STICE y ROBL (1988). Un año después COLLAS y ROBL lograron producir un clon
séxtuplo con una tasa de sobrevivencia de los embriones de 7,2%.
Porcino
PRATHER y col. (1988) informaron sobre la primera gestación después de la transferencia de
embriones producidos por medio de transferencia nuclear. A pesar que la gestación fue comprobada,
hasta el día 59 no hubo nacimientos en ese ensayo. Un año después fue publicado el nacimiento de un
lechón a partir de un embrión donante de 4 células (PRATHER y col. 1989) La tasa de sobrevivencia de
los embriones manipulados fue muy baja (1,1%), 1 lechón vivo de 88 embriones transferidos.
PROCHAZKA y col. (1990) emplearon ovocitos de cerdo madurados in vivo como receptores de
blastómeros de embriones de 2 a 8 células. Los autores comprobaron que una parte de los ovocitos
tuvo una buena capacidad de regular el normal desarrollo de los núcleos transferidos, la otra careció de
esa capacidad. En las primeras 24 a 30h de cultivo in vitro se dividieron 12 de 16 embriones producidos,
1 embrión se dividió hasta el estadio de blastocisto (d 7).
Recientes investigaciones indicaron que ovocitos porcinos madurados in vitro pueden ser utilizados
como receptores de blastómeros (NAGASHIMA y col., 1992). Después del cultivo in vitro pudieron
desarrollarse 11,9% de mórulas y blastocistos (TERLOUW y col., 1992).
Ovino y caprino
WILLADSEN informó en el año 1986 el nacimiento de 3 corderos, producto de la fusión de blastómeros
de embriones de 8 células con ovocitos enucleados. Dos de 3 animales se originaron del mismo
embrión (mellizos homocigotas). Ello llamó la atención en el mundo científico y desencadenó
numerosos ensayos que sirvieron para el posterior desarrollo y transferencia de la técnica a otras
especies domésticas. SMITH y WILMUT (1989) informaron el nacimiento de 4 corderos, producto de la
transferencia de blastómeros de 16 células y de la MCI de un blastocisto en mitades de ovocitos
enucleados. A través de este experimento los autores comprobaron que los núcleos pueden
reprogramar una célula y regular el desarrollo normal del embrión producido. McLAUGHLIN y col.
(1990) lograron comprobar el desarrollo de 4 hermanos clones el día 45 de la preñez a través de la
técnica de ultrasonido. Los mismos fueron producidos transfiriendo blastómeros de embriones de 8 y 16
células. Actualmente es posible cultivar los embriones clonados hasta el estadio de mórula (PUGH y
col., 1992). YONG y col. (1991) produjeron 2 cabras idénticas después de la transferencia de los
blastómeros de un embrión de 32 células. La tasa de sobrevivencia en ese experimento fue de 21%.
Bovino
Las primeras transferencias de núcleos en esta especie fueron descriptas por ROBL y col. (1987). Los
autores utilizaron ovocitos fertilizados como células receptoras, a las cuales se les extrajeron los
pronúcleos con ayuda de centrifugación. Después de la transferencia de los blastómeros extraños en
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las células receptoras se desarrollaron 5 de los 38 embriones recuperados (17%) del oviducto de oveja
hasta el estadio de M y B. Después de la transferencia de 2 blastocistos a hembras receptores se
produjo el nacimiento de 2 terneros. La transferencia de núcleos de blastómeros de embriones de 2, 4 y
8 células a ovocitos receptores, fertilizados y enucleados resultó en la división hasta 2 y 4 células. Ese
año el mismo grupo de investigación (PRATHER y col., 1987) informó el nacimiento de 2 terneros,
resultado de la transferencia de núcleos de mórulas en ovocitos fertilizados y enucleados. En total
fueron transferidos 19 M y B a 13 receptoras después de un cultivo previo en oviducto de oveja durante
4-5 días. En este trabajo llamó la atención que los ovocitos madurados in vitro mostraron un desarrollo
significativamente menor hasta M y B que los ovocitos receptores obtenidos frescos 36h después del
celo (BARNES y col., 1987). El cultivo in vivo de los embriones producidos a partir de la transferencia
nuclear, en oviducto de oveja fue superior al cultivo in vitro en medio Tyrode con 3mg/ml de BSA, en el
cual se obtuvieron como máximo estadios de 6 células después de un cultivo de 3 días. MAREK y col.
(1990) observaron que el estadio del embrión donante de blastómeros (d 5, 5,5 y 6) no afecta la tasa de
electrofusión. Sin embargo, después de la transferencia de los blastómeros de embriones de 6 días se
desarrollaron más embriones a estadios de M y B (34,5%, después de un cultivo in vivo) que con
embriones donantes de 5 días. STICE y col. (1991) observaron que con el reclonado tanto las tasas de
fusión (66%, 60%, 52% y 54%) como las tasas de desarrollo hasta los estadios de mórula y blastocisto
(20, 10, 19 y 12%) disminuían con el aumento del reciclaje desde el primer clonado al tercer reclonado
respectivamente.
Mientras se llevaban a cabo los ensayos con embriones donantes de blastómeros, obtenidos in vivo, de
los cuales los embriones clonados eran cultivados en oviducto de oveja, CLEMENT-SENGEWALD y col.
(1990) y SIMS y col. (1991) describían el empleo de embriones producidos in vitro como donantes de
blastómeros y el cultivo in vitro de los embriones clonados. Con el empleo simultáneo de ovocitos
receptores madurados in vitro, por ambos grupos de trabajo, se comprobó la posibilidad de producir
embriones clonados hasta estadios transferibles in vitro.
El grupo de trabajo de BONDIOLI (1990) informó sobre numerosos ensayos de transferencia de
núcleos. Para ello fueron empleados sólo ovocitos obtenidos in vivo después de la extracción y lavaje
del oviducto de vacas superovuladas. Los embriones donantes fueron obtenidos entre el dia 5 y 6,5 por
medios no quirúrgicos (estadio de 16-64 células). Después de la transferencia nuclear, los embriones
producidos fueron cultivados transitoriamente en oviducto de oveja y transferidos a vacas receptores
(sincrónicas) en estadios de M y B. Después de la transferencia de 337 embriones fueron
diagnosticadas, el día 42, 79 gestaciones (23,4%). Después de la transferencia de 62 M y B, producidos
con blastómeros de embriones descongelados, se diagnosticaron (d 42) 10 animales preñados (16,1%).
Cuando los embriones fueron congelados/descongelados y empleados para el reclonado se lograron
sólo 3 (13,0%) gestaciones de 23 embriones (d 42). En promedio se obtuvieron 22,5% de gestaciones
(106 preñeces de 463 embriones). De esas gestaciones se obtuvieron 92 terneros vivos. De un embrión
donante se pudieron lograr como máximo 8 gestaciones (d 42). Siete toros fueron idénticos. Cuando los
embriones producidos no fueron cultivados en oviducto de oveja sino in vitro se dividieron 13% de los
embriones hasta M y B. Después de la transferencia de esos 11 embriones se obtuvieron 3 terneros
vivos. WILLADSEN y col. (1991) alcanzaron 42% de preñez (d35) y 38-33% de nacimientos (100
terneros). Llamó la atención en un número importante de terneros el elevado peso y los problemas de
parto como consecuencia de ello. Se requirió asistencia en 84% de los partos. WILLADSEN y col.
(1991) produjeron 13 clones de un par de mellizos idénticos cada uno, 10 clones trillizos y 5 clones con
4 hermanos idénticos. El mayor clon bovino lo constituyen 7 toros vivos (BONDIOLI y col., 1990).
Hasta el momento nacieron terneros del primer clonado y tercer reclonado (STICE y col., 1991). Se
describó también la gestación de clones de embriones donantes congelados/descongelados y con
subsiguiente reclonaje (BONDIOLI y col., 1990). Los resultados más importantes de los experimentos
de clonaje en el bovino se resumen en la tabla 6.
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Tabla 6:
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Resultados obtenidos en los experimentos de clonado
Origen del embrión donante
in vivo
in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
Origen de los ovocitos
in vivo
in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
72
S.r
66
80
in vivo
in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
24
S.r.
11
-
33
-
28
Tasa máxima de fusión (%)
Cultivo
m & b obtenidos (%)
Embriones transferibles (n)
463
Terneros nacidos (n)
92
(302 transferencias)
100
Sobrevivencia embrionaria (%)
19
(33)
Tamaño máximo del clon
7
4
16-64bl.
8-64bl.
BONDIOLI
WILLADSEN y col.
CLEMENT-
SIMS y
NORTHEY y
y col.
(1986)
SENGEWALD
col. (1991)
col. (1992)
Estadio del embrión donante
de núcleos
Fuente
(1990)
y col. (1990)
S.r = Sin referencias; m & b: mórulas y blastocistos
Perspectivas
No obstante que en conejos la tasa de ovocitos/blastómeros fusionados en los experimentos de
HEYMAN y col. (1990) fue de 91,5%, es necesario mejorar la tasa de fusión en las otras especies,
como por ejemplo en el bovino. BONDIOLI y col. (1990) informaron la fusión de cerca de 70% de los
ovocitos/blastómeros sometidos a pulsos eléctricos. Las tasas de fusión parecen ser más altas
empleando estadios embrionarios tempranos como donantes de blastómeros (SMITH y WILMUT, 1989).
Ello puede ser consecuencia de la diferencia de tamaño de los blastómeros. Un blastómero grande
inyectado bajo la zona pelúcida será presionado con fuerza contra la membrana celular y la superficie
de contacto será mayor, estos aspectos facilitan el proceso de fusión después de aplicados los pulsos
eléctricos. A partir de un determinado estadio del embrión donante de blastómeros parece que la
diferencia de tamaño no juega un rol de importancia.
Las tasas de fusión de embriones de 5, 5,5 y 6 días obtenidas por MAREK y col. (1990) no presentan
diferencias. El agregado de citocalasina B en el medio en el cual son colocados los complejos
ovocito/blastómero después del pulso eléctrico, puede aumentar la tasa de fusión en embriones ovinos
(SMITH y WILMUT, 1989). En el bovino no ha podido ser comprobado ese efecto (LEVANDUSKI y
WESTHUSIN, 1990).
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150
Tasa de activación
La división de los ovocitos sin fertilizar puede provocarse por medio de diferentes estímulos. Este
proceso se define como activación partenogenética. Como estímulos pueden servir: etanol, Ca2+,
Mg2+-ionóforo o pulsos eléctricos. La activación partenogenética de los complejos ovocitos/
blastómeros después de la transferencia nuclear es necesaria, porque la activación natural del ovocito a
través del espermatozoide falta. Dado que los procesos intracelulares que se originan a través de la
activación no son conocidos, deben establecerse estudios futuros para esclarecer estos fenómenos.
Solo entonces será posible determinar en qué momento la mayor parte de los ovocitos responderá al
estímulo partenogenético y de que manera deberá ser modificado el estímulo para lograr mayores tasas
de activación.
Estadios del embrión donante de blastómeros
Para los trabajos de clonado se destinan embriones donantes en un estadio avanzado, con el fin de
obtener un mayor número de núcleos idénticos. A partir de un estadio embrionario determinado no es
posible reprogramar los núcleos. Su diferenciación celular es irreversible. En el futuro deberá precisarse
el momento exacto de la diferenciación nuclear. Los estadios más avanzados con los cuales se
pudieron lograr animales vivos se describen en la tabla 7. Los resultados de WILLADSEN en ovinos
fueron superados por SMITH y WILMUT (1989) a través de la transferencia de blastómeros de la MCI
de blastocistos en ovocitos ovinos con el nacimiento de corderos. No puede ser descartado el empleo
con éxito de estos estadios en todas las especies animales. Cuando se aclare el mecanismo exacto de
la diferenciación nuclear existirá la posibilidad de trabajar para invertirlo o diferirlo.
Estadio de los blastómeros
Llama la atención en la transferencia de núcleos, que una parte de los blastómeros del mismo embrión
puede ser reprogramada por el ovocito. La otra parte no sigue ese proceso. Como consecuencia de ese
comportamiento heterogéneo puede concluirse que sólo blastómeros de un estadio determinado son
adecuados para la transferencia. Estudios futuros deberán determinar cuál es ese estadio, como
pueden sincronizarse y mantenerse en el mismo.
Tabla 7: Eficacia de los pasos metodológicos, sobrevivencia de los embriones y tamaño de los clones
(número de animales vivos) de trabajos experimentales con embriones de animales de interés
zootécnico
ESPECIE
leporina
porcina
ovina
caprina
Enucleación (%)
100
74
75
s.i.
Fusión (%)
91,5
82
90
51,1
E transferidos
207
88
4
48
Animales nacidos
8
1
3
10
(n)
Sobrevivencia (%)
3,9
1,1
75
20,8
número de células
del donante
32
4
8
2-32
Fuente
HEYMAN y col
(1990)
PRATHER y col.
(1989)
WILLADSEN
(1986)
YONG y col.
(1990)
s.i. = sin información
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Cultivo de los embriones clonados
A través de mejores condiciones in vitro es posible obtener una mayor tasa de M y B. Con la
transferencia de estos estados avanzados es posible mejorar considerablemente las tasas de preñez y
con ello la eficacia de un programa de clonado. Ello permitiría excluir aquellos embriones que se ven
intactos después de las primeras divisiones pero que no alcanzan los estadios de mórula o blastocisto.
Con el reemplazo del cultivo temporal in vivo de los embriones clonados en receptoras intra- o ínter
específicas a través del cultivo in vitro pueden evitarse las pérdidas en la recolección de los embriones.
Con la modificación de las condiciones del cultivo toman importancia los cultivos "monolayer"
(monocapa de células granulosas y de oviducto) o cultivos de suspensiones (células de oviducto) y la
aplicación de medios condicionados de células de granulosa u oviducto.
Después del mejoramiento de los pasos metodológicos del clonado y del aumento del número de
animales idénticos puede estudiarse el efecto de la unión del plasma celular del blastómero con el
ovocito (Cybrid). Ello puede ser importante porque no sólo existe ADN en el núcleo sino también en el
citoplasma (mitocondrias). Ello puede hacer necesario que para la producción de individuos matroclin
homocigotas deban emplearse, junto con los blastómeros de un mismo embrión también ovocitos de
una misma vaca. Existe la posibilidad que los blastómeros posean diferente información genética como
consecuencia de mutaciones numéricas o estructurales de los cromosomas durante la división celular.
El desarrollo del clonado de embriones dependerá en el futuro del desarrollo de los biométodos
asociados como la congelación o vitrificación de los embriones, la producción de embriones como
donantes potenciales de blastómeros, el desarrollo de medios de cultivo in vitro como así también de la
transferencia de los embriones. Sólo la asociación del reclonado, congelado y transferencia no
quirúrgica de los embriones hace posible la intensificación del aprovechamiento de animales de alto
valor genético.
Resumen de los pasos metodológicos del clonado de embriones
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16.
17.
18.
Maduración in vitro de los ovocitos, obtenidos de ovarios de matadero, en MPM + 20 % de SVC +
FSH durante un mínimo de 20 h.
Eliminación de las células del cumulus con Tripsina/EDTA (0,1/0,2%) y una pipeta fina (170 µm).
Montaje de la unidad de micromanipulación. El medio de micromani-pulación debe contener
Citocalasina B (5 g/ml).
Pretratamiento de 10 a 15 de los ovocitos denudados durante 10 min. en medio conteniendo
Citocalasina B (5 g/ml).
Transporte de los ovocitos tratados a las gotas de manipulación.
Enucleación del ovocito, eliminando el corpúsculo polar y el citoplasma adyacente.
Enucleación del primer grupo de ovocitos.
Colocación del embrión donante de núcleos en la gota de manipulación.
Después de 5-10 min., comenzar entonces con la recolección de los blastómeros.
Fijar el embrión donante y aspirar un blastómero con la pipeta de enucleación.
Fijar un ovocito enucleado e inyectar el blastómero en el espacio perivitelino (emplear el mismo
orificio de la zona pelúcida).
Repetir el procedimiento con los otros ovocitos enucleados.
Transportar el complejo ovocito-blastómero en medio sin Cito B.
Recomenzar con un nuevo grupo a partir del punto 4.
Montaje de la unidad de electrofusión.
Trasladar un máximo de 10 a 15 complejos ovocitos-blastómeros al medio Zimmerman de fusión
celular, esperar por lo menos 5 minutos.
Colocar un máximo de 2 complejos en la cámara de fusión.
Orientación manual de los complejos (superficies de contacto blastómero/ ovocito paralelas a los
electrodos).
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Clement-Sengewald
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21.
22.
Descarga de los pulsos de fusión.
Colocación de los complejos tratados en MPM + 20% SVC o TL Hepes.
Evaluación del resultado de la fusión después de 30 a 60 minutos.
Cultivo de los complejos fusionados en medio condicionado o en cultivos celulares (cultivo de
células de la granulosa u oviducto).
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Animales transgénicos
155
PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS
G. Brem, U. Berg & H.D. Reichenbach
Introducción
En genética molecular moderna se desarrollaron métodos adecuados que permiten trabajar específicay repetidamente con ADN, como portador de la información genética. Esas técnicas de genética
molecular abren en la producción animal nuevas perspectivas, dado que es posible por primera vez
trabajar directamente a nivel génico, ello significa la posibilidad de aislar, secuenciar, recombinar y
transferir genes individuales. El espectro de aplicaciones de esas técnicas no está desarrollado
ampliamente. Sin embargo es posible pronosticar que el futuro de la producción animal será afectado
directamente y que los métodos de la producción animal convencional serán complementados y
posiblemente también parcialmente reemplazados (ver capítulo XIX).
Transferencia de genes significa transferencia e integración del ADN recombinado in vitro y su
estructura acoplada al genoma del receptor. Si la estructura de ADN se integra en el genoma del
receptor, éste se denomina transgénico. El producto de ese transgen, una proteína codificada por el
ADN transferido, es el producto transgénico. Con la ayuda de la transferencia de genes se pretende
lograr que una determinada cualidad en el organismo receptor sea modificada o una nueva sea
incorporada. Además se espera que el transgen integrado en el genoma sea transmitido a la herencia a
fin de establecer una línea transgénica.
En la extensa definición original sólo se habla de animales transgénicos cuando se comprueba que el
transgen se hereda en forma estable y se exprime. Pero en la actualidad se ha establecido en el
lenguaje cotidiano emplear el término: animal transgénico a partir del momento en el cual se puede
comprobar la presencia del nuevo gen en un individuo, al cual se ha practicado la transferencia génica.
Por otra parte en producción animal la transferencia de genes es sólo interesante cuando la estructura
génica es transmitida a la descendencia, de forma tal de establecer líneas transgénicas en la población.
El ADN recombinado en las estructuras génicas puede tener origen en los más variados organismos
donantes, debido a la uniformidad en la estructura básica de la doble cadena de ADN. Junto con el ADN
procariótico de origen viral o bacteriano el ADN de los organismos eucarióticos representa una fuente
inagotable para la transferencia génica.
No debe olvidarse, sin embargo, que especialmente para la expresión de transgénicos pueden
establecerse fuertes interacciones dependientes del origen y del receptor del ADN. Fue observado, por
ejemplo, que la expresión de las estructuras génicas que contienen aún componentes procarióticos,
puede ser reducida o incluso suprimida en animales mamíferos. Además se ha observado que es de
gran importancia para la expresión si los componentes estructurales del gen son de origen genómico o
provienen del ADNc. De esa forma puede observarse que de los trangenes que contienen intrones se
produce en promedio 10-100 veces más ARNm que de transgenes que contienen solamente ADNc
(BRINSTER y col., 1988).
A continuación se hará referencia exclusivamente a la producción de bovinos y otros animales
transgénicos de interés productivo y no a la transformación genética de células procarióticas o
eucarióticas. Con la producción de un organismo transgénico se pretende que el transgen esté presente
en todas las células somáticas y sobre todo también en las células reproductivas del animal. Dado que
no existe hasta el momento método alguno que permita transformar en forma completa un organismo ya
formado genéticamente, se practica la transferencia génica tan temprano en el desarrollo del animal
como es posible. El momento más apropiado es el estado embrionario temprano, es decir el estadio
unicelular (ovocito fecundado = cigoto), con poco número de células (blastómeros) o en los estadios de
mórula o blastocisto como máximo. Ello significa que los métodos de obtención, manipulación y
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Brem & col.
156
transferencia de esos estadios tempranos deben estar establecidos y disponibles en las especies
mamíferas.
Se disponen en la actualidad de varios métodos prometedores de transferencia génica. Los tres más
importantes son:
- La microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto
- La transferencia de ADN a través de vectores retrovirales
- Producción de quimeras transgénicas a partir de células y embriones transformadas genéticamente.
La técnica más empleada en la actualidad es sin dudas la microinyección de ADN. a pesar de que las
otras dos cuentan, junto a algunas limitaciones, con una serie de ventajas no despreciables.
Lamentablemente la técnica que emplea células embrionales primordiales no fue desarrollada aún y la
aplicación de vectores retrovirales lo es en forma muy incompleta como para ser utilizadas en los
animales domésticos.
El camino más próximo para la transferencia de ADN en el núcleo celular es la microinyección directa
de una solución de ADN en el citoplasma del núcleo o en el pronúcleo (foto 1). GORDON y col. (1980)
indicaron por primera vez que la microinyección de una solución de ADN en el pronúcleo es un camino
practicable para la transferencia génica en mamíferos. Después de la microinyección de ADN clonado
en el pronúcleo de ovocitos fertilizados de ratón fue posible encontrar esas secuencias virales en partes
desarrolladas de los fetos. Poco tiempo después se indicó, en otros trabajos, que genes eucarióticos
intactos podían incorporarse a los fetos. Fue posible establecer también la presencia del transgen en
animales adultos como así también la transmisión a la descendencia.
En la actualidad la técnica de producción de ratones transgénicos fue introducida con éxito en muchos
laboratorios y se pusieron en práctica estudios para determinar la regulación de la expresión génica y el
efecto biológico del gen. Como ya fue mencionado, la microinyección de ADN en el pronúcleo de
cigotos o en los núcleos de embriones bicelulares es el método de elección para la transferencia génica
en los animales domésticos. La amplia experiencia obtenida en experimentos con ratones constituyó sin
duda una base adecuada para el desarrollo de la técnica en los animales de interés zootécnico. Debe
aclararse, sin embargo, que debido al desigual desarrollo embrionario temprano y especialmente a la
diferente morfología de los embriones de animales domésticos se produjeron algunos problemas. Por
ejemplo, las estructuras nucleares de las especies bovina, porcina y hasta cierto grado de la ovina y
caprina no pueden ser observadas con el microscopio o sólo con dificultad debido a los gránulos
citoplasmáticos oscuros. Para la observación del núcleo los embriones ovinos requieren un microscopio
de interferencia según NOMARSKI, los embriones bovinos y porcinos deben ser centrifugados para
exponer el núcleo. Tampoco se contaba con suficientes conocimientos prácticos sobre como se debía
establecer el tiempo óptimo para la obtención, microinyección y transferencia de los embriones para
contar con las mejores posibilidades en el éxito de la transferencia génica.
La producción de mamíferos transgénicos puede dividirse básicamente en 6 fases:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Clonado de las estructuras génicas y producción de la solución inyectable de ADN.
Preparación de los animales donantes y obtención de los ovocitos o embriones.
Exposición de los pronúcleos y microinyección del ADN.
Transferencia de los embriones inyectados al oviducto o, después de un cultivo temporal, al útero
de receptoras.
Comprobación de la integración en los animales nacidos y, si es posible, primeras evaluaciones de
la expresión del transgen en los niveles de trascripción (ARN) y translación (proteína).
Producción de descendencia transgénica por medio de métodos convencionales y evaluación de
eventuales mutaciones presentes a través de la formación de líneas homocigotas (test de
homocigosis).
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Animales transgénicos
157
Hasta el momento se sabe que, en principio, toda molécula de ADN puede microinyectarse en el
genoma de un mamífero. El largo del fragmento de ADN a introducir por medio de los vectores de
clonado no debe superar el límite máximo de 50 kb (clones cosmidios). En otros numerosos
experimentos de transferencia génica se demostró que es posible alcanzar fragmentos mucho más
largos. De esta forma no es raro observar, en animales transgénicos, fragmentos de varios 100 kb o
aún más de 1 000 kb de largo, como consecuencia de la concatemerización de los fragmentos
inyectados.
Evidentemente la inyección de ADN lineal conduce a tasas superiores de integración. En cambio
moléculas con forma de espiral o "supercoiled" parecen integrarse con una frecuencia
significativamente menor (BRINSTER y col., 1985). También es mejor cuando los fragmentos de ADN
no son cortados romos ("blunt") sino cuando conservan terminales sobresalientes.
Las soluciones de ADN para microinyección deben estar absolutamente libre de partículas
contaminantes, para evitar el taponado de la pipeta de microinyección o la lesión de los cigotos
inyectados. Ello establece que todas las soluciones deben ser filtradas (filtros de 0,2 µm) y que todos
los recipientes, con los cuales el ADN toma contacto deben ser enjuagados previamente con agua
filtrada. Sólo en casos aislados se inyecta la totalidad del vector, dado que ADN procariótico puede
provocar problemas de expresión. Después de la restricción el vector y el ADN de inserción son
separados, en la regla, por medio de electroforesis. El fragmento deseado es aislado del gel, lavado y
colocado en una solución buffer. Inmediatamente después se establece la concentración de ADN de tal
manera que por cada pl (10-12) estén contenidos, según la aplicación, varios cientos de copias de la
estructura génica. En fragmentos de ADN un largo de 5-8 kb corresponde a una concentración de 1-2
µg de ADN/ml. No fue encontrada una correlación entre cantidad del ADN inyectado y el número de
copias integradas. La solución preparada de ADN se fracciona y conserva por medio de congelación
(BRENIG, 1987).
La frecuencia de integración en la producción de mamíferos transgénicos es influenciada por: la pureza,
la forma, el tipo de terminales, la concentración y la solución buffer del ADN. De ello se concluye que ya
durante la preparación de la solución de inyección del gen, se establecen importantes condiciones para
el éxito de la transferencia génica.
Recolección de los embriones
Los animales donantes son tratados con gonadotrofinas, con diferentes programas de superovulación
según la especie, inseminados o servidos dos veces. La obtención de los cigotos se lleva a cabo a
través del lavaje del oviducto en un lapso de 12-24h después de la inseminación. El lavaje de oviducto
puede llevarse a cabo mediante cirugía con el animal en narcosis o después del sacrificio. Debe tenerse
especial cuidado, que el oviducto sea seccionado del cuerpo del animal dentro de los 15 min de
desangrado. Los oviductos son lavados con una solución de PBS. Con ayuda de una lupa
estereoscópica se aíslan los ovocitos o embriones de la solución obtenida del lavaje y se colocan en
medio fresco. Las células del cumulus, que eventualmente pudiesen quedar adheridas, pueden
eliminarse con un tratamiento de hialuronidasa o por medio de pipeteo. Los embriones son cultivados in
vitro hasta el momento de la inyección.
La eficacia de los programas de transferencia génica con animales domésticos es, en promedio,
claramente menor que con el ratón. Como se puede observar en la tabla 1 ello se debe al bajo número
de cigotos que pueden inyectarse por donante, a las bajas tasas de preñez y sobrevivencia embrionaria
y a la menor frecuencia de integración. Para la producción de un animal transgénico se deben emplear,
en general, más donantes y receptoras de animales de interés zootécnico que con ratones o conejos.
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Brem & col.
158
Microinyección de ADN
Para la microinyección es necesario contar con una mesa de trabajo estable. El lugar de trabajo
comprende un microscopio invertido, dos micromanipuladores para las pipetas de sostén y de
inyección y un aparato de inyección. La presión de inyección puede ser regulada con ayuda del aparato
de inyección accionado por medio de un pedal. Sobre la platina del microscopio se encuentra una
cámara de inyección que contiene el medio y los embriones a tratar. Los embriones bovinos y porcinos
son centrifugados 3 min a 15 000 g (WALL y col., 1985). A través de la centrifugación se desplazan los
gránulos citoplasmáticos oscuros hacia un polo, los núcleos y pronúcleos se hacen visibles en el medio
del embrión.
Tabla 1: tasas de éxito en programas de transferencia génica en diferentes animales de
experimentación e interés productivo
Especie
murina
leporina
porcina
ovina
bovina
Embriones inyectados por
donante (S)
15
20
20
4
7
Número de receptoras por
cada donante (E)
2
2
2
1,5
1
% Preñez
60
50
50
40
30
10-20
10
5-8
15
10
% de integración (animales
transgénicos/ animales
nacidos)
15
10
10-15
5-10
5-10
% Animales
transgénicos/embriones
inyecta-dos y transferidos
2
1
0,5
0,5-1
0,5
Número de animales
necesarios (S+E) por
c/animal transgénico
10
15
20
40
40
% Animales nacidos/
embriones inyectados
A pesar de ese tratamiento la inyección de esos embriones es más difícil que la de embriones de ratón
o conejo.
Para la inyección se fija el embrión mediante vacío a la pipeta de sostén de tal forma que el (pro-)
núcleo se haga bien visible. La pipeta de inyección tiene un diámetro de 1 a 2 µm y es llenada con la
solución de ADN. Para la inyección, la pipeta es introducida por medio del micromanipulador a través de
la zona pelúcida, la membrana celular y (pro-) nuclear. La inyección con un volumen de 1-2 pl de la
solución de ADN aumenta el volumen del núcleo más del 50%.
Transferencia de los embriones
Después de un cultivo temporal, los embriones inyectados son transferidos mediante cirugía a oviductos
de receptoras sincronizadas. La sincronización de las receptoras se lleva a cabo a través de un
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159
tratamiento hormonal específico de especie. Antes de la transferencia de los embriones tratados se
controla la reacción ovárica de la hembra receptora. Sólo son empleadas aquellas receptoras que
respondieron al tratamiento hormonal con el número adecuado de folículos, que depende de la especie
tratada.
En la especie bovina se procede a cultivar los embriones in vivo o in vitro durante varios días, a fin de
evitar la trabajosa intervención de la transferencia al oviducto (BERG y BREM, 1989). La finalidad es
cultivar los embriones de una o dos células hasta el estadio de mórula y transferir éstas directamente en
el útero de las receptoras. Para el conejo, cerdo, oveja y cabra el cultivo intermedio no es necesario,
dado que en esas especies incluso la transferencia uterina se lleva a cabo mediante cirugía.
Comprobación de la integración y la expresión
Después de la transferencia génica sólo es posible en casos aislados determinar la integración del gen
a través de cambios de fenotipo en los animales nacidos. Incluso aún cuando la estructura génica
empleada permita esperar algún efecto, debe llevarse a cabo la comprobación de la integración del gen
presente independientemente del fenotipo. Ello se debe a que la estructura génica integrada no siempre
se exprime en los animales positivos. Para la comprobación de la integración génica se disponen de
varios métodos. El material de evaluación lo constituyen células con núcleo, que se toman de los
órganos o fluidos corporales. Normalmente se toman las pruebas del tejido de la punta de la cola o de la
sangre. De ellas se aisla el ADN, que no requiere que sea especialmente de alto peso molecular, como
lo es en el caso de los bancos de reservas genómicas.
La lisis completa del tejido se logra a través de un tratamiento con proteinasa K-buffer a 55 C. La
extracción se logra con cloroformo fenolado. Con acetato de Na y etanol se provoca la precipitación que
aumenta con la centrifugación. Inmediatamente después se determina la concentración con ayuda de
un espectrofotómetro, a partir de alícuotas diluidas.
La exacta y más segura comprobación de la integración de las estructuras génicas se puede llevar a
cabo por medio del método Southern-Blot. Aproximadamente 20-30 µg de ADN genómico de alto peso
molecular es hidrolizado completamente con enzimas de restricción adecuadas. Después de la división,
la mezcla de fragmentos de ADN es separada electroforéticamente en gel-agarosa horizontal. Un
marcador aplicado al mismo tiempo permitirá la determinación del tamaño de los diferentes fragmentos
de ADN. Los fragmentos separados son transportados a filtros de celulosa o a membranas de Nylon
según el método de SOUTHERN (1975). El ADN, separado en el gel de agarosa, es transportado después de la desnaturalización alcalina- a la nitrocelulosa o membrana de nylon que se encuentran
directamente sobre agar por medio de capilaridad con ayuda de un buffer de transferencia. Con ADN
genómico, el Blot puede terminar al cabo de 10-16 h. El tiempo de transferencia de ADN puede
reducirse a menos de una hora con aparatos de vacío o de electro-Blotting. En un método rápido de
evaluación de un número grande de pruebas de ADN se transporta una alícuota de ADN
desnaturalizado y lavado en forma grosera, a una membrana soporte bajo presión negativa e
inmediatamente después se híbrida con una prueba marcada radioactivamente. Con el método descrito
por BRENIG y col. (1989) puede comprobarse la estructura génica en el ADN del animal hospedador en
25-30 h. Con el reemplazo de la marcación radioactiva por un método de luminiscencia química puede
ahorrarse más tiempo.
Después de la desnaturalización y neutralización se continúa la transferencia de los fragmentos
separados del gel al filtro de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN utilizados en la prueba son
marcados radioactivamente. Ello puede llevarse a cabo mediante translación "nick" u oligopriming.
Los filtros de nitrocelulosa son pre-hibridizados con ADN no específico e hibridizados posteriormente
con ADN radioactivo. Después de un lavado astringente abundante, los filtros son expuestos a un film
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Brem & col.
radiográfico con una película reforzadora durante un tiempo determinado a 80o C. Una alternativa al
uso de sustancias radioactivas es la aplicación de dUTP biotinilado (LANGER y col., 1981) para el
marcado de fragmentos. Biotina tiene una fuerte afinidad a la avidina, la cual por su parte puede
acoplarse a indicadores adecuados (anticuerpos, enzimas, colorantes). De esta forma se pueden
identificar también las cantidades más pequeñas de complejos biotina/ADN.
En el método Southern-Blot la elección de la o las enzimas y de las pruebas de hibridación tiene una
importancia definitiva. En los casos más adecuados hay una enzima cuyos dos lugares de división en la
estructura génica están separados entre si en forma suficiente para usar el fragmento ubicado entre
medio como grupo de hibridación. Si para la división del ADN se emplean los lugares de corte
marginales, en los cuales el fragmento fue separado del vector, aparecen en el análisis Southern-Blot,
junto con el o los fragmentos esperados con el tamaño correspondiente a la estructura génica, dos
fragmentos en lo general más largos.
El análisis de patrones ("pattern") de tal naturaleza permite sacar algunas conclusiones sobre la
integración. Se sabe que, en muchos animales transgénicos, no sólo se integra una copia de la
estructura génica inyectada. Varias copias son frecuentes en dependencia de los lugares marginales,
concatómeros unidos al genoma en forma de "head to tail", "head to head" o "tail to tail". De la misma
forma no es un fenómeno extraño que se pierdan algunas bases en terminales sobresalientes de los
fragmentos, durante la integración. De esta forma desaparecen los lugares de división en los terminales
5'-3'- en los fragmentos integrados de ADN. Si se divide el ADN genómico con enzimas de restricción,
que cortan al final de la estructura génica, se separan los concatómeros del interior del fragmento de
ADN en forma precisa y esperada. Sin embargo, dado que los lugares de corte en las terminales se
pierden, se originan en las posiciones 5'-3'- fragmentos más grandes. Ello es así porque en ambas
copias marginales del genoma se encuentran aún las secuencias hasta los próximos lugares de
fragmentación en la cadena de ADN, apropiados para las enzimas de restricción. El largo de esas
copias génicas marginales es casual y depende de la presencia de lugares de división adecuados en la
zona de integración del ADN genómico. En casos relativamente escasos la integración de la estructura
génica se produce no solamente en un lugar sino en dos o más. En casos favorables puede
comprobarse su existencia por medio de análisis Southern-Blot. Con frecuencia esto no se logra en el
primer animal receptor, pero sí después de la segregación del transgen en la descendencia. Se supone
que para la expresión de las estructuras génicas la pérdida de bases marginales en general no tiene
importancia.
Si se emplean en la transferencia génica secuencias homólogas, es decir fragmentos de ADN
provenientes de la misma especie, el análisis Southern-Blot debe planearse cuidadosamente. En esos
casos la comprobación específica de la integración génica sólo es posible mediante la correcta
selección de adecuadas enzimas de restricción, de lo contrario la diferenciación entre el ADN endógeno
y el transferido es difícil. Dado que, sin embargo, sólo en casos excepcionales se elige el mismo orden
de regiones no trasladadas promotoras y estructurales del gen y del genoma, se adecuan
especialmente los lugares entre ambos genes como pruebas de hibridación. A pesar de ello ocurren
también en esos casos señales a través de la hibridación cruzada de las pruebas con secuencias
genómicas, que deben ser consideradas en el análisis. De vez en cuando se observan en las pruebas
de integración patrones de integración inesperados. En esos casos el complejo patrón de restricción,
que no responde al original, se puede determinar mediante un análisis de restricción y Southern.
El número de estructuras génicas integradas en el genoma se determina por medio del análisis Dot-blot.
El mismo no es una técnica de transferencia capilar, dado que el ADN es aplicado a la membrana de
soporte mediante una máscara perforada. La electroforesis no es necesaria y la calidad del ADN no
necesita ser tan buena como para el análisis de Southern-Blot. El ADN desnaturalizado es aplicado,
lavado, horneado e hidrolizado. A través de la cuantificación densimétrica se calcula aproximadamente
el número de copias del transgen (tamaño del genoma haploide = 3 . 109 pb).
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Animales transgénicos
161
Una técnica desarrollada hace pocos años, la reacción PCR (Polymerase Chain Reaction, capítulo XV),
puede emplearse para evaluar si un animal es transgénico en un tiempo relativamente corto y con poco
material celular. Cuando se pretende localizar el lugar de integración en el cromosoma se puede llevar a
cabo una hibridación in situ de los cromosomas en metafase. El término hibridación in situ se emplea
también para la comprobación directa de ADN y ARN en muestras de tejidos congelados.
La especificidad para la expresión de un gen o estructura génica en un tejido se establece, entre otros,
a través de su promotor. Por esa razón, para la evaluación de la transcripción correcta de una
estructura génica inyectada se aisla el ARN de los tejidos en los cuales se espera la mayor expresión.
La preparación del ARN se lleva a cabo según los protocolos de CHIRGWIN y col. (1979) y GLISIN y
col. (1974), los cuales se basan en la lisis celular y desnaturalización proteica con isotiocianato de
guanidina. El ARN es transferido a filtros de nitrocelulosa o de nylon (THOMAS, 1980) como para el
análisis Southern-Blot o a geles desnaturalizados de agarosa/formaldehido, después de su
desnaturalización con glioxal o dimetilsulfóxido (DMSO).
Para recabar información sobre cantidad, estructura o porcentaje de síntesis se llevan a cabo tests con
nucleasa S1 y ribonucleasa o ensayos de extensión del iniciador ("primer"). En el análisis S1 (SHARP y
col., 1980) o el test de la protección de la ribonucleasa (CHAMBERLIN y RYAN, 1982) se emplean
pruebas de cadenas simples, complementarias con el ARN que se pretende evaluar. Con ese método
se pueden estudiar los puntos terminales 5'- y 3'- como así también la cantidad específica de ARN.
Después que se pudo comprobar que la estructura génica microinyectada se transcribe correctamente,
se debe evaluar la translación. Se analiza en primer lugar si la proteína correspondiente se sintetiza y,
de ser así, en que cantidad. Para ello se disponen de métodos colorimétricos o electroforéticos en gel
con coloración posterior (Comassie-Blue, plata) del gel o transporte a filtros de nitrocelulosa o
membranas de nylon (Western-Blot). Además pueden emplearse métodos clínicos de diagnóstico
(radioinmunoensayo, ELISA), los cuales están disponibles en parte en forma de kit. Para más
información sobre esos métodos consultar la literatura siguiente: LOWRY y col., 1951; BRADFORD,
1976; PETERSON, 1977; PETERSON, 1979; OAKLEY y col., 1980 HAMES & RICKWOOD, 1981;
MOEREMANS y col, 1985; DARBRE, 1986; MOEREMANS y col., 1986; SALINOVICH & MONTELARO,
1986.
Herencia del transgen
Un requisito indispensable para la aplicación de la transferencia génica en producción animal es que el
gen transferido se transmita a la descendencia. Para ello es necesario que el animal receptor del gen
(microinyectado) posea en todas o, al menos, en parte de sus células reproductivas el transgen.
Lamentablemente se conoce poco sobre los caminos moleculares y biológicos que se suceden en la
integración de un ADN inyectado. Por ejemplo, no se conoce exactamente cuando se lleva a cabo la
integración y si ésta permanece estable en todas las células durante el desarrollo posterior del embrión.
En ensayos de evaluación de animales nacidos transgénicos y especialmente en aquellos de
producción de descendencia transgénica se ha observado que a pesar de la inyección del ADN, en el
pronúcleo embrionario pueden originarse mosaicos.
Mosaicos son animales originados por diferentes líneas, que provienen de un cigoto pero que poseen
diferentes genotipos. Mosaicos transgénicos poseen células que contienen el transgen y otras que no lo
tienen. Ello puede conducir a problemas en la formación de descendencia transgénica cuando en las
células gonadales de los progenitores no está presente el transgen. Según las experiencias obtenidas
se puede esperar que aproximadamente 30% de los animales receptores primarios del gen (por medio
de microinyección) son mosaicos y que no transmitirán el transgen a su descendencia en la frecuencia
esperada de 50%.
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La herencia de animales transgénicos, en los cuales la estructura génica inyectada se integró en forma
estable y se transmite a la descendencia, responde a las leyes mendelianas, dado que en general la
integración del gen se produce en un solo lugar en un cromosoma. De acuerdo a la definición se
describe a este tipo de animales como transgénicos heterocigotas. Sin embargo este término no es el
adecuado, dado que falta el alelo correspondiente al transgénico en el cromosoma homólogo. Como es
de esperar, 50% de la descendencia debe poseer el transgen. Sin embargo, si las gónadas son
mosaicos de líneas transgénicas y no transgénicas, el porcentaje de descendencia transgénica variará
entre 0-50% de acuerdo a la participación cuantitativa de ambas líneas celulares. Los mosaicos se
originan sólo en la generación F0. Los animales transgénicos de la generación F1 y posteriores poseen,
si son positivos, la estructura génica en todas las partes del cuerpo y células de la hilera germinal. Se
ha observado, no obstante, que la integración no siempre permanece estable a través de las
generaciones.
La observación de que un transgen no permanece estable sino que puede perderse no fue aclarada en
forma suficiente. Aún más frecuente que la inestabilidad de la integración es la gran variabilidad de la
expresión del transgen, de forma tal, que en el curso de las generaciones, se presentan todas las
formas posibles de variación: aumento, disminución o ausencia de expresión. Aún dentro de grupos de
hermanos enteros se observó variabilidad de la expresión del transgen entre animales positivos. Las
razones para ello no han sido aclaradas, seguramente desempeña el fenómeno conocido como
"imprinting" un rol de importancia. A través de la diferente metilación, la expresión de un gen depende
de su origen materno o paterno.
La comprobación de varios lugares de integración en el genoma de animales transgénicos ocurre con
relativa poca frecuencia. Si los lugares de integración están tan alejados entre sí, que pueden conducir
a recombinaciones al azar, pueden originarse más de 50% de descendencia transgénica. De un animal
transgénico con dos tipos de integración independientes puede esperarse que el 75% de la
descendencia hereden el transgen, 25% recibirá uno de ambos transgenes y otro 25% ambos tipos en
su genoma. El 25% restante no será transgénico. A través del apareamiento de animales transgénicos
heterocigotas se obtiene, en casos normales, 50% de transgenes heterocigotas, 25% de homocigotas y
25% de negativos.
El azar de la integración génica en los animales transgénicos primarios (F0) puede conducir a la
integración en el sector de un gen de importancia para el desarrollo del feto. Mientras un alelo intacto en
el cromosoma homólogo de animales heterocigotas esté presente, no se producen problemas como
consecuencia de esa mutación por inserción. Una excepción la constituyen posiblemente los efectos
génico-aditivos, cuya integración en un lugar génico determinado tienen como consecuencia una
reducida expresión de la característica endógena aditiva. Del apareamiento de animales heterocigotas
que tienen una mutación de inserción no es posible obtener descendencia transgénica homocigota. Si el
gen afectado por la mutación de inserción es esencial para el desarrollo del feto no nacerán animales
transgénicos homocigotas. Antes de la reproducción de animales transgénicos debe evaluarse si los
animales son libres de mutaciones de inserción, a fin de evitar un aumento de la carga letal. Dichas
mutaciones de inserción pueden ser interesantes en investigación básica.
Para la producción animal la aparición de mosaicos y mutantes de inserción tiene como consecuencia
que para la introducción de un gen determinado en una población, un solo animal transgénico no es
suficiente. Independientemente de la alta tasa de consanguinidad que se pueda generar, las
posibilidades de producir una línea transgénica con un solo animal son reducidas.
Para que una línea transgénica pueda tener éxito y aplicación en la práctica deberían cumplir las
siguientes condiciones:
- Transmisión estable del transgen a la descendencia.
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- Ausencia de mutaciones de inserción y la posibilidad de producir animales transgénicos
homocigotas.
- Expresión estable del transgen y efecto biológico positivo sobre la característica deseada.
De ello se desprende que se deben producir como mínimo 5-10 animales transgénicos primarios (F0)
para producir, con una probabilidad suficientemente alta, líneas que respondan a las exigencias
establecidas.
Programa de transferencia génica en el bovino
Después que se informó por primera vez, en el año 1985 (HAMMER y col., 1985; BREM y col., 1985),
sobre la exitosa aplicación de la transferencia génica en los animales domésticos (cerdo, oveja, conejo)
se intensificaron los esfuerzos en los años siguientes para mejorar la metodología y los genes. Mientras
que la tasa de integración no aumentó sensiblemente, en algunos ensayos se pudo mejorar la
expresión a través del empleo de genes optimizados. La eficacia de un programa de transferencia
génica depende de una serie de factores, como la habilidad en la manipulación embrionaria, el tipo y
duración del cultivo in vitro, la calidad de la transferencia de los embriones, la edad de las receptoras
empleadas y la sincronicidad entre donantes y receptoras.
El esquema de desarrollo de un programa de transferencia génica se inicia con la selección,
estimulación e inseminación (natural o artificial) de las donantes (fig. 1). La obtención de los cigotos se
lleva a cabo por medio de la matanza o cirugía de las donantes, 75-97 h después del celo. Los
embriones son centrifugados para exponer los pronúcleos (WALL, 1985). Junto con embriones de una
célula se emplean para la inyección también embriones con 2 blastómeros. Una forma alternativa para
la obtención de embriones para la microinyección de ADN en el bovino es la producción in vitro de
embriones (ver capítulo XI).
En la actualidad este método biotecnológico desplaza a la obtención in vivo de los embriones. La
producción y el cultivo in vitro presentan las ventajas de ser más económicos, se evita la intervención
quirúrgica de las donantes y receptoras como así también de los animales empleados para el cultivo
temporal. Otra ventaja de la producción in vitro es la posibilidad de determinar el estadio del pronúcleo
con mayor precisión. Ello permite la inyección de un mayor número de embriones. Después de la
microinyección los embriones se cultivan in vitro o in vivo en el oviducto de receptoras temporales. La
desventaja del último método se basa en las reducidas tasas de recuperación de los embriones como
así también en su trabajosa ejecución. Los problemas de falta de desarrollo de los embriones
producidos in vitro, a partir de los estadios de 8 y 12 células, pudieron resolverse con la aplicación del
cocultivo de los embriones con células de la granulosa y del oviducto. Los embriones microinyectados
son transferidos en los días 6-7 de desarrollo, momento en que alcanzan los estadios de mórula o
blastocisto, en forma no quirúrgica a receptoras sincronizadas.
LOHSE y col. (1985) informaron sobre el primer ensayo de transferencia génica en el bovino. Los
autores inyectaron en ovocitos fertilizados una estructura génica TQ (timidin quinasa) y demostraron
que 30% de los embriones indicaban una actividad TQ de 2 desviaciones estándar por encima de los
controles. LOSKUTOFF y col. (1986) lograron 3 preñeces de la transferencia de 43 cigotos y 17
embriones de dos blastómeros inyectados. En otro estudio McEVOY y col. (1990) obtuvieron 569
ovocitos de 52 vaquillonas superovuladas (5,1 embriones de una y dos células por cada donante) por
medio de laparotomía en la línea media. Los pronúcleos fueron observados en 71% de los casos
después de 3 min y 81% después de 5 min de centrifugación a 13000 g, 62 y 60% de ellos se
desarrollaron 24h después del cultivo. Como consecuencia de la microinyección degeneraron 20% de
los cigotos. Embriones de una y dos células (n = 108) fueron transferidos a 46 receptoras. Al día 55
fueron detectadas 20 hembras (43%) con 32 fetos, 17 de las cuales parieron (37%). Uno de los 27
terneros nacidos fue transgénico. La tasa de sobrevivencia de los embriones de uno y dos blastómeros
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fue de 22 a 36%. CHURCH y col. (1986) informaron que se desarrollaron 111 embriones de 852 cigotos
bovinos inyectados con el gen de la fetoproteína alfa, de los cuales se identificaron 4 que integraron el
gen. Después de la inyección de 1161 cigotos con 3 diferentes estructuras génicas y la transferencia de
641 (55%) la tasa de nacimiento fue de 10,5% (126) frente a 43% del grupo control. De los 126
embriones inyectados y transferidos integraron el ADN 7 terneros. BIERY y col. (1988) informaron sobre
la tasa de detección de los pronúcleos después de la centrifugación de 1325 cigotos a 15000 g durante
4 min. Después de la microinyección y el cultivo in vivo en oviducto de oveja durante 6 días, se
recuperaron 84% de los embriones, de los cuales 21% se desarrollaron hasta los estadios de mórula y
blastocisto.
La integración del ADN se registró en 4 fetos. ROSCHLAU y col. (1988) obtuvieron, luego de la
castración de las donantes, 513 cigotos de oviductos que fueron inyectados con 3 diferentes estructuras
génicas virales. En 14 de 44 embriones, de dos semanas de edad, fue posible comprobar la presencia
del ADN; 5 embriones exprimieron el gen. De la transferencia de 43 embriones a 23 receptoras
resultaron 14 preñeces y nacimientos. La integración del ADN bGH inyectado se comprobó en 1 ternero.
En ensayos propios (REICHENBACH, 1989) se compararon diferentes sistemas de cultivo in vivo con
cultivos in vitro. Las tasas de desarrollo obtenidas se detallan en la tabla 2. De ello se concluye que de
las 3 especies obtenidas, el cerdo fue menos y el conejo fue el más adecuado para el cultivo de los
cigotos. Lo destacable de este estudio fue que los sistemas de cultivo in vitro empleados (BERG y
BREM, 1989) fueron comparables a los mejores resultados obtenidos in vitro, considerando los
embriones cultivados y los transferidos.
Tabla 2: Tasas de recuperación y desarrollo de los cigotos y embriones cultivados in vivo e in vitro
después de la inyección génica (REICHENBACH, 1989)
Cultivo
temporal
Embriones
transferidos
de 1 y 2
células
Embriones desarrollados
Embriones
Recuperados
>1 división
mórulas/blastocistos
celular
(a)
n
(b)
n
(b/a)
%
(c)
n
(c/b)
%
(d)
n
(d/b)
%
(d/a)
%
in vivo
vaca
8 Mi
3K
183 66
93
48
51
73
24
27
26
56
17
14
18
29
9
21
in vivo
cerda
3 Mi
1K
79
29
22
12
28
41
7
5
7
5
3
2
14
17
4
7
in vivo
coneja
4 Mi
2K
82
41
46
31
56
76
28
21
28
21
13
14
28
45
16
34
in vitro
5 Mi
4K
123
71
123
71
100
100
63
43
63
43
18
21
15
30
15
30
Mi = Microinyectados
K = no microinyectados (controles)
Tres grupos de trabajo: en Texas (U.S.A, MASSEY, 1990), en Leiden (Holanda, KRIMPENFORT y col.,
1990) y en Munich (República Federal de Alemania) publicaron el empleo exitoso de los embriones
bovinos producidos in vitro hasta el nacimiento de terneros (tabla 3). Los primeros terneros
transgénicos, producidos con el empleo de embriones producidos in vitro, nacieron en 1991
(KRIMPENFORT y col., 1991). Como se señala en la tabla 3, 1% de los ovocitos recolectados culmina
en terneros después de la fertilización, microinyección, cultivo y transferencia de los embriones tratados.
A pesar de ello las ventajas de la producción in vitro de embriones superan al sistema de producción in
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vivo. En el futuro la producción de animales transgénicos se desarrollará, con seguridad, apoyada en la
producción in vitro de los embriones, porque se considera que la eficacia de las diferentes etapas
mejorará en los próximos años.
Tabla 3: Microinyección de ADN en embriones producidos in vitro según diferentes autores
Texas, USA
MASSEY, 1990
Pasos
Maduración de
los ovocitos
Microinyección
de los ovocitos
Embriones
transferidos
Gestaciones/
Terneros
n
%
Leiden, Holanda
KIMPENFORT y
col., 1991
n
%
Munich, Alemania
resultados propios,
1989, 1991/92
n
%
2408
-
2297
-
686
-
858
36
1154
50
496
72
49
6
129
11
60
12
12
24
21*
21
12
26
* 2 terneros transgénicos
Dado que las receptoras significan el mayor costo de un programa de transferencia génica, empleando
la producción in vitro de embriones, se trabaja intensamente en el diagnóstico de la integración del gen
ya sea durante la gestación (a través de la recolección y análisis de las células embrionarias) o, mejor
aún, en los embriones de 6-7 días de edad, por medio del diagnóstico de PCR (capítulo XV).
Foto 1: Microinyección de ADN en el pronúcleo de un cigoto de
ratón
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Wolf & Brem
168
DESARROLLO Y APLICACIONES DE LAS CELULAS EMBRIONARIAS PRIMORDIALES
E. Wolf & G. Brem
Introducción
A partir de la exitosa producción de líneas celulares pluripotentes de embriones de ratón a comienzos
de la década del '80, las mismas se emplean intensamente como modelos para el estudio embrionario
básico como así también como vectores para la transferencia de genes. Otros objetivos en la
investigación de células primordiales embrionarias comprende su empleo como donantes de núcleos en
experimentos de clonado como también la conservación ex situ de información genética. El presente
capítulo presenta un resumen de los resultados en la investigación. Estos documentan el estado actual
de la puesta a punto y empleo de las células embrionarias primordiales en animales de experimentación
y de interés productivo.
Definición y características
Las células embrionarias primordiales son líneas celulares continuas de origen embrionario y
totipotentes, a partir de las cuales se pueden desarrollar todos los órganos, incluyendo la hilera
germinal. Las células pluripotentes de origen embrionario pueden obtenerse mediante diferentes
métodos (ROBERTSON, 1987). Un camino posible lo constituye el aislamiento de células pluripotentes
de teratocarcinomas espontáneos como también su producción a partir de localizaciones embrionarias
ectópicas (DAMJANOV y col., 1987). Junto con esas alternativas existe actualmente la posibilidad de
aislar células pluripotentes directamente de los embriones. Las células pluripotentes aisladas de
teratocarcinomas se denominan células-EC, las obtenidas de embriones EK (BRANDLEY y col., 1984) o
más comúnmente ES.
Las células EC no pueden diferenciarse de las morfológicamente ES, en su comportamiento antigénico
de superficie como tampoco en su diferenciación in vivo o in vitro (EVANS y KAUFMAN, 1981; MARTIN,
1981). No obstante las células totipotentes embrionarias cuentan con algunas ventajas frente a las del
carcinoma embrionario:
- Directa aislación a través de marcadores genéticos como determinadas isoenzimas (BRADLEY y
col., 1984) o mutaciones (MARTIN y col., 1987)
- La conservación de un número diploide de cromosomas en el cual se hayan establecido las líneas
femenina (XX) y masculina (XY, NICHOLS y col., 1990)
- Un porcentaje relativamente alto de quimeras después de la inyección de células ES en blastocistos
con la posibilidad de formar quimeras de la hilera germinal (BRADLEY y col., 1984)
- Permite la posibilidad de obtener células ES de embriones partenogenéticos que cuentan con una
constitución genética homocigota diploide (ROBERTSON, 1987).
Formación y cultivo
La aislación de líneas totipotentes de embriones se basa en las siguientes condiciones (BRADLEY,
1990):
- Las células deben estar presentes en el estadio del embrión
- Las células deben ser protegidas de señales que desencadenen su diferenciación
- Deben se capaces de reproducirse in vitro
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Células embrionarias primordiales
169
Dos grupos de investigación lograron por primera vez el aislamiento de líneas celulares totipotentes de
ratón al comienzo de la década del 80. EVANS y col. (1981) cultivaron blastocistos de la cepa
consanguínea 129, cuya implantación fue impedida a través de una ovariectomía del animal donante en
el día 2,5 después del estro y un tratamiento simultáneo con progesterona (implante). Las células ES se
obtuvieron los días 6-8 de comenzado el estro, fueron cultivadas durante 4 días, momento en el cual los
blastocistos producidos eclosionan y las células trofoectodérmicas se diferencian en trofoblastos
gigantes (grandes). La masa celular interna (MCI), estructura con forma oval-cilíndrica, ubicada en el
centro del blastocisto fue aislada con un capilar de vidrio y tripsinada. Las células obtenidas fueron
cultivadas en un medio DMDM (Dulbecco's modified Eagles medium) modificado, individualmente o en
pequeños grupos sobre una línea continua de fibroblastos de ratón (STO) inactivados con mitomicina.
Las colonias con una morfología típica ES (colonias claras, continuas, sin limites celulares visibles, foto
1) fueron recolectadas y colocadas sobre una capa de células nutrientes (feederlayer).
Foto 1: Célula embrionaria primordial totipotente (ES)
MARTIN (1981) aisló MCIs de blastocistos expandidos a través de cirugía inmunológica (foto 2). A
través de un tratamiento con Pronase (0,5%) en M2 (37o C, 3-10 min) se eliminó la zona pelúcida (foto
2a). Las MCIs fueron cultivadas en DMEM modificado con fibroblastos STO inactivados en su mitosis. El
medio DMEM fue previamente condicionado con células de carcinoma de la línea PSA-1. Una
información más exacta sobre el protocolo de trabajo se encuentra en el trabajo de ROBERTSON
(1987).
La aislación y cultivo de células ES se logró originalmente sólo con el empleo de células nutrientes
(fibroblastos STO inactivados en su mitosis o fibroblastos embrionales primarios), cuyas funciones como
la desintoxicación del medio en general, la fijación de las células y la inhibición de la diferenciación en
particular fueron descriptas (ROBERTSON, 1987). La presencia de células nutrientes complica, sin
embargo, la manipulación genética de las células ES como así también la caracterización de los
factores de crecimiento y diferenciación.
SMITH y HOOPER (1987) descubrieron un factor soluble en un medio condicionado con células BRL
(buffalo Rat liver), que podía inhibir la diferenciación en forma reversible (differentiation inhibiting activity
= DIA) aún cuando es cultivado sin células nutrientes. En forma pura DIA es una glicoproteína con un
peso molecular de 43000 e idéntico al factor inhibidor de la leucemia (LIF = Leukeaemia inhibitory
factor, SMITH y col., 1988; WILLIAMS y col., 1988). LIF está actualmente disponible
biotecnológicamente (GEARING y col., 1989) y se ofrece en el mercado bajo la denominación ESGRO
(Amrad, Australia).
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170
Foto 2: Aislación inmunológica de las MCIs de un
blastocisto (ratón): a) eliminación de la zona pelúcida;
b) Cultivo de los embriones (37oC, 20-30 min) en suero de
conejo anti ratón, inactivado por medio de calor y lavado en
M2; c) colocación de los embriones en gotas con
complemento de cobayo (1:10) para destruir las células
trofoectodérmicas; d) eliminación de las células lisadas con
una pipeta. La flecha indica la MCI
Con el agregado en el medio de cultivo de LIF se logró la formación de líneas celulares ES diploides
con o sin el empleo de células nutrientes (HENDYSIDE y col., 1989; NICHOLS y col., 1990). WELLS y
col. (1991) pudieron establecer líneas celulares ES de embriones sometidos a un shock térmico (42o C
durante 10 min) y a un tratamiento con Puromicina, con una eficiencia significativamente mayor que con
embriones no tratados. Mientras que en la mayor parte de los ensayos para el desarrollo de células ES
se emplearon embriones de la línea consanguínea 129 LEDERMAN y BURKI (1991) lograron establecer
una quimera de la hilera germinal a partir de embriones de la línea C57BL/6. En ese trabajo, el
aislamiento de las células ES se logró por medio de células con mitosis inactivada de la linea 5637
(carcinoma humano), con mayor frecuencia que con los fibroblastos embrionarios murinos. El trabajo de
SMITH (1991) presenta una lista completa de los métodos disponibles y materiales necesarios para el
cultivo de células ES.
Diferenciación in vivo e in vitro de células embrionales totipotentes
Cuando las células ES alcanzan una alta concentración en el cultivo tienden a diferenciarse
espontáneamente, observándose en primer lugar células epiteloides como endodermo primitivo. Si las
células ES son mantenidas sin células nutrientes, en cultivos de suspensión sobre sustratos no
adhesivos se presenta un fenómeno de diferenciación aún más complejo (DOETSCHMAN y col., 1985).
Como primer estadio se forman agregados de células ectodérmicas, rodeadas por una capa simple de
células endodérmicas (= "Embryoid bodies" = cuerpos embrioides simples; foto 3a). Con un cultivo
progresivo se forman estructuras quísticas que contienen también estructuras mesodérmicas (cuerpos
embrioides complejos; foto 3b).
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Células embrionarias primordiales
171
Foto 3: Cuerpos embrioides simples (A) y complejos (B)
Bajo las condiciones establecidas por DOETSCHMAN y col. (1985) se formaron "islas de sangre" y
células miocárdicas en 30% de los cuerpos embrioides complejos. Si los cuerpos embrioides son
colocados nuevamente sobre un substrato adhesivo se produce una amplia diferenciación en derivados
de las tres capas dérmicas (por ejemplo, células nerviosas, musculares, pigmentarias, condrocitos, etc).
Tabla 1: Producción de quimeras por medio de la inyección de células primordiales embrionarias * en
blastocistos (resultados no publicados)
Blastocistos
NMRI
C57Bl/6
Balb/c
Blastocistos inyectados y transferidos
225
520
56
Número de transferencias
Blastocistos/transferencia
24
9.4
48
10.8
6
9.3
Preñeces
10 (42%)a
25 (52%)a
3 (50%)a
Nacimientos
33 (15%)b
87 (17%)b
6 (11%)b
Animales destetados
28 (85%)c
54 (62%)c
4 (66%)c
Número de quimeras de pelaje
9 (32%)d
24 (44%)d
4 (100%)d
< 20%
bis 95 %
bis 50%
Quimeras apareadas
9
22
4
Quimeras infértiles
0
7
1
Quimeras con más de 10 descendientes
9
11
3
Quimeras de la hilera germinal
0
6
1
Manifestación del quimerismo de pelaje
*D3 y diferentes clones homólogos recombinados (gene disruption); Valores promedio de atransferencias,
bembriones transferidos, canimales nacidos y danimales destetados
El potencial de diferenciación in vivo de las células ES puede ser evaluado a través de un transplante
sucutáneo en ratones singénicos. EVANS y KAUFMAN (1981) observaron en ese ensayo una alta
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172
incidencia de tumores de rápido crecimiento. En la evaluación histopatológica de los mismos se observó
la participación de varios tejidos que fueron identificados como teratocarcinomas. Sin embargo el test
definitivo de la totipotencia de las células embrionarias se lleva a cabo a través de la inyección de las
células ES en blastocistos o mórulas de otra especie con el fin de producir quimeras (fig. 1).
Inyección de células ES en los blastocistos y
transferencia de los embriones a receptoras
seudográvidas
Nacimiento de las quimeras
Test para comprobar el quimerismo de la
hilera germinal a través del cruzamiento de
las quimeras con marcadores genéticos
(marcadores de color de pelaje)
Nacimiento de la descendencia, proveniente
de células ES
Fig 1: Evaluación in vivo de la pluripotencia de las células ES a través de la inyección en blastocistos
Una amplia exposición de los materiales necesarios y de los diferentes pasos metodológicos se
encuentran en el trabajo de BRADLEY (1987). Por esa razón nos referiremos a los puntos más
importantes de acuerdo a nuestra experiencia. Las células ES se inyectan en blastocistos (d 3)
recolectados de ratonas donantes superovuladas. Alternativamente se pueden utilizar mórulas (d 2).
Estas deben ser tratadas, sin embargo, con citocalasina B en un medo libre de Ca++ y Mg++ para
lograr un reversible aflojamiento del citoesqueleto. BRADLEY (1987) recomienda para la inyección una
cámara enfriada (10o C), que de acuerdo a nuestra experiencia no es necesaria. De importancia es la
calidad de las micropipetas de inyección y sujeción. Su construcción se presenta en las figuras 2 y 3.
Los aparatos necesarios para ello en el capítulo X (fotos 5, 6 y 8).
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173
Fig 2: Elaboración de las pipetas para inyección de lás células ES en blastocistos o mórulas. Los
capilares de borosilicato son estirados con un estirador de pipetas y cortados en diagonal en un
diámetro de 18 a 22 m con un escalpelo sobre goma siliconada. Con cierta experiencia se
obtiene el 50% de los capilares con la forma ideal (a). Pipetas muy largas (b), muy cortas (c) y
con irregularidades (d) son inadecuadas para la inyección
Ambas pipetas se manipulan a través de micromanipuladores. El sistema de sostén es llenado con aire
y controlado con la boca o una jeringa de 10 ml. El sistema de microinyección que contiene silicona
líquida es accionado por medio de una jeringa Hamilton (fig. 4). La inyección se lleva a cabo como se
indica en la fig. 8, siendo la mejor posición el límite entre 2 células trofoectodérmicas. Después de la
inyección de 8-15 células ES en cada blastocisto ó 3-4 células ES en cada mórula, los embriones son
cultivados 30 a 60 min y posteriormente transferidos en el útero de receptoras seudográvidas (d 2).
Fig 3: Elaboración de una pipeta de sostén. El capilar es estirado a mano hasta un diámetro de 80-120
m y apoyado sobre la esfera de vidrio de la microfragua (a). La esfera es calentada hasta que la pared
del capilar y la esfera se funden ligera-mente (b). Se interrumpe a continuación la corriente eléctrica de
forma tal que el filamento que calienta la esfera se contrae y el capilar se quiebra (c). A continuación se
redondea y reduce el borde de la pipeta con ayuda de la esfera candente (d, e, f) a un diámetro final de
20 a 30 m.
La eficacia de la producción de quimeras como así también el porcentaje de células ES en los tejidos
somático y reproductivo dependen esencialmente de la calidad de las líneas celulares ES pero también
del origen genético de los embriones receptores. De esta forma los blastocistos de la línea C57BI/6 se
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adecuan muy bien para la inyección de células ES de la línea 129 (SCHARTZ-BERG y col., 1989;
resultados propios no publicados; foto 5, tabla 1). NAGY y col. (1990) pudieron producir quimeras a
partir de células ES y embriones tetraploides. En las quimeras se pudo comprobar su completo origen
de células ES. Los animales murieron, sin embargo, poco después del nacimiento por razones no
establecidas.
La colonización de la hilera germinal a través de células ES fue observada por primera vez por
BRADLEY y col. (1984). Un factor de importancia en ese sentido es el cariotipo de las células ES
(BRADLEY, 1990). Mientras las traslocaciones y trisomías sólo tienen un efecto reducido sobre el
porcentaje de células ES en tejidos somáticos, la participación en los tejidos de la hilera germinal es
muy improbable.
Células embrionarias totipotentes de la hilera germinal
A partir de las experiencias descriptas en el ratón, diferentes grupos de trabajo intentaron establecer
líneas celulares totipotentes a partir de embriones bovinos, porcinos, caprinos y ovinos. Las primeras
publicaciones sobre la aislación de líneas celulares contínuas de embriones bovinos y ovinos datan del
año 1987.
Foto 4: Inyección de células primordiales embrionarias en un
blastocisto, a) antes de la inyección; b) colocación de la pipeta en el
límite entre dos células trofoectodérmicas; c) inyección de 8-10
células ES; d) el blastocisto se colapsa luego de retirar la pipeta
STRINGFELLOW y col. (1987) cultivaron un embrión bovino de 11 dias, obtenido en forma no
quirúrgica, en medio Ham's F-20 (100 ml suplementado con 10 ml de suero fetal bovino, 11 mg Piruvato
de Na, 0,5 mg insulina y 10 l EGF). Después de 13 días se estableció una monocapa (monolayer), que
fue separada con 0,4% de Tripsina en medio PBS libre de Ca2+ y Mg2+ y nuevamente cultivada. Nueve
días después 50% de las células mostraron confluencia. Esa línea celular pudo ser mantenida en el
medio de cultivo hasta el pasaje 38 (1:2 respectivamente). Las células mono- y binucleares fueron
consideradas morfológicamente similares a las trofoblásticas. Los mismos autores lograron, poco
después, establecer una línea celular totipotente (BE12-6) bajo las mismas condiciones y con
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Células embrionarias primordiales
175
morfología comparable a la anterior que ha podido mantenerse en cultivo más de 200 pasajes y que
actualmente es considerada inmortal (STRINGFELLOW y col., 1991).
Foto 5: Quimeras en la hilera germinal, producto de la
inyección de células ES D3 (agutí) en blastocistos Balb/c
(albino)
HANDYSIDE y col. (1987) trataron de establecer células ES de ovino. Los autores aislaron masas
celulares internas (MCIs) de embriones de 6 y 8 días de la raza Welsh Mountain a través de
inmunocirugía y las cultivaron intactas o desmenuza-das (3-5 min en 0,25% de Tripsina, 1 mM EDTA
Na2, 1% suero de pollo en PBS libre de Ca2+ y Mg2+) con células fibroblásticas de la línea STO o de la
piel de ovino (TGskin) inactivadas con mitomicina en 60% de medio CMß condicionado con BRL
(microgotas de 20 l bajo parafina, a 37o C, 5% CO2/95% aire). Los autores emplearon en total 60
embriones (16 mórulas o blastocistos tempranos, 30 expandidos y 14 protruidos). Una evaluación
morfológica de los embriones (cortes semifinos, microscopia electrónica) mostró diferencias entre las
células de la MCI adyacentes al blastocele del resto de sus células. En las primeras los autores
observaron estadios tempranos de diferenciación endodérmica en los blastocistos con zonas intactas,
mientras que en los blastocistos protruidos fue posible reconocer un endodermo claramente
diferenciado. Una aislación de la MCI a través de cirugía inmunológica fue más simple de llevar a cabo
en blastocistos expandidos con zona intacta. Después de la adhesión de las células de la MCI
(comprendiendo cerca de 43 células) se produce un aplanamiento de la colonia celular y no un cilindro
oval como en el ratón. La división celular fue reducida en extremo comparada con el ratón. Algunos
grupos de células, semejantes en un inicio a las células ES de ratón fueron cubiertas enteramente por
células de apariencia endodérmica que formaron estructuras quísticas. Después del primer pasaje no se
encontraron colonias semejantes a las células ES presentes. REXROAD (1990) cultivó embriones
ovinos (d 7-9) y MCIs, obtenidas a través de cirugía inmunológica sobre fibroblastos STO o fibroblastos
embrionarios ovinos. A partir de las MCIs se originaron con mayor eficacia colonias primarias que a
partir de embriones intactos, independientemente de la edad de los embriones y del tipo de células
nutrientes que se emplearon.
PIEDRAHITA y col. (1988) llevaron a cabo ensayos orientados a aislar del cerdo células semejantes a
las ES. Los autores cultivaron embriones de 7 a 8 dias (dia 0 = primer día del celo) en DMEM sobre
fibroblastos STO inactivados por medio de rayos x. El medio fue suplementado con 10% SFB, 0,1
mmol/l 2-mercapto-etanol, 2mml/l L-glutamina y antibióticos. Colonias similares morfológicamente a las
colonias ES fueron cambiadas de medio cada 7-10 días. De 118 MCIs 84 sobrevivieron las
manipulaciones y 3 líneas pudieron ser mantenidas hasta el 10o pasaje. Una de las 3 líneas tenía
morfología de las células ES, las otras 2 estaban compuestas de células similares a las ES y epiteliales.
De 25 embriones cultivados se establecieron 8. Se pudieron establecer 2 líneas que sobrevivieron 10
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pasajes. Ambas líneas contenían células trofoblásticas como así también una pequeña parte de células
similares a las ES. STROJEK y col. (1990) evaluaron el efecto de la edad de los embriones y diferentes
medio de cultivo sobre la formación de células ES. Mientras que con embriones de 9 días no se
obtuvieron resultados positivos se desarrollaron 14 colonias a partir de 69 embriones de 10 días de
edad. Estas colonias provenían, según los autores, de la MCI. El cultivo de los embriones y su
adherencia se lograron sobre fibroblastos de útero de cerdo y no sobre fibroblastos STO. Los autores
sospecharon en una interacción química no definida aún como la razón de ese fenómeno. Los pasajes
posteriores pudieron llevarse a cabo, sin embargo, sobre fibroblastos STO. El medio de cultivo más
adecuado fue el DMEM suplementado con 10% de SFB, 10% de suero de cerdo, 0,2 mg/ml de insulina
bovina y 0,1 mM 2-mercaptoetanol. En total se pudieron expandir 7 colonias mediante 3 a 5 pasajes y
las líneas resultantes pudieron ser congeladas.
EVANS y col. (1990) y NOTARIANNI y col (1991) emplearon blastocistos expandidos de la raza Large
British White para producir células embrionarias totipotentes. Fueron cultivados los embriones intactos o
las MCIs después de su aislación mecánica en medio DMEM modificado (+ 10% de suero de ternero +
5% de SFB + 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol + antibióticos) sobre fibroblastos STO inactivados con
mitomicina. Los autores observaron el crecimiento de los embriones y de las MCIs aisladas sobre las
células nutrientes (fibroblastos STO), contrariamente a lo encontado por STROJEK y col. (1990). Al
principio se observó el desarrollo de células epiteloides (grandes, aplanadas, translúcidas), mientras
que después del primer pasaje (7-14 dias después del comienzo del cultivo) se observaron colonias de
dos tipos. El primer grupo, formado por pequeñas colonias, se caracterizó por células grandes
indiferenciadas de las cuales surgían células gigantes similares a las trofoblásticas. Las células del
segundo grupo fueron caracterizadas de acuerdo a los criterios morfológicos (células con un núcleo
translúcido claro, nucléolo visible y poco citoplasma) como células similares a las ES. Estas formaron
grandes colonias. Como criterio bioquímico del estatus indiferenciado de esas células se demostró la
falta del filamento intermediario Vimentin a través de una prueba de fluorescencia. Esas células
pudieron ser mantenidas en cultivo cerca de un año, sin alteraciones morfológicas, con pasajes
semanales. Los ensayos de diferenciación in vitro indicaron diferencias claras con respecto a la
morfología de las cuerpos embrioides en relación con el ratón. Sin embargo las células se diferenciaron
en las 3 capas embrionarias (epitelio, endotelio, células musculares y nerviosas) sobre un substrato
adhesivo. La comprobación de la totipotencia in vivo de las células similares a las ES, a través de la
producción de quimeras, no fue publicada hasta el momento. NOTARIANNI y col. (1990) lograron
establecer, en la especie ovina, una línea similar a la ES empleando las mismas condiciones de cultivo.
PIEDRAHITA y col. (1990a) estudiaron el efecto de diferentes células nutrientes sobre la eficiencia de la
producción de líneas celulares embrionarias de cerdo. En ese experimento se emplearon fibroblastos
STO, células BRL, combinación de esos cultivos (9:1 y 1:1), fibroblastos embrionarios primarios de
cerdo (PEF) y ratón (MEF), PEF en combinación con células BRL, células epiteliales uterinas de cerdo y
células epiteloides aisladas de embriones porcinos. Los fibroblastos STO fueron evaluados en
combinación con medio condicionado con células BRL. La aislación de células epiteloides como
también de líneas celulares similares a la ES se logró exclusivamente sobre células fibroblásticas STO
con y sin medio condicionado con células BRL. Los autores no pudieron mejorar las condiciones de
cultivo establecidas por EVANS y col. (1990). Mientras PIEDRAHITA y col. (1990a) confirmaban la
aparición de diferentes tipos celulares después de la desagregación de MCIs proliferadas y adheridas,
resultaron divergencias en el potencial de diferenciación de las líneas celulares de tipo epitelial y
similares a ES. En las primeras se formaron estructuras en cultivos de suspensión que fueron
consideradas análogas de los cuerpos embrioides de ratón. Las líneas celulares similares a la ES, por
el contrario, no mostraron diferenciación in vitro alguna.
En un estudio posterior PIEDRAHITA y col. (1990b) pudieron comprobar el status indiferenciado de las
células similares a las ES dado que éstas no exprimieron Vimentina ni Citoqueratina 18. El intento de
establecer paralelamente en el mismo trabajo líneas celulares ovinas fue menos exitoso, las células
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Células embrionarias primordiales
177
pudieron mantenerse vivas sólo 3 pasajes como máximo. El estudio de MEINECKE-TILLMAN y
MEINECKE (1991) con el objeto de establecer líneas celulares pluripotentes a partir de embriones
ovinos, caprinos y porcinos comparó diferentes células nutritivas (fibroblastos de hígado, riñón y
testículo fetales de bovino; células granulosas de porcino y bovino; células epiteliales de útero y
oviducto de oveja, cabra y cerda como así también fibroblastos STO). Principalmente con el empleo de
fibroblastos embrionarios de hígado de bovino los autores pudieron establecer líneas embrionarias
totipotentes de las tres especies estudiadas e incluso mantenerlas por varios meses en cultivo. El
trabajo no contiene, sin embargo, información más detallada de la caracterización de esas líneas
celulares. STROJEK y col. (1991) emplearon embriones obtenidos el día 7 in vivo o producidos in vitro
para la producción de células totipotentes. Los autores evaluaron el efecto de diferentes medios (DMEM
y BME/Ham's F 10 (1:1), cada uno suplementado con 5 y 20% de SFB, 10% de suero de ternero
neonato y 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol), células nutrientes (fibroblastos embrionarios primarios de ratón
y células primarias de la granulosa de vaca) y diferentes presiones de oxígeno (5 y 20%) sobre la
protrusión, fijación y diferenciación de los blastocistos. Los mejores resultados de protrusión se
obtuvieron sin células nutrientes en BME/Ham's F 10 con 5% de CO2 en atmósfera de aire a una
temperatura de 39o C. Por otro lado el empleo de células nutrientes tuvo un efecto positivo sobre la
fijación de los blastocistos protruidos. En ese sentido los autores diferencian 2 tipos de fijaciones: el tipo
A caracterizado por un crecimiento radial de las células trofoectodérmicas (fig. 10), el tipo B mostró la
fijación de la MCI con degeneración de las células trofoectodérmicas.
Aunque bajo particulares condiciones de cultivo se produjo una fuerte proliferación de las células
trofoectodérmicas, en ningún caso se observó una proliferación de la MCI. No se observaron diferencias
entre los embriones producidos in vivo o in vitro. La falta de proliferación de las masas celulares
internas de embriones bovinos fue publicada anteriormente por SCHELLANDER y col. (1989), quienes
trabajaron bajo condiciones similares. En un ensayo posterior los autores observaron el efecto positivo
de LIF sobre la proliferación de MCIs de blastocistos bovinos cuando éstos fueron cultivados sin células
nutrientes en medio DMEM modificado. Sin embargo, el intento de establecer líneas celulares no tuvo
éxito (HASSAN-HAUSER y col., 1990).
Foto 6: Blastocisto bovino después de 10 días de cultivo
(tipo de fijación A: células trofoectodérmicas de
crecimiento radial, MCI en posición central)
STRELCHENKO y colaboradores lograron, por otra parte, aislar líneas celulares similares a las ES a
partir de MCI de embriones bovinos (SRELCHENKO y col., 1991; SAITO y col., 1992). Los autores
cultivaron 11 hemi-embriones, resultado de la división de 6 embriones de 7 días obtenidos por medios
no quirúrgicos, en TCM 199 suplementado con 10% de suero de ternero neonato sobre fibroblastos
embrionarios primarios de ratón, inactivados con mitomicina. Tres embriones se fijaron de acuerdo al
tipo A, en los cuales no sólo se observó la proliferación de las células del trofoectodermo sino también
un crecimiento de la MCI. Esta fue disociada con tripsina a los 7 días y colocada sobre células
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nutrientes frescas. Los autores emplearon, a partir de ese momento, medio MEM modificado con 10%
SFB, 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol como también 4,5 g/l de glucosa. Un 30% del volumen de ese medio
fue condicionado sobre células LIF de la línea 5637 en proliferación. Después de 5 días las primeras
colonias similares a las ES fueron visibles. A partir de ellas se pudieron producir 2 líneas que
sobrevivieron 4 pasajes. Una serie tóxica de SFB eliminó las células producidas sin que se pudiese
comprobar su totipotencia in vitro e in vivo. En la tabla 2 se presentan los diferentes medios de cultivo
empleados exitosamente en la producción de líneas celulares similares a las ES a partir de embriones
de animales de interés productivo. Es importante destacar, sin embargo, que los resultados alcanzados
en la especie murina aún no han podido ser alcanzados por las especies domésticas. Como razón de
esa diferencia se discute el diferente desarrollo después de la implantación entre el ratón y los
ungulados. Mientras en el embrión de ratón ocurre una rápida proliferación de la MCI después de la
implantación, el disco embrionario de las especies unguladas se mantiene inicialmente en inactividad
mitótica (NOTARIANNI y col., 1990).
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Células primordiales
179
Tabla 2: Ensayos exitosos para producir líneas celulares similares a la ES de animales domésticos
EVANS Y COL. (1990)
NOTARIANI Y COL.
(1990/1991)
Autor
PIEDRAHITA y col. (1990a,b)
STROJEK Y COL.(1990)
STRECHELKO y col.
(1991)
Especie
Material empleado
Células nutrientes
Porcina, ovina, bovina
Blastocistos y MCIs d 7-9
Fibroblastos STO
Porcina
MCIs de embriones d 7-8
Fibroblastos STO
Porcina
Embriones d 10
Fibroblastos de útero
porcino (FUP)
Medios de cultivo
DMEM
DMEM
DMEM
L-Gln [mmol/l]
-
2
-
Bovina
Embriones divididos d 7
Fibroblastos
embrionarios murinos
(FEM)
TCM 199
(Para el cultivo inicial
MEM-Alfa
(Cultivos posteriores)
-
2-ME [mmol/l]
0,1
0,1
0,1
0,1
Antibiótico
Si
Si
Si
S. i.
Otros agregados
-
Medio cond. BRL
Temperatura [ C]
S. i.
S. i.
0,2 g/l Insulina, Nucleótidos,
aminoáci-dos no esenciales
S. i.
4,5 g/l Glucosa
Medio 5673-condionado
S. i.
CO2 [%]
S. i.
S. i.
S. i.
S. i.
O2 [%]
S. i.
S. i.
S. i.
S. i.
Medio base
S.i.: sin información; L-Gln= L=-Glutamina; 2-ME= 2-Mercaptoetanol; SF = suero de ternero; SFB = suero fetal bovino; SP = suero porcino
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180
Aplicaciones de las células embrionarias totipotentes
Las células ES del ratón se emplean en la actualidad casi en forma de rutina como vectores en la
transferencia de genes para la producción de modelos animales con modificaciones génicas
determinadas. Dado que la integración del gen en las células de los mamíferos se produce al azar, la
tasa de recombinación homóloga/integración al azar es de alrededor de 13-3 (FROHMAN y MARTIN,
1989; MELTON, 1990). Esa frecuencia de recombinaciones homólogas es muy baja para llevar a cabo
la alteración del genoma a través de la microinyección del gen en el pronúcleo. Por esa razón se opta
por el empleo de las células embrionarias totipotentes, a las que se les ha transfeccionado el gen
deseado y se evalúa la integración en el lugar adecuado. En esos ensayos se emplearon, en la mayoría
de los casos, líneas ES con cariotipo masculino (por ejemplo: B. E14TG2a, CCE, D3, CC1.2). Para lo
cual existe una serie de razones (MANSUR, 1990):
- Las líneas celulares masculinas ES parecen ser más estables en cultivo que las femeninas.
- Solamente a partir de células ES masculinas pueden originarse espermatozoides funcionales. Dado
que la descendencia es más numerosa es más fácil detectar quimeras masculinas que femeninas,
respecto a la presencia de células ES en la hilera germinal.
- Cuando células ES masculinas son inyectadas en un blastocisto femenino y las células totipotentes
forman una parte importante del organismo se produce una conversión del sexo. Esto significa que
se produce un macho. En ese caso la hilera germinal es formada en un 100% por células ES.
La electroporación es el método de elección para la transfección de células ES, dado que en
condiciones experimentales óptimas se integra sólo una copia del vector de ADN (THOMAS y
CAPECCHI, 1987). Los vectores deben estar acompañados de un gen marcador, dada la baja
frecuencia de integraciones estables (10-5-10-2), a partir de la cual puedan ser seleccionadas las
células. En la mayoría de los casos se emplea el gen bacteriano de la Neomicina fosfotransferasa
(neo®). El medio de selección contiene G418. Como forma alternativa a la electroporación se empleó la
microinyección de ADN (ZIMMER y GRUSS, 1989). Ese método permite producir un alto porcentaje de
células transformadas estables (10-20%), sin embargo la ejecución es muy complicada. THOMAS y
CAPECCHI (1987) desarrollaron 2 diferentes tipos de vectores, que emplearon para la disrupción del
gen HPRT (fig. 5).
A
B
Neo
9
6
6
9
Neo
7
1
2 3
4 5
6 78
9
1
2 3
reemplazo de
secuencia
2 3
4 5
hprt- G 4 1
6 78
9
hprt
hprt
1
4 5
6 7 Neo
9
inserción de
secuencia
1
2 3
4 5
6 7 8Neo
9
6 78 9
hprt- G 4 1
Fig 5: Vector para un transferencia génica con un objetivo determinado (según CAPECCHI, 1989)
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Células embrionarias primordiales
181
Los denominados genes de inserción tienen una fractura en la doble hélice en el lugar correspondiente
a la secuencia homóloga del gen endógeno. Si se produce cross over en el momento de la
yuxtaposición del gen endógeno, se integrará todo el vector en el gen endógeno y las secuencias de
ambos se presentan en forma doble. Por otra parte existen vectores complementarios, co-lineales a la
secuencia endógena, que contienen una determinada mutación y que reemplazan al gen endógeno a
través de un cross-over doble.
La frecuencia de clones homólogos recombinados puede ser aumentada en genes que ya son
exprimidos en las células ES si se renuncia a las secuencias promotoras tanto en zona homóloga del
vector como también del Gen neo®. Si se produce la recombinación las secuencias en el vector entran
bajo el control del promotor del gen endógeno el gen neo® se exprimirá. De otra forma se logra la
expresión con una integración al azar y gran parte de las células mueren durante la selección con G418
(MASOUR, 1990).
Con genes que no se exprimen en las células ES se emplea otra estrategia conocida como selección
positiva-negativa (SPN). Ese método propuesto por MASOUR y col. (1988) se basa en dos supuestos:
-
la integración al azar de un una estructura génica lineal ocurre al final de la estructura, mientras
la recombinación homóloga tiene lugar dentro de la zona homóloga a través de cross-over.
Estructuras génicas lineales que no contienen al final secuencias homólogas están en
condiciones de recombinarse en forma homóloga eficientemente
Un vector SPN contiene además del gen neo® como secuencia selectiva positiva dentro de la zona
homóloga, un marcador contra el cual se puede seleccionar en forma negativa. Un ejemplo de ello es el
gen de la Timidinquinasa (VHS-tq) del virus Herpes simplex que está ubicado distal a la región
homóloga (fig. 6).
Si se lleva a cabo la recombinación se pierde la zona que incluye el gen VHS-tq. En el caso de una
integración al azar permanece esa región y las células que expresan el gen VHS-tq mueren mediante
selección con Ganciclovir. Con ese método se pudo aumentar los clones recombinantes por el factor 10
hasta 12500 (MASOUR, 1990). Clones positivos se identifican con ayuda de la sonda de ADN
(polimerase-chain reaction, PCR) como así también por medio del análisis Southern-Blot. Luego se
reproducen para ser inyectados a blastocistos y producir quimeras transgénicas.
Si las células embrionarias totipotentes en esos animales colonizan también la hilera germinal se
produce descendencia heterocigota, después del apareamiento con animales no transgénicos. Esta
puede ser empleada para producir animales y líneas transgénicas homocigotas. Cambios fenotípicos en
portadores homocigotas de cambios genéticos inducidos permiten hacer deducciones sobre la función
del gen en estudio y sus productos. Con ese método fueron inactivados y caracteriza-dos interesantes
genes de importancia biológica y evolutiva en el ratón (tabla 3).
Células ES fueron empleadas también para buscar importantes genes o secuencias regulatorias de
ADN, hasta el momento desconocidos, para la diferenciación durante la ontogénesis (GOSSER y col.,
1989; FIEDRICH y SORIANO, 1991). Con ese objetivo se transfeccionaron células ES con
construcciones (estructuras) génicas, las cuales junto a un marcador selectivo positivo (en el mayor de
los casos neo®) contienen el gen de la -galactosidasa bacteriana (lacZ) con una zona promotora
mínima (enhacer trap) o bien sin promotor (promotor trap, fig 13). Los clones que integran esa
estructura génica se emplean en la producción de quimeras. La expresión del gen lac Z puede hacerse
visible por medio del cronogen X-gal, cuyo fraccionamiento provoca una coloración azul. De esta forma
el gen puede ser determinado en diferentes estadios embrionarios. En el caso que se establezca un
modelo de expresión interesante, es posible clonar las zonas responsables a partir del gen lac Z. En las
estructuras del promotor Trap se produce la expresión del gen lac Z sólo si éstas se integran en la zona
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182
de influencia del promotor endógeno y con ello interrumpen el gen endógeno correspondiente. Si se
logran producir quimeras de la hilera germinal con esa línea puede caracterizarse, entonces, el gen
endógeno interrumpido a través de la reproducción y evaluación del fenotipo de los portadores hetero- y
homocigotas, no sólo estructural sino funcionalmente.
neor
Gene targeting
Pint-2-N/TK
HSV-tk
int-2+
neor
Int-2- neor HSV - tk- (G4 1 8r, GANCr )
Integración al azar
neor
neor
HSV-tk
HSV-tk
Int - 2+ neor HSV - tk+ (G4 1 8r, GANCS)
Fig 6: Vector para una
CAPECCHI, 1989)
selección
positiva-negativa
(según
Las aplicaciones descriptas de las células embrionarias totipotentes pueden llevarse a cabo en principio
en las especies animales de interés zootécnico, si se logran establecer líneas celulares funcionales. La
fig 8 describe un modelo de producción de bovinos transgénicos aplicando líneas celulares pluripotentes
(BREM, 1986). Además surge la interesante posibilidad de evaluar la expresión de transgenes
integrados al azar en las células ES o en sus derivados diferenciados para emplear sólo clones
adecuados para producir quimeras transgénicas. Este es el punto decisivo considerando la baja
eficiencia de la producción de individuos transgénicos a través de la microinyección de ADN en el
pronúcleo de los animales de interés productivo frente a los ratones (BREM, 1988). Contrariamente a la
obtención de embriones uni- o bicelulares, los embriones requeridos para obtener células totipotentes
para la transferencia génica pueden ser obtenidos en la especie bovina en forma no quirúrgica. EVANS
y col. (1990) además someten a discusión a las células ES frente a la posibilidad de llevar a cabo
intervenciones complejas en el genoma con el fin de variar características controladas por varios genes.
Tabla 3: Ejemplos de la producción de ratones con cambios genéticos establecidos con el empleo de
células ES como vectores para la transferencia génica
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Células embrionarias primordiales
183
Gen
Linea
celular ES
Donante de
blastocistos
Quimera de la
hilera germinal
Literatura
Hox-1.1
D3
C57Bl/6
Hox-1.5
CC1.2
C57Bl/6
3
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Hox-1.6
D3
C57Bl/6
3
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En-2
D3
CD1
-
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C57Bl/6
-
ZIMMER & GRUSS, 1989
ß2-microglobulina
D3
C57Bl/6
6
ZIJLSTRA y col., 1989/90
N-myc
D3
C57Bl/6
4
STANTON y col., 1990
HPRT
E14TG2a
C57Bl/6JLac x
CBA/CaLac
19
HOOPER y col., 1987
HPRT
CCE
MF1
11
KUEHN y col., 1987
HPRT-
E14TG2a
C57Bl/6/Ola x
CBA/Ca/Ola
1
THOMPSON y col., 1989
HPRT-
ES98-12
C57Bl/6
2
KOLLER y col., 1989
Wnt-1
(int-1)
AB-1
C57Bl/6
19
McMAHON & BRADLEY, 1990
IGF II
CCE.33
CD-1
-
DeCHIARA y col., 1990/91
MF1
3
C57Bl/6
4
MHC
Class II
D3
C57Bl/6
si
COSGROVE y col., 1991
c-abl
CCE
CD-1
0
SCHWARTZBERG y col., 1989/91
MF1
0
C57Bl/6
6
c-abl
CCE
C57Bl/6
1
TYBULEWICZ y col., 1991
IL-2
E14
C57Bl/6
3
SCHORLE y col., 1991
c-src
AB2.1
C57Bl/6
14
SORIANO y col., 1991
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184
Enhancer trap
neo
E
P
neo
gene x
Transcripción
Lac Z protein
neo protein
Translación
Promotor trap
S
P
neo
Integración en el interior del gen x en la
orientación y marco de lectura correctas
ATG
E
P gene x
S
Lac Z fusion protein
P
neo
neo protein
Fig 7: Vectores "Enhacer trap" y "promoter trap" según ROSSANT y JOYNER (1989). Los mismos
contienen como marcador de selección el gen neo y un gen lacz (zona negra) para el
reconocimiento de las regiones inductoras de trascripción con una zona promotora mínima o
reducida
El primer paso es la producción de células pluripotentes. Como donantes de embriones se eligen
madres de toros (MT), apareadas con padres de toros (PT) para alcanzar un nivel genético equivalente
al de los toros de prueba. Las células plirupotentes son transfeccionadas in vitro, la integración y
expresión analizadas y finalmente son empleadas para la producción de quimeras. Las mórulas y
blastocistos receptores se obtienen de las madres de madres apareadas con padres de madres. Los
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185
terneros nacidos son evaluados en su capacidad de transmitir las nuevas cualidades genéticas. La
descendencia de la línea celular son medio hermanos paternos, que poseen la mitad de los genes del
apareamiento programado y heterocigotas con respecto al gen transferido.
ADN clonante
(homólogo-heterólogo)
Plasmidio
BB
KB
Bacteria
transforma
Transferencia de genes
en cultivos celulares
Implantación ectópica
Líneas
celulares (♂)
ADN
clonado
BK
Teratoma
KK
Quimera
Población
Quimera
Medio-hermanos paternos
transgénicos
Fig 8: Modelo para la producción de animales transgénicos a través de la producción de quimeras a
partir de embriones y células de teratocarcinoma (BREM, 1986):
SIMS y FIRST (1993) informaron por primera vez sobre gestaciones producidas con células germinales
totipotentes. De 12 líneas celulares (tabla 4), los autores obtuvieron 10 por medio de cirugía
inmunológica de la masa celular interna de 3 blastocistos producidos in vitro. Se logró establecer 3050% de líneas celulares, no fueron observadas diferencias en la habilidad de las MCIs en establecer
esas líneas. Después del cultivo de los complejos fusionados en medio CRaa+selenio, insulina y
transferrina + 5% de SFB se obtuvieron 109 (24%) blastocistos.
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186
Tabla 4: Blastocistos (d7) producidos con la transferencia nuclear de células germinales totipotentes
(ES)
Días después de la
inmunocirugía
No. de líneas
celulares
Blastocistos/
complejos fusionados
Blastocistos %
0-14
4a,b,c,
26/102
26
15-28
5a,b,c
47/213
22
29-42
2a,b,c
14/55
25
42-56
1*
6/21
29
57-70
1*
8/36
22
71-84
1
4/18
22
99-112
1a
4/15
27
1 dias después de la inmunocirugía a partir de la transferencia nuclear
* de un blastocisto
a,b,c, líneas celulares con (a) transferencia de embriones, (b) preñeces, (c) fetos de 220 dias
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Células embrionarias primordiales
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190
Dovc
LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR, Polimerase Chain Reaction) APLICADA EN
PROGRAMAS DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
P. Dovc
Introducción
En los programas de transferencia de embriones es deseable contar, antes de la transferencia, con
información confiable sobre el genotipo del embrión. Sobre todo sería importante diagnosticar su sexo.
De la misma forma sería interesante obtener información sobre la eventual presencia de
predisposiciones a enfermedades hereditarias y la constitución génica en algunos loci, importantes para
las características de valor productivo.
La reacción en cadena de polimerasa brinda la oportunidad de amplificar específicamente un reducido
número de copias de ADN genómico para fines analíticos. La ejecución de estos tests, aunque sensible
a perturbaciones, es relativamente simple y puede brindar la información deseada al cabo de pocas
horas. Por ello el diagnóstico génico mediante la reacción PCR es un método de elección para los
programas de TE. La historia de la biología molecular muestra que a menudo el desarrollo y la puesta a
punto de nuevas técnicas tienen una marcada influencia sobre el modus procedere para resolver
problemas básicos y aplicativos. De esta forma la reacción de PCR marcó un importante cambio en la
estrategia para resolver problemas en un amplio campo de la biología molecular. La reacción PCR en la
forma actual fue establecida por MULLIS y FALOONA en 1987 y fue intensamente automatizada
mediante la aplicación de modernos instrumentos. Por un lado la reacción PCR puede reemplazar
parcialmente algunos métodos antiguos y complicados (determinación del genotipo de loci individuales).
Por otro lado permite el desarrollo de nuevas estrategias (p.e. "gen linkage", análisis a nivel molecular,
caracterización del genotipo de determinadas células en forma individual). La reacción PCR representa
una eficiente técnica para la replicación de segmentos específicos de ADN in vitro e impulsa el
desarrollo del área de análisis de ADN y ARN.
La idéntica duplicación del material hereditario y su transmisión a la próxima generación es una
característica de todo ser vivo. La reproducción de la masa hereditaria (replicación del ADN) sucede en
forma semi conservadora: en la doble hélice de ADN una es la cadena original, mientras que la otra es
su homólogo sintetizado posteriormente. In vivo la replicación de ADN es un proceso complejo que
requiere la acción coordinada de una gran cantidad de enzimas. En primer lugar las largas moléculas
de ADN genómico deben ser desespiralizadas, estabilizadas en ese estado, replicadas y luego la nueva
cadena doble, recién sintetizada, debe ser transformada nuevamente en la cadena de doble hélice
original. Estos procesos ocurren a una velocidad de unas miles de bases por minuto con una frecuencia
de error de 1x10-9. Las polimerasas de ADN juegan un rol preponderante en la replicación in vivo de
ADN como matriz (template), un final 3'OH de un fragmento corto de una cadena doble de ADN libre
como oligonucleótido iniciador (primer) y nucleótidos trifosfato desoxigenados (dNTPD, N corresponde a
adenosina, citosina, guanidina o timidina) como bases para la cadena complementaria. Normalmente
las polimerasas de ADN necesitan para su actividad, la presencia de iones metálicos como cofactores.
Estos componentes -matriz, oligonucleótido iniciador con final 3'OH libre, dNTPs y polimerasasrepresentan también los elementos para la replicación de ADN in vitro. En la concepción de la reacción
PCR se unieron varios pasos de la síntesis, logrando una amplificación específica de una región
limitada por oligonucleótidos iniciadores (MULLIS y col., 1987).
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Reacción en cadena de polimerasa
191
Principios de la reacción PCR
La idea de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se basa en la repetida síntesis de una región de
ADN que es limitada por dos moléculas iniciadoras. Para la selección y la síntesis del iniciador es
necesario tener por lo menos la información sobre la secuencia en los extremos del ADN que se desean
amplificar. Esto posibilita la ubicación de dos oligoelementos iniciadores complementarios a la cadena
matriz, de tal manera que demarcan la secuencia blanco. La matriz de ADN es desnaturalizada en
primer lugar mediante calentamiento de 94 a 96o C, la reasociación se impide luego por medio de un
enfriamiento rápido. En presencia de iniciadores adecuados, dNTPs y polimerasas de ADN, se logra un
acoplamiento de las moléculas iniciadoras a la parte homóloga de la matriz (primer annealing),
posteriormente la polimerasa puede sintetizar la segunda cadena.
De esta manera se obtienen dos cadenas dobles a partir de una. Estas pueden ser a continuación
utilizadas nuevamente como matriz. Una repetida desnaturalización por medio de calor conduce a la
liberación esta vez de cuatro matrices que pueden ser complementadas a continuación formando cuatro
cadenas dobles de ADN. De esta forma se puede duplicar el número de copias de cada ciclo y después
de n ciclos concentrar una región específica a un valor 2n.
Es necesario destacar que durante la amplificación se forman dos distintas amplificaciones: cortas,
limitadas en ambos extremos por la del iniciador y copias largas que sobrepasan la secuencia homóloga
al iniciador en el final 3'OH. La amplificación de los fragmentos cortos sucede en forma exponencial,
mientras que el incremento de las copias largas se manifiesta en forma lineal. Después de n ciclos el
número de fragmentos cortos aumentó a 2n (n + 1). Una sola molécula puede ser modificada de esta
manera en 20 ciclos por el millonésimo factor (220). La idea ya fue descripta en los años '70 (KLEPPE y
col., 1971). En un comienzo se utilizó una polimerasa de ADN termolábil (fragmento Klenow de la
polimerasa I de E. Coli). Luego de cada desnaturalización fue necesario agregar la polimerasa
nuevamente, lo que complicaba y encarecía el procedimiento. La aplicación de la polimerasa de ADN
termoestable de thermus aquaticus, cuya actividad se mantiene durante un alto número de ciclos,
permite incorporar la polimerasa una sola vez al comienzo de la reacción.
Diferentes pasos de la reacción PCR (desnaturalización, alineamiento del iniciador-primer annealing- y
extensión del iniciador) requieren cambios de temperatura relativamente rápidos. Una solución sencilla
es la instalación de 3 baños María. Uno con temperatura de desnaturalización (94-96o C), el segundo
con la temperatura adecuada para el alineamiento del iniciador a la matriz (primer annealing, 50-70oC)
y el tercero con la temperatura apta para la síntesis (72o C). Dado que es muy trabajoso cambiar
manualmente los tubos de ensayo se recurrió rápidamente a la ayuda de brazos robots. El siguiente
paso fue el desarrollo de los hoy muy comunes termocicladores, capaces de repetir cíclicamente los
cambios de temperatura deseados gracias a microprocesadores. Los programas de estos aparatos
permiten variar sus funciones. Esto significa que es posible prolongar el tiempo de desnaturalización en
el primer ciclo, extender la duración de la fase de síntesis en el ciclo final y enfriar el tubo de ensayo a
4o y hasta 8o C al concluir la reacción. La mayoría de las máquinas pueden ser programadas
libremente siendo posible le elección de temperaturas dentro del margen de 50-96o C. El cambio de
temperatura al calentar o enfriar sucede a una velocidad de 1 a 2oC/min-1. Según el equipamiento
técnico se distinguen termocicladores con un bloque metálico termorregulado para los tubos y otros con
baño fluyente.
Componentes de la reacción
Los componentes de la reacción PCR pueden ser comprados en forma de set completo ("gen-Amp.Kit",
Perkn-Elmer/Cetus). Diversas firmas ofrecen también los componentes en forma separada. El empleo
de un set es recomendable para el principiante y para los laboratorios que tienen dificultades en
conseguir los reactivos de alta calidad. La combinación individual de los componentes para la reacción
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192
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PCR requiere la adquisición de polimerasa ADN, dNTPs, MgCl2, KCl, Tris, detergente no iónico,
gelatina o albúmina de suero de vaca, iniciadores y matriz de ADN.
En la mayoría de los casos se utiliza la polimerasa de ADN termoestable, aislada de la bacteria
termófila thermus aquaticus (polimerasa ADN-Taq). La termoestabilidad y la alta temperatura óptima
hacen que esta enzima sea de elección para múltiples aplicaciones. La misma es ofrecida ya por varias
firmas. Aparte de la polimerasa ADN-Taq hay otras polimerasas termoestables en el mercado (polimerasa ADN-Tth de thermus thermophilus, polimerasa ADN-Bst de Bacillus stereo-thermophilus,
polimerasa ADN-Vent der thermococcus litoralis). La mayoría de las polimerasas de ADN termoestables
tienen una actividad óptima a temperaturas entre 70-78o C y sintetizan la cadena homóloga a una
velocidad de más de 1000 bases por minuto. Para esa actividad óptima se requiere un pH de 8,2 a 9,5
en 10mM de solución tampón Tris. Los nucleótidos trifosfáticos desoxigenados (dNTP) son ofrecidos
liofilizados o en soluciones acuosas de 100 mM. Es conveniente preparar soluciones de 2mM de cada
dNTP y congelarlas en pequeñas porciones (100 a 200 µl). Bajo estas condiciones son estables durante
varias semanas.
Las soluciones tampón son usualmente producidas y almacenadas en forma décupla concentrada. La
composición común es de 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatina, 0,01%
NPO4 y 0,01 Tween 20 (SAIKI y col., 1988). Detergentes no iónicos pueden ser reemplazados por
Tritón x-100 aunque la presencia de un detergente es decisiva para el procesamiento de la enzima. Se
debe recordar que altas concentraciones de dNTPs forman complejos MgCl2, lo que reduce la
disponibilidad del mismo. Por ello es necesario aumentar la concentración de MgCl2 en dicho caso.
Los oligonucleótidos iniciadores sintéticos con 18 a 30 nucleótidos mostraron ser adecuados para la
amplia gama de aplicaciones. Iniciadores cortos de 18 nucleótidos son suficientes para la
ampificaciones de matriz-ADN poco complejas (p.e. plasmidios). Los iniciadores universales con lectura
hacia adelante y atrás (Forward y Reverse-Primer) son adecuados para la amplificación de sectores
clonados. A menudo la calidad y pureza de los iniciadores sintéticos es satisfactoria y pueden ser
utilizados sin purificación accesoria. En caso contrario se ofrece la purificación HPLC en una columna
cromatográfica o la limpieza a través de poliacrilamida. Al diseñar un iniciador se debe tener en cuenta
que los iniciadores tengan semejante cantidad de guanidina y citosina, que no formen estructuras
secundarias estables y que tengan poca homología entre sí. Sobre todo es importante que no exista
homología en la región 3'- entre los iniciadores. Ya se ofrecen a la venta programas de computación
que facilitan decisivamente la selección de los iniciadores.
Como matriz (template) puede ser utilizado ADN del más variado origen. Para una amplificación exitosa
es de decisiva importancia que la preparación del ADN no contenga impurezas que puedan interferir la
misma negativamente. Sobre todo la presencia de fenol, detergentes y EDTA tiene un efecto
perturbador. Dado que el largo de las amplificaciones excede en raros casos 1-2 Kb, el ADN-matriz no
requiere tener alto peso molecular. Sectores cortos pueden ser amplificados exitosa-mente aún a partir
de matrices ADN degradadas como por ejemplo en material arqueológico (PÄÄBO y col., 1988). Para la
amplificación es importante una buena desnaturalización de la matriz-ADN. Se recomienda una
desnaturalización de por lo menos 5 min antes de la aplicación de la enzima.
Las condiciones de reacción dependen sobre todo de la temperatura de fusión del iniciador
(temperatura de alineamiento, "annealing temperature") y del largo de la amplificación (tiempo de
síntesis). Es necesario establecer experimentalmente el tiempo de reacción óptima para cada par de
iniciadores. El volumen de reacción varía de 25 a 100µl dependiendo de la cantidad de amplificaciones
que se requiere para los estudios posteriores. Por razones económicas es propicio reducir al mínimo el
volumen de reacción en análisis de rutina. La concentración del iniciador oscila entre 25 y 100 pmol.
Para la mayoría de las amplificaciones son suficientes 25 a 30 ciclos de amplificación. Se requieren más
ciclos si la matriz-ADN que se quiere copiar se presenta en un reducido número de muestras (p. e. ADN
de células aisladas).
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Reacción en cadena de polimerasa
193
Análisis de los productos de la reacción PCR
La concentración específica de la secuencia entre los iniciadores permite amplificar una cantidad
suficiente de ADN para un análisis electroforético a partir de un grupo pequeño de copias de la matrizADN. En la mayoría de los casos es posible separar las amplificaciones en gel de agarosa de 0,8 a
2,0% y observarlas bajo luz ultravioleta después de una coloración con etidio bromado (Ethidium
Bromid). Si se trabaja con fragmentos muy cortos, que deben ser divididos con enzimas de restricción
después de la amplificación (fragmentos más cortos que 50 pB), algunas veces es necesario utilizar
geles de poliacrilamida (PAA) para alcanzar una separación suficiente. Para los geles PAA se puede
utilizar la coloración con etidio bromado o la coloración con plata. Esta última, a pesar de ser más
complicada, es más apropiada para fragmentos muy cortos y cantidades pequeñas de ADN debido a su
sensibilidad.
Particularmente exigente es la separación electroforética de las amplificaciones de las llamadas
regiones "microsatélites". Microsatélites son regiones repetidas en el genoma que se componen de
muchas copias de una secuencia corta (por lo general son dinucleótidos). Estas regiones se diferencian
a menudo en el largo solamente por dos nucleótidos. Para el análisis de dichas amplificaciones es
importante un sistema electroforético de alto poder resolutivo. En estos casos se utilizan productos de la
reacción PCR marcados radioactivamante o de otra manera. Estos son separados sobre geles finos
PAA (estos geles se utilizan también para determinar la secuencia del ADN).
Para detectar mutaciones puntuales se aprovecha la distinta forma de fusión de las amplificaciones que
surgen a partir de las mutaciones. Para ese fin se preparan geles con gradientes lineares del
desnaturalizante ("Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DGGE, MYERS y col., 1987). En la
migración a través del gradiente las moléculas de ADN se desnaturalizan en forma paulatina en función
del número de dominios de fusión (región topográfica de la hélice de ADN). Esto determina el diferente
modo de fluir. En este sistema no es necesario buscar lugares de restricción polimorfos para la
separación específica del alelo. Una sola mutación puntual altera la temperatura de fusión de un
dominio determinado (25 a varios cientos de nucleótidos) hasta 1,5o C. La migración de los fragmentos
parcialmente desnaturalizados en el DGGE es más lenta que el flujo de los fragmentos
correspondientes no desnaturalizados.
La separación electroforética de los fragmentos de cadenas simples en geles-PAA nativos brinda un
método alternativo para la detección de mutaciones puntuales en amplificaciones obtenidas mediante la
reacción PCR. Las amplificaciones desnaturalizadas con anticipación forman estructuras secundarias
en el gel PAA nativo dependientes de la secuencia. Las diferentes mutaciones puntuales influyen de
manera difícilmente pronosticable sobre las estructuras secundarias de los fragmentos. No obstante lo
hacen de forma tan marcada que es posible identificar mutantes que difieren por una mutación puntual
debido a la diferente movilidad entre dos amplificaciones.
Reacción PCR múltiple (PCR Multiplex)
Junto con la amplificación específica de una región flanqueada por un par de iniciadores que
pertenecen a una matriz compleja, la elección de otros pares de iniciadores posibilita la amplificación de
varios fragmentos específicos de ADN en una sola reacción PCR. Para ello se deben cumplir algunas
condiciones: cada par de iniciadores debe responder a la exigencia general para los iniciadores
descripta en el punto "componentes para la reacción", no debe existir alta homología entre los
iniciadores de una reacción y finalmente todos deben tener similar temperatura de fusión (Tm).
Reacciones PCR múltiples son reacciones concebidas con el fin de estudiar simultáneamente varias
localizaciones (loci) del genotipo (p.e. diagnóstico génico de enfermedades hereditarias con un amplio
espectro de diferentes mutaciones, exámenes de identidad, etc.). A veces se utiliza la reacción PCR
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múltiple como reacción interna de control para comprobar la región haploide existente en el genoma
(región específica para el cromosoma Y, PEURA y col., 1991). La importancia de la reacción PCR
múltiple como reacción de control es cuestionable sobre todo en los casos en los cuales se amplifican
muy pocas matrices y especialmente se supone que las amplificaciones en las diferentes localizaciones
son sucesos independientes.
Tipificación del genotipo de espermatozoides (Single Sperm Typing)
La construcción de mapas génicos exigió hasta el momento el apareamiento selectivo, el estudio de la
descendencia o la determinación de las combinaciones génicas en base a los datos obtenidos por el
estudio del pedigree. La primera posibilidad fue aprovechada a menudo para animales. Para el estudio
del genotipo humano sólo es considerada la segunda estrategia. La introducción de los marcadores
RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) posibilitó dividir el genoma humano en sectores mas o
menos regulares de 10 cM. El análisis del pedigree permite determinar las distancias génicas en
sectores de 1 cM (en el hombre cerca de 100 kb) en forma estadísticamente asegurada. Para la
estimación de distancias más cortas el número de datos requeridos sería demasiado grande por lo que
este método parece ser inadecuado para estos objetivos. A partir de la introducción de la reacción PCR
es posible amplificar el ADN de una célula en lugares específicos en forma tan abundante que las
ampliaciones obtenidas son suficientes para fines analíticos. Durante la meiosis el ADN de las gametas
puede ser afectado por crossing-over lo que genera nuevas recombinaciones además de las de origen
materno y paterno. La frecuencia de éstas es un índice para la posibilidad de un crossing-over y la
distancia entre loci investigados. Para estos estudios se adecuan individuos que son heterocigotas en
ambas localizaciones examinadas. La amplificación simultánea de ambas regiones obtenidas de
espermatozoides individuales y la posterior determinación del alelo para ambos loci permite identificar la
variante de los padres como así también la recombinante (LI y col., 1988). En los ciclos iniciales se lleva
a cabo una amplificación simultánea de ambos loci con dos pares de iniciadores (reacción PCR
múltiple), luego se dividen los componentes para amplificar cada región separadamente. La detección
de las variantes del alelo se lleva a cabo mediante la hibridación de las amplificaciones con
aligonucleótidos específicos para el alelo marcado radiactivamente (OEA) o no. Los resultados de la
tipificación de espermatozoides individuales demuestran que en 20% de los mismos no se produce
amplificación. Para obtener resultados confiables estadísticamente se requiere evaluar una cantidad
abundante de espermatozoides. A pesar que el trabajo con las células espermáticas individuales es
relativamente complicado, este método es de gran valor para la obtención de cartas génicas, porque
brinda resultados rápidos independientes del intervalo generacional.
Determinación del sexo
El sexado confiable de los embriones en estadios preimplantatorios es un problema actual en
programas de TE. Existieron diferentes intentos para determinar el sexo: métodos inmunológicos o
citogenéticos y otros mediante técnicas de ADN. Cabe destacar que se probó intensamente como
alternativa de clasificar los espermatozoides antes de la fertilización. Los métodos que se fundaban en
el diferente peso específico de los cromosomas X e Y demostraron no ser adecuados por la alta
variabilidad del contenido citoplasmático. Igualmente el intento de seleccionar los espermatozoides X e
Y según su motilidad en función del pH produjo resultados insatisfactorios. La detección inmunológica
depende del reconocimiento específico del antigen HY propio del sexo masculino (BOOMAN, 1989).
Este método dio resultados no confiables y mostró ser inadecuado para la aplicación práctica. La
representación citogénica de los cromosomas sexuales es relativamente exigente y requiere para la
determinación confiable del sexo un número alto de blastómeros. El problema principal de la
determinación del sexo mediante sondas específicas para el ADN del cromosoma Y es el largo
procesamiento y la baja sensibilidad de los sistemas de hibridación.
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Reacción en cadena de polimerasa
195
También en este campo de diagnóstico del sexo la aplicación de la reacción PCR promovió una nueva
estrategia en la búsqueda de una solución. En principio una sola copia del ADN-matriz es suficiente
para amplificar una región. Como fue mencionado al tratar la amplificación del ADN de los
espermatozoides, en algunos casos, el ADN de una célula no es suficiente para una amplificación
exitosa. Por ello, para diagnosticar el sexo es conveniente disponer de 2 a 3 blastómeros para
amplificar el ADN. Luego de aislar los blastómeros por medio de microcirugía, las células deben ser
lisadas con el propósito de liberar el ADN genómico para su posterior amplificación. Para la
amplificación de las secuencias del sexo se dispone de diferentes pares de iniciadores (p.e. BRY4a,
REED y col., 1989). A menudo se eligen secuencias repetidas de los cromosomas sexuales para la
amplificación. De esta forma se dispone desde un principio de un número mayor de copias, facilitando
notablemente la obtención de la cantidad necesaria de amplificaciones para el análisis. En
consecuencia se necesitan menos ciclos de amplificación (20 a 25), obteniéndose resultados más
rápidos. Al amplificar secuencias específicas del cromosoma Y se obtienen amplificaciones sólo en
embriones masculinos (HERR y col., 1990a, b). Para excluir errores durante la reacción es conveniente
amplificar una región autosomal (GROBET y col., 1992). Esto hace necesario una reacción PCR
múltiple con 2 pares de iniciadores por lo menos. La cuestionable relevancia del control de la reacción
fue mencionada anteriormente. Una posibilidad alternativa para la amplificación de las secuencias
específicas del sexo es la amplificación de las secuencias presentes tanto en el cromosoma X como en
el Y. Estas secuencias, sin embargo, se diferencian por medio de mutaciones propias del tipo de
cromosoma. Un ejemplo para dichas secuencias son los genes ZFX y ZFY (Zinc, MARDON y PAGE,
1989). Se trata de genes con una sola copia (Single Copy Gene) que existen tanto en el cromosoma Y
como en el X. Ambos se diferencian, sin embargo, en un corto fragmento de la secuencia. Uno tiene un
lugar de corte para la endonucleasa, el otro no. Esto conduce a un polimorfismo del largo de los
fragmentos después de la restricción de las amplificaciones (REEP) con dicha enzima. Los iniciadores
para las amplificaciones específicas de los genes ZFX y ZFY son aptos para un amplio espectro de
especies. Ambos iniciadores son 25-meros, el iniciador 5-'P1-5EZ tiene la secuencia:
5'ATAATCACATGGAGAGCCACAACT-3.
El iniciador 3'- tiene la secuencia: 5'GCATTTCTTTTGGTTATCTGACAAAGT-3'
Los RFLPs de las ampliaciones fueron observados en las especies humana, bovina, ovina y caprina
(AASEN y MEDRANO, 1990). La tabla 1 presenta los RFLPs observados en las esas especies.
Tabla 1: Largo de los fragmentos y enzimas de restricción para la demostración del RFLP de los genes
ZFX (445pb) y ZFY (447 pb)
Especie
Enzima
Largo de fragmento (pb)
ZFX
ZFY
Humana
HaeIII
400+45
317+84+46
Bovina
PstI
445
344+103
Ovina
SacI
272+173
447
Caprina
SacI
272+173
447
Las amplificaciones tratadas con la correspondiente enzima de restricción o las amplificaciones
específicas del cromosoma Y con sus correspondientes pruebas de control son separadas en gel de
agarosa y coloreadas con bromuro de etidio.
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196
Foto 1: Amplificación de la secuencia específica repetida del cromosoma Y y
RFLP de las amplificaciones específicas de los cromosomas X e Y.
Las columnas 1 y 8: 100 pb marcador, columna 2: amplificación del
ADN femenino con un iniciador específico del cromosoma Y. Columna
4 y 5: amplificación de los ADN masculino y femenino con iniciador
P1-5EZ/P2-3EZ. Columna 6 y 7: división enzimática de los
amplificadores de los ADN masculinos y femeninos con los
iniciadores P1-5EZ/P2-3EZ
Caracterización del genotipo
Las características cuantitativas son de importancia para la zootecnia práctica. Estas son determinadas
en forma poligénica y hasta el momento poco accesibles a los análisis de genética molecular. Pero hay
algunos ejemplos que ilustran la importancia de algunos genes individuales para la producción animal.
Las proteínas de la leche representan una familia de genes sumamente polimorfa. Las distintas
variantes se distinguen en mutaciones puntuales y pequeñas pérdidas en el genoma. Existe especial
interés en caracterizar la caseina y la lactoglobulina ß. Ambas enzimas tienen influencia sobre las
cualidades de la leche (GRAML y col., 1987). Con la elección de iniciadores adecuados se pueden
amplificar regiones polimorfas e identificar mutaciones puntuales mediante el RFLP. La principal ventaja
de este método es la independencia de la expresión génica (el sistema es aplicable también en
animales machos) y su rapidez (LIN y col., 1992).
Control de la descendencia
Para el control de la descendencia se aplican comúnmente secuencias altamente polimorfas y repetidas
las cuales forman, en combinación con diferentes sondas, un sistema de alto poder de resolución. Con
éste se pueden hacer afirmaciones estadísticamente seguras sobre la descendencia. Frecuentemente
se utilizan regiones microsatélites (denominadas también VNTR, variable number of tandem repeat).
Algunos alelos se distinguen en el largo de las repeticiones tándem (tandem repeat). Después de la
amplificación con iniciadores que flanquean estas regiones se puede, luego de separar las
amplificaciones en gel secuencial, identificar los polimorfismos. Con la combinación de varios loci
aumenta el poder resolutivo de este método (GEORGES y col., 1991). Con fines forenses se emplean
regiones con repeticiones de Tri- o Tetranucleótidos junto con los VNTRs. Para la aclaración de la
descendencia materna se dispone del análisis de la secuencia de la región hipervariable (D-loop). En
las especies mamíferas el ADNmt es de herencia materna y está presente en numerosas copias por
célula.
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Reacción en cadena de polimerasa
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Diagnóstico de enfermedades hereditarias
Las enfermedades hereditarias dependientes de un solo gen, con mutaciones bien definidas y que
causan el desarrollo de los síntomas clínicos, son apropiadas para el diagnóstico por medio de la
reacción PCR. El método se basa en la ampliación de la región que puede estar afectada por la
mutación. En principio puede tratarse de mutaciones puntuales o pérdidas (deletions) en el genoma.
Para el diagnóstico se disponen básicamente de 3 alternativas: hibridación de las amplificaciones con
oligonucleótidos específicos para el alelo (OEA), análisis de restricción de las amplificaciones y
determinación directa de la secuencia de la región amplificada.
Con el surtido de endonucleasas disponibles actualmente en el mercado, es posible encontrar para casi
todas las secuencias una enzima apropiada. Para la determinación directa de la secuencia de los
productos de la reacción PCR se ofrecen varias alternativas. Una posibilidad es la concepción de una
reacción PCR en la cual solo en los primeros ciclos ambas cadenas son sintetizadas. A continuación
predomina la síntesis de una cadena. El incremento del producto de la reacción PCR es lineal en lugar
de exponencial). Finalmente el producto es una cadena simple de ADN, la cual puede ser utilizada
directamente como matriz para la secuencia a determinar. Otra posibilidad es la determinación directa
de la secuencia del producto de cadena doble de la reacción PCR. Esto, sin embargo, parece ser difícil
sobre todo con amplificaciones cortas. Una última posibilidad la presenta, por supuesto, el clonado de
las amplificaciones y el posterior análisis de los clones recombinantes.
Un ejemplo para el análisis de restricción de las amplificaciones es la detección de la anemia falciforme
del hombre (SAIKI y col., 1985). Para ese fin se amplifica una región con un largo de 725 pb del gen de
la -globulina y luego se divide la amplificación mediante la enzima CvnI. Con ello se obtienen dos
fragmentos constantes (256 y 88 pb) y un fragmento de 381 pb de largo. Este puede ser dividido en dos
subfragmentos (201 y 180 pb) si proviene de un individuo sano. En cambio en individuos con anemia
falciforme una mutación puntual causa la pérdida del lugar de reconocimiento para la enzima
(KAZAZZIAN, 1989). La identificación directa de la mutación es posible después del análisis
electroforético de las ampliaciones tratadas enzimaticamente.
La citrulinemia es una enfermedad hereditaria del bovino provocada por una mutación puntual en el gen
de la enzima argininasuccinato sintetasa. En los animales que padecen esta enfermedad, el codón 86,
que normalmente codifica para arginina, se transforma en un codón stop. La consecuencia es un
producto génico corto en el locus que impide el normal desenvolvimiento del ciclo metabólico de la urea
provocando un aumento de la concentración de citrulina con alteraciones patológicas. La mutación
modifica también el lugar de reconocimiento de la endonucleasa AvaII, presente en animales sanos, de
forma tal que en los animales con esa deficiencia genética el lugar con AvaII no se puede separar. Con
la elección de una iniciador adecuado es posible amplificar una fragmento de 176 pb de largo, que
produce dos fragmentos (98 bp + 78 pb) cuando los animales sanos son tratados con AvaII. En los
animales enfermos falta el lugar de reconocimiento para AvaII (FÖRSTER, 1991).
Diagnósticos de rutina para la talasemia- se basan en la hibridación específica del ADN amplificado con
oligonucleótidos específicos para el alelo en combinación con el análisis de restricción.
Aproximadamente la mitad de los más de 60 mutantes de la talasemia son identificables mediante el
análisis de restricción. Las mutantes restantes son diagnosticables mediante el análisis de restricción. El
resto de las mutantes es diagnosticable por medio de la hibridación Dot-blot con oligonucleótidos
específicos para el alelo. La precisión del lavado debe ser establecida de tal manera que la diferencia
entre las fuerzas de la señal de hibridación entre homocigotas y heterocigotas sea detectable con
claridad. La secuenciación de las regiones amplificadas cobra particular importancia en la identificación
de nuevas mutantes (WONG y col., 1987).
Defectos ocasionados por pérdidas pequeñas pueden ser diagnosticados mediante la selección de
iniciadores apropiados para ambos lados del lugar presumible de la pérdida. Un ejemplo de ello es el
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198
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diagnóstico de la distrofia muscular Duchenne. En una reacción PCR se emplean 18 iniciadores, que
limitan 9 regiones más comúnmente afectadas por pérdidas del gen distrofin. La falta de las
amplificaciones de la región determinada indica la mutación. En general este método es limitado por el
largo de la amplificación en individuos sin pérdidas, dado que la amplificación de regiones que superan
2 kB es problemática y poco adecuada para el diagnóstico de rutina.
Comprobación del transgen
Como ocurrió en otras áreas de la genética molecular, la reacción PCR encontró rápidamente su
aplicación en el diagnóstico de transgénesis. En la concepción del sistema de comprobación se hace
uso, sobre todo, de las particularidades de la secuencia transferida. Se intenta amplificar los fragmentos
del transgen no presentes en el ADN genómico endógeno o aquellos diferentes de la secuencia
endógena (p.e. mutaciones puntuales que modifican las secuencias de reconocimiento para las
endonucleasas, pérdidas, inserciones, etc.). En algunos casos el transgen se diferencia de la secuencia
endógena por la falta de secuencias vectores o por las regiones promotoras. En ambos casos la
presencia de elementos heterólogos puede ser utilizada para el diseño de iniciadores. Mediante la
evaluación cuantitativa de la reacción PCR se puede deducir el número de copias del transgen. Con ese
fin se lleva a cabo a menudo una co-amplificación en un locus endógeno para estimar la cantidad de la
amplificación del transgen en función de la producción estandarizada de amplificaciones del locus de
referencia. De singular importancia es la evaluación de la reacción PCR en la fase logarítmica dado que
las diferencias causadas por la distinta cantidad original de ADN matriz son evidentes sobre todo en ese
momento. El mejoramiento de la cuantificación significa una marcación estandarizada, covalente de las
amplificaciones (iniciadores marcados en forma fluorescente).
Diagnóstico de enfermedades infecciosas
La reacción de PCR se ofrece como método diagnóstico para detectar infecciones, sobre todo las
subclínicas porque su sensibilidad permite la detección de cantidades mínimas de ADN (teóricamente
una sola copia de la molécula matriz es suficiente). Es posible comprobar secuencias integradas en el
genoma (p.e. infecciones retrovirales) como también la presencia de secuencias episomales y
extracelulares propias de las infecciones.
La reacción de PCR facilitó un progreso importante en la investigación HIV. Se posibilitó el diagnóstico
de secuencias provirales HIV-I de las células mononucleares de la sangre periférica, obtenida de
pacientes sero-positivos; a pesar que no fue posible confirmar la infección a través del cultivo del virus
(OU y col., 1988). De especial importancia es la aplicación de la PCR en el diagnóstico de infecciones
subclínicas provocadas por agentes difícilmente cultivables in vitro. La elección del iniciador específico
de especie garantiza la identificación del agente infeccioso. El polimorfismo en las regiones específicas
de especie permite la identificación de las distintos tipos (DOVC y col., 1992). De esta forma se dispone,
en el estudio etiológico de las infecciones, de un método eficaz que puede aclarar también los
interrogantes forenses.
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Reacción en cadena de polimerasa
199
Apéndice
Protocolo de laboratorio para la amplificación de la región ZFX y ZFY de blastómeros.
1.
2.
3.
4.
5.
Los blastómeros obtenidos por medio de microcirugía son suspendidos en 5µl de medio y
transferidos a un tubo de ensayo Eppendorf. Se añaden 20 µl de agua bidestilada a fin de alcanzar
un volumen final de 25µl.
Posteriormente los blastómeros (3-5) son congelados cíclicamente 10 veces en hielo seco y
descongelados a 96o C en un termociclador. En el último ciclo el tratamiento térmico es prolongado
a 10 minutos. Luego las pruebas son mantenidas en hielo.
Para la reacción PCR se prepara la siguiente solución "Master-mix" (expresada en µl):
H2O
8,5
10 x buffer
5,0
dNTPs
5,0
Iniciador
3,0 + 3,0
Polimerasa Taq
0,5
25µl de Master-mix son incorporados a la solución con los blastómeros lisados. Todo se cubre con
60µl de parafina.
La reacción de PCR se lleva a cabo en el termociclador:
1 min: 94o C
1 min: 60o C
1 min: 72o C
25 ciclos
En el primer ciclo se prolonga el primer paso a 5 min y en el último ciclo el último paso a 4 min.
6.
7.
Después de 25 ciclos se añade 0,5 ml de polimerasa Taq, posteriormente se sigue con otros 25
ciclos.
Después de 50 ciclos se produce la división enzimática de las amplificaciones. Luego la
electroforesis en gel.
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201
ASPECTOS SANITARIOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
R. Alberio
Introducción
El embrión como transmisor de enfermedades
En el intercambio internacional de genotipos, actualmente es posible afirmar que el semen es una forma
más segura desde el punto de vista sanitario para llevarlo a cabo que el animal vivo. Como se verá a
continuación, la transmisión potencial de enfermedades por medio del embrión es inferior a la del animal
vivo y a la del semen. Por otro parte, el embrión constituye un genotipo por sí mismo lo cual representa
otra ventaja (genética) con respecto al semen que sólo representa una parte del genotipo deseado.
La transmisión de enfermedades por el embrión puede deberse a agentes patógenos presentes en el
embrión o en el líquido en que es vehiculizado. Teniendo en cuenta ambas posibilidades, existen 6 tipos
de riesgo de contaminación vía embrionaria (THIBIER, 1990).
1) En primer lugar se debe tener presente la posibilidad de la contaminación intracelular. Si bien este es
un riesgo potencial para ambas gametas (ovocito o espermatozoide) y algunos ejemplos han sido
puestos en evidencia en el ratón (JAENISCH y BERNS, 1977 y MIMMS, 1966), ninguna evidencia ha
sido hasta el presente demostrada en los animales domésticos de granja.
2) La penetración de un agente patógeno en el embrión puede ocurrir tanto en el momento de la
fecundación como por acción propia del agente. En el primer caso se ha observado que al menos en
dos enfermedades a virus (lengua azul y BHV-1) los espermatozoides presentaban adheridos al agente
cuando se obtuvieron de toros infectados (FOSTER y col., 1980; ELHAZHARY y col., 1980). Estos
tendrían capacidad infectante en caso de fecundar. Sin embargo, las precauciones descriptas
previamente para la aceptación de un toro dador, hacen esto poco menos que imposible. Para el
segundo caso, son sólo excepciones descriptas en el ratón (GWATKIN, 1967) en que se ha mostrado
capacidad de atravesar la membrana pelúcida. Hasta el momento no ha sido descrito ningún agente
infeccioso capaz de atravesar la membrana pelúcida en los animales domésticos.
3) Un riesgo de tercer nivel es el de la presencia de agentes patógenos en el ambiente uterino. Si bien
en condiciones naturales es prácticamente imposible una fecundación o el desarrollo normal de un
embrión temprano en presencia de agentes patógenos en trompas o útero, algunos de estos agentes
han sido encontrados en trabajos experimentales con virus de la IBR/IPV o de la FA (SINGH y col.,
1983; McVICAR y col., 1986). En el mismo sentido se sabe que algunos virus, en algunas especies,
pueden estar protegidos y/o adheridos a la superficie de la membrana pelúcida sin que se puedan
eliminar por el lavado, como es el caso del virus IBR/IPV (SINGH y col., 1982).
4) Riesgo de contacto con agentes patógenos en el momento de la recolección, debido a infecciones
del tracto genital externo o a maniobras inapropiadas durante el lavaje.
5) Riesgo de contaminación durante las manipulaciones in vitro. Además de las manipulaciones
corrientes (búsqueda, evaluación, lavado, acondicionamiento) debe recordarse que también pueden
llevarse a cabo otras que implican una ruptura de la membrana pelúcida (congelación, bisección,
biopsiado para sexaje). Estas últimas deberán llevarse a cabo en medios controlados y esterilizados
previamente.
6) Existe por último el riesgo de trasmitir agentes patógenos en el momento o en las maniobras
destinadas a su transferencia. Medidas elementales de manejo en esta maniobra hacen de este riesgo
uno de los más improbables.
Los riesgos de la transmisión de agentes patógenos
Los embriones bovinos son transferidos entre los días 6-8 de desarrollo. Este corto período de vida
intrauterina reduce sensiblemente las posibilidades de que los embriones puedan ser contaminados,
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tanto más por el hecho que sólo estarán expuestos a aquellos agentes liberados al tracto reproductivo.
El período de recolección mencionado garantiza la existencia de la membrana pelúcida que como se
dijo antes, es impermeable a la mayoría de los agentes infecciosos. Los parásitos, bacterias y hongos
son fácilmente descartados en su capacidad de penetrar, por su gran tamaño. Sólo los virus podrían
cuestionarse aunque no se han determinado penetraciones virales en el bovino.
En el caso eventual de agentes patógenos en el tracto genital, el hecho de utilizar grandes volúmenes
de medio para la recolección de los embriones provoca automáticamente una gran dilución de dicho
agente. El lavado del embrión así como el agregado de enzimas y/o antibióticos, reducen la posible
presencia de agentes patógenos. Por último, la congelación misma ha demostrado ser eficaz en la
inactivación de muchos virus que se pueden adherir al embrión (SINGH, 1987). Numerosas
investigaciones dejaron en claro, en los últimos años, los pocas posibilidades de transmitir agentes
patógenos por vía del embrión correctamente tratado
Agentes patógenos a considerar
En principio, todos los tipos de microorganismos deben ser tenidos en cuenta. Sin embargo,
prácticamente, sólo los virus pueden constituirse en agentes de verdadero peligro, debido a sus
características biológicas. Las bacterias y otros microorganismos representan un riesgo de segundo
orden. Alrededor de unos 50 agentes han sido o son investigados para determinar los riesgos que su
transmisión podría tener a través del embrión. En este estudio, realizado recientemente por el
Subcomité de Investigación de la IETS, se concluyó también que no es posible hacer extrapolaciones
entre especies para un mismo agente ni entre agentes dentro de la misma especie. Una de las razones
principales es la característica específica de la membrana pelúcida (CHEN SHI SONG y WRATHALL,
1989) que la haría reaccionar de forma diferente ante un mismo agente patógeno. En una reciente
revisión sobre el tema realizada por SINGH (1988) se presentan resultados concernientes a embriones
obtenidos de animales seropositivos o infectados con diferentes bacterias y virus y su efecto o
determinación tanto sobre los embriones (Cuadro 1) como sobre las receptoras o los productos nacidos
de la transferencia.
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203
Cuadro 1: Determinación de presencia de agentes patógenos sobre embriones de vacas seropositivas
o infectadas (SINGH, 1988)
No de ovocitos
y embriones
colectados
60 (26)
Agentes
sobre el
embrión
-
BVDV sero+
2 (21)
-
SINGH y col. 1982
BTV infectada
51 (14)
-
BOWEN y col. 1983
FMDV infectada
302 (21)
-
McVICAR y col., 1987
Estado de la
donante
BLV sero+
Referencias
BOULLANT y col. 1981
MEBUS Y Col., 1987
IBR sero+
13 (18)
-
SINGH y col., 1982
IBR infectada
63*
Peste bovina
infecciosa
B. Abortus
infecciosa
C. psitaci inf.
107
-
MEBUS y col., 1987
160
-
VOEKEL y col., 1978
5
-
BOWEN y col., 1978
7
-
JORGENSEN y RASBACH (no
publicado)
M. paratub. inf.
* tratados con tripsina
Abreviaturas ver glosario al final del capítulo
En ningún caso fue detectada su presencia en el embrión, seroconvertibilidad o enfermedad en
receptoras o terneros nacidos (Cuadro 2).
Cuadro 2: Transferencia de embriones provenientes de donantes sero-positivas o infectadas (SINGH,
1988)
Estado de la
donante
No de
embriones
transferidos
Serologia de
donantes o
hijos
Referencias
BLV sero+
596
-
EAGLESOME y col., 1982
BTV sero+
1500
-
THIBIER y NIBART, 1987
334
-
THOMAS y col., 1983
IBR sero+
64*
1500
-
SINGH y col., 1987
THIBIER y NIBART, 1987
B. Abortus
sero+
39
-
del CAMPO y col., 1987
BTV infectada
IBR infectada
*tratadas con Tripsina
Abreviaturas, ver Glosario al final del capítulo.
En todos los casos señalados se utilizaron o estudiaron embriones después de sucesivos lavados tal
como se describirá mas adelante. Tales lavados no garantizan "la limpieza" de la totalidad de los
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204
agentes como fuera demostrado en el caso de embriones expuestos a IBR y a VSV (SINGH, 1987). La
adherencia de los virus a la membrana pelúcida no pudo ser anulada por los simples lavados y fue
necesaria una corta exposición a la tripsina para eliminarlos (Cuadro 3).
Cuadro 3: Efecto de la tripsina sobre la adherencia de virus de IBR y VS en embriones previamente
expuestos a ellos (SINGH, 1987)
No de embriones
expuestos
% de embriones
con virus
IBR
80
70
SINGH y col., 1982
VS
96
30
SINGH y THOMAS (no
publicado)
IBR
32
0
SINGH y col., 1982
VS
23
0
SINGH y THOMAS (no
publicado)
Tratamiento
Referencias
Sin tripsina
Con tripsina
Sobre esto último, el tratamiento con tripsina no parece necesario ya que THIBIER y NIBART (1987)
transfirieron más de 1500 embriones provenientes de vacas IBR seropositivas sin modificar la serología
negativa de las vacas receptoras. Tal vez esto se deba a que si hubiese habido presencia de virus en
útero, no hubiese habido fecundación o desarrollo de los embriones en dicho medio (THIBIER, 1990).
Con respecto a la fiebre aftosa, enfermedad endémica y de gran trascendencia en los países de
América del Sur, en un reciente trabajo realizado en Argentina y supervisado por los Departamentos de
Agricultura de EE.UU. y Canadá, se demostró que los sucesivos lavados de los embriones son
suficientes para eliminar el virus al que fueron expuestos. En el mismo trabajo se demostró que los
embriones provenientes de vacas y toros que sufrieron la enfermedad y transferidos a vacas
seronegativas, no modificaban tal estado en las receptoras. También se verificó esto en los terneros
nacidos así como la ausencia de signos clínicos de la enfermedad en éstos y en sus madres (VILLAR y
col., 1991). En trabajos de exposición de embriones a diferentes agentes virales se demostró que
ninguno afectaba la viabilidad de los mismos. Por el contrario, la exposición a B. abortus producía una
disminución de la viabilidad embrionaria (SINGH, 1987). En la mayoría de los animales infectados o
seropositivos a varios virus (BLV, BTV, FMDV, IBR) y a B. abortus, se obtuvo presencia de los agentes
patógenos en los fluidos de lavajes (SINGH, 1987). De ésto se puede concluir, que frente a varios
agentes que pueden estar presentes en el útero los embriones desarrollan pero las manipulaciones in
vitro (lavajes, tripsinado) son suficientes para corregir su infección.
Fuera de lo mencionado, también algunas bacterias pueden adherirse o adsorberse a la membrana
pelúcida tales como el Haemophilus sommus (THOMSON y col., 1988), los ureaplasmas (BRITTON y
col., 1988) y los mycoplasmas (BIELANSKY y col. 1990). Sin embargo, su sensibilidad ante los
antibióticos resta importancia a estas adherencias bacterianas.
Como conclusión es posible afirmar que:
- Hasta el presente no se ha detectado en el bovino ningún agente patógeno capaz de atravesar la
membrana pelúcida por sí solo. La integridad de la misma es entonces una condición sine qua non
para garantizar la salud del embrión.
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205
- Para todos los agentes patógenos que se encuentran en el medio de colecta o en las inmediaciones
del embrión pero que no se adsorben al mismo, el correcto lavaje del embrión es suficiente para su
eliminación. El correcto lavaje significa: realización de diez baños sucesivos con una dilución de
1/100 en cada pasaje cambiando la pipeta en cada baño. Al final de este proceso el medio deberá
permanecer estéril.
-En el caso de embriones con virus adsorbidos (VSV, IBR) deben complementarse los baños normales
con un tratamiento adecuado con tripsina.
-Debe tenerse en cuenta la posible presencia de agentes patógenos en sueros fetales o albúminas
bovinas utilizadas en los medios
De acuerdo con lo descrito anteriormente y según el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas
(Anexo I) por medio de la transferencia de embriones, la IETS ha categorizado en el año 1989 a las
enfermedades en cuatro grupos (Anexo II). Tal categorización es incluida posteriormente por la OIE en
sus recomendaciones generales sobre el tema.
Condiciones Generales de las precauciones sanitarias en la transferencia de embriones
De acuerdo con lo analizado hasta este momento es posible definir claramente los dos puntos centrales
donde a través del uso de la transferencia de embriones se puede transmitir una enfermedad. Estos dos
puntos son respectivamente la fase in vivo y la fase in vitro.
- Fase in vivo: concierne a los animales dadores (toros y vacas) involucrados en el proceso. Es
claro que los mismos pueden ser vectores de agentes patógenos hacia el embrión, pero hemos visto
que existen las metodologías de laboratorio para contrarrestar la mayor parte de las situaciones
estudiadas.
- Fase in vitro: involucra fundamentalmente al hombre y al entorno en que se realizan las
manipulaciones. La corrección en el desarrollo de estas últimas de acuerdo con las normas actualmente
existentes dan la garantía de máxima confiabilidad en la técnica de transferencia de embriones.
Cabría agregar por último una tercera fase de vigilancia (nuevamente in vivo) que es la que se puede
establecer a nivel de las receptoras elegidas como sanas y mantenidas luego de la TE en cuarentena el
tiempo necesario para determinar que no hay seroconversión o signos clínicos.
De todas formas surge como trascendente la segunda fase, ya que poniendo énfasis en la misma es
posible una cierta flexibilidad en la primera, posibilitando así una mayor facilidad en la realización de
intercambio de genotipos. A pesar de esto, la profilaxis basada en el estado sanitario de las donantes
sigue siendo la norma más corrientemente aceptada. Se parte así de la premisa que si el animal
donante está sano, también lo estarán sus embriones. Aplicando estos criterios generales, las
exigencias reglamentarias de los países difieren desde aquéllas que van de la no importación de
embriones desde países donde existe determinada enfermedad hasta otros que sólo exigen que la
donante se encuentre libre de enfermedades específicas.
Los niveles o criterios establecidos para la manipulación de semen (condiciones sanitarias del país o
territorio; condiciones sanitarias del rebaño o rodeo y condiciones sanitarias del animal) son entonces
adoptados para los embriones. Sin embargo, las características propias del embrión en cuanto al
manejo del semen así como los costos y limitaciones que se le impondrían a la transferencia de
embriones han provocado una evolución inteligente de las exigencias y reglamentaciones
recomendadas actualmente. Pasos dados en tal sentido por países que marcan rumbos en esta
temática (EE.UU., CEE), permiten esperar una evolución favorable en las normas actuales. A su vez las
investigaciones sobre este tema continúan por lo que también esto contribuirá a la dinámica de tales
reglamentaciones.
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Normas propuestas para el control sanitario en el intercambio internacional de embriones
Como para el caso del semen, existen normas generales a seguir en cada uno de los pasos de la
transferencia de embriones, destinadas al intercambio internacional de los mismos. Estas normas
generales tienen luego variantes en su aplicación por los países y se refieren a los siguientes aspectos:
1. Características de la Unidad de Transferencia de Embriones
2. Condiciones del equipo humano y de los materiales utilizados
3. Requisitos de la donante
4. Manipulación sanitaria de los embriones
5. Infraestructura y personal
5.1. Unidad de Transferencia de Embriones
Estas unidades se encontrarán debidamente inscriptas en los Servicios Sanitarios correspondientes,
estarán bajo la supervisión de un Profesional Veterinario también inscripto para la realización de estas
tareas y deberá contemplar las siguientes subunidades o sectores:
5.1.1. Sector de alojamiento y servicio de los animales. Será un área destinada a los animales incluidos
en todo el programa de transferencia de embriones. Puede encontrarse en una unidad de transferencia
de embriones o en una explotación. En ambos casos estos animales estarán aislados de todo animal
que no esté comprendido en el programa.
5.1.2. Sector de colecta. El mismo puede ser un lugar cerrado o abierto pero en ambos casos deberá
contar con instalaciones apropiadas para el correcto manejo de los animales y deberá permitir una
buena limpieza y desinfección previas a cada manipulación. Asimismo deberá asegurar que las
intervenciones sobre las hembras se hagan en buenas condiciones higiénico-sanitarias.
5.1.3. Sector de procesamiento de embriones. Deberá ser un ambiente cerrado, fijo o móvil. En él se
llevarán a cabo la totalidad de las manipulaciones a que son sometidos los embriones (búsqueda,
evaluación, lavaje, acondicionamiento, congelación, etc.). El sector deberá contar con materiales (piso,
paredes y techos) impermeables y que soporten los lavajes y desinfecciones repetidas. Deberá tener
mesada/s anticorrosivas, desagües, agua fría y caliente y estar protegida de la presencia de roedores e
insectos. En ella estará el material utilizado para las manipulaciones entre las cuales una lupa con
aumento x 50 y equipo de congelación. Será lavado y desinfectado previo a cada uso.
5.1.4. Sector de almacenamiento de embriones. Se trata de un local sólo destinado a almacenar
embriones, con características semejantes a las descriptas en 1.3. Especialmente: que permita la
limpieza y desinfección repetidas, protegida de roedores e insectos y lavada y desinfectada antes de ser
usada para conservar embriones. Contendrá los termos de nitrógeno líquido necesarios.
5.1.5. Sector de lavado, desinfección y esterilización. Será un ambiente cerrado con características
similares al descrito en 1.3 y destinado únicamente a su uso específico.
Se anexan las normas propuestas por la OIE (1986) correspondientes a las Unidades de Recolección
(Anexo III).
5.2. Personal que participa en el programa y materiales utilizados.
5.2.1. El personal que realiza y supervisa el desarrollo del programa constituye el eje sobre el cual
deberá garantizarse el éxito técnico y sanitario de un programa de transferencia de embriones. Un
equipo oficialmente inscripto debiera poseer las cuatro condiciones siguientes (THIBIER, 1990):
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- estar compuesto por personal competente tanto en lo técnico como en lo higiénico-sanitario y
comprenderá al menos un profesional veterinario.
- poseer un equipamiento adecuado y trabajar en instalaciones de acuerdo con lo descrito en el punto
5.1.
- aceptar seguir rigurosamente todas las recomendaciones exigidas para la manipulación de embriones,
en los textos correspondientes (Normas OIE, IETS, etc.).
- aceptar someterse con regularidad a un control de calidad destinado especial-mente a asegurar la
ausencia de agentes infecciosos en muestras de líquidos de colecta, lavaje, y ovocitos o embriones
degenerados.
Condiciones como las descriptas e impuestas en muchos países (CEE) dan a los servicios sanitarios
oficiales las garantías necesarias para otorgar las correspondientes autorizaciones.
5.2.2. Los materiales utilizados en la colecta y manipulación de embriones estarán correctamente
lavados y esterilizados (Ver Anexo IV).
5.3. Requisitos de la donante
Los requisitos generales exigidos para la donante son los descriptos en el Sector IV, Capítulo I del
Manual de la IETS. Es conveniente sin embargo discriminar algunos requisitos específicos que son los
que actualmente posibilitan el intercambio internacional de embriones entre países con determinadas
enfermedades y otros libres de ellas. Al respecto parece interesante mencionar la reglamentación
actualmente propuesta por la APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) para regular la
importación de embriones desde países donde existe actualmente la fiebre aftosa o la peste bovina
(Federal Register, 1990). Hasta el presente era imposible este tipo de intercambio y las pautas
propuestas aquí, producto de los continuos avances en las investigaciones en el tema, abren nuevas y
excelentes perspectivas para países infectados con enfermedades como FA. Las normas propuestas en
tal documento con respecto a las donantes incluyen:
5.3.1. Durante el año previo a la colecta de embriones ningún caso de FA, PB, CBP, RVF, VS, BSE o
cualquier enfermedad transmisible de los rumiantes deberá haber ocurrido en la Unidad de
Transferencia de Embriones o en el rodeo de donde proviene la donante.
5.3.2. Durante el año previo a la colecta, ningún caso de las enfermedades mencionadas en 3.1 habrá
ocurrido dentro de un radio de 5 km de la Unidad de Transferencia de Embriones o del rodeo donde
estuvo la donante.
5.3.3. Durante los 60 días previos a la colecta, la donante no ha sido vacunada contra FA o PB.
5.3.4. Durante los 60 días previos al ingreso a la Unidad de Transferencia de Embriones (al menos 24
horas antes a la realización del servicio que dará lugar a los embriones) las donantes permanecerán en
un mismo rodeo y ningún animal se incorporará al mismo.
5.3.5. En el día de la colecta de embriones y entre 30 y 120 días después se tomarán muestras de
suero (10 ml) que serán congeladas y enviadas al Foreign Animal Dissease Diagnostic Laboratory para
su análisis. Si alguna de las siguientes enfermedades existe en el país de origen (FA, CBP, RVF, VS,
PB) la donante será evaluada para certificar que está libre de tales enfermedades, a partir de las
muestras tomadas. También podrá evaluarse presencia o ausencia de brucelosis en estas muestras si
la donante no proviene de un rodeo certificado como libre de la enfermedad.
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5.3.6. Si la donante no proviene de un establecimiento certificado libre de tuberculosis, se deberá
realizar un test de tuberculina intradérmica entre 30 y 120 días después de la recolección de los
embriones y después de 60 días de cualquier aplicación intradérmica para detectar tuberculosis previa.
5.3.7. Entre 30 y 60 días después de la colecta la donante debe ser revisada por el veterinario oficial y
estar libre de las enfermedades descriptas en 3.1, brucelosis y tuberculosis.
5.3.8. Embriones producidos por una donante que muere antes de realizados los tests dentro de los
tiempos requeridos, no podrán ser aceptados.
5.3.9. Desde el momento de la colecta de embriones hasta terminar los tests mencionados, ningún
animal en la unidad de transferencia de embriones ni en el rodeo de origen de la donante exhibirá
evidencias clínicas de algunas de las enfermedades descriptas en 3.1.
En lo concerniente a la CEE y en particular con respecto a la FA, sus reglamentaciones indican que un
embrión fresco proveniente de un animal que se encuentra en un país donde se vacuna contra FA no
puede entrar a otro país donde no se vacuna. Sin embargo, un embrión congelado sí puede hacerlo a
condición que no haya habido vacunación en los 30 días previos a la colecta y que haya pasado un
mínimo de 30 días entre la colecta y la expedición del embrión.
Sobre estos ejemplos se pueden encontrar versiones diversas para cada país. Es paradojal a veces que
países de América Latina donde existen la mayoría de las enfermedades mencionadas, tengan en sus
reglamentaciones cláusulas más estrictas que en EE.UU. y la CEE donde muchas de ellas han sido
erradicadas. En la versión de 1986 del Código Zoosanitario Internacional de la OIE, las normas
simplificadas para el manejo de las donantes (referidas como ejemplo a FA) son las siguientes:
Si la importación es a partir de países libres de FA, los Servicios Veterinarios deberán solicitar la
presentación de un certificado internacional de salud que indique:
- Las donantes estarán en un rodeo sin cambios en los 30 días previos a su partida a la Unidad de
Transferencia de Embriones.
- Ni la donante ni otro animal del rodeo presentará signos clínicos de FA durante las 24 horas previas a
su partida a la unidad de transferencia de embriones y por los siguientes 30 días.
- Las donantes serán inseminadas con semen de acuerdo a lo descrito en los capítulos
correspondientes.
- La unidad de transferencia de embriones será libre de FA en los 30 días siguientes a la colecta.
Si la importación es a partir de países considerados infectados con FA, el certificado de salud exigido
por los Servicios Sanitarios oficiales deberá indicar:
- La donante y todo otro animal en el rodeo de origen no mostrará signos clínicos de FA durante las 24
horas previas a su partida a la Unidad de Transferencia de Embriones ni en los 30 días posteriores.
- La donante estuvo aislada en el establecimiento de origen por los 30 días previos a su partida a la
Unidad de Transferencia de Embriones y mostró signos negativos a los tests diagnósticos de FA.
- No ha sido vacunada contra FA o,
- fue vacunada con vacuna cumpliendo los estándares de la OIE (el tipo y línea de virus también
deberá consignarse en el certificado).
- Fue inseminada con semen proveniente de toros de acuerdo a lo descrito en los capítulos
correspondientes.
- Fue transportada a la Unidad de Transferencia de Embriones sin pasar a través de una zona
infectada y la Unidad de Transferencia de Embriones se mantuvo libre de FA hasta 30 días después
de la colecta.
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De los tests habitualmente realizados sobre las muestras de sangre tomadas se pueden mencionar los
siguientes:
a) para FA: test VIA. También y como complemento para FA se puede solicitar el test de aislamiento
viral a partir de hisopado faríngeo (Probang Test).
b) para IBR: seroneutralización o test de ELISA.
c) para VS: fijación de complemento o seroneutralización.
d) para lengua azul: inmunodifusión en agar gel.
e) para brucelosis: prueba de seroaglutinación lenta en tubo (WRIGHT). Se aceptará negativa la
dilución 1/50.
A las precauciones descriptas al comienzo de este capítulo y propuestas por los EE.UU. en el Federal
Register (1990) se deberán agregar las siguientes:
5.3.1. Al menos 24 horas antes de realizar el servicio para producción de embriones, la donante deberá
ser alojada en la unidad de transferencia de embriones.
5.3.1.1. La donante quedará en la unidad de transferencia de embriones hasta la colecta de embriones
y durante los 30 días posteriores a la misma.
5.3.1.2. Durante el período en que la donante permanezca en la Unidad de Transferencia de embriones
ningún animal puede estar en contacto con ella a menos que:
- haya seguido los mismos pasos ya descriptos para la donante.
- sea parte del rodeo de origen de la donante.
- sirva como toro donante en cuyo caso habrá sido evaluado como se describió previamente.
5.4. Manipulación sanitaria de los embriones.
Todo lo concerniente a los medios de colecta y lavaje, procedimiento de lavaje y/o tripsinado de los
embriones y evaluación de la integridad de la membrana pelúcida de los mismos es descrito en detalle
en la Seccción IV, Capítulo II del Manual de la IETS. Como medida precautoria suplementaria, en estas
etapas de laboratorio también serán tomadas muestras que permitan determinar la inexistencia de
microorganismos en el embrión antes de su transferencia. Como los procedimientos a realizar
destruirían al embrión si se llevaran a cabo en él, se procede a realizar pruebas indirectas tomando
muestras de los fluidos de colecta y de los cuatro últimos lavados de embriones y todos los ovocitos sin
fertilizar y embriones anormales. Los procedimientos para las tomas de estas muestras se encuentran
en la Sección IV, Capítulo II, del Manual de la IETS (Anexo IV). Asimismo y como complemento de lo
antes descrito, se anexan las normas propuestas por la OIE (Código Zoosanitario Internacional, 1986)
para las elaboraciones de los correspondientes Certificados Zoosanitarios Internacionales que deberán
tener en cuenta las Administraciones Veterinarias. Los ejemplos que se adjuntan son los descriptos por
la OIE en 1986.
Conclusiones
A partir del material aquí presentado se puede concluir que gracias al desarrollo de biotecnologías como
la obtención y procesamiento de semen y embriones, el intercambio internacional de genotipos es
actualmente factible con muy buenas garantías de no ser al mismo tiempo vectores de enfermedades
contagiosas. Si bien hasta el presente ninguna de las alternativas mencionadas da una seguridad
absoluta de la no transmisibilidad de enfermedades por estas vías, las normas y reglamentaciones
existentes, basadas en trabajos de investigación intensos llevados a cabo en los últimos años, dan
márgenes de seguridad suficientes como para que la mayoría de los países utilicen estas metodologías.
Una observación importante es que muchas de estas normas de prevención han ido haciéndose menos
rígidas a medida que nuevos trabajos demostraban que eran innecesarias. De esta manera, y para el
caso particular de los embriones, las condiciones de seguridad que brinda el producto final, asociado
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con la disminución de algunas de las trabas sanitarias han hecho que sea actualmente el material de
elección para el intercambio de genotipos. De la misma manera, el uso de esta metodología como base
para la conservación de genotipos (Banco de Germoplasma) dará garantías suficientes para el uso
futuro de este material sin riesgos sanitarios.
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LISTA DE ENFERMEDADES SEGUN
SU PELIGROSIDAD E IMPACTO ECONOMICO
LISTA A
A 010
A011
A012
A013
A014
A015
A016
A017
A020
A021
A022
A030
A040
A050
A060
A070
A080
A090
Fiebre aftosa (FA)
FA - Virus O
FA - Virus A
FA - Virus C
FA - Virus SAT 1
FA - Virus SAT 2
FA - Virus SAT 3
FA - Virus Asia 1
Estomatitis vesicular (EV)
EV - Virus Indiana
EV - Virus New Jersey
Enfermedad vesicular del cerdo
Peste Bovina
Peste de los pequeños rumiantes
Perineumonía contagiosa bovina
Dermatosis nodular contagiosa
Fiebre del Valle de Rift
Lengua Azul
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LISTA B
Enfermedades comunes a varias especies
B051
B052
B053
B055
B056
B057
B058
B059
Carbunco bacteridiano
Enfermedad de Aujeszky
Equinococosis/Hidatidosis
Cowdriosis (heartwater)
Leptospirosis
Fiebre O
Rabia
Paratuberculosis
Enfermedades de los bovinos
B101
B102
B103
B104
B105
B106
B017
B018
B019
B110
B111
B112
B113
B114
Anaplasmosis
Babesiasis
Brucelosis bovina (B.abortus)
Campilobacteriosis genital bovina
Tuberculosis bovina (Mycobacterium bovis)
Cisticercosis (C.bovis)
Dermatofilosis
Leucosis bovina enzoótica
Septicemia hemorrágica
Rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR/IPV)
Theileriasis
Tricomonosis
Tripanosomosis
Fiebre catarral maligna
LISTA C
Enfermedades comunes a varias especies
C611
C612
C613
C614
C615
C616
C617
C618
C619
C620
C621
C622
Listerelosis
Toxoplasmosis
Melioidosis
Carbunco sintomático
Botulismo
Otras infecciones clostridiales
Otras pasteurelosis
Actinomicosis
Salmonelosis intestinales
Coccidiosis
Distomatosis hepática
Filariasis
Enfermedades de los bovinos
C652
C653
C654
Enfermedad de los mucosas/Diarrea viral bovina
Disenteria vibriónica
Barros
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CATEGORIZACION DE LAS ENFERMEDADES DE ACUERDO CON EL RIESGO DE SU
TRANSMISION POR LOS EMBRIONES SEGUN LA IETS
Conclusiones de la Sociedad Internacional de Transferencia de embriones
(IETS) Comité de importación/exportación
Subcomisión de investigaciones
San Diego (Estados Unidos), 15-17 de enero de 1989.
Luego de la revisión, efectuada en 1988 por la Subcomisión de Investigaciones, Comité de
Importación/Exportación de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS) y de las
informaciones en el terreno con relación a las enfermedades infecciosas, estudiadas desde el punto de
vista del riesgo de su transmisión por la transferencia de embriones, la IETS clasificó estas
enfermedades en las siguientes categorías:
Categoría 1
Enfermedades o agentes de enfermedades para los que se han reunido pruebas suficientes como para
afirmar que el riesgo de transmisión es despreciable, a condición de que los embriones se manipulan
correctamente1 entre la recolección y la transferencia:
-Leucosis bovina enzoótica
-Fiebre aftosa (bovinos)
-Brucella abortus (bovinos)
Categoría 2
Enfermedades para las que se han reunido pruebas que indican que el riesgo de transmisión es
despreciable, a condición de que los embriones se manipulen correctamente* entre la recolección y la
transferencia, pero para las que hay que verificar los datos existentes mediante nuevas transferencias:
- Rinotraqueítis infecciosa bovina
- Lengua Azul (bovinos)
- Enfermedad de Aujeszky (cerdos)
- Peste porcina clásica
Categoría 3
Enfermedades o agentes de enfermedades para los que los resultados preliminares indican que el
riesgo de transmisión es despreciable, a condición de que los embriones se manipulen correctamente**
entre la recolección y la transferencia pero para los que dichas comprobaciones preliminares deben
corroborarse con datos experimentales complementarios, in vitro e in vivo:
- Peste bovina (bovinos)
1
* Manual de la IETS (Recomendaciones para la manipulación higiénica de los embriones)
**Manual
de la IETS (Recomendaciones para la manipulación higiénica de los embriones).
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- Enfermedad de la mucosa (DVB)
- Lengua Azul (ovinos)
- Campylobacter fetus (ovinos)
- Fiebre aftosa (cerdos)
- Enfermedad vesicular del cerdo
- Peste porcina africana
- Temblor epidérmico del carnero
- Haemophilus somnus
Categoría 4
Enfermedades o agentes de enfermedades que han sido o son objeto de trabajos preliminares:
-Virus Akabane (bovinos)
-Estomatitis vesicular (bovinos y cerdos)
-Chlamydia psittaci (bovinos)
-Ureaplasmas/micoplasmas (bovinos)
-Maedi-visna (ovinos)
-Adenomatosis pulmonar (ovinos)
-Temblor epidérmico (caprinos)
-Lengua Azul (caprinos)
-Artritis y encefalitis caprina
-Parvovirus (cerdos)
-Enterovirus (cerdos)
-Leptospirosis (cerdos)
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NORMAS PROPUESTAS POR LA OIE PARA LAS UNIDADES
DE RECOLECCION DE EMBRIONES
(Código 1986)
5.2.3.: UNIDADES DE RECOLECCION
Autorización sanitaria con miras a la exportación
Anexo 5.2.3.1.
OVOCITOS/EMBRIONES BOVINOS
A. Objetivos del control
El objetivo del control sanitario oficial de los óvulos/embriones de bovinos destinados a los intercambios
internacionales es garantizar la ausencia de gérmenes patógenos específicos eventualmente asociados
a los óvulos/ embriones y evitar todo riesgo de infección de las hembras receptoras y de su
descendencia.
Puede haber o no similitud de situación sanitaria entre el país exportador y el país importador; los
programas nacionales de control pueden variar considerablemente, al igual que las condiciones
exigidas para las vacunaciones y las pruebas diagnósticas. Por ellos, las condiciones de autorización de
las Unidades de recolección y de los laboratorios de tratamiento asociados a ellas, pueden ser
diferentes en el país exportador y en el país importador. Por tales motivos, entre otros, el presente
Anexo no abarca más que los principales requisitos sanitarios aplicables a la recolección, al tratamiento
y al transporte de los óvulos/embriones.
B. Condiciones generales
La Administración Veterinaria debe procurar que las medidas zoosanitarias enunciadas en los párrafos
siguientes sean respetadas en los intercambios internacionales de óvulos/embriones.
1. Unidad de recolección
La Unidad de recolección es el establecimiento donde están alojadas y son tratadas las hembras
donantes con vistas a la recolección. Es en general, una parte definida de la explotación donde se
mantiene el rodeo de origen de las hembras donantes, o bien, una parte específicamente definida de un
establecimiento hacia el que se trasladan las hembras donantes para proceder a la recolección y a los
exámenes de control. En ambos casos deben aplicarse las siguientes condiciones:
a) La Unidad de recolección debe ser autorizada por un veterinario oficial y puesta bajo vigilancia
veterinaria directa.
b) La instalación y el equipo de la unidad deben permitir que las intervenciones sobre las hembras
donantes se hagan en buenas condiciones de higiene; deben asimismo permitir el primer
procesamiento de los óvulos/embriones.
c) El personal que trabaja en la unidad debe tener una perfecta formación, tanto en los aspectos
técnicos como en los fundamentos de profilaxis de las enfermedades y aplicar las más estrictas normas
de higiene, con objeto de evitar la introducción de enfermedades en la unidad. Debe trabajar provisto de
ropa y calzado de protección.
d) El acceso a la unidad estará prohibido a toda persona no autorizada.
e) La unidad no debe estar situada en una zona infectada (de peste bovina o fiebre aftosa) durante las
recolecciones.
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2. Laboratorios de manipulación de óvulos/embriones
El laboratorio, que puede ser móvil o fijo, se define como un sitio en donde los óvulos/embriones son
recogidos en el medio de recolección, examinados, lavados y sometidos a todos los tratamientos
necesarios antes de ser congelados y puestos en cuarentena.
El laboratorio fijo puede ser una parte de una Unidad de recolección y procesamiento específicamente
definida, o bien una parte debidamente acondicionada de un establecimiento existente. Puede estar
situado en el lugar de mantenimiento del rebaño o de las hembras donantes. En ambos casos, las
condiciones generales de autorización de las Unidades de recolección deben ser cumplidas y aplicarse
además las siguientes condiciones:
a) El laboratorio debe estar bajo vigilancia directa de un veterinario oficial.
b) Cuando se manipulan los óvulos/embriones destinados a la exportación y antes de su conservación
en ampollas/pajuelas, ninguna operación deber ser efectuada sobre los óvulos/embriones de nivel
sanitario inferior.
c) El laboratorio debe estar protegido contra roedores e insectos.
d) El laboratorio móvil debe ser perfectamente desinfectado cada vez que se utiliza en las diferentes
Unidades de recolección.
e) El laboratorio no debe situarse en una zona infectada (de peste bovina) durante las recolecciones.
3. Hembras donantes
a) En las 24 horas anteriores a la recolección, todos los bovinos, ovinos, caprinos y porcinos del rebaño
de origen deben ser objeto de un examen clínico realizado por un veterinario oficial y declarados libres
de cualquier enfermedad contagiosa transmisible a los bovinos.
b) El rebaño debe estar libre de fiebre aftosa, peste bovina y perineumonía contagiosa bovina, y no
debe encontrarse en una zona infectada (de peste bovina o fiebre aftosa) durante los 30 días antes y
después de la recolección.
c) El rodeo de origen de las hembras donantes debe de preferencia formar parte de los rebaños que
son objeto de un programa nacional de profilaxis; debe por lo menos estar "libre" de tuberculosis y
brucelosis bovina. No debe haberse producido durante los 12 meses anteriores ninguna evidencia
clínica ni antecedente de infección de Trichomonas fetus o de Campylobacter fetus.
d) Las hembras donantes deben cumplir con todos los requisitos fijados por la Administración
Veterinaria del país exportador.
e) Las hembras donantes no deben haber sido importadas de otro país durante los 6 meses anteriores y
deben haber permanecido durante por lo menos 30 días en el rebaño de origen.
f) Las hembras donantes y el rodeo de origen deben ser objeto de un nuevo examen clínico efectuado
por un veterinario oficial por los menos 30 días después de la recolección, y ser declarados libres de
toda enfermedad contagiosa transmisible a los bovinos.
g) El propietario de las hembras donantes debe certificar que, a su conocimiento, dichos animales no
son portadores de taras genéticas conocidas, ni están emparentados con portadores de taras genéticas.
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217
4. Examen a efectuar de las hembras donantes y los óvulos/embriones
Existen dos métodos principales para asegurar que los óvulos/embriones están libres de gérmenes
patógenos. El método tradicional consiste en exámenes realiza-dos sobre las hembras donantes; estos
exámenes exigen mucho tiempo. Puede ser necesario controlar los sueros apareados y reiterar otras
pruebas después del período normal de incubación de una enfermedad para determinar el estado
sanitario de las hembras donantes. El otro método se basa en trabajos recientes bien documentados
que permiten reconocer con gran fiabilidad que los óvulos/embriones están libres de bacterias y virus
especificados*** cuando han sido procesados de conformidad con el Manual de la Sociedad
Internacional de Transferencia de Embriones (I.E.T.S.)****. Dicho método evita los largos períodos de
aislamiento y los reiterados exámenes de las hembras donantes, a condición de que éstas respondan a
los criterios de base enunciados en el párrafo 3 del presente Anexo.
a) Método tradicional
i) Exámenes realizados sobre las hembras donantes en aplicación de un acuerdo bilateral.
Conservación de los óvulos/embriones en nitrógeno líquido durante un período de tiempo superior a la
duración normal del período de incubación de las enfermedades de las que el país importador se quiere
proteger. Esto permite someter a las hembras donantes a exámenes serológicos en el momento de la
recolección, o antes de ésta, y nuevamente después de la recolección. Los resultados negativos de
dichos exámenes, asociados a las nuevas técnicas de lavado, dan un grado de seguridad superior al
que se alcanzaba anteriormente.
ii) Utilización de semen para la inseminación de las hembras donantes y fecundación de los óvulos que
respondan a las condiciones sanitarias y a las normas enunciadas en el Anexo 5.2.1.1. Cuando el
semen congelado utilizado para inseminar a las hembras donantes procede de toros que ya han
muerto, o cuando el estado sanitario de los toros respecto a una o varias enfermedades infecciosas
concretas no se conocía en el momento de la recolección, podrán exigirse exámenes complementarios
de las hembras donantes inseminadas, después de la recolección de los óvulos/embriones, para
verificar que dichas enfermedades no les fueron transmitidas. Los exámenes del semen pueden
constituir otra alternativa de control.
En caso de monta natural o de utilización de semen fresco, los sementales deben cumplir con las
mismas condiciones sanitarias que las hembras donantes.
b) Nuevo método: lavado de óvulos/embriones
La zona pelúcida de cada óvulo/embrión debe ser examinada en toda su superficie bajo un aumento de
por lo menos 50x, y debe ser garantizada intacta y exenta de cualquier material adherente. Los
óvulos/embriones deber ser lavados de conformidad con las recomendaciones del Manual de la
I.E.T.S.; su zona pelúcida debe estar intacta antes y después del lavado. Sólo deben ser lavados
conjuntamente los óvulos/embriones procedentes de una misma hembra donante. (Toda expedición de
***Los
trabajos realizados sugieren que las técnicas de lavado descriptas en el Manual de la IETS ofrecen un alto
grado de seguridad frente a los siguientes agentes patógenos: Brucella y virus de la lengua azul, de la leucosis
bovina enzoótica (LBE), de la enfermedad de las mucosas (BVD) y de Akabane. Las técnicas de lavado con
tripsina parecen necesarias para eliminar los virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR) y de la estomatitis
vesicular (Manual de la IETS, 4.16)
**** Manual of the International Embryo Society 1986
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218
Alberio
óvulos/embriones deberá ser acompañada de una atestación firmada por el veterinario responsable del
laboratorio de manipulación certificando que dichos exámenes fueron realizados).
5. Recolección y conservación de ovocitos/embriones
a) Medio
Todo producto biológico de origen animal utilizado para la recolección, procesado, lavado o
conservación debe estar exento de microorganismos vivos. Los medios y las soluciones utilizados para
la recolección, congelación y conservación de ovocitos/embriones deben ser esterilizados según
métodos reconocidos, conformes a las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S. y manipulados de
forma que permanezcan estériles. Se deben agregar antibióticos en el momento de la recolección,
lavado y conservación, de conformidad con las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S.
b) Material
Todo el material utilizado para la recolección, manipulación, lavado, congelación y conservación de los
óvulos/embriones debe ser esterilizado antes de su utilización, de conformidad con las
recomendaciones del Manual de la IETS.
6. Exámenes y tratamientos facultativos1
a) Un país importador puede pedir el examen de los ovocitos/embriones y de los líquidos de recolección
o de lavado. En ese caso, los exámenes serán realizados en un laboratorio autorizado y deberán
confirmar, en la medida de lo posible, la ausencia de gérmenes patógenos.
i) Ovocitos/embriones
Cuando los embriones son recolectados exclusivamente para la exportación, los óvulos no fecundados
y los embriones que presentan anomalías genéticas, procedentes de una misma hembra donante,
deberán ser lavados de conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS.
ii) Líquidos del lavaje uterino
El líquido de lavaje debe colocarse en un recipiente estéril, por ejemplo una probeta graduada, y dejarse
en reposo durante una hora. El líquido sobrenadante deber ser retirado a continuación y los 100 ml del
fondo que contienen los residuos acumulados, decantados en un frasco estéril. Si se utiliza un filtro
deben ser agregados a los 100 ml del líquido conservado mediante enjuague.
iii) Líquido del lavado de los embriones
Los cuatro últimos líquidos de lavado de los óvulos/embriones (lavados 7, 8, 9 y 10) deben ser
agrupados (manual de la I.E.T.S.).
iv) Muestras
Las muestras arriba descriptas deben ser conservadas a 4ºC y examinadas dentro de las 24 horas. De
no ser posible, deben ser conservadas a una temperatura igual o inferior a -70ºC.
b) Puede ser solicitado un tratamiento de óvulos/embriones mediante la tripsina. Este tratamiento debe
ser realizado de conformidad con las recomendaciones del manual de la I.E.T.S.
c) Sólo deben ser procesados al mismo tiempo los óvulos/embriones procedentes de una misma
hembra donante.
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219
7. Conservación, cuarentena y transporte
a) Los ovocitos/embriones deben ser conservados en ampollas/pajuelas esterilizadas y éstas, a su vez,
en contenedores esterilizados con nitrógeno líquido, respetando condiciones de estricta higiene, en un
lugar de almacenamiento autorizado por la Administración Veterinaria del país exportador y que no
presente ningún riesgo de contaminación para los ovocitos/embriones.
b) Sólo deben colocarse en la misma ampolla/pajuela los óvulos/embriones procedentes de una misma
hembra donante.
c) Las ampollas/pajuelas deben ser precintadas en el momento de la congelación y etiquetadas de
conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS. El contenedor con nitrógeno líquido debe
ser precintado antes de su envío.
d) Los ovocitos/embriones deben congelarse en alcohol "fresco" o en nitrógeno líquido, y conservarse
en nitrógeno líquido "fresco" en contenedores esterilizados.
e) Los ovocitos/embriones conservados no deben ser exportados antes de haber finalizado las
operaciones objeto del certificado sanitario
1 Se prevé el estudio de un anexo sobre los métodos recomendados para las pruebas de investigación
de agentes patógenos en los líquidos de irrigación y de lavaje, cuando el país importador solicite esos
exámenes particulares. Dados los conocimientos actuales, se puede afirmar que las técnicas existentes
para el aislamiento de bacterias y virus parecen ser eficaces.
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Alberio
CONSIDERACIONES PRACTICAS Y ASPECTOS COMERCIALES DE LA TRANSFERENCIA DE
EMBRIONES
R.H. Alberio
Introducción
Se trata ésta de una tecnología reciente donde no sólo se han tenido que desarrollar sus aspectos
técnicos sino también los sistemas de aplicación en forma comercial.
La biología de la transferencia de embriones es muy compleja y por ello las técnicas que componen un
programa de TE tienen diferentes grados de imperfección lo que debe ser tenido en cuenta al
desarrollar su aplicación práctica desde el punto de vista comercial. Desde otro punto de vista, en esta
era de la tecnología, los productores no quieren quedar fuera de los cambios que se producen en su
medio. Una de las nuevas adquisiciones tecnológicas para reproducir los genotipos superiores es la TE.
El potencial está indicado por su uso en programas de mejora genética, por lo que la pregunta es cómo
hacer para que la técnica tenga su mejor aprovechamiento. La demanda de los productores ya no sólo
es por los animales registrados sino por aquellos que producen más en las evaluaciones con
parámetros objetivos de calidad, o simplemente con el tipo de animal que aún sin evaluaciones
objetivas de producción tiene en un momento dado mayor demanda en el mercado. Las características
de la técnica permiten una adaptación rápida a las necesidades del mercado, objetiva o subjetivamente
determinado.
La TE ha modificado en buena medida el comercio tradicional de los reproductores. En lugar de elegir
solamente al mejor toro, la atención está dirigida también a la obtención de las mejores vacas. De esta
manera, ciertas reproductoras comienzan a ser valoradas actualmente tanto como lo es el toro. Así,
algunos cabañeros comienzan a producir vacas donantes como antes producían toros para IA.
Algunos programas alternativos a considerar en la TE
-La vaca permanece como donante permanente
Esto tiene sentido cuando el propietario puede vender con provecho más embriones o terneros de esa
vaca de los que se pueden producir. Los embriones pueden ser transferidos frescos o congelados para
abastecer la demanda fuera de la temporada de producción de terneros. La congelación ha abierto
enormes perspectivas en los programas genéticos y comerciales ya que los embriones pueden ser
mantenidos indefinidamente en el termo, a un bajo costo y pueden ser vendidos en cualquier momento
y lugar. Una de las formas de venta es sobre preñez confirmada lo que en general es deseable para el
comprador. Una variante es congelar embriones todo el año y luego transferirlos durante la temporada
de servicios. De esta manera, si bien la tasa de éxito es algo menor con embriones congelados, es
posible reducir los costos totales al no tener que disponer permanentemente de receptoras lo que suele
ser uno de los aspectos más costosos del proceso. Si se adopta la variante de congelar los embriones,
es conveniente recordar que aproximadamente un 25% de ellos no son congelables pero si transferibles
en fresco por lo que siempre hay que prever para ello un número de receptoras.
-La donante es superovulada sólo una vez y vuelve al servicio
Esta variante permite al productor realizar una superovulación y recolección entre parición y nuevo
servicio, multiplicando así por 2 ó 3 el número de terneros a obtener en un año. Si bien ésta no es la
modalidad más aconsejada, muchos productores desean comenzar de esta forma no sólo para ver el
grado de éxito de la misma sino para aproximarse a la técnica de una forma no muy complicada ni
costosa. En este caso se considera recomendable no trabajar con menos de 3 a 4 vacas para disminuir
así la posibilidad de caer sobre un animal que no produce embriones.
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Consideraciones prácticas y aspectos comerciales
239
-Donantes en el Centro de TE
Los embriones se producen, transfieren, gestan y los terneros se crían hasta el destete en el Centro de
TE. En ese momento son entregados al propietario. Una alternativa más económica y más frecuente es
entregar la receptora al propietario cuando se hizo el diagnóstico de gestación (2 a 3 meses). Estos
sistemas tienen la ventaja de liberar al propietario de todos los problemas y responsabilidades
inherentes al programa y también benefician al técnico, ya que de esa manera tendrá el conjunto del
problema en sus manos, pudiendo controlar más estrechamente y con mayores recursos cada una de
las etapas. Por otra parte, el centro en general estará dotado de una infraestructura destinada
específicamente a esta actividad.
-Programa en el establecimiento de origen de las donantes
Ello exige de manejos, cuidados y procedimientos más intensos a los que, en general, se acostumbra
en el campo. En consecuencia se requiere de personal entrenado y de la supervisión del propietario y/o
encargado. La parte más compleja y costosa de este sistema lo constituye la provisión de receptoras en
el número necesario, y de buena calidad en el momento apropiado. También requiere la atención
permanente de los partos a lo largo de todo el año.
-Venta de receptoras preñadas
Esta ha sido una de las formas comerciales más importantes en TE que tiende actualmente a ser
reemplazada por la venta de embriones congelados.
-Venta de la producción de un tratamiento superovulatorio
Es otra de las formas contractuales que ha adquirido cierta popularidad en nuestro país a partir de
hembras compradas en concursos o exposiciones y con ellas se procede a la comercialización de uno o
varios lavajes en forma equivalente a lo que ocurre con el semen congelado de toros.
Algunos aspectos del negocio de la TE
La TE es clasificada en general en el área de negocios conocidos como biotecnológicos. La
biotecnología ha atraído en los últimos años la atención de capitales de riesgo interesados en invertir en
la misma. Sin embargo, a menudo la gente experimentada en biotecnología no lo es en los negocios y a
menudo es difícil unir un negocio seguro con un sistema biológico como la TE. En consecuencia ha
tomado mucho tiempo, trabajo y comisión de errores desarrollar el negocio de la TE.
La demanda de la TE ya está establecida por lo que, como en todo negocio de riesgo, el profesional
que entra en el mismo deberá poner un precio en el servicio que proveerá. Esto se logra por diferentes
vías pero en todos los casos se deberán considerar los costos fijos y los variables. Como en general los
costos son altos y frecuentemente el negocio financiero es muy rentable, se deberá tener en cuenta
cuál puede ser el futuro del negocio antes de introducir a alguien en el mismo con expectativas irreales.
Los costos fijos, básicamente la infraestructura y equipos, suelen ser altos y por lo tanto requieren una
gran inversión inicial. Un centro de TE debe tener buena presentación, estar ubicado en un lugar con
clima favorable y de fácil acceso. Un laboratorio móvil es más versátil pero sus costos de mantenimiento
suelen ser muy altos. El rodeo de receptoras es una gran inversión con alto costo de mantenimiento y
manejo así como un importante capital con gran proporción de lucro cesante.
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240
También el costo de mantenimiento de las donantes es alto y si bien su número es bajo, hay que
considerar que el mantenimiento de vacas no recolectadas aumenta los costos por donante. El
equipamiento mínimo necesario suele no ser de gran magnitud pero sí de costo alto. Por el contrario, el
material de consumo es importante en los costos tanto por su cantidad como por su precio ya que en
gran parte es importado.
Una vez establecidos los costos fijos y variables, el precio final del producto a vender será determinado
en función de su competitividad. La TE es un negocio donde cada día hay más competencia y donde la
calidad y precio del trabajo son elementos fundamentales para el logro de nuevos clientes.
Estructura de costos y algunas formas de cobro del trabajo de TE (en dólares americanos)
Costos
1 vaca
(2 gestaciones)
4 vacas
(8 gestaciones)
Prostaglandinas
FSH
Medios y material
descartable
Suplemento a personal
y gastos de transporte
Transferencia (4/donante)
10
70
40
280
20
80
70
30
70
120
TOTAL
200
590
Estimando que en día de trabajo se pueden recolectar y congelar o transferir lo producido por 4 vacas,
el costo por vaca recolectada variará entre 200 dólares (si se recolecta una) a alrededor de 74 dólares
si se recolectan 4. Lo descrito es el costo de funcionamiento, pero no tiene en cuenta amortización de
entrenamiento, equipos, etc. Esto deberá evaluarlo el profesional. Cuál es el precio de este servicio?
Existen múltiples formas de arreglo para cobrar este tipo de trabajo, uno de los más corrientes es el
siguiente:
1 vaca
4 vacas
Prima/gestación*
(2 gestaciones)
(8 gestaciones)
(100/gestación)
200
800
* Esta prima en algunos casos puede elevarse hasta 200 o 300 dólares por gestación. Sin embargo, el
actual incremento de la oferta de profesionales capacitados en TE y la menor demanda pueden inducir
acuerdos que bajan el nivel de la prima original. De acuerdo con esto, el lavaje de 4 donantes y la
obtención de 8 gestaciones se cobraría alrededor de 1400 dólares con un costo de 600 dólares. El resto
(800 dólares) será destinado a amortización, ganancia neta, etc.
Una recolección con dos gestaciones obtenidas se cobrarían 400 dólares con un costo de 200 dólares.
Como se puede apreciar, se deberá adecuar el tipo de cobro a cada situación.
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Aplicaciones de la transferencia de embriones
241
APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
G. Brem
Introducción
Debido a las limitaciones biológicas, los métodos biotecnológicos aplicados actualmente para
incrementar la tasa reproductiva de la hembra no tienen el efecto multiplicador conocido en los animales
machos. Mientras que es posible incrementar el número de la descendencia de un toro por el factor
1000 o aún mayor a través de la inseminación artificial, en la hembra no siempre es posible aumentar
siquiera por el factor 10 el número de terneros nacidos a través de la transferencia de embriones. No
obstante ello existe una serie interesante de aplicaciones de esta técnica en la producción e
investigación. Los aspectos más importantes del aumento de la tasa reproductiva de la hembra bovina
son los siguientes (BREM, 1986, 1990):
1.
Aumento del progreso genético en la producción de leche y carne a través del aumento de la
intensidad de selección de las madres de toros.
2. Aumento del progreso genético en rodeos cerrados de producción de leche y carne.
3. Aumento de la eficiencia de los programas de núcleos de producción (capítulo XXII).
4. Rápida multiplicación de razas o mutaciones exóticas de valor productivo.
5. Aumento de la tasa de mellizos.
6. Rápidas y mejores posibilidades para llevar a cabo programas de cruzamiento con razas lecheras y
carniceras.
7. Posibilidad de llevar a cabo la prueba de la descendencia de vacas y la prueba de hermanas
enteras en las familias de las vacas.
8. Acortamiento del intervalo generacional.
9. Determinación y control del sexo.
10. Estimación del efecto materno.
11. Facilidad de la importación y exportación de material genético.
12 Desarrollo de las condiciones adecuadas para otras técnicas reproductivas en marco de la
micromanipulación de embriones.
Particularmente el aspecto mencionado en el último punto (12) ha ganado en los últimos años particular
importancia. La división microquirúrgica (capítulo X), la producción in vitro y el clonado de embriones
(capítulo XII) como así también la producción de animales transgénicos le han dado a la transferencia
de embriones una nueva dinámica. Por ello, en las siguientes descripciones de las diferentes
aplicaciones de la TE convencional, no es siempre posible evitar algunas superposiciones con los
capítulos siguientes. Se presentarán además algunas áreas que, a través de la manipulación de los
embriones, aumentan la eficiencia de la TE.
Aumento del progreso genético en la producción de leche y carne a través del aumento de la
intensidad de selección de las madres de toros
Para la mayor parte de las razas bovinas productoras de leche existen programas de mejoramiento
genético por medio de la inseminación artificial. En ellos, como p.e. en el programa de mejoramiento en
Bavaria, los toros obtenidos de cruzas programadas son seleccionados a través de 6 niveles.
Posteriormente los reproductores probados, con una edad de 5 a 6 años, están disponibles para la
inseminación artificial (ver capítulo XXII). En principio se puede afirmar que el éxito adicional de la TE
aplicada en programas de IA es más reducido cuanto más eficiente sea este último, es decir cuanto
mayor sea la intensidad de selección de las madres de toros. Por otro lado el empleo de la TE sólo es
recomendado en un estricto programa de selección. En programas de mejoramiento subóptimos es
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Brem
242
conveniente aumentar el progreso genético, en primer lugar a través de una mejora de los programas
convencionales de IA. La TE requiere altos capitales de inversión y tecnología lo que la convierten en
una técnica más costosa que un programa de mejoramiento por medio de IA. De la misma forma un
programa de TE tendrá éxito sólo si se establece un trabajo conjunto entre un equipo altamente
calificado y productores informados e interesados en el progreso genético del ganado. SKJERWOLD
(1974) disminuyó la tasa de reposición de las madres de toros de 2% al 0,4% en un cálculo modelo. A
través de la reducción del número de madres de toros se incrementó 20% el éxito de la selección sobre
la línea madre-hijo. Dado que la línea madre-hijo participa en sólo 1/4 del progreso genético (G) total, el
incremento de G es de sólo 5%. En otro cálculo LAND y HILL (1975) seleccionaron 1-1,3% de las
vacas como madres de toros, en lugar del 2% original. De esta forma aumenta el progreso genético
sobre la línea madre-hijo en una relación 100:110:125, lo que representa un incremento del éxito de la
selección de 2,5 a 6%. Partiendo de una tasa de reposición de 3% y aumentando la tasa de
reproducción por el valor 10, se incrementa 9% el G (CUNNINGHAM, 1976). En un modelo empleado
en el estudio del efecto de la TE sobre el progreso genético en un rodeo lechero PIRCHNER y
DEMPFLE (1977) evaluaron entre otros factores las siguientes variantes:
1. Aumento anual de la tasa reproductiva a 4 y 80 veces por medio de TE.
2. Aplicación de TE solamente en madres de toros o en la población total.
Los resultados de ese modelo de cálculo se resumen en la tabla 1. A través de la aplicación de la línea
madre-hijo es posible incrementar el progreso genético entre 5 y 10%, con la producción
complementaria de 4 a 8 terneros más por año y vaca. con la transferencia de 80 embriones por vaca
donante aumentaría 17% la eficiencia de la selección. La experiencia práctica indica, sin embargo, que
no es posible alcanzar un aumento de la tasa reproductiva de esa magnitud.
Tabla 1:
Progreso genético de la producción de leche (PIRCHNER y DEMPFLE, 1977)
h2= 0,25
Edad a la primera parición = 2,5 años
N de hijas/toro = 50
1/3 de las vacas se insemina con toros en prueba
Toros:
Toros de toros reposición
Vacas de toros
"
5%; i= 2,06; φ = 0,88; t= 7 años
20%; i= 0,93; φ = 0,88; t= 5,3 años
Re
%
i
φ
t
Re
%
i
φ
t
∆G
∆t σA
aumento
%
80
0,35
0,5
4,0
3
2,27
0,5
5,0
0,185
-
A1
80
0,35
0,5
4,0
0,75
2,76
0,5
5,0
0,196
6
A2
80
0,35
0,5
4,0
0,04
3,61
0,5
5,0
0,196
17
B1
20
1,4
0,5
4,0
0,75
2,76
0,5
5,0
0,221
19
B2
1
2,66
0,5
4,0
0,04
3,61
0,5
5,0
0,271
46
A1 = Aplicación en núcleos de producción, 4 embriones transferidos con éxito.
A2 =
"
"
"
, 80 embriones transferidos con éxito.
B1 =
" en la población, 4 embriones transferidos con éxito.
B1 =
"
" , 80 embriones transferidos con éxito.
Re% = tasa de reposición
i = intensidad de la selección
σ = exactitud de la estimación del valor genético.
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Aplicaciones de la transferencia de embriones
243
t = intervalo generacional
φA= desviación standard genética aditiva
∆G= progreso genético
El incremento del progreso genético por año depende de la tasa reproductiva y de la exactitud de la
estimación del valor genético. Para los modelos de cálculo en las tablas 2 y 3 (BREM, 1979) se
establecieron los siguientes valores iniciales:
VIA
i
t
PT
0,88
2,06
7,0
MT
0,5
2,27
5,0
PV
0,88
0,93
5,3
MV
0,5
0,35
4,0
PT: padres de toros; MT: madres de toros; PV: padres de vacas; MV: madres de vacas
En la tabla 2 se resumen los valores absolutos y relativos para el incremento del progreso genético por
año y desviación estándar. Se observa que la influencia del aumento de la tasa reproductiva es mayor
cuanto mayor sea la tasa de reposición en la población inicial. Si se selecciona 2% de las vacas como
madres de toros y se aumenta 8 veces la tasa reproductiva el aumento del progreso genético, para una
exactitud de la estimación del valor genético de 0,5, será de 9%. Si por el contrario se seleccionan 15%
de las vacas, la aplicación de TE permitirá un aumento de 12%. Si la exactitud original de la estimación
del valor genético es de 0,3 el aumento oscilará en ambos casos entre 6 y 8%.
El intervalo generacional puede ser acortado mediante el empleo de la TE, porque de las madres de
toros seleccionadas será posible obtener con seguridad un ternero macho por año. Con una tasa de
reposición de 2% y una reproducción aumentada 8 veces (con rIA= 0,5) el progreso genético puede ser
mayor de 14% a través de la reducción del intervalo generacional de las madres de toros de 5 a 4 años
(tabla 3). A través de la aplicación de la transferencia de embriones en rodeos aislados se influye la
línea madre-hija. CUNNINGHAM (1976) comparó la superioridad genética de la descendencia en
sistemas convencionales y de transferencia de embriones. Si se emplea 59% de las vacas para la
producción de hembras reproductoras la descendencia alcanzará una superioridad de 2,2% después de
la selección por producción de leche. Con un número de la descendencia de 2 a 10 veces superior por
vaca puede aumentar la superioridad genética a 3,8 y 6,1%.
Si se llevara a cabo TE en toda la población (tabla 1) el progreso genético aumentaría 20% con un
incremento de la tasa reproductiva por el factor 4. Con una descendencia de 80 animales por vaca el
progreso genético podría aumentar 46% (PIRCHNER y DEMPFLE, 1977).
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Brem
244
Tabla 2: Aumento del progreso genético a través del incremento de la tasa reproductiva de la línea
madre-hijo aplicando la TE en dependencia de la exactitud de la estimación del valor genético
(rIA) y de la tasa de reposición de la población inicial (TR)
Ternero / vaca / año
TR
%
rIA
1
0,3
0,4
0,5
0,5
abs.
0,17
0,18
0,19
abs.
0,17
0,19
0,20
%
2
2
3
abs.
0,17
0,19
0,20
%
4
4
5
abs.
0,18
0,19
0,21
%
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7
8
2
0,4
0,4
0,5
0,17
0,18
0,19
0,17
0,18
0,19
2
3
3
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4
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7
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0,4
0,5
0,16
0,17
0,18
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0,17
0,18
3
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0,19
5
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10
10
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0,16
0,16
0,17
0,16
0,17
0,18
3
3
4
0,16
0,18
0,19
5
7
8
0,17
0,18
0,19
7
9
11
15
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0,4
0,5
0,15
0,16
0,17
0,16
0,17
0,18
3
4
5
0,16
0,17
0,18
6
7
9
0,17
0,18
0,19
8
10
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0,3
0,4
0,5
0,15
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0,16
0,17
0,17
3
4
5
0,16
0,17
0,18
6
8
9
0,16
0,18
0,19
9
11
13
0,3
0,4
0,5
0,15
0,15
0,16
0,16
0,16
0,17
4
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0,18
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Aplicaciones de la transferencia de embriones
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Tabla 3: Aumento del progreso genético a través del incremento de la tasa reproductiva y disminución
del intervalo generacional en la línea madres de toros de 5 a 4 años
Terneros / vaca / año
TR
%
rIA
1
0,5
1
2
4
0,3
0,4
0,5
abs.
0,18
0,19
0,20
%
5
5
5
abs.
0,18
0,19
0,21
%
7
7
8
abs.
0,18
0,20
0,21
%
9
10
10
abs.
0,19
0,20
0,22
%
10
12
13
2
0,3
0,4
0,5
0,17
0,19
0,20
5
5
5
0,18
0,19
0,20
7
8
8
0,18
0,19
0,21
9
10
11
0,18
0,20
0,21
11
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0,4
0,5
0,17
0,18
0,19
5
5
5
0,17
0,19
0,20
7
8
8
0,18
0,19
0,20
9
10
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0,18
0,20
0,21
11
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0,5
0,17
0,18
0,19
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0,20
7
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0,20
10
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12
0,18
0,19
0,21
12
13
15
5
0,3
0,4
0,5
0,17
0,18
0,19
5
5
5
0,17
0,18
0,20
7
8
9
0,17
0,19
0,20
9
10
11
0,18
0,19
0,21
12
14
15
7
0,3
0,4
0,5
0,17
0,18
0,18
5
5
5
0,17
0,18
0,19
8
8
9
0,17
0,19
0,20
10
11
13
0,18
0,19
0,20
12
14
16
10
0,3
0,4
0,5
0,16
0,17
0,18
5
5
5
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0,18
0,19
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0,20
13
15
17
0,3
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0,5
0,16
0,17
0,18
5
5
5
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KRÄUßLICH (1978) caracterizó la futura aplicación técnico-productiva de la TE en un rodeo de 100
vacas, bajo las premisas que la tasa de preñez de la transferencia no quirúrgica sea de 50%, que se
transfieran 4 embriones/donante y se practique el sexado. Las 20 donantes serán inseminadas con
toros elite de la misma raza, 2/3 de de las restantes inseminaciones se hará con toros de razas
productoras de carne. La relación del sexo será 1:0,89, nacerán 18% más de terneros. Como progreso
genético adicional se espera una producción de 40-50 kg de leche.
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Mejoramiento del rendimiento lechero y de producción de carne
La razas de doble propósito son seleccionadas según sus características productoras para leche y
carne. El éxito de la selección por cada característica es menor que en los casos de selección de razas
de un solo propósito productivo. KRÄUßLICH (1976) estimó el progreso genético anual para un
programa convencional de TE. El porcentaje de reposición de las madres de toros en los sistemas
convencionales es de 1,3%, en el modelo de TE 0,2%. En el cálculo son tenidos en cuenta los
siguientes valores: h2 leche= 0,25; h2 pdf= 0,40; P leche= 700 kg; pc= 45 kg.
En un esquema de selección, en el cual se selecciona mediante la prueba de producción propia en una
relación 1:5, el programa de TE permite un progreso genético adicional de 5,5 kg/año de leche y 0,23
kg/año en peso de faena (pdf). El mejoramiento relativo es de aproximadamente 14% frente a un
programa convencional.
PIRCHNER y DEMPFLE (1977) estimaron que sería posible alcanzar aumentos del 5%, considerando
una característica para leche y una para carne de igual significado. El cálculo de las tablas 2 y 3 se
basa en los mismos parámetros de una población. La transferencia se aplicará sólo en las madres de
toros y por lavaje se transferirán 4 embriones. Con la extensión a la población total se esperan
aumentos del 20%.
Mejoramiento del rendimiento de producción de carne
SKJERVOLD (1974) estudió la aplicación de la prueba de la descendencia en razas productoras de
carne. Las terneras deben ser seleccionadas después de la prueba de campo, de manera tal que se
incorporará 1/3 de las donantes al programa. La calidad de la res se estimará a través de la faena de la
descendencia. Dado que la descendencia se faenará al año de edad, el intervalo generacional de los
padres se prolongará sólo un poco. De esta forma es posible un incremento del éxito de la selección
entre 20 y 25%.
Los efectos de la selección, en un programa de TE, según el rendimiento propio antes de la edad
reproductiva fueron destacados por HILL y LAND (1975). Al año de edad las terneras serán
seleccionadas, superovuladas, inseminadas con toros jóvenes y los embriones obtenidos serán
transferidos a receptoras. El intervalo generacional es de 2-2,5 años. El progreso genético estimado en
peso a los 400 días aumentará de 9 a 16 kg/año.
PIRCHNER y DEMPFLE (1977) estimaron el progreso genético en un rodeo bovino productor de carne
de 2 000 cabezas, cuando toda la descendencia es evaluada en su crecimiento (test de rendimiento
propio). Con una heredabilidad de 0,36, la primera parición a los 2 años y un porcentaje de reposición
de toros del 0,5% se obtendrá un aumento del progreso genético en producción de carne del 33%,
disminuyendo el porcentaje de reposición al 66% por medio de TE.
Aumento de la tasa de mellizos
Transferencia de dos embriones
La transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino permite alcanzar una elevada tasa de preñez
pero un reducido porcentaje de mellizos.
ROWSON y col. (1971) compararon los resultados obtenidos después de la transferencia de 2
embriones en uno o ambos cuernos uterinos. Los grupos contaban con 11 vaquillonas. Después de la
transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino la tasa de preñez, determinada a la faena (60 dias),
fue de 73% pero sólo 45% de los animales tenían mellizos. La tasa de gestación de los animales
faenados a los 90 días, fue de 72% cuando los 2 embriones fueron transferidos en ambos cuernos y la
de preñeces melliceras 73%. SREENAN y col. (1975) informa-ron sobre una tasa de preñez de 82% en
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Aplicaciones de la transferencia de embriones
247
un grupo de 72 receptoras luego de la transferencia quirúrgica y bilateral de 2 embriones. De las
receptoras preñadas se detectó 74% de gestaciones melliceras. La sobrevivencia de los embriones
transferidos fue de 71%.
En promedio se obtienen 77% de preñez, de las vacas preñadas 67% presentan gestaciones melliceras
y 65% de los embriones transferidos sobreviven. Con la transferencia de 2 embriones en un cuerno
uterino se observan menores tasas de gestaciones dobles (ROWSON y col., 1971).
Aumento de la frecuencia de partos melliceros de origen genético
La tasa de partos melliceros tiene una heredabilidad muy baja de 4% y una repetibilidad de 6%. A
través de laparoscopia deben ser observadas las ovulaciones espontáneas de aquellos animales que
parieron mellizos. Los animales con varias ovulaciones dobles son incorporados al programa de TE. Si
la tasa de mellizos en la población es de 4%, es posible, según las estimaciones de LAND y HILL
(1975), aumentar ese valor en 0,5% anualmente por medio de la TE. Si se alcanza en la población una
tasa de mellizos de 16%, aumentará la frecuencia en algo más de 1% aplicando la TE.
Resumiendo es posible afirmar, desde el punto de vista de la intensidad de selección como así también
de otras consideraciones productivas, que la transferencia de embriones ofrece una buena posibilidad
de alcanzar objetivos productivos determinados con mayor rapidez que con la inseminación artificial.
Una condición para ello es que se lleven a cabo estudios para la optimización de la producción y
estructura de la población, a fin de establecer una base sólida para la aplicación de la TE. De la misma
forma debe garantizarse un exitoso programa técnico de TE, a fin de llevar a cabo los objetivos
genéticos propuestos.
Rápida reproducción de individuos y razas exóticos
Muchas poblaciones bovinas no son originarias de las zonas que actualmente habitan. La migración es
un factor de gran importancia en los cambios de la composición genética de las poblaciones. Ello se
refleja con claridad en el siguiente ejemplo: En el siglo pasado se exportaron animales de las razas
Schwarzbunte y Braunvieh de Europa a Estados Unidos, donde fueron sometidos a una intensa
selección para producción de leche. Durante los últimos 20 años animales de las razas HolsteinFriesian y Brown-Swiss fueron reimportados a Europa e incorporados a las poblaciones. Mientras en el
siglo pasado la exportación se llevó a cabo con animales, la reimportación del material genético se
cumplió al principio y en gran medida con semen congelado. Hace algunos años se importan también
embriones congelados.
Las razas, denominadas exóticas en EE.UU., Simmental y Charolais fueron consideradas interesantes
en Norteamérica para la producción de carne en las décadas del 60 y 70. La reducida cantidad de
animales disponibles y las serias limitaciones sanitarias para la importación de más animales condujo a
la reproducción de los mismos por medio de la transferencia de embriones. La aplicación de la TE en
esa área obviamente contribuyó con el surgimiento biotecnológico de esta técnica. Su uso con fines
productivos se cumplió recién en una segunda fase de su aplicación, después que la reproducción de
las razas exóticas había alcanzado dimensiones poblacionales suficientes como para desistir de la TE.
El costo de la comercialización internacional de reproductores es en general muy elevado y con
frecuencia difícil de llevar a cabo como consecuencia de las estrictas medidas sanitarias de importación.
En ese sentido la transferencia de embriones cobra particular importancia al aumentar el número de la
descendencia de animales de alto valor genético ya existentes. De esta forma es posible, según
CUNNINGHAM (1976) incrementar 500% la tasa reproductiva de un animal importado.
Otra área interesante para la aplicación de la TE la constituyen individuos de importancia genética
particular, como por ejemplo los animales sin cuernos. HAUSSMANN (1978) desarrolló una ecuación,
con la cual es posible calcular el número de descendientes a obtener de una donante con la aplicación
de la superovulación (tabla 4).
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248
Nj = a (v . g . q)j/T
Nj = donantes por año j
a = número de donantes hembras
v = terneros/donante
g = relación de sexos (normalmente 50:50)
j = años desde el comienzo del programa
T = intervalo generacional
Considerando que actualmente la exportación de material genético se lleva a cabo en gran medida con
embriones congelados y no exclusivamente con semen, se presenta la excelente posibilidad de
reproducir los animales importados como embriones, renunciando así a una permanente importación.
Como la experiencia lo demuestra esta alternativa constituye una importante aplicación de la
transferencia de embriones.
Tabla 4:
Reproducción de una hembra por medio de la transferencia de embriones en función del
número de descendientes hembra por donante (HAUSMAN, 1978)
Embriones
♀/donante
2
Años
3
10
Animales/donante
4
4
25
100
8
16
625
10 000
12
64
15 625
1 000 000
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APLICACIONES DE LA PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES
G. Brem
Introducción
Para la producción in vitro de embriones (PIV) existe una serie de aplicaciones que corresponden en
parte a aquellas de la transferencia de embriones, como por ejemplo su empleo en la reproducción de
razas en peligro de extinción, de genotipos exóticos o en el aumento del número de terneros en un
rodeo. Por otra parte la PIV tiene aplicaciones que son particulares de ese método biotecnológico. Un
ejemplo de ello es la producción de terneros a partir de animales faenados y sometidos a pruebas de
rendimiento propio. En el presente capítulo se presentará un panorama de las principales aplicaciones
de la PIV de embriones bovinos desde el punto de vista productivo y técnico. Generalmente los
programas de PIV pueden dividirse en proyectos de acuerdo al origen de los ovarios y de los ovocitos.
En ellos se pueden desarrollar los trabajos con un pool de ovarios de terneras o vacas. En otros casos
se pueden seleccionar determinadas hembras, las cuales en forma individual o en determinados grupos
son consideradas para un programa de PIV después de la faena.
Producción in vitro de embriones en programas de investigación y como técnicas reproductivas
Para el estudio de los fenómenos vinculados con el desarrollo de estadios embrionarios tempranos es
necesario en la regla un gran número (p.e.: el desarrollo de una biblioteca de ADN) de embriones
desarrollados en forma sincrónica. Para cumplir con esos objetivos se presentan, particularmente en la
especie bovina, dos problemas: es extremadamente dificultoso (en promedio sólo 8 embriones/
donante) recolectar esos estadios (a través del lavaje de oviducto o después de la matanza) de la
donante. En segundo lugar debe esperarse una divergencia del estadio de los embriones de hasta 24h,
en función del momento de la fecundación. La PIV tiene la ventaja de producir embriones en un número
suficientemente grande y sincrónico en el desarrollo. Es posible, además, llevar a cabo estudios con los
ovocitos recolectados durante la maduración y la fertilización.
Para llevar a cabo los métodos de clonado y la transferencia de genes en el bovino se requiere de un
gran número de ovocitos, cigotos y en parte también embriones. Su realización con embriones
recolectados in vivo sería dificultosa e imposible de continuar a largo plazo. La PIV constituye el método
de elección, demostrado en las primeras experiencias en la producción de animales clonados y
transgénicos. Los resultados obtenidos con esos programas son aún insatisfactorios, sin embargo
constituyen una buena alternativa, comparada con la aplicación de embriones obtenidos in vivo.
En los programas de investigación y manipulación mencionados se puede emplear en la regla un pool
no seleccionado de ovarios. Los embriones, donantes de blastómeros, requeridos para un programa de
clonado constituyen una excepción. De la misma forma puede ser necesario en un programa de
transferencia génica, dependiendo de la estructura génica a transferir (capítulo XIII), emplear animales
de razas lecheras o con una constelación genética especial.
Vacas de interés productivo como donantes de ovocitos
Al contrario de la recolección de ovocitos de un pool de ovarios para diversos programas, obtener
ovocitos de una vaca es interesante desde el punto de vista productivo. Particularmente animales con
una larga y eficiente vida productiva constituyen un potencial prometedor para la PIV. A pesar que esas
vacas tienen más descendencia que la media de la población, persiste aún una gran demanda por sus
descendientes. Esas vacas, de acuerdo a la experiencia, no responden satisfactoriamente a un
programa de superovulación como los animales jóvenes, de forma tal que un programa de TE no brinda
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Aplicaciones de la producción in vitro de embriones
251
el éxito esperado. En el momento de la faena o la matanza de esos animales la PIV ofrece la última
posibilidad de aprovechar su potencial genético.
Como demostración del significado que puede tener ese programa es interesante el ejemplo de la raza
Holstein-Friesian alemana (HFa). De las 23 000 vacas elite hay más de 120 que tienen un rendimiento
en su vida de 100 000 kg de leche. En promedio se faenan alrededor de 5000 vacas por año. Con un
empleo consecuente de la PIV podrían producirse anualmente 10 000 terneros adicionales con muy
buenos valores productivos estimados. Ello sería especialmente interesante por que además se
necesitaría menos semen por embrión producido comparado al requerido en el servicio con IA. Las
porciones de semen de toros HFa se disponen en general en cantidades insuficientes y son además
caras. En muchos casos el uso eficiente del semen cubre los costos del programa de PIV e incluso
posiblemente de la transferencia de los embriones producidos.
En una segunda etapa se podría extender la PIV a toda la población Herdbook (HB). Si se eligen para el
programa de PIV 50 000 vacas HB, lo que constituye 30% de las vacas faenadas, se podrían producir
alrededor de 100 000 terneros. Esos terneros podrían reemplazar a los animales descendientes de
animales de bajo valor productivo y aumentar de esa forma el progreso genético de la población. Desde
el punto de vista reproductivo la consecuencia sería que alrededor de 10% de las inseminaciones serían
reemplazadas con la transferencia de embriones producidos in vitro.
Genéticamente el empleo de las vacas HB en la PIV significaría una mejora del progreso genético sobre
la línea madre-hija (capítulo XXI).
Convencional: tasa de reposición
PIV:
madre de vaca= 80% => i= 0,35
rIA = 0,5
∆G = .35. .5 sA = .175 sA
tasa de reposición
madre de vaca= 60% => i = 0,64
rIA = 0,5
∆G = .64 . .5 . sA = .32 sA
Según ello el aumento del progreso genético sobre la línea madre-hija sería del 83%.
A pesar que la línea madre-hija contribuye solamente en un 10% del progreso genético total, la casi
duplicación del ∆G sobre esa línea es ventajosa porque aumentaría el significado de la línea más débil
en el mejoramiento genético. A través del empleo más intensivo de las vacas del Herdbook es de
esperar, además, ventajas adicionales en los componentes maternos.
Producción in vitro de embriones de razas bovinas en peligro de extinción
La formación de reservas genéticas de razas en peligro de extinción gana creciente significado. Existen
estimaciones que de las 500 razas que existen en la actualidad sólo 20 mantendrán significado en la
producción a fines de este siglo. Sin embargo existen esfuerzos por evitar la pérdida total del potencial
genético de esas razas a través de la congelación y conservación de semen y embriones. En ese
sentido la PIV de embriones es particularmente interesante porque las pocas hembras aún existentes
son relativamente viejas y no pueden ser incluidas en un programa de transferencia de embriones o lo
son sin éxito. Nosotros hemos observado en vacas viejas que los ovarios carecían de folículos, lo que
hacía imposible el programa de PIV. En la mayoría de las vacas es posible obtener los ovocitos,
producir embriones, congelarlos y conservarlos en nitrógeno líquido durante décadas. En el momento
de reestablecer la raza en peligro de extinción o para superar las depresiones consanguíneas los
embriones producidos pueden ser descongelados e incorporados en la pequeña población existente.
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252
Brem
Terneras o fetos como donantes de ovocitos
También de los ovarios de terneras y fetos pueden obtenerse ovocitos para la PIV. A pesar que el
número de folículos existentes es mayor que en ovarios de vacas adultas, la producción de embriones
de terneras es menor, como consecuencia de la menor tasa de desarrollo de los ovocitos (ver capítulo
XI). A pesar de ello la PIV es posible y encuentra aplicación en algunas áreas específicas.
Un aspecto de importancia es el acortamiento del intervalo generacional. Ello sería interesante cuando
la obtención de los ovocitos de esas terneras sea repetible. Hasta el momento existe información
insuficiente sobre ese aspecto. La PIV de embriones de terneras, después del sacrificio en el matadero,
puede ser interesante también bajo determinadas condiciones. Por ejemplo cuando es necesaria una
determinada constelación genética, diagnosticable genéticamente y que puede ser producida a través
de la recombinación de la meiosis. Como ejemplo se encuentran haplotipos MHC o individuos
homocigotas sin cuernos. Si la ternera no representa el genotipo deseado, puede provocarse 4 meses
después la siguiente ronda recombinante por medio de la PIV. El intervalo generacional puede
acortarse de esta manera de 3 a 1,1 años. Ello aumentará las posibilidades de seleccionar el genotipo
deseado. Los animales producidos serán recriados, destinados a otras pruebas o a la producción.
Otra alternativa de aplicación es la de terneros de engorde. En Bavaria la carne de ternero se produce a
partir de las terneras, dado que los machos son engordados como toros. Las terneras alcanzan 170 kg
a los 4 meses. Si se logra producir 4 embriones y con ello 2 terneros con la aplicación de la PIV, sería
posible alcanzar un 50% de reposición. La selección posibilitada de esta forma (tabla 1) podría
concentrarse en parámetros de rendimiento cárneo como engorde diario o cualidades a la faena (p.e.:
componente cárneo, partes de valor carnicero, etc.). Como ejemplo de la ganancia diaria el progreso
genético podría corresponder a 25 g por año (∆G= 0,8 . 0,7 . 50 g/1.1 = 25 g).
Producción de razas productoras de carne en rodeos lecheros
La producción in vitro y la transferencia de embriones de razas productoras de carne o de doble
propósito a vacas lecheras, no afectadas a la reposición, es una alternativa más de la aplicación de la
PIV. Esa alternativa es interesante económicamente cuando existe una mayor diferencia entre el valor
de los terneros de las donantes y las receptoras frente a los costos producidos por la PIV y la
transferencia. Una condición importante es que la obtención se lleve a cabo sin problemas, esto es, que
se disponga en el matadero de un número suficiente de hembras.
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Aplicaciones de la producción in vitro de embriones
253
Tabla 1: Intensidad de selección en función del número de animales seleccionados
Animales seleccionados
(%)
Intensidad de selección
i
80
0,35
60
0,64
40
0,97
20
1,4
10
1,76
5
2,06
3
2,27
1
2,67
0,8
2,74
0,6
2,83
0,4
3,96
0,2
3,17
0,1
3,37
0,01
3,96
G = rAI . i . sA
∆G= Progreso genético
rIA= Exactitud de la estimación del valor genético
i = Intensidad de selección
SA = Desviación estándar genética aditiva
Un efecto positivo de la producción de embriones de razas cárneas en vientres de vacas lecheras se
produce cuando se emplea semen de toros seleccionados por sus atributos en su rendimiento cárneo,
ganancia de peso o facilidad de parto. Con ello se posibilita también obtener rendimientos óptimos con
toros puros o con embriones cruzas, como consecuencia del efecto de heterosis.
A través de la transferencia bilateral de los embriones a una receptora se posibilita además aumentar
hasta 40% el número de terneros por vaca. Ello podría ser otra razón para aplicar la PIV en razas
cárneas. Además de la transferencia bilateral es posible aumentar la tasa de mellizos hasta 50%
mediante la transferencia contra lateral de embriones a vacas servidas o inseminadas.
La aplicación de la PIV es simple y económicamente aceptable si la transferencia de embriones
congelados/descongelados tiene valores de sobrevivencia de 50% aproximadamente. De esta forma
será posible conservar los embriones en el contenedor de nitrógeno líquido y transferirlos dentro de los
programas de rutina sobre celo inducido o natural. Los costos del ternero producido corresponderían al
20% del precio de venta. La PIV de embriones constituye un método biotecnológico prometedor en el
aumento de la eficiencia de la producción bovina intensiva.
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Brem
254
Prueba de rendimiento a la faena y de los parámetros de calidad de carne
Un aspecto especialmente innovador de la PIV de embriones lo constituye la particularidad de la
obtención de ovocitos que los animales pueden ser selecciona-dos después de la faena según sus
particularidades cárneas. En programas convencionales de selección esas características pueden
evaluarse mediante engorrosas pruebas de progenie. Esas pruebas de la descendencia pueden
llevarse a cabo sólo en una parte de los toros. Para un programa de IVP es posible emplear semen de
toros que cuenten con buenos valores en esas particularidades.
En los toros jóvenes es posible llevar a cabo una prueba de rendimiento a la faena después del período
de recolección de semen.
La condición para una consecuente prueba de rendimiento propio de las vacas faenadas es que se
puedan tomar datos fehacientes a la faena como también identificar los ovarios en forma individual. A
partir de los datos del matadero deberá ser posible la toma de una decisión selectiva y llevar a cabo la
PIV. A partir de algunos cálculos se demostrará qué progreso genético anual es posible alcanzar
(desviaciones estándar) con este método en función del porcentaje de animales seleccionados y de la
heredabilidad (tabla 2). Los valores de la tabla 2 tienen validez sólo si toda la descendencia en el rodeo
es producida de esa forma. Si sólo se incluye una parte de la población, el progreso genético
corresponderá sólo a esa parte de la población o a los terneros originarios de ese programa. Para
determinar el progreso genético en toda la población se deberá considerar qué porcentaje de la
descendencia total tiene origen en ese programa y el progreso genético de los parámetros
correspondientes en la descendencia originaria de un programa convencional.
Tabla 2: Progreso genético anual (en desviaciones estándar sA) en función del porcentaje de las
vacas seleccionadas mediante prueba de rendimiento propio y de la heredabilidad (h2)
Vacas faenadas
seleccionadas (%)
80
60
50
40
20
10
5
Intensidad de
selección ik
.35
.64
.8
.97
1.4
2.06
2.06
0,2
.14
.17
.18
.19
.23
.26
.28
0,3
.17
.20
.22
.24
.28
.31
.34
0,4
.20
.23
.25
.27
.32
.36
.40
0,5
.22
.26
.28
.30
.36
.41
.44
0,6
.25
.29
.31
.33
.39
.45
.49
0,7
.27
.31
.33
.36
.43
.48
.53
0,8
.28
.33
.36
.39
.46
.51
.56
0,9
.30
.35
.38
.41
.48
.55
.60
h2
TB = 2,5 años; TK = 3 años; iB = 1.4; Fertilidad 100%
(iB + iK) . h
∆G -------------------. sA =
T b + TK
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(1,4 + iK) . h
-------------------------- . sA
5,5
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Aplicaciones de la producción in vitro de embriones
255
Dado que las características corporales a la faena tienen una heredabilidad e importancia económica
altas, es de esperar que este programa pueda llevarse a cabo exitosamente. Las características de
calidad de la carne que generalmente también encuentran consideración tienen la dificultad que hasta el
momento no se dispone en el lugar de métodos simples, rápidos y valederos de evaluación.
En la elección de las características a seleccionar debe evaluarse detalladamente qué parámetros
serán considerados. La consideración simultánea de varias características determina, por un lado, un
trabajo más complejo en la selección de las vacas en el matadero. Por el otro, naturalmente un reducido
progreso genético de las características individuales. Cuando las correlaciones entre las características
son suficientemente positivas y altas, se llegará a un considerable mejoramiento correlacionado con la
selección de una característica.
Por último debe acentuarse una vez más que a través de la combinación de la selección de vacas
faenadas y posterior producción in vitro de embriones, se cuenta por primera vez con un método
aplicable en la práctica para alcanzar el mejoramiento genético de las características a la faena de la
hembra bovina. Ello cobra particular importancia en los tiempos actuales, en los que se le atribuye a la
calidad de los productos una importancia creciente. Un significativo progreso, alcanzable a través de la
aplicación de nuevas biotecnologías.
Obtención de los ovocitos de animales vivos
La punción de ovarios de animales vivos constituye una continuación prometedora del desarrollo y
aplicación de la PIV. A través de las técnicas de ultrasonido es posible puncionar los folículos y obtener
los ovocitos en forma repetida, lo que posibilita aumentar el número de ovocitos recolectados. En el
caso de que esa forma de recolección de ovocitos continuada se pueda llevar a cabo y que se puedan
producir embriones con la misma eficiencia que con ovarios de animales sacrificados, podría esperarse
en teoría la producción de 100 embriones transferibles por vaca y año. Ello aportaría una considerable
mejora de la aplicación de la TE porque aumentaría el número de la descendencia y disminuiría la tasa
de descarte de los animales seleccionados.
La aplicación consecuente de la PIV de embriones con los ovocitos obtenidos de animales vivos puede
constituir una alternativa de los programas de superovulación en el mediano y largo plazo. La ventaja de
esa técnica es que permitiría obtener ovocitos de vacas de alto valor genético, que no responden a los
tratamientos hormonales de los programas de TE. El número de embriones por donante y año puede
aumentar e incluso sería posible continuar el programa de PIV en animales preñados sin peligro de
afectar la continuidad de la gestación. Condiciones para ello son la optimización de la eficiencia de las
técnicas de recolección, un número suficiente de ovocitos vitales en condiciones de madurar y ser
fertilizados con una metodología económica.
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Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones
257
APLICACIONES DE LA PRODUCCION DE MELLIZOS IDENTICOS Y DEL CLONADO DE
EMBRIONES
G. Brem & A. Clement-Sengewald
Introducción
Las aplicaciones de los mellizos idénticos y los hermanos clones, como productos de la microcirugía
han dejado de ser sólo modelos de investigación y encuentran en la actualidad aplicación en los
programas de producción por medio de la IA y en núcleos de producción.
La división microquirúrgica de los embriones es una técnica menos compleja que el clonado. Los
embriones a dividir son recolectados por métodos no quirúrgicos. Luego de la micromanipulación las
mitades obtenidas son transferidas a las vacas receptoras (cap. X). El clonado requiere, por el contrario,
la obtención de ovocitos madurados in vivo, mediante lavaje o castración, o in vitro a partir de ovarios
obtenidos del matadero. Los embriones en estadio unicelular demandan el cultivo temporal antes de su
transferencia definitiva, ya sea in vivo o in vitro. Por esas razones el clonado de embriones se lleva a
cabo en pocos laboratorios especializa-dos y equipados para ello. En este capítulo se describirán las
consecuencias genéticas que tiene el espectro de aplicaciones de la producción de mellizos
homocigotas (cuadro 1) y de terneros a partir de embriones clonados (cuadro 2).
Cuadro 1: Aplicaciones de la división de embriones
Investigación básica:
-
Estudio del efecto materno durante la gestación
Estudio de los efectos genéticos y ambientales sobre el fenotipo
Producción animal:
-
Cuadro 2:
Aumento del número de terneros por vaca donante
Disminución de los costos en un programa de TE
Reducción del número de toros en espera
Aumento de la eficacia en la formación de reservas genómicas
Aumento del progreso genético
Aplicaciones del clonado en producción animal
Investigación básica:
-
Estudio de la interacción núcleo-citoplasma
Delimitación de la (de) diferenciación del núcleo celular
Producción animal
-
Limitación de la variabilidad genética
Estudio de las influencias genéticas y ambientales en el animal
Disminución del número de animales de experimentación
Aceleración del progreso genético
Selección del sexo
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Brem & Clement-Sengewald
258
Investigación básica
El empleo de animales genéticamente idénticos conduce, en experimentos que no son repetidos, a una
consecuente disminución de la varianza. Con la distribución de animales idénticos en diferentes
alternativas de tratamientos, el efecto de los mismos es posible de medir con mayor exactitud que con
el empleo convencional de animales experimentales. Esa superioridad de los mellizos idénticos puede
definirse como el "valor de la eficiencia de los mellizos" (VEM). El mismo establece cuántos animales,
en cada uno de los 2 grupos estudiados, pueden reemplazarse por mellizos idénticos sin que el ensayo
pierda su validez estadística. La eficacia de los experimentos con mellizos idénticos o clones es mayor
aún con el aumento de la heredabilidad. Una ventaja particular del empleo de animales idénticos
producidos por medio de microcirugía la constituye el hecho que ya se pueden llevar a cabo estudios
durante la gestación, la perinatalidad y en las primeras semanas de cría.
Los animales genéticamente idénticos son adecuados también para el estudio de la interacción
genotipo-ambiente. Los genotipos idénticos pueden ser distribuidos en diferentes ambientes y al mismo
tiempo es posible alcanzar en cada grupo, una división de los componentes de la varianza, por medio
de los valores de medición y de la varianza dentro de los clones. La distribución de clones de razas
europeas en regiones tropicales y subtropicales son un ejemplo de tales estudios. A través de los
mismos es posible establecer si los valores de rendimiento son los mismos para condiciones extremas o
si deben establecerse nuevos criterios de selección para la elección de los reproductores más
adecuados. Otro componente de investigación es la interacción genotipo-año, a través de la
conservación y la transferencia distribuida en el tiempo de embriones divididos o clonados. Con un
empleo consecuente de este método es posible también establecer valores genéticos estimativos de
∆G.
Los animales originados de la microcirugía y transferencia nuclear son también adecuados para el
estudio y medición de los efectos maternos. Estos efectos se caracterizan por aquellas características
de la descendencia afectadas no solo por el genotipo sino también por el fenotipo materno, que
contiene a su vez componentes genéticos y ambientales. Los componentes genéticos de la madre
pueden tener origen en el núcleo o en factores citoplasmáticos. En los animales mamíferos la herencia
extracromosomal tiene lugar exclusivamente en el ADN mitocondrial. Los mellizos idénticos no solo
tienen el mismo genotipo sino también el mismo ADN extracromosómico. Por el contrario los clones se
diferencian en su ADN citoplasmático, dado que el ovocito receptor de los núcleos puede originarse de
diferentes vacas.
El estudio de las interacciones núcleo-plasma puede, en consecuencia, aclarar la pregunta no
respondida aún sobre el rol que desempeña el ADN no contenido en el núcleo. Esto es, establecer la
función del ADN de las mitocondrias o los centrómeros (herencia matroclin). A través de la transferencia
de núcleos celulares de una edad definida, es posible establecer el momento conocido como
"diferenciación nuclear", en el cual la capacidad de la célula de poder diferenciarse en cualquier órgano
(totipotencia) se pierde. A partir de ese momento no es posible provocar un nuevo comienzo de división
celular. En consecuencia una rediferenciación es imposible. Ello significa que en el interior del núcleo
celular se manifiestan procesos de envejecimiento y cambios que hasta el momento no han sido
estudiados suficientemente (STICE y ROBL, 1989).
El ambiente pre- y post-natal es separado de la propia madre por medio del empleo obligado de la
transferencia de embriones. Los efectos maternos se pueden dividir principalmente en las siguientes
áreas:
1.
2.
3.
4.
Genéticas,
extracromosomales,
ambiente uterino,
y ambiente post-parto durante el período de amamantamiento.
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Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones
259
La varianza genotípica total para una característica cuantitativa determinada se compone, sin
considerar el efecto génico epistático, de componentes directos, maternos, aditivos y de aquellos
condicionados por la dominancia, los efectos mitocondriales y las influencias ambientales:
Vp = VGa(d) + VGa(m) + VGd(d) + VGd(m) + VMi(m) + VUt(m) + VU(d)
Ga
Gd
Mi
Ut
U
(d)
(m)
= efectos génicos aditivos
= efectos génicos dominantes
= efectos mitocondriales
= Influencias uterinas
= Influencias ambientales
= efectos directos
= efectos maternos
Los componentes genéticos causales pueden estimarse individualmente de las covarianzas entre
animales emparentados (tabla 1). Es posible estimar la influencia uterina, el ambiente materno como así
también los factores ambientales directos por medio de la transferencia de embriones (1 ó 2 embriones
en 1 ó 2 receptoras).
Tabla 1: Coeficientes de los componentes de la covarianza genética entre animales emparentados
(según Brem 1986, 1990)
Covarianzas
entre
Componentes causales
VGa(d)
VGa(d)
VGa(m)
VGd(m)
VMi(m)
Cov MH
1
1
1
1
1
Cov HC
1
1
1
1
0
Cov HE
1/2
1
1/4
1
1
Cov M D
1/2
1/2
0
0
1
Cov M mH
1/4
1
0
1
1
Cov P D
1/2
0
0
0
0
Cov P mH
1/4
0
0
0
0
Varianza
MH
HC
HE
mH
P
M
D
= mellizos homocigotas
= hermanos clon
= hermanos enteros
= medio hermanos
= padre
= madre
= descendencia
Los estudios sobre predisposición a enfermar y de enfermedades hereditarias con mellizos idénticos
tienen una larga tradición en el hombre y animal. Predisposición a enfermedades se define a la
disposición individual para sufrir alteraciones de los procesos metabólicos como consecuencia de
carencias particulares. La resistencia es la desensibilidad o la exitosa resistencia pasiva contra agentes
patógenos. Resistencia y predisposición son dos términos recíprocos. La mayor parte de las
enfermedades hereditarias y anomalías morfológicas congénitas son de naturaleza poligénica. La
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260
Brem & Clement-Sengewald
estimación de la heredabilidad tiene gran importancia en la patogénesis. Su determinación se dificulta
porque la mayor parte de las malformaciones y enfermedades no presentan una variación continua sino
que se presentan como características umbrales. Esto significa que sólo se manifiestan superando
determinado umbral. El empleo de la concordancia de mellizos homocigotas o hermanos clon en la
estimación de la heredabilidad de la disposición a una enfermedad evita la desviación provocada
cuando se incluye toda la población. Ello se cumple si se garantiza la ausencia de influencias familiaambiente. A través de la elección del material animal adecuado (animales idénticos genéticamente o
emparentados) y del ambiente uterino y post-natal puede aclararse si la expresión del defecto o la
disposición están afectados y en que intensidad por uno o varios loci, componentes genéticos aditivos,
dominantes y/o epistáticos, uterinos, ambientales, penetrancia o expresividad. La realización de este
tipo de estudios está limitada por la complejidad de producir el material animal adecuado, sin embargo
los mismos constituyen el único modelo experimental adecuado para responder a las preguntas sobre la
disposición a enfermedades y a su patogénesis.
Producción animal
Como ya fue mencionado los animales idénticos se adecuan bien para estimar la varianza genética y
las influencias ambientales. Con el material animal adecuado es posible obtener también los valores
estimados de heredabilidad. Otro parámetro que influye sobre la intensidad del progreso genético es la
exactitud de la estimación del valor genético. Aumentos de su exactitud tienen efecto directo en el
incremento del éxito de la selección. En los programas de mejoramiento por medio de la inseminación
artificial los valores genéticos de los machos pueden ser estimados con seguridad en base a la
información obtenida de la descendencia. En cambio la exactitud de la estimación del valor genético de
las hembras es considerablemente menor. Con la información obtenida de dos pruebas de rendimiento
propio de mellizos idénticos es posible aumentar la exactitud de la estimación del valor genético en 40%
para valores de baja heredabilidad (p< 0,1) y para heredabilidades de valor medio (0,2 hasta 0,4) hasta
30%.
La producción de mellizos homocigotas en un programa de mejoramiento por medio de IA tiene efecto
sobre la línea madre-hijo con un aumento de la intensidad de selección anual, dado que el número de
terneros machos por madre de toro aumenta. En programas convencionales de mejoramiento, el
progreso genético absoluto es de 0,173; 0,2 ó 0,21 desviaciones estándar para una reposición de 10, 1
ó 0,1% respectivamente. Con la aplicación de la TE y la MC puede provocarse un aumento de 20-25%
en la línea madre-hijo con una reposición de 1%. Con una tasa de reposición de 10% los valores
ascienden a 40-50% aproximadamente (fig. 1).
En razas productoras de carne los mayores aumentos del progreso genético en un programa de TE
podrían ser alcanzados por medio de la microcirugía. Ese método no cubre, sin embargo, los costos de
la técnica, a pesar del mayor precio de los terneros. Este método es interesante para empresas elite,
cuyos ingresos principales no provienen de la comercialización de ganado destinado a la faena sino a
través de la venta de reproductores de alto valor genético, los cuales pueden alcanzar altos precios. La
producción de mellizos idénticos tiene aspectos muy interesantes cuando se aplican en la producción
de toros. Animales idénticos pueden ser sometidos, por ejemplo, a una prueba de rendimiento propio y
al final pueden ser faenados a fin de recabar la información sobre la composición y calidad de la carne.
A partir de esos datos pueden ser seleccionados sus hermanos idénticos. Precisamente, la información
de las características con alta heredabilidad tiene un significado de importancia.
Por medio de la congelación de los embriones divididos o clonados es posible reducir el tiempo de
espera de los toros en selección. Los toros sometidos a la selección durante 3 años son mantenidos
como "toros de espera" hasta que se dispone de la información de la descendencia y se lleve a cabo la
selección. La espera no solo ocasiona altos costos sino también pérdidas de animales (20%).
Cumplidos los plazos no todos los toros seleccionados están en las condiciones óptimas para la
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Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones
261
reproducción. A través de la transferencia de los embriones y la congelación de los embriones idénticos
es posible, después del nacimiento, recría y evaluación de los animales producidos, llevar a cabo la
selección y recién entonces recurrir a los genotipos congelados.
En la evaluación de las consecuencias genéticas de los programas de clonado debe diferenciarse entre
el valor genético general y el valor clon. Bajo la denominación valor genético general se entiende la
suma de los efectos génicos aditivos que el animal a seleccionar transmite a la descendencia, al ser
cruzado con animales elegidos por azar. Ese valor se refiere a una determinada población. El valor clon
es la suma de todos los efectos génicos (aditivos, dominantes, epistáticos) que conducen al mismo
rendimiento en los hermanos clon bajo las mismas condiciones ambientales. Dado que el parámetro
más importante es el valor genético general, la selección de toros y vacas se lleva a cabo según ese
principio.
Figura 1: Resultados de la selección de una característica en programas de mejoramiento (progreso
genético en desviaciones estándar)
En la aplicación de rutina del clonado de embriones la selección clonada juega un rol decisivo junto con
la selección genética condicionante del progreso genético. De la comparación entre valor clonado y
genético resulta que el clonado no conduce a priori a un mejoramiento del progreso genético. Recién la
combinación de la selección clonada y genética junto con la óptima aplicación de la capacidad de
evaluación conduce a un éxito acumulativo (fig. 2). Por ello es importante aprovechar simultáneamente
las selecciones clonal y genética (cuadro 1).
El éxito de ambas selecciones dependerá, en primer lugar, de la exactitud de la estimación del valor
genético, del valor clonado y de la intensidad de selección. El intervalo generacional en la prueba de las
hermanas puede llevarse a cabo según el modelo del programa MOET para adultos en 4 años (capítulo
XIX). Con una gran similitud entre hermanos clon, 1 ó 2 animales alcanzan para seleccionar el mejor
clon (tabla 2).
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262
Selección
Año
0
4
5a8
Medidas
Según el valor genético:
Padre de toro y
Madre de toro
Recolección y
clonado de
embriones test
Según el valor clon:
Descongelación
de embriones y:
a) Los mejores clones
para la selección a través
de la clonación
a) Reproducción
por medio de
clonado
b) Clones elite para su
reproducción
b) Cruzamientos
entre los animales
evaluados, clones
superiores y
descendientes de
clones hembras
con toros elite
Ventas de los animales de lo clones seleccionados
Fig. 2: Combinación de las selecciones genética y por medio de clonación
Tabla 2: Exactitud de la estimación del valor genético (A) y del valor clon (C) con una h2 = 0,25
(TEEPKER and SMITH, 1989)
Correlación entre
hermanos clon
A
C
1
Número de hermanos probados
2
5
10
0,25
0,50
0,63
0,79
0,88
0,50
0,50
0,58
0,65
0,67
0,80
0,50
0,53
0,55
0,55
0,25
0,50
0,63
0,79
0,88
0,50
0,71
0,82
0,91
0,95
0,80
0,89
0,94
0,98
0,99
Otra situación se cumple con la determinación de los valores genéticos de los clones. Con un aumento
de la diferenciación entre heredabilidad y similitud entre los hermanos clon disminuye la estimación del
valor genético. En un ensayo modelo con mellizos idénticos se llevaron a cabo los siguientes puntos:
-
Prueba de rendimiento propio de engorde de 4 mellizos idénticos.
Empleo de los toros mellizos en la inseminación.
Destino de 12 hijos machos por toro a las estaciones de prueba de descendencia para ser
evaluados en su engorde y rendimiento a la faena.
Destino de 12 hijas por toro para ser evaluadas en su engorde y rendimiento a la faena.
Faena y análisis completo de los toros después de los tests.
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Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones
263
Los análisis llevados a cabo concluyeron, como era esperable, en la existencia de una alta similitud
entre los mellizos homocigotas en el engorde. La similitud varió entre 65 y 80%, lo que significa que el
test de un mellizo permite obtener buena información sobre la predisposición genética del hermano y
eventualmente también de los hermanos clones. Las diferencias entre los grupos de descendientes
machos y hembras fueron extremadamente reducidas para los valores de engorde y faena. La prueba
estadística indicó que esas diferencias entre la descendencia de los pares de mellizos son casuales y
pueden aclararse por medio de la variación de la toma de muestra. En consecuencia, las relaciones
entre la descendencia de los mellizos idénticos son altas. Como es de esperar no tiene importancia qué
mellizos se empleen en el programa de mejoramiento, dado que los valores genéticos producto de la
evaluación de la descendencia deben arrojar los mismos resultados. La correlación entre las pruebas de
rendimiento propio y de la descendencia es muy alta. A partir de esos resultados se supone que el valor
genético aditivo de los toros es predecible por medio de la prueba de rendimiento propio del hermano
mellizo y de los hermanos clones. A través de ello es posible aprovechar mejor las capacidades de
evaluación de las estaciones de prueba de engorde y faena por medio del empleo de la transferencia de
embriones y del clonado que con los métodos convencionales.
TEEPKER y SMITH (1989) llevaron a cabo modelos de cálculos de las mejoras de la eficiencia
esperable con la aplicación de la transferencia de embriones. La selección clonal puede provocar una
mejora de la eficiencia de 1,9 unidades estándar en una ronda de selección (tabla 3). Ello
correspondería a una eficiencia de lactación de 1 500 kg, lo que conduciría a que el rendimiento de los
mejores animales del clon superarían considerablemente los rendimientos de los animales
reproductores de la población. Se debe considerar que los resultados de la selección de clones
posiblemente no puedan ser acumulados como los progresos genéticos a largo plazo. El progreso
genético anual de los programas de IA es de 1% aproximadamente, en programas con una buena
eficiencia hasta 1,5%. Con programas MOET aplicados en madres de toros o programas de núcleos de
producción se pueden alcanzar progresos genéticos de 2 a 2,4%. La selección clonal puede posibilitar,
por otra parte, un progreso genético de 20 a 25%.
Tabla 3: Modelo de cálculo del éxito de selección (genético = A y clonal = c) después de una ronda de
selección (h2 = 0,25 y correlación entre hermanos clon = 0,50; según TEEPKER y SMITH,
1989)
Selección
según
Estructura genética
MH
mH HC
Elevación del
rendimiento
A
Valores relativos
C
A+C
A
4-5
3-5
1,0-1,7
0,528
100
96
99
C
1-4
2-5
3,1-5,0
1,879
70
100
96
C+A
4-5
2-4
1,3-2,5
2,339
96
98
100
Uno de los primeros modelos de cálculo del progreso genético anual con la aplicación del clonado de
embriones fue propuesto por NICHOLAS y SMITH (1983). Los autores compararon el éxito genético con
la producción de grandes clones frente al de un programa de inseminación artificial (fig. 3).
A través de la selección de los padres de los clones es posible alcanzar una ventaja inicial de 4 años
(medidos en progreso genético teórico anual) comparado con el programa convencional por medio de
IA. Después de 3 años se dispone del rendimiento de los clones, los mejores pueden ser seleccionados
y destinados a la población. La descendencia nacida el año siguiente estaría 13-17 años más
adelantada que aquella de un programa de IA. En el mismo año se cruzan los mejores clones entre sí, a
fin de disponer de una nueva ronda de selección en el 8 año. Después de 16 años la diferencia entre la
producción y empleo de los clones y el sistema de selección convencional por medio de la
descendencia sería de aproximadamente 30 años.
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264
En la evaluación de las ventajas genéticas de los programas de clonado se debe diferenciar entre
clones machos y hembras. Los clones machos permiten un progreso genético seguro y eficiente en las
características de engorde y rendimiento a la faena en razas productoras de carne y de doble propósito.
Permiten, además, un mayor y más eficiente aprovechamiento de los toros elite, si se produjeron
embriones idénticos y uno de ellos fue congelado. Existe la posibilidad de estudiar la disposición y
resistencia a enfermedades cuando se dispongan de métodos adecuados para su estudio. Con los
clones hembra sería posible producir grandes grupos de animales que, bajo condiciones ambientales
definidas, estarían 2 desviaciones estándar por encima de la media. Ello significaría para una raza
lechera como Holstein Friesian una garantía de producción de 10 000 kg de leche. En la raza Fleckvieh
sería posible alcanzar una producción de 7 000 kg con un buen desarrollo muscular.
44
Cría y uso de
los clones
seleccionados
Subsecuente
tasa de
respuesta
36
28
Prueba de progenie
20
Padres
de toros
Selección
de los
12
mejores
clones
Posible
respuesta
IA comercial
Respuesta
alcanzada
4
Mejora
genética
0
inicial
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Fig. 3: Posible progreso genético por medio de la producción y empleo de clones seleccionados en
comparación con el ∆G teórico en programas convencionales de selección por medio de la
descendencia (NICHOLAS y SMITH, 1983)
En el futuro, una adecuada combinación de selección clonal y genética podría provocar una marcada
aceleración del progreso genético.
Bibliografía
NICHOLAS, F.W., C. SMITH. 1983. Increased rates of genetics change in dairy cattle by embryo transfer and
splitting. Animal Prod., 36: 341-353.
STICEL, S.L., J.M. ROBL. 1989. Current success in cloning mammalian embryos. Age 12: 83-88.
TEEPKER, G., C. SMITH. 1989.Combining clonal response and genetic response in dairy cattle improvement.
Animal Prod., 49: 163-169.
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Aplicaciones de la transferencia génica
265
APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA GENICA
G. Brem
Introducción
Durante los últimos años se discutieron una serie de áreas de aplicación de la transferencia génica en
los animales domésticos. Hasta el momento sólo se pueden modificar, a través de la transferencia
génica, características genéticas, las cuales están asociadas a pocos genes (cualitativas). Sin embargo
se conocen pocas características en producción animal que son afectadas por los conocidos como
genes simples (genes principales). En las características más importantes de producción y reproducción
se trata, en consecuencia, de las características denominadas cuantitativas, que responden a una
herencia de tipo poligénica.
El hecho que el límite entre las características cuali- y cuantitativas carece de solución de continuidad
fue plenamente demostrado con la producción de ratones transgénicos gigantes. El crecimiento, una de
las clásicas características cuantitativas en producción animal, se convirtió en una característica
cualitativa cuando el gen de la hormona de crecimiento se transfirió en ratones estableciendo un
mecanismo de retroalimentación independiente. En parte, es posible provocar similares efectos también
con la aplicación de somatotrofina bovina en vacas lecheras. A pesar que nuestros conocimientos en
esa área aún son insuficientes, los resultados de esos estudios pueden interpretarse, en el sentido de
una hipótesis de trabajo, que genes principales pueden provocar efectos génicos similares a los aditivos
determinando el rendimiento de una característica, particularmente debido a la gran variabilidad de los
efectos individuales. Según la definición de genética cuantitativa, en el efecto génico aditivo no es
posible reconocer el efecto de un único gen. Esa definición se basa en análisis estadísticos de la
distribución de las características en la descendencia o la población, sin conocimientos de los efectos
génicos que lo motivan. Es de esperar que estudios posteriores puedan aumentar nuestros
conocimientos sobre la determinación y efecto de ciertas características.
En lo que respecta a las áreas de aplicación de la transferencia génica en los animales de interés
productivo existen perspectivas reales de afectar la eficiencia productiva en forma positiva. Actualmente
las actividades en la investigación se concentran en las áreas: crecimiento, resistencia a las
enfermedades, calidad de los productos animales, "gen farming" y nuevos mecanismos o caminos
metabólicos.
Crecimiento
El crecimiento es un fenómeno extremadamente complejo que, dependiendo de la determinación
genética, es influenciado por el efecto conjunto de hormonas y factores auto- paracrinos como también
alimentación y factores ambientales. Desde el punto de vista de genética básica son especialmente
interesantes los genes de proteínas de la cascada hormonal de crecimiento, que se originan en el
hipotálamo o en la hipófisis y que afectan, vía hígado, sus órganos blanco periféricos. Las secuencias
de aminoácidos y genes para esas hormonas proteicas son conocidas y fueron ya clonadas y
secuenciadas.
El comienzo del círcuito neuroendócrino de la hormona de crecimiento se encuentra en el hipotálamo.
Allí se sintetizan la hormona estimulante somato-liberina (GHRH = Growth Hormon Releasing Hormone,
GHRF = Growth Hormone Realising Factor) y la hormona inhibidora somatostatina (SRIF =
Somatotropin Inhibiting Factor Hormone) según un período circadiano y en dependencia de diversos
factores, especialmente de la concentración sérica de diversas hormonas (GH, IGFI, etc.).
La GHRH es un oligopéptido de 43-44 aminoácidos con diferente homología entre las especies que se
sintetiza en los núcleos arcuato y ventromedial del hipotálamo. La SRIF no indica, por el contrario,
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266
Brem
especificidad alguna. Está formada por dos diferentes péptidos de 14 y 28 aminoácidos de largo y se
produce no solo en el hipotálamo sino también en el páncreas y en el intestino.
La hormona de crecimiento (GH = Growth Hormone, STH = Somatotropes Hormone, Somatotropin) es
sintetizada en las células acidófilas del lóbulo anterior de la hipófisis. La misma está compuesta de 190191 aminoácidos y contiene 2 puentes disulfúricos intramoleculares. Junto con la forma 22 kDa se
encuentran en el hombre otras formas (20, 45 y 80-90 kDA). El péptido de señal, originado en la síntesis
primaria, se separa en el retículo endosplasmático. La homología entre la hormona de crecimiento del
bovino y otras especies corresponde, para el ovino en un 99,5% (un aminoácido diferente), cerdo 90,5%
(18 diferentes aminoácidos) la rata y el ratón 87,9 y 87,4 respectivamente (23 y 24 aminoácidos
diferentes) y frente al hombre 66,3% (64 aminoácidos diferentes).
La somatomedina C (IGFI = Insulin-like Growth Factor I), polipéptido básico de 70 aminoácidos y
7,5kDa, es un factor mitogénico subordinado a la hormona de crecimiento. Se sintetiza en el hígado,
riñón, pulmón, corazón, glándula mamaria y la epífisis ósea. De la misma forma fue encontrado en
diferentes células tumorales. La somatomedina tiene efectos endócrino, autócrino y parácrino. La
homología de las secuencias polipéptidas del IGFI entre las especies ya mencionadas es superior al
90%. El IGFI tiene 2 hormonas precursoras ("prepro" IGFIA e IB) que son el resultado de la separación
alternativa del ARN. Las mismas son idénticas en sus terminales amínicas pero se diferencian en sus
terminales carboxiladas.
La liberación de la hormona de crecimiento se produce, como ya fue mencionado, en dependencia de
GHRH y SRIF e indica un marcado episodio circadiano de varios picos. La hormona de crecimiento es
distribuida en el organismo a través de la circulación sanguínea y asociada, principalmente, con
receptores GH del hígado como así también del tejido graso, muscular, renal cardíaco y tejido de
crecimiento óseo. El efecto de la GH varía de acuerdo al balance energético (KARG, 1988). Bajo un
balance energético positivo, la somatotrofina tiene, junto con la IGFI, un efecto anabólico proteico
estimulante del crecimiento. Con un balance negativo predomina un efecto lipídico catabólico. El factor
IGFI tiene un efecto estimulante sobre la síntesis de ADN, la tasa de división y la diferenciación celular
como así también sobre la síntesis de proteína.
La aplicación de hormonas de crecimiento en producción animal fue estudiada intensamente a partir de
la disposición de somatotrofina producida en forma recombinante. En un gran número de trabajos se
señaló que después de la administración de la hormona de crecimiento se alcanzaron efectos positivos
en el mejoramiento de los parámetros de rendimiento del crecimiento (aumento de peso diario,
conversión del alimento, distribución de la grasa y de rendimiento lechero).
En el año 1982, como ya fue mencionado, fueron producidos ratones transgénicos con la hormona de
crecimiento. En esos ratones se observó un enorme aumento del potencial de crecimiento con una
multiplicación de su velocidad y una duplicación del peso final. En la actualidad existen numerosas
publicaciones sobre animales transgénicos de interés productivo, los cuales contienen y exprimen
genes de la familia de la somatotrofina. En la especie bovina no se ha publicado aún la producción de
un animal transgénico con efectos comprobados de la hormona GH.
Al contrario de los resultados publicados sobre ratones transgénicos con GH y sobre tratamientos de la
misma hormona en animales de interés zootécnico se observó, con sorpresa, que los cerdos
transgénicos con los genes MT-hGH y MT-bGH no presentaban aumento de crecimiento. El rendimiento
de los cerdos transgénicos tendió a ser ligeramente menor que el de los animales control cuando los
animales tratados fueron alimentados con una ración normal de 16% de proteína cruda. En la actualidad
se conoce que para mejorar la eficacia del crecimiento de estos animales transgénicos se los debe
alimentar con una ración rica en proteína (18% de proteína cruda) con el complemento de lisina.
Después de una alimentación consecuente de la descendencia transgénica con una ración rica en
Aplicaciones de la transferencia génica
267
proteínas se observó que, efectivamente, se producía un aumento de la ganancia de peso de 16,5%
(PURSEL y col., 1988; 1989).
Otro problema de la aplicación de la somatotrofina en los animales domésticos se origina en la
depresión de la ingesta en aproximadamente un 20% que se contrapone al aumento del crecimiento.
Cerdos transgénicos GH muestran una clara mejora de la conversión alimenticia hasta el 18%. El
cambio más marcado es sin duda la reducción masiva de la grasa corporal. El espesor de la grasa
dorsal se reduce de 18-20mm a 7-8mm (HAMMER y col., 1986, PURSEL y col., 1989 y 1990).
La redistribución de los nutrientes (nutrient portioning) es el aspecto más positivo de los cerdos
transgénicos. El crecimiento es el resultado de la hiperplasia de células diferenciadas y su posterior
hipertrofia. Cuando un tejido se ha diferenciado y su contenido de ADN es relativamente estático, el
crecimiento es el resultado de la concurrencia de la hipertrofia de distintos tejidos y de la disponibilidad
de sustancias nutritivas. Según un modelo de HAMMOND (1952) los tejidos neural y óseo tienen
prioridad aún con baja disponibilidad nutricional. Los tejidos muscular y graso se hipertrofian, de
acuerdo a su potencial genético, frente a una sobreoferta nutricional (STEELE y PURSEL, 1990). La
práctica de la producción animal está concentrada en la obtención óptima de tejido muscular con
reducido contenido de grasa intramuscular y moderado crecimiento del tejido graso. Dado que en
nutrición animal existe la sensación que la capacidad genética está agotada con los estándares
nutricionales actuales, existe ávido interés en la aplicación de la transferencia génica y en tratamientos
con la hormona de crecimiento. No existe, sin embargo, camino seguro mediante el cual se pueda
lograr -vía transferencia génica- un mejoramiento de la distribución grasa intramuscular y con ello del
sabor de la carne.
El mecanismo de acción de la somatotrofina no está aclarado totalmente. Junto con los efectos directos
sobre el metabolismo celular existen una serie de efectos indirectos a través de mediadores
secundarios. El factor IGFI es responsable, por ejemplo, de numerosos efectos anabólicos de la
hormona de crecimiento. La influencia directa de esta última sobre el metabolismo lipídico conduce a
una reducción de la conversión de la glucosa, a la inhibición de la síntesis lipídica, aumenta el
metabolismo lipídico y conduce por esa vía a una reducción del depósito graso de los animales tratados
con GH. En forma sincrónica con el efecto inhibidor de la hormona de crecimiento sobre el tejido graso
se provoca una estimulación del crecimiento adicional del músculo por una adaptación el organismo a
su nuevo estatus. Los lípidos destinados originalmente a las reserva grasa son metabolizados para
colaborar con la síntesis proteica.
En un experimento se empleó un promotor de la prolactina bovina con el gen de la hormona de
crecimiento de la misma especie en el cerdo. Los cerdos transgénicos producidos tuvieron una
concentración de GHb dentro de los niveles fisiológicos de 20 ng/ml y su crecimiento fue normal. La
liberación episódica fué lograda a través de sulpirida, un antagonista de la dopamina y a través de TRH
(Thyreotropin Realising Hormone). Según ello el transgen está subordinado al mecanismo normal de
retroalimentación de la prolactina (POLGE y col., 1990).
Ovejas transgénicas GH y GHRH mostraron un incremento del nivel de hormona de crecimiento pero no
un aumento del crecimiento (REXROAD y col., 1990). La aplicación del promotor de la metalotionina Ia
y del gen de la hormona de crecimiento de la oveja condujo, de la misma forma a un aumento del nivel
sanguíneo de la hormona de crecimiento (NANCARROW y col., 1990). Mientras la velocidad de
crecimiento no fue afectada, el contenido graso de la reses ovinas contenía menos grasa (5-7%) que los
animales controles (25-30%).
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268
Resistencia a las enfermedades
Resistencia, cualidad adquirida genéticamente, es la insensibilidad de las especies, razas o animales
frente a determinados microorganismos, parásitos o toxinas. Dado que los costos producidos por las
enfermedades en los animales de interés productivo corresponde a un 10% del valor de la producción,
cobra importancia junto con la profilaxis también la producción de animales resistentes. Lamentablemente, la selección por resistencia a las enfermedades no está libre de dificultades. En muchos casos si
bien la variabilidad de la predisposición a enfermar varía en forma discontinua, no se hereda según las
leyes de Mendel. Con frecuencia la predisposición a una enfermedad es un característica con valor
umbral y una variación continua pero no reconocible. Los animales con un valor de la predisposición por
debajo del umbral son sanos, aquellos con un valor mayor serán afectados por la enfermedad. Frente a
esa situación se desarrollaron estrategias genéticas para la selección de la característica "presencia o
ausencia". Las mismas tendrán un éxito satisfactorio mientras no sea posible producir una característica
con varias clases o con una variación diagnosticable.
Los primeros estudios sobre resistencia y predisposición a las enfermedades se llevaron a cabo hace
algunos años. Una serie de resistencias a enfermedades son caracteres poligénicos, como por ejemplo
la tolerancia a la tripanosomiasis de algunas razas africanas, las cuales son también muy rústicas y
resistentes al calor. Por otra parte existen mecanismos de resistencia, que dependen de un solo gen
como lo es la resistencia a la diarrea neonatal de los cerdos, provocada por E. coli K 88, y la resistencia
a la influenza del ratón.
Los mecanismos de defensa contra agentes infecciosos pueden ocurrir, por ejemplo, a través de la
modificación o pérdida de receptores. Esto impide la penetración del agente patógeno. El ingreso o la
reproducción de los agentes patógenos son afectados por mecanismos generales de respuesta
inmunitaria y expresión del MHC. Esas resistencias son en general muy complejas. Diferentes
moléculas como interferon, neuropéptidos, interleuquinas y hormonas fueron estudiadas en sus
propiedades inmunomoduladoras. La respuesta inmunitaria humoral puede correlacionarse en forma
negativa con la actividad microbicida de los macrófagos. Es conocido que los productos génicos del
MHC desempeñan un rol importante en la respuesta inmunitaria y que influyen la resistencia y
predisposición frente a enfermedades. Ya se han encontrado asociaciones de haplotipos MHC con
determinadas enfermedades en los animales domésticos.
El Instituto de investigación en genética animal (DLO) de Holanda pretende aumentar la resistencia a la
mastitis bovina (especialmente producida por E. coli), aumentando los niveles de lactoferrina en el tejido
mamario a través de transferencia génica.
Para los programas de transferencia génica se consideran fundamentalmente 5 clases de genes
mamíferos:
-
MHC
del receptor de las células T
de la inmunoblobulina
linfoquina
especiales de resistencia a enfermedades.
Un comienzo interesante en el desarrollo de resistencia contra infecciones virales es la denominada
"inmunización intracelular". La inmunización automática sería posible a través de la expresión de partes
proteicas, integradas como transgenes, con efecto antígeno. Junto con esa posibilidad se podrían
transferir también genes de anticuerpos reorganizados (inmunización genética). En un ejemplo de un
antígeno que en condiciones naturales no está presente en ratones, conejos y cerdos se demostró que
la expresión de transgenes puede conducir a altos títulos de anticuerpos (WEIDLE y col., 1991).
Aplicaciones de la transferencia génica
269
La producción de animales transgénicos constituye una técnica particular pero también prometedora
contra infecciones virales. Los animales transgénicos contienen genes antisense, los cuales actúan
contra el virus. A través de la expresión del RNA antisense (RNAas), el cual debe estar presente
intracelularmente en abundancia, se produce la hibridación con el RNA sense y con ello una inhibición
de la replicación del genoma viral. ERNST y col. (1990) describieron la producción de conejos
transgénicos, los cuales exprimian RNAas contra adenovirus H 5 (Ad 5). Aún queda por aclarar, en qué
medida los animales transgénicos están protegidos contra la replicación viral. Al menos en el cultivo
celular pudo demostrarse que las líneas celulares, conteniendo el RNA as fueron 90-98% más
resistentes contra Ad 5 que las líneas celulares normales. Actualmente se trabaja en la aplicación de
esa particularidad en los bovinos transgénicos.
La transferencia génica representa, sin lugar a dudas, un interesante y seguramente prometedor
método de reducir, en forma exitosa, la disposición a enfermedades provocadas por determinados
agentes patógenos. No obstante debe destacarse que es necesario aún llevar a cabo una intensa
investigación básica en genética molecular para que dichas técnicas sean empleadas con éxito en la
práctica.
Calidad de los productos animales
La mejora de la calidad o composición de productos animales a través de la transferencia de genes
podría abrir nuevos caminos en la producción animal. Un modelo propuesto por MERCIER (1987)
contempla la reducción del contenido de lactosa en la leche. Con la producción de vacas transgénicas,
que posean el gen de la lactasa acoplado a un promotor específico de la mama, se podría lograr la
metabolización de la lactosa en glucosa y galactosa; permitiendo que personas que sufren de
intolerancia a la lactosa puedan consumir leche. Ello tendría singular importancia en los países en vías
de desarrollo, donde más del 90% de la población adulta sufren de intolerancia a la lactosa y los
métodos de separación son difíciles o imposibles de llevar a cabo.
BREMEL y col. (1989) discutieron otras posibilidades de modificación del contenido de la leche (cuadro
1). Además de la producción de otras proteínas, las cuales pueden ser aisladas independientemente de
su localización original, se piensa en una modificación de la composición de la leche per se. De esta
forma sería posible modificarla a fin de poderla emplear con mejores resultados en la alimentación del
bebé.
Gene farming
Como ya fue explicado, es posible que la expresión génica puede producirse solamente en un órgano
determinado, a través de la combinación de genes con elementos reguladores específicos. De esta
forma es evidente que genes unidos a promotores de proteínas de la leche se expriman en primer lugar
en las células mamarias.
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270
Cuadro 1: Posibilidades de modificación de la composición de la leche (BREMEL y col., 1989)
Objetivo
Genes
Aumento del contenido proteico
Caseina
Posibilidades de procesamiento
Variantes de caseina o variantes de
caseina manipuladas
Leche libre de β-globulina
β-globulina anti-sense
Reducción del contenido graso
Acetil-CoA-carboxilasa
Mayor contenido de materia seca
β-galactosidasa, Lactasa
Prevención de mastitis
Genes de anticuerpos
En consecuencia de ello, si la translación del RNAm, el transporte de las proteínas y la sección de los
péptidos de señal funcionan consecuentemente, la proteína codificada por el gen se fracciona en el
alvéolo mamario y se obtiene, como producto gentecnológico, en la leche ordeñada. De ello surge la
pregunta: porqué debe optarse por animales mamíferos como "bio-reactores" para la producción de
importantes proteínas genéticas, en lugar de producir esas sustancias con el cultivo de E. coli u otros
microorganismos? Los siguientes argumentos respaldan el empleo de la glándula mamaria como
órgano productor de proteínas extrañas:
- Muchas proteínas necesitan para su funcionalidad -en parte- amplias modificaciones
postranslacionales (por ejemplo: glicosidación, hidroxilación β o carboxilación β). En muchos casos
ello no es posible en los sistemas recombinantes simples desde E. coli a S. cervesiae o lo es en una
forma insuficientemente precisa. Las proteínas producidas de esta forma pueden modificase
convirtiéndose en antígenos, por un lado, por el otro pueden faltarles una actividad o tenerla
incompleta.Los animales mamíferos están en condiciones, contrariamente a los sistemas
procarióticos de producción, de establecer las modificaciones postranslacionales en las proteínas
nuevas. No fue aclarado hasta el momento en qué medida es posible llevar a cabo esa producción
con células in vitro en forma idéntica a la de las células en sus órganos de origen (p. e.: hígado).
- La expresión de proteínas extrañas en la leche es un sistema en el cual el producto puede obtenerse
en forma convencional a través del ordeñe y sin perjuicio de los animales empleados.
- La capacidad de síntesis de la glándula mamaria es considerable. La concentración de la suma de
proteínas lácteas endógenas es de 4-6%. Aún cuando no sea posible producir 60 g de proteína
recombinante en un litro de leche, a través de gene farming, las cantidades de 1 y 2 µg/l son
suficientes para obtener importantes cantidades de proteínas de alto valor farmacéutico con vacas de
alta producción.
- La leche es un producto de alta pureza e higiene. No deberían presentarse problemas insolubles en
la aislación de las proteínas extrañas de la leche. Se evita en particular la presencia de restos
procarióticos y residuales en las proteínas purificadas.
Para el empleo de la glándula mamaria como bio-reactor es necesario la presencia de los elementos
regulatorios clonados. Ya fueron aislados los genes y promotores para la caseína alfa s1, caseina ß,
lactoalbúmina alfa, lactoalbúmina ß y la proteina whey acidi (WAP) en algunas especies incluida la
bovina. Se pudo demostrar que casi todos esos genes se exprimen con especificidad de tejido, aún en
animales transgénicos de otras especies. Aparte del ratón fue posible comprobar, en parte, alto
contenido de proteína extraña en conejos, ovejas, cabras y cerdos transgénicos. Es necesario continuar
Aplicaciones de la transferencia génica
271
con la investigación, sin embargo la posibilidad básica de lograr una valorable expresión, traducida en
algunos gramos por litro de leche fue comprobada en varios experimentos.
De acuerdo a los conocimientos actuales, las proteínas segregadas por la glándula mamaria aparentan
ser más activas biológicamente. La posibilidad y medida de las modificaciones no ha sido aclarada
completamente. Se puede suponer que ese sistema significará un importante aporte de proteínas de
alto valor en medicina.
Nuevas vías metabólicas
Un área de importancia, en el cual la transferencia génica afectará la productividad es la modificación
de las vías metabólicas. WARD y col. (1986) pensaron especial-mente en la reconstitución de vías
metabólicas presentes normalmente pero perdidas en determinadas especies como así también en la
incorporación de nuevas vías que hasta el momento no fueron observadas. Ello significaría que los
genes necesarios para esa vía metabólica deben obtenerse de otras fuentes y que antes de la
transferencia deben ser preparados para la expresión en organismos mamíferos.
El interés se concentra en la modificación de vías metabólicas por medio de la introducción de métodos
biosintéticos para elementos esenciales. Se conoce que el aminoácido cisteina es un substrato limitante
de la síntesis de lana en la oveja y que no es posible aumentar su concentración sérica con medidas
nutricionales porque la cisteina excedente es eliminada en el rumen. Por esa razón sería ventajoso si
ovejas transgénicas pudiesen sintetizar cisteina. Para ello deben aislarse los genes para la serina
transacetilasa y la acetil serin acetilasa de procariotes y transferirse a la oveja con nuevos elementos
regulatorios. Las ovejas transgénicas deberían estar en condiciones, de acuerdo a su nueva vía
metabólica transgénica, de sintetizar la cisteina en el epitelio ruminal, empleando H2S, y transportarla a
los folículos.
Un segundo camino propuesto por WARD y col. (1986) sería la vía metabólica de glicoxilato, que
permitiría a los ovinos sintetizar glucosa a partir de acetato. Ello es interesante por que todos los
rumiantes emplean la glucosa como fuente energética para determinados tejidos (cerebro, feto) pero
carecen de una fuente suficiente para ese sustrato. En consecuencia los rumiantes deben sintetizar la
glucosa a partir de aminoácidos y de los ácidos libres como propionato. El isositrato se forma a partir de
acetato y oxalacetato y bajo la influencia de isotratliasa se forma glicoxilato y succinato. De dos
moléculas de acetato se origina una de succinato.
No debe quedar sin mencionar que la introducción de estas nuevas vías metabólicas no es simple y que
deben considerarse y cumplirse una serie de condiciones complementarias. Debe pensarse tan sólo en
la localización y disponibilidad de las enzimas correspondientes. Un interesante hallazgo en relación
con el desarrollo de nuevas vías metabólicas se llevó a cabo en una línea de ratones transgénicos, que
poseían 250 copias de un filamento intermediario del gen de la queratina ovina. En esa línea murina se
observó la caída y crecimiento cíclicos del pelo, originados por el desbalance provocado por el aumento
del nivel del filamento intermediario queratina y el consecuente nivel reducido de proteínas asociadas al
filamento (POWELL y ROGERS, 1990). La consecuencia genética del problema descrito, como
consecuencia del origen de mosaicos o mutantes de inserción, es que para la incorporación de un
determinado gen en una población no alcanza la producción de un sólo animal transgénico.
Independientemente de que a través de ello se puedan originar problemas de consaguinidad, las
posibilidades de crear una línea funcional con un sólo animal transgénico son muy reducidas. Para que
una línea transgénica pueda ser empleada con éxito en producción animal debe cumplir las siguientes
condiciones:
Transmisión estable del transgen a la descendencia.
Estar libre de mutaciones de inserción y poder producir animales transgénicos homocigotas.
Expresión estable del transgen y efecto biológico positivo de la característica deseada.
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272
De ello surge que deben producirse por lo menos 5 a 10 animales transgénicos primarios para
establecer, con alta probabilidad, líneas transgénicas que respondan a los objetivos.
Para la producción de líneas transgénicas el objetivo genético y la velocidad en que pueden producirse
esos cambios (progreso genético) son definitivos en el resultado final. Un análisis de costos, similar a
los efectuados en los programas de mejora genética tradicionales, puede llevarse también a cabo para
los cambios genéticos transgénicos. Si la finalidad genética de la transgénesis comprende
características que son consideradas en una programa genético tradicional, es necesario comparar el
progreso genético posible con y sin líneas transgénicas. En las especies bovina y porcina la
comparación indicó que en las líneas transgénicas es necesario un aumento del progreso genético de
5,5 a 16,5%, según cual sea la característica productiva (BREM, 1989), para alcanzar el progreso
genético adecuado en el mismo lapso que se alcanza con la IA (cuadro 2).
Cuadro 2:
Progreso genético necesario en las líneas transgénicas para producir la misma mejora
del rendimiento que en los mejores programas de selección por medio de la inseminación
artificial (BREM 1989)
Promedio
Progreso
genético anual
esperado %
Años necesarios
para producir líneas
transgénicas (F3)
Efecto transgénico
esperado %
Cantidad de leche
6000 kg
1,5
11
16,5 (= 960 kg)
Aumento de peso
diario
1200 kg
1,5
11
16,5 (= 200 g)
60%
0,5
11
5,5 (3,3%)
Grasa dorsal
20 mm
2,0
4
8% (0 1,6 mm)
Aumento de peso
diario
700 g
2,5
4
10% (= 70 kg)
Rendimiento
cárneo
57%
1,5
4
6% (0 3,4%)
Característica
Bovino
Rendimiento
cárneo
Cerdo
De ello se concluye que en aquellas características de trascendencia en programas de mejoramiento
genético por medio de IA, es necesario un alto efecto biológico del transgen para alcanzar el mismo
progreso genético. Dado que, de acuerdo a la experiencia obtenida, los efectos génicos tienen con
frecuencia efectos colaterales no deseados, la finalidad productiva de los animales transgénicos son las
características que no pueden mejorarse con los programas de mejoramiento tradicionales o lo son en
forma insuficiente (como por ejemplo como consecuencia de la baja heredabilidad). Esas características
son las que afectan la resistencia a las enfermedades o a la calidad de los productos animales.
La aplicación de líneas transgénicas para el mejoramiento comercial o nacional no requiere de medidas
genéticas especiales. Junto con el efecto del transgen el pool genético inicial (pedigree o población
núcleo) es de definitiva importancia. Con los altos costos y esfuerzo que requiere la producción de
líneas transgénicas, la selección de los animales para la transferencia génica es de suma importancia.
Como medida de seguridad se recomienda establecer de cada línea transgénica un banco genómico,
en forma de semen y embriones congelados. Las líneas transgénicas se adecuan especialmente para
Aplicaciones de la transferencia génica
273
las líneas paternas, porque la difusión del transgen es relativamente fácil a través de la IA o el servicio
natural. Particular-mente cuando el alelo transgénico tiene efecto en su forma más simple (genotipo
TO).
El desarrollo de un pool transgénico en un rodeo núcleo de producción o programa de mejoramiento
con MOET fue discutido por SMITH y col., (1987). Los conocimientos actuales no son suficientes aún
como para hacer definiciones sobre los efectos de la acumulación de los alelos transgénicos en un pool
genético.
La producción de líneas transgénicas exige del esfuerzo técnico, en laboratorios adecuados para ese,
fin y de personal altamente calificado. Firmas productoras de líneas maternas y paternas, como ya
existen en las producciones avícola y porcina, como así también el trabajo conjunto entre estaciones de
IA y Asociaciones de productores deberían estar en condiciones de proporcionar el adecuado marco
organizativo y las inversiones necesarias. La incorporación de otros métodos biotecnológicos como la
producción de quimeras de la hilera germinal con clones embrionarios a través de la transferencia
nuclear de embriones totipotentes o de células primordiales embrionarias (cap. XIV) en ovocitos
enucleados podría tener un efecto importante en el futuro. Esa combinación uniría las ventajas
genéticas del clon embrionario (cap. 12) con las de las líneas transgénicas (cap. 13).
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Kräusslich
275
PROGRAMA DE NUCLEOS GENETICOS CON LA APLICACION DE METODOS REPRODUCTIVOS
BIOTECNOLOGICOS
H. Kräußlich
Introducción. Selección tradicional a través del registro de pedigree
El pedigree tradicional fue desarrollado en Inglaterra entre los siglos XVIII-XIX y a partir de allí se
distribuyó por todo el mundo. La población bovina se divide en animales reproductores (Registro de
pedigree) y productores. Ello se puede representar en una pirámide (fig.1). El progreso genético
alcanzado a través del registro de pedigree se transfiere al resto del rodeo por medio de la venta de los
reproductores.
Toros
Registro de pedigree
Rodeo puro por
cruza y general
Fig. 1: Programa tradicional de mejoramiento
Las condiciones para un moderno registro de pedigree junto con la definición de un objetivo productivo
uniforme, son:
a. Identificación de los toros, vacas y terneros (caravanas, tatuajes).
b. Registro de los servicios naturales (monta), inseminaciones artificiales y los nacimientos (notificación
del nacimiento).
c. Registro de la ascendencia a partir de los certificados de servicio y de nacimiento (certificación a
través de la determinación del grupo sanguíneo o del ADN-fingerprinting).
d. Tests de producción para las características establecidas en los objetivos.
e. Evaluación fenotípica de acuerdo a los estándares de la raza.
f. Selección (registro en el libro de pedigree) y apareamiento de los animales, que responden a las
exigencias establecidas.
Selección por medio de la inseminación artificial
En poblaciones con un alto porcentaje de inseminaciones artificiales y con una parte aceptable de su
población bovina bajo pruebas de selección, se establecieron los programas de selección por medio de
la inseminación artificial bajo la base del registro de pedigree. Los programas de selección se basan en
el modelo de 4 líneas (fig. 2). Los reproductores machos y hembras con cualidades por encima de la
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276
media son destinados a ser los padres de las vacas (PV) y madres de las vacas (MV). El cruzamiento
de padres de toros con madres de toros será para cubrir la próxima generación de toros de prueba.
Progreso genético
Madres de
toros
Padres de
toros
Padres de
vacas
Madres de
vacas
Descendencia
Fig. 2: Programa de selección empleando el modelo de 4 líneas
El progreso genético en programas de selección por medio de inseminación artificial puede ser
estimado según el modelo de RENDEL y ROBERTSON (1950) de la suma del éxito de selección (SE)
de las cuatro líneas de selección y de la suma de los cuatro intervalos generacionales:
SEPT + SEPV + SEMT + SEMV
SE/t = -----------------------------------------------TPT + PV + TMT + TMV
SE/t
T
PT
PV
MT
MV
= Exito de selección anual
= Intervalo generacional
= Padres de toros
= Padres de vacas
= Madres de toros
= Madres de vacas
El éxito de la selección (SE) está influenciado por la intensidad de selección (dependiente de la tasa de
selección), la exactitud del valor de la heredabilidad y la desviación estándar.
SE
SE
i
rAI
= i. rAI . sA
= Exito de la selección por generación
= Intensidad de la selección
= Desviación estándar aditiva
La figura 3 muestra el esquema general del programa de selección por medio de la inseminación
artificial basado en el modelo de las cuatro líneas.
En la producción de leche las características de selección más importantes se marcan solamente en las
hembras. Por esa razón se emplea el test de las hijas para la estimación del valor genético de los toros.
(Exactitud del valor génico= rAI = 0,8 hasta 0,9), a través del cual el intervalo generacional se prolonga
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277
de 2-3 a 6-7 años con servicio natural. En la producción bovina para carne es posible determinar el valor
genético de los toros y vacas exclusivamente a través del rendi-miento propio y del test de los
hermanos, lo que permite acortar el intervalo generacional (2-3 años).
La tabla 1 da un panorama del progreso genético para la producción de bovinos para leche en
programas de mejoramiento por medio de inseminación artificial bajo condiciones adecuadas.
Madres de toros
Madres con registro
genealógico
Terneros
Vacas en
producción
Toros sometidos al
test de rendimiento
propio
Toros test IA
Toros
Semen
Padres de toros
Fig. 3: Esquema de un programa de mejoramiento por medio de inseminación artificial
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278
Tabla 1: Progreso genético esperado por año para el ganado lechero
Condiciones iniciales
Rendimiento promedio
Heredabilidad (h2)
Coeficiente de variación
5000 kg
25 %
15 %
Toros
Número de padres
(rendimiento de la descendencia
Número de madres
(rendimiento propio)
Exactitud de la estimación del
valor genético (rAI)
Toros (%)
Vacas (%)
Selección de
vacas
50
50
3
2
88
66
88
66
Tasa de selección (% seleccionado)
Toros
Vacas
1:20
1:50
1:5
9:10
Intensidad de selección (i)
Toros
Vacas
2,1
2,4
1,4
0,2
Intervalo generacional (años)
Toros
Vacas
7
6
7
4
Progreso genético esperado (%)
1,5
La aplicación de la transferencia de embriones en programas convencionales de mejoramiento para
razas lecheras y de doble propósito se basa fundamentalmente en la línea madre de toro en test (fig. 2).
CUNNINGHAM (1976) concluyó que un aumento del numero de terneros de 1 a 10 por madre de toro y
por año conduciría a un aumento del progreso genético anual de 8% en las razas productoras de leche.
Dado que los programas de mejoramiento convencionales por medio de inseminación artificial provocan
un progreso genético de 1,5%, puede considerarse ese aumento como reducido. El estudio sobre el
efecto de la transferencia de embriones en programas de mejoramiento por medio de inseminación
artificial para razas bovinas de doble propósito estableció que es posible incrementar entre 5-10% el
progreso genético por año tanto para la característica producción de carne como de leche KRÄUßLICH
(1976). La tabla 2 muestra los valores esperados de progreso genético comparando el servicio natural
con la transferencia de embriones.
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Tabla 2: Progreso genético esperado anualmente para razas bovinas de producción de carne
Condiciones
inciales, aumento
diario de músculo
Eficiencia media
Heredabilidad (h2)
Coeficiente de
variación
1000 g
30 %
60 %
30 %
10 %
5%
Servicio natural
Exactitud de la
estimación del valor
genético (rAI)
Aumento
diario
(g)
63
TE
Músculo
(%)
Aumento
diario
(g)
Músculo
(%)
55
63
55
Descendencia/vaca
1
4
Intervalo
generacional (años)
Toros
Vacas
2
3
2
3
Selección
Toros
Vacas
1:10
1:1
1:20
1:3
Intensidad de
selección (i)
Toros
Vacas
1,8
0,0
2,1
1,1
Progreso genético
esperado por año (%)
1,4
0,5
2,6
1,0
La tabla 2 indica que con el servicio natural practicado en los bovinos para producción de carne se logra
el mismo progreso genético en la característica ingesta diaria (casi la misma heredabilidad que
rendimiento lechero) que en el ganado lechero bajo un programa de mejoramiento por medio de
inseminación artificial. La causa principal es que el intervalo generacional de los toros es
considerablemente más corto (2 años en bovinos de carne frente a 7 años en bovinos lecheros). La
transferencia de embriones permite, con tasas de éxito aceptables, un aumento del progreso genético
de casi un 100%, como consecuencia de la drástica reducción de la tasa de selección.
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núcleos
Núcleos de producción con transferencia de embriones (Programa-MOET, Multiple-ovulationembryo-transfer)
La producción de bovinos en núcleos exige la formación de rodeos núcleos con toros y vacas elite como
así también llevar a cabo tests de rendimiento y la selección en esos rodeos. Los programas de
superovulación, transferencia de embriones y división microquirúrgica para la producción de mellizos
idénticos pueden ponerse en práctica de dos maneras:
a. Para la formación del rodeo de excelencia (núcleo), con el objeto de concentrar los mejores genotipos
hembra.
b. Para aumentar la intensidad de selección (i) y la exactitud de la estimación del valor genético (rAI) del
rodeo núcleo, con el fin de acelerar el progreso genético.
En países con programas eficientes de mejoramiento con el empleo de IA será difícil lograr mejoras
considerables, a través de programas de núcleos de producción, para las principales características:
cantidad y contenido de la leche, consumo diario, peso a la faena (CUNNINGHAM 1976, KRÄUßLICH,
1976). Las ventajas de los núcleos de producción las constituyen en esas razas las características:
conversión del alimento, resistencia a las enfermedades y fertilidad. Esas características pueden ser
controladas con suficiente seguridad sólo en establecimientos ganaderos, cuyo manejo y productividad
pueden ser programados y dirigidos directamente por el responsable de la producción (Estaciones de
prueba). Ello es común en núcleos de producción de empresas productoras de aves o cerdos, no así en
las Uniones de productores privados como las Asociaciones de las diferentes razas, organizaciones
para la prueba de los reproductores e inseminación artificial.
La TE hace posible trabajar también en la producción animal con núcleos de producción. Los programas
MOET son también adecuados para regiones con una reducida concentración de tests de rendimiento
como también de inseminaciones, dado que permiten llevar a cabo un programa de selección efectivo
con progresos genéticos aceptables a pesar de la falta de infraestructura. A continuación se discutirán
algunas formas de MOET:
- Programas de TE para los rodeos
- Programas MOET cerrados para razas bovinas productoras de carne
- Programas MOET cerrados para razas lecheras y de doble propósito
- Programas MOET abiertos
Programas de TE para los rodeos
En los programas para rodeos aplicando TE el principal aspecto genético para la aplicación de la
transferencia de embriones se basa en la línea madre-hija. Para el sevicio o inseminación se eligen los
mejores toros de la población total de esa raza. Los programas de mejoramiento de los rodeos son
especialmente adecuados para productores que quieren mejorar genéticamante su rodeo a través de
una rápida reproducción de las mejores vacas. BREM (1986) desarrolló un modelo para la aplicación de
la transferencia de embriones y la división microquirúrgica para producir mellizos idénticos. Las vacas
adecuadas para la recolección de los embriones serán donantes destinadas al rodeo seleccionado. Las
vacas que, desde el punto de vista genético, no son adecuadas para la TE serán empleadas como
receptoras, las que no son adecuadas para la recolección de los embriones serán inseminadas.
Finalmente se emplearán las vaquillonas recriadas como receptoras.
El éxito de la selección de este programa empleando siempre el mismo toro y comparándolo con el
servicio natural y la inseminación artificial, depende del número de embriones transferibles obtenidos de
cada donante, de la tasa de preñez y en el caso de la división microquirúrgica de la tasa de mellizos
producidos (fig. 4).
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281
GT = progreso genético de la generación de terneros
rIA = exactitud del valor de estimación de la varianza
SA = desviación estándar genética aditiva
TP = tasa de preñez
TM = tasa de mellizos
Fig. 4: Superioridad genética de la descendencia empleando transferencia y microcirugía de
embriones en un rodeo lechero (BREM, 1986)
En la tabla 3 se indica la mayor producción de terneros con el empleo de la transferencia de embriones
y de la división microquirúrgica con diferentes tasas de éxito como también diferentes tasas de éxito del
programa de TE, de la preñez obtenida y de mellizos producidos.
Con el aumento de la tasa de éxito de la transferencia de embriones desciende el porcentaje de
animales seleccionados, aumenta la eficacia de la selección y en consecuencia el éxito final del
programa.
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282
Tabla 3: Mayor producción porcentual de terneros por medio de la aplicación de TE-MC con diferentes
tasas de éxito.
Número de
embriones
transferibles
Producción
de mellizos
preñez
0,5
0,4
12,8
0,5
16,0
0,6
19,2
0,6
15,4
19,2
23,0
0,5
15,4
19,2
23,0
0,6
18,4
23,0
27,7
0,5
16,5
20,6
24,7
0,6
19,8
24,7
29,6
2
4
6
La superioridad genética de la descendencia aumenta con el incremento de la eficacia de la TE-MC y
alcanza, con una producción de 6 embriones, una preñez y producción de mellizos de 0,5; 68% más
que en un programa sin TE-MC.
La división microquirúrgica posibilita la aislamiento de los blastómeros para la determinación del sexo
por medio del método de PCR. De esta forma pueden ser transferidos en primer lugar embriones
hembra y así incrementar el reducido potencial de receptoras disponibles. En general coinciden todos
los trabajos publicados sobre programas de mejoramiento de rodeos en que el éxito de la selección
sobre la línea vaca-vaca empleando la TE puede ser incrementado considerablemente. El factor
limitante lo constituyen los costos de la transferencia de embriones (FEWSON, 1989).
Programas MOET cerrados para razas bovinas productoras de carne
LAND y HILL (1975) fueron los primeros en presentar un modelo de núcleo en bovinos productores de
carne, empleando transferencia de embriones, para la selección de caracteres en animales en
crecimiento. El modelo se basa en el empleo de un número fijo de vacas en el núcleo y en el destino
como receptoras de las vacas no seleccionadas. La intensidad de selección en la línea de vaca a vaca
depende del número de terneros obtenidos por donante y del tamaño del núcleo (ver tabla 3). Para
ambos sexos se establece el principio de selección individual y en masa (rendimiento propio) y el
intervalo generacional se puede acortar hasta dos años. La comparación del progreso genético entre el
programa de núcleo y el convencional de mejoramiento la constituye la característica peso vivo a los 13
meses (h2 = 0,5 desviación estándar = 40 kg). En el programa de mejoramiento de la British Meat and
Livestock Commision (MLC 1971) se esperaba en 1971 un progreso genético de 9 kg de peso vivo.
En un lapso de 20 años y con una consanguinidad tolerable de 10% (0,5% anual) sería necesario un
rodeo de 500 hembras, destinando 1 toro cada 8 donantes. Reduciendo el rodeo a 300 vacas y
empleando 4 donantes/toro se logra un 90% del valor máximo del progreso genético. La fig. 5
representa el progreso genético esperado con rodeos de diferentes tamaños y con un esquema de
apareamientos según HILL y LAND (1976).
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283
Fig 5: Comparación entre esquemas de selección convencionales y empleando TE. La respuesta
está representada en términos relativos como la intensidad de selección anual (media de la
selección diferencial entre vacas y toros/ intervalo generacional) y en la predicción del peso a
los 400 días, asumiendo h2 = 0.5 y = 40 kg. La tasa de consanguinidad está expresada para
el total de donantes y receptoras (HILL y LAND, 1976)
Programas MOET cerrados para razas lecheras y de doble propósito
El primer modelo para un programa de núcleos de producción para razas lecheras fue presentado por
NICHOLAS en el año 1979. En principio es similar al modelo propuesto por LAND y HILL (1975, ver
más arriba).
Resumiendo se puede afirmar que el programa MOET, aplicado en razas productoras de carne para las
características que pueden ser evaluadas en el animal vivo, posibilita un duplicación del progreso
genético comparado con los programas de mejoramiento convencionales. Para mantener la
consanguinidad dentro de un límite tolerable, el rodeo debe contar con 500 hembras. El intervalo
generacional puede reducirse 2 años. La aplicación del programa de núcleos de producción es
especialmente de interés en regiones donde los tests de producción para los programas de
mejoramiento, sobre la base de pruebas a campo, no se han establecido aún o sólo pueden llevarse a
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núcleos
284
cabo con dificultades. Los programas MOET son interesantes también para empresas privadas de
producción, las cuales pretenden seleccionar un gen determinado (por ej.: "Coulard- Doppellendegen",
ausencia de cuernos, animales transgénicos) y desean aplicar método biotécnicos (determinación del
sexo, clonado, análisis de genoma, transferencia de genes). Los productores de animales de cabaña
deben aplicar la TE y la microcirugía de embriones para aumentar la intensidad de selección de las
madres de toros y vacas para continuar luego con los métodos tradicionales de mejoramiento (programa
de selección del rodeo). Ello tiene la ventaja de evitar desde el principio los problemas de
consanguinidad.
Los modelos MOET, en discusión actualmente, se basan en los modelos publica-dos por NICHOLAS y
SMITH (1983). En modelos juveniles la selección se lleva a cabo en ambos sexos a una edad de 12
meses a partir de la información de la familia materna, como el rendimiento lechero de la madre, de las
medio-hermanas, hermanas enteras y de la abuela. En los modelos adultos se seleccionan los machos
y hembras en base al rendimiento de las hermanas enteras, medio-hermanas y de la madre. En las
reproductoras se dispone del rendimiento de su primera lactación. El intervalo generacional para el
modelo juvenil comprende cerca de 2 años, para el adulto 3,5-4 años mientras que en el programa de
selección convencional son necesarios 6,5 a 7 años. El cuadro 1 contiene información sobre el progreso
genético de los programas juveniles y adultos en el momento de la selección. Las ventajas del
acortamiento del intervalo generacional tienen, sin embargo, como consecuencia una menor exactitud
de la estimación del valor genético.
Cuadro 1: Comparación entre los esquemas MOET juveniles y adultos según NICHOLAS y SMITH
(1983)
Mes
Esquema juvenil
Esquema adulto
1
NACIMIENTO
13
Selección de la generación inicial
según el pedigree
14-15
TE de la generación inicial
Servicio
23-24
Nacimiento de la 1o generación
de la descendencia de TE
Destete
34-35
Primera lactación concluida
Primera lactación concluida
36-37
Selección de la 1o generación
según el pedigree
Selección de la generación
inicial según el rendimiento
propio y el de las hermanas
TE con la 1o generación
44-46
Nacimiento de la 2o generación.
Descendencia de TE
NACIMIENTO
TE con la generación inicial
Nacimiento de la 1o
generación. Descendencia
de TE
Formación del núcleo
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285
La formación del núcleo se puede llevar a cabo mediante la selección de las mejores vacas de la
población o la compra de vacas de alto rendimiento productivo (cuadro 2). Para la inseminación de esas
hembras se eligen en general toros de calidad internacionalmente reconocida. Según BREM (1986) la
elección de las hijas de las mejores madres como base del núcleo brinda la siguiente superioridad en la
población en la misma generación, expresada en desviaciones estándar genéticas, frente a la selección
de vacas de cabaña (hembras de pedigree):
Vacas en la poblaciónVacas fundadoras del núcleo
0,53
1,83
Diferencia
1,50
De ello se concluye que la cuidadosa selección de las vacas fundadoras del núcleo
tiene un significado definitivo en el éxito de programa de núcleos de producción.
Cuadro 2: Formación de núcleos de producción
- Formación del núcleo
Selección de las mejores hembras
Selección de los reproductores machos de la población extraña
- Núcleo
Superovulación y TE
Pruebas de rendimiento
Selección de reproductores hembras y machos
- Transferencia a la población
Distribución de los reproductores machos para el servicio
natural o IA
Esquema de un programa de núcleos cerrados de producción
Los modelos para núcleos cerrados publicados hasta el momento parten de 200 a 400 vacas en el
núcleo, 16 a 64 donantes elegidas por año y 4 a 8 toros. La figura 6 presenta el esquema de un
programa de núcleo cerrado con 250 vacas en el núcleo, 32 donantes seleccionadas y 8 toros. Este
programa requiere la transferencia de 500 embriones por año.
Valores esperados del progreso genético con programas MOET cerrados
El aumento esperado del progreso genético, resultante del acortamiento del intervalo generacional, se
reduce como consecuencia de la disminución de la exactitud de la estimación del valor genético, la
prueba de la descendencia logra la mayor exactitud, el test de las hermanas y del rendimiento propio
permiten lograr sólo exactitudes medias (cuadro 3). RUANE y SMITH (1988) estimaron que el progreso
genético en un núcleo con un esquema juvenil es, en 20 años, 55% superior al mejoramiento alcanzado
por medio de la prueba de la descendencia. Con un esquema adulto la superioridad es del 20%. Esas
estimaciones con modelos deterministas no pudieron ser comprobadas en estudios de simulación.
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núcleos
286
RUANE y THOMPSON (1991) encontraron a partir de estudios de simulación sobre 6 generaciones que
los resultados alcanzan sólo el 60% (4 padres en el núcleo) hasta 70% de los valores estimados para el
progreso genético con modelos deterministas. La razón más importante es la reducción de la varianza
entre familias como consecuencia de la selección (efecto Bulmer). Las tasas de consanguinidad en los
estudios de simulación después de 6 generaciones variaron entre 4,2-4,8% con 8 padres y 7,7-7,9%
con 4 toros. Ello implica 1,7 a 2,7 veces mayor tasa de consanguinidad que con modelos deterministas.
La consanguinidad puede disminuirse considerablemente empleando más de 1 toro por familia
seleccionada (24-34%).
Reposición
30 terneras son
recriadas. 1er. Parto
a los 2 años
250 vacas del núcleo
bajo control de
producción de leche e
ingesta
Las vacas excedentes
se destinan a los
establecimientos con
control de producción
Eliminación anual
Selección anual de las
32 mejores hembras y
de los 38 mejores
machos para la
producción de
embriones
130 toros de ellos se
seleccionan a partir del
test de las hermanas
(1. lactación) y
rendimiento propio
500 embriones
Nacimiento de
130 terneras
Los embriones
con transferidos
Nacimiento de
130 terneros
Fig. 6: Ciclo anual de un rodeo-núcleo con un programa de superovulación y
transferencia de embriones
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Cuadro 3: Comparación de la prueba de la descendencia frente al test de las hermanas para la
producción de leche
Años
Prueba de la descendencia
1 1/2
Vaca preñada con el semen del
toro en prueba
3 1/2-4
6 1/2-7
1o de 50 hijas. Estimación del
valor genético y selección
Mayor exactitud de la estimación
del valor genético
Prueba de las hermanas
Medio-hermanas y hermanas
enteras preñadas
o
1 Lactación de 4 hermanas
enteras y 16 medio-hermanas.
Estimación del valor genético y
selección
Intervalo generacional más corto
WRAY (1989) desarrolló una algoritmia determinista para programas de núcleos de producción para la
especie porcina, que considera los efectos de la selección y la consanguinidad sobre la varianza
genética y la exactitud de la estimación del valor genético. Los primeros análisis indican una mayor
coincidencia de los valores estimados de ese modelo con los de los estudios de simulación. Falta
todavía una comprobación empírica del alto progreso genético en programas cerrados de núcleos de
producción. Hasta el momento no se publicaron los análisis de los datos de esos núcleos. Las ventajas
y desventajas de los núcleos de producción se presentan en los cuadros 4 y 5. Las figuras 7 y 8
ejemplifican un núcleo de producción básico y otro para la producción de 60 toros test respectivamente
para ganado Holstein en Sudáfrica (DICKS, 1991a y b).
Cuadro 4: Ventajas de los núcleos de producción
- Aumento del nivel genético en la formación del núcleo
- Progreso genético más rápido
- Mejores controles de los tests y del manejo (se evitan las
manipulaciones)
- Una selección más orientada al valor económico
- Selección de características, difíciles de evaluar a campo
(por ej.: conversión del alimento)
- Concentración de los recursos genéticos
- Posibilita el empleo de técnicas costosas y complicadas
- Los resultados económicos son alcanzados más temprano
- Menores costos a nivel nacional
- Formación de unidades-núcleos separadas para diferentes
objetivos productivos y diferentes ambientes
Cuadro 5:
Desventajas de los núcleos de producción
- Riesgo de enfermedades (concentración)
- Riesgo como consecuencia de la concentración de la población en un sólo
establecimiento ganadero
- Posibilidad de una interacción genotipo-ambiental
- Necesidad de capital para la formación del establecimiento del núcleo
- Una comercialización más intensiva del los reproductores con las
desventajas que ello implica
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núcleos
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Donante de
embriones
Venta
50%
Donante de
semen
Receptoras
Lavaje 30%
Vaquillas
Toritos
Venta de hermanos
enteros ± 20%
Venta o
alquiler
Venta del ± 10%
Distribución 50%
en el/los
Centro/s
Registro de
producción
Venta
90%
Toros de
prueba
Distribución
50% en el
rodeo
Registro de
producción
Progenie
en test
Venta
del 80%
Destino del
20% a la
industria
Selección: 10%
de las mejores
Lavaje
Vacas en
producción
Selección: 10%
de las mejores
Identificación del
mejor 5% (±)
Lavaje
Fig 7: Un programa básico de núcleo de producción propuesto para la empresa
Taurus stock improvment cooperative limited para ganado Holstein Friesian
en Sudáfrica (DICKS, 1991a)
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260 embriones
60% de preñez
160 preñeces
55 ♀
venta
(requiere 200
receptoras aprox.)
75 ♀
75 ♂
20 ♀
15 ♂
venta
60 ♂ a
80 embriones
Recolección de
embriones
Población
180 embriones
Fig. 8: Un programa-núcleo para la producción de 60 toros Holstein para pruebas
de rendimiento (DICKS, 1991b)
Programas abiertos de núcleos de producción
CHRISTENSEN (1984) y COLLEAU (1985) desarrollaron programas híbridos a partir de programas
MOET cerrados y programas de mejoramiento convencionales, aplicando inseminación artificial. Esos
programas se designan en general como programas abiertos de núcleos de producción. La selección se
realiza sobre la línea masculina (padres de vacas y toros, ver figura 2) como en los programas
convencionales de selección con IA. Los toros test, seleccionados en el núcleo, son sometidos a una
prueba de la descendencia a campo. Los mejores toros elegidos de la descendencia (padres de toros)
son incorporados al núcleo. El manejo de las madres de toros en el rodeo núcleo bajo un ambiente
controlado sirve para impedir su trato preferencial ("preferential treatment") por parte de los cabañeros.
Al mismo tiempo el ambiente controlado provoca una mayor heredabilidad como consecuencia de la
baja varianza fenotípica.
VA
h2 =-------; (VA = varianza genética aditiva; VP = varianza fenotípica)
VP
Ambas conducen a una mayor exactitud de la estimación del valor genético y con ello a una mayor
seguridad en la selección de las madres de los toros.
COLLEAU (1985) desarrolló un programa abierto con 3 variantes, de las cuales 2 (A y B) se describen
en el cuadro 6. En la variante A la descendencia cuenta con una edad de 9 meses en el momento de la
selección de las vacas donantes, de forma tal que el intervalo generacional comprende 2 años. Ese
acortamiento del intervalo generacional exige sin embargo la transferencia de los embriones en un
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núcleos
290
momento en el cual aún no es seguro si la vaca será elegida como donante. Ello
transferencias de los embriones y con ello los costos comparándolo con la variante B,
intervalo generacional se duplica frente a la variante A. Comparando con el programa
mediante IA la variante A es superior en aproximadamente 10% y en todos los casos
variante B.
aumenta las
en la cual el
convencional
mejor que la
Cuadro 6: Modelos para núcleos de producción abiertos según COLLEAU (1985)
Edad de la donante
en meses
16
18
20
25
29
Esquema A
Esquema B
ET
ET
Concepción
Destete
Destete
36
a partir de una
lactación parcial
38
partir de la
primera
lactación TE
Selección
Selección a
COLLEAU (1986) amplió la variante A mediante la importación de semen congelado de toros probados
de otras poblaciones o de embriones congelados. La tabla 4 contiene los resultados más importantes.
Tabla 4: Progreso genético (%/ año) en el rodeo-núcleo con el empleo de semen de toros probados de
una población extraña frente al método convencional con uso de IA.
Progreso genético/año (%)
Años
A
0-10
10-20
Inseminaciones de la población
extraña
20-30
0-10
10-20
20-30
B
100
127
109
119
120
119
120
36
11
2
500
137
115
120
125
119
121
62
18
3
100
151
121
121
133
120
125
75
25
6
0
1
500
165
130
121
140
120
127
81
29
6
A = Superioridad inicial de los toros extraños (0 ó 1 ∆G)
B = Número de toros en test/año en la población extraña
En la tabla 4 se parte de la premisa que sólo toros elite son seleccionados para el núcleo (los mejores 3
toros por año). Los resultados muestran que en la superioridad de la población extraña el nivel genético
de esa población con esos toros puede alcanzarse en 10 años. En una selección consecuente los toros
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criados en el núcleo son mejores que los extraños, lo que se destaca en los bajos valores del semen
extraño. La transferencia a la población hembra local es, sin embargo, lenta. Después de 30 años la
situación genética de la población, con la aplicación de un programa abierto de núcleo de producción,
es superior en un 25% comparado con la importación de semen de una población extraña, en marco de
un programa convencional de mejoramiento con IA.
CHRISTENSEN (1989) sugiere otra variante en la combinación entre las pruebas de la descendencia y
los programas de mejoramiento con IA para el plan de selección de toros elite.
En ese plan las hijas, producto del apareamiento de los toros elite (padres de toros) con madres de
toros, son superovuladas lo más temprano posible (14-18 meses). Los embriones recolectados son
transferidos frescos, de manera tal que dos años después la primera generación de hembras alcance la
pubertad, pueda ser apareada con los toros elite de la siguiente generación y esté disponible para el
programa MOET.
El cuadro 7 indica que en la 4o generación 86,5% de los genes de las hembras del núcleo se originan
de toros elite. La probabilidad de que ello ocurra sin transferencia de embriones comprende 2,6%. Ese
plan tiene la ventaja, que los animales del núcleo no deben ser mantenidos en un rodeo cerrado o en
una Estación para madres de toros. El único criterio de selección es el componente genético de los
toros elite, sobre el cual los tratamientos especiales no tienen efecto y la cría de las madres de toros
puede llevarse a cabo en cabañas normales. Sin embargo de esta forma no es posible considerar
algunas características porque no pueden ser controladas a campo, como por ej. conversión del
alimento.
Cuadro 7: Componente genético de toros elite según CHRISTENSEN (1989)
Generación
Componente genético de
toros elite años I a V (%)
Probabilidad sin
MOET (%)
0
I = 50
100
1
I = 25
III = 50
40
2
I = 12,5
II = 25
III = 50
16
3
I = 6
II = 12,5
III = 25
IV = 50
6,4
4
I = 3
II = 6
III = 12,5
IV = 25
V = 50
2,6
El programa de evaluación de las donantes de la Cooperativa de Producción de Osnabrück (República
Federal de Alemania) sigue un camino totalmente diferente, combinando partes del modelo MOET con
los programas convencionales de mejoramiento con IA. El objetivo principal de esa iniciativa es la
evaluación neutral estandarizada del rendimiento de las potenciales madres de toros (Estación de
prueba de toros), para eliminar el efecto del tratamiento especial de las madres de los toros por parte de
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292
los cabañeros y considerar además otras características. El intervalo generacional puede mantenerse, a
través de un programa de dos niveles, relativamente corto. En la primera lactación se lleva a cabo una
preselección a partir del rendimiento en la cantidad de leche, grasa (%) y proteína (%, rendimiento en
100 días). En ese nivel se selecciona 1% de las vaquillonas en prueba y se lleva a cabo la TE. La
selección inmediata y definitiva de las madres de los toros se lleva a cabo en la 2o lactación. En el
segundo nivel de la selección se elegirán 20 madres de toros de 70 vacas en test. La figura 9 muestra el
programa de la Cooperativa de producción de Osnabrück. Según KANDZI y GLODEK (1987) se puede
aumentar con ese programa el progreso genético tres veces sobre la línea madre-hijo y 20% en total,
eliminado los tratamientos especiales. Los ejemplos acentúan en suma, que los programas abiertos de
núcleos de producción no muestran un sistema uniforme sino la integración de la TE bajo las
condiciones dadas en los programas establecidos de mejoramiento genético mediante IA, con el objeto
de optimizar el progreso genético.
Tiempo
28 meses:
Parición de
vaquillonas
Progreso selectivo en las
madres
10 000 vaquillonas OHG
Empleo de la
descendencia
Reposición
1º
- Prueba de ascendencia
- Prueba propia
- Clasificación del tipo
- Facilidad de ordeñe
31 meses:
Producción de
embriones
40 meses:
Nacimiento de la
descendencia TE
42 meses:
2º parición
100 vaquillonas donantes
Transferencia de
embriones para producir:
300 donantes
70 mejores vaquillonas
donantes
2º selección
Venta
Prueba de Estación de TE:
- 2º lactación
- Fertilidad
- Estabilidad metabólica
- Sanidad de la ubre
50 meses:
Selección de las
madres de toros
20 madres para toros de
prueba de OHG
20 toros de
prueba
Fig. 9: Programa de evaluación de las vacas donantes de la Cooperativa de Productores de Osnabrück
(República Federal de Alemania)
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293
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