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MAPEO DE QTLs PARA CARACTERES RELACIONADOS A EFICIENCIA DE USO DE
NITRÓGENO EN MAÍZ MEDIANTE MARCADORES SSRs Y SNPs
Mandolino C.I1.; D’Andrea K.E2.; Olmos S.E1.; Otegui M.E3.; Eyhérabide G. H4.
1
Laboratorio de Biotecnología. EEA INTA-Pergamino.2 CONICET-FAUBA, Av. San Martin 4453, C.A.B.A. 3IFEVA
(CONICET-FAUBA). 4 Programa de mejoramiento de maíz, EEA INTA-Pergamino. [email protected]
Nitrogen (N) is the macronutrient most limiting to maize (Zea mays L.) grain yield. Breeding for N use
efficiency (NUE) would improve yield with reduced fertilizer application. Our objectives were to study
phenotypic variability in NUE and related traits for QTLs detection in a population of 181 recombinant
inbred lines (RILs) derived from the cross of B100 × LP2. All inbreds were phenotyped for NUE, plant N
uptake at maturity, protein, the proportion of N in the biomass at maturity (N/BiomM), N harvest index
(NHI) and the anthesis-silking interval (ASI) in experiments conducted in INTA Pergamino during the
2009-2010 and 2011-2012 growing seasons. Genotyping was carried out using a set of 84
microsatellites (SSRs) and 7 single nucleotide polymorphism markers (SNPs). The population showed
phenotypic and genotypic variability for all the traits (p<0.001). A total of 13 QTLs were detected on
Chromosomes 1, 2, 4, 5, 8 and 9, including 1 QTL for N uptake, 2 QTLs for protein, 1 QTL for NHI, 3
QTLs for N/BiomM, 2 QTLs for NUE and 4 QTL for ASI. The proportion of the total phenotypic variance
explained by each QTL ranged from 6 to 17% across traits and environments. Many of the QTL
colocalized with previously reported QTL for N remobilization and N contain.
Key words: Maize, Nitrogen Use Efficiency, Quantitative Trait Loci
Palabras clave: Maíz, Eficiencia de Uso de Nitrógeno, Loci de caracteres cuantitativos.
Introducción
El maíz es uno de los principales cultivos a nivel mundial, y el principal en área
sembrada de América Latina. El consejo internacional de cereales o IGC (International Grain
Council) estima que la producción mundial de maíz en la campaña agrícola 2018/2019 será
de 1022 millones de toneladas, siendo más de 60 millones de toneladas superior a lo
cosechado en la campaña 2013/2014. Ciertamente el gran desafío será producir esas
toneladas adicionales. Si bien el uso de fertilizantes nitrogenados ha sido uno de los
principales promotores del aumento en el rendimiento en la agricultura actual, su utilización
implica riesgos de contaminación ambiental, por la lixiviación del Nitrógeno (N) no absorbido
hacia aguas subterráneas y por incremento de emisiones de óxido nitroso (N2O) al ambiente
(Cárdenas-Navarro, 2004). La mejora genética del cultivo de maíz por una mayor eficiencia
en el uso del N (EUN) permitiría el logro de mejores rendimientos con menor aplicación de
fertilizantes y/o una mayor respuesta por unidad de N aplicado como fertilizante (Arellano et
al, 1996). Por esto, es importante seleccionar cultivos que absorban y metabolicen N de una
manera más eficiente para la producción de granos (Hirel et al, 2001).
En trabajos previos realizados en la EEA-Pergamino se desarrolló una las colecciones de
Líneas Endocriadas Recombinantes (RILs) derivada del cruzamiento de las líneas LP2 × B100
(D’Andrea et al, 2006). Las líneas LP2 y B100, al igual que un centenar de líneas
pertenecientes al programa de mejoramiento de maíz de INTA Pergamino, se caracterizaron
con 50 SSRs a fin de estimar la estructura genética de la población (Olmos et al, 2010). Este
análisis agrupó a las líneas LP2 y B100 en clusters distintos a lo largo de los sucesivos ciclos
de simulación de agrupamientos, evidenciando a nivel molecular la diferenciación fenotípica
contrastante observada previamente.
Los objetivos de este trabajo fueron la caracterización de la variabilidad fenotípica de la
EUN y caracteres relacionados a EUN y la determinación de las bases genéticas de la EUN, a
través de la detección de QTL asociados a EUN y a caracteres relacionados en la población
de RILs.
Materiales y Métodos
El material genético evaluado consistió de una población de 181 RILs en estado S 6,
derivada del cruzamiento B100 × LP2, y las dos líneas parentales.
Evaluación fenotípica
Las evaluaciones fenotípicas se llevaron a cabo en el campo experimental de INTA
Pergamino sobre un suelo arcillo limoso (Argiudol típico), durante las campañas agrícolas
2009-2010 (Exp 1, buen nivel de N edáfico) y 2011-2012 (Exp 2, bajo nivel de N edáfico)
bajo riego. Los ensayos se distribuyeron en un diseño completamente aleatorizado con dos
repeticiones. Las determinaciones fenotípicas en cada parcela se realizaron sobre un
conjunto de plantas marcadas en el estadio V 3. Los caracteres evaluados fueron: N
absorbido a madurez fisiológica (NabsMF), Porcentaje de Proteína en grano (Proteína),
Índice de cosecha de N (ICN: kg de N en grano/kg de N absorbido en biomasa aérea),
proporción de N en planta a madurez fisiológica (N/BiomMF), EUN (kg de grano/kg de N
absorbido en biomasa aérea) e Intervalo Antesis Silking (ASI).
Los datos fenotípicos se analizaron usando el paquete estadístico InfoStat (Di Rienzo et
al, 2011). Se realizó la estadística descriptiva de los datos y se determinó normalidad de la
distribución de los mismos usando la prueba de Shapiro-Wilks modificado, aquellos
caracteres que no presentaron distribución normal fueron transformados usando la función
conveniente en cada caso antes de realizar el análisis de la variancia (ANOVA).
Evaluación Genotípica
El genotipado de las líneas se realizó a partir de bulks de cinco plantas adultas de maíz.
La extracción de ADN se realizó según Kleinhofs et al. (1993). Las muestras de ADN extraído
fueron cuantificadas en geles de agarosa al 0.8% teñido con bromuro de Etidio usando como
testigos patrones de concentración de ADN conocida.
La caracterización genotípica se llevó a cabo usando los siguientes marcadores:
Microsatélites (SSRs): Las secuencias de los primers se obtuvieron de la base de
datos pública MaizeGDB (www.maizegdb.org). Se seleccionaron SSRs uniformemente
distribuidos a lo largo de cada cromosoma de maíz. Las regiones SSRs se amplificaron por
PCR, se corrieron en geles de poliacrilamida al 6% (m/v) en condiciones desnaturalizantes a
voltaje constante y se visualizaron por tinción con plata según protocolo Promega Corp.
Polimorfismos de nucleótido simple (SNPs): Se diseñó un microchip Illumina con 96
SNPs localizados en genes relacionados con el metabolismo de N y el estrés abiótico, que fue
analizado con la plataforma BeadXpress de Illumina en la Unidad de Genómica de INTA
Castelar. Se utilizaron para el análisis aquellos SNPs que fueron polimórficos entre los
parentales y que tenían frecuencia del alelo menor (MAF) mayor a 0,1, Gen Train Score
(GTS) mayor a 0,7 y la separación de los Cluster mayor a 0,2.
La segregación de los marcadores y la construcción de los mapas de ligamiento se llevó
a cabo usando el programa GQMol Versión 2008 6.1 (Cruz y Schuster, 2008). Para la
construcción de los mismos se usaron 84 marcadores SSRs y 7 marcadores SNPs que
segregaron según lo esperado (1:1). Los mapas cubrieron una distancia total de 1.126,2 cM,
con una separación promedio entre marcadores de 12 cM. El análisis de asociación entre los
marcadores y el fenotipo se realizó mediante el programa Win QTL Cartographer V 2.5
(Wang et al, 2012) mediante mapeo por intervalo compuesto (MIC).
Resultados y Discusión
Las RILs mostraron variabilidad fenotípica y genotípica (Tabla 1) para todos los
caracteres (p<0,001), la mayoría de los cuales no presentó distribución normal (p<0,001).
Se identificaron 13 QTLs ubicados en los cromosomas 1, 2, 4, 5, 8, 9 (Tabla 2). La
mayoría de los QTLs no se repitieron en los dos experimentos. Sólo el QTL para N/BiomMF
en el cromosoma 8 y el QTL para ASI en el cromosoma 1 se expresaron en ambos
ambientes. El 53% de los QTLs detectados mostraron efectos aditivos positivos. Los QTLs
para N/BiomMF y ASI mencionados, que fueron reproducibles entre experimentos,
presentaron efectos aditivos negativos, lo que indicaría que el alelo de LP2 reduce el valor
genotípico de ambos caracteres. Por otro lado, el alelo de LP2 aumentaría los valores de ICN
y EUN, según se observa en el ensayo del año 2009. El porcentaje de variancia fenotípica
explicada por los QTLs varió entre 6 y 17 %.
Tabla 1. Estadística descriptiva y prueba de normalidad
Año
Carácter
NabsMF
% Proteína
2009
2011
ICN
Media
B100
LP2
RILs
n
D.E.
CV
Mín
Máx
Normalidad SW
Valor p
1,60
1,51
1,60
169
0.36
22.57
0.98
3.58
10,28
9,67
10,37
169
0,98
9,41
8,03
13,23
<0.0001
0,64
0,62
0,57
169
0,11
18,63
0,20
0,72
8,44
14,10
0,0771
<0,0001
0,476
<0,0001
N/BiomMF
10,80 10,80 10,57
169
1,02
9,67
EUN
38,75 40,25 35,12
169
8,06
22,94
11,44 50,94
ASI
-1,50
3,50
1,51
169
1,66
109,8
-2,00
7,00
0,0031
NabsMF
1,23
1
1,03
171
0,17
16,42
0,68
1,63
0,4125
% Proteína
9,59
7,44
8,91
171
1,08
12,11
6,70
11,82
ICN
0,58
0,67
0,56
171
0,12
21,42
0,12
0,72
N/BiomMF
9,15
7,65
8,62
171
0,82
9,49
6,54
10,54
0,3284
9,01
60,77
<0,0001
-2,75 10,50
<0,0001
EUN
38,55 56,05 40,66
171
ASI
-2,00
171
3,00
1,74
11,00 26,96
2,16
124,5
0,014
<0,0001
p<0,01 indican diferencias significativa con respecto al modelo de normalidad (prueba Shapiro Wilks)
Muchos de los QTL detectados en este trabajo colocalizan con QTL del metabolismo del
N. Los QTL Nbiom8-09 y Nbiom8-11 coinciden con QTLs identificados para N removilizado
(Coque et al, 2008) y para contenido de N en planta (Gallais y Hirel, 2004). Los QTL Eun109, Asi1-09 y Asi1-11 coinciden con un QTL detectado para contenido de N (Coque et al,
2008). El QTL Pr5-09 se corresponde con QTLs detectados par actividad de glutamina
sintetasa (Hirel et al, 2001).
Conclusión
La población de RILs presentó variabilidad genotípicas para todos los caracteres
estudiados (p<0,001), confirmando la utilidad del germoplasma para el estudio de las bases
genéticas del control de la EUN.
Se detectaron QTLs en los cromosomas 1, 2, 4, 5, 8 y 9. La mayoría de los QTLs
identificados coinciden con QTLs del metabolismo del N encontrados en estudios previos
para otro germoplasma.
A partir de este mapeo de mediana densidad, se analizará la secuencia de referencia de
B73 dentro del intervalo comprendido por los marcadores flanqueantes a los QTL para
identificar genes candidatos y se optimizará la posición de los QTL identificados mediante la
utilización de mayor cantidad de marcadores funcionales, como SNPs y SSRs localizados en
dichos genes candidatos, que permitan dilucidar las bases genéticas asociadas a la EUN.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los proyectos: PICT 00239 de la ANPCyT y PNCyO
PE1127043.
Tabla 2. QTLs detectados usando MIC para cada carácter en cada año de ensayo.
Carácter
Añoa
QTL
Cr
cMb
LODmax
ICc (cM)
A
R2
NabsMF
2011
Nabs9-11
9
64,8
3,4
62,5-70,6
Pr1-09
1
50,3
4,0
50,2-57,3
bnlg127-bnlg1270
0,05
7,8
umc1514-umc2025
-0,27
7,4
Pr5-09
5
61,7
6,6
59,7-62,3
PZA03618.1-phi085
0,37
13
MM flanqueante
%
Proteína
2009
ICN
2009
Icn9-09
9
64,8
6,4
60,5-66,8
bnlg127-bnlg1209
0,004 13,5
2009
Nbiom8-09
8
55,8
4,5
44,8-60,8
bnlg1863-PZB00865.2
-0,45 13,9
Nbiom4-11
4
50,3
4,7
42,0-54,3
phi026-bnlg1137
-0,27 10,5
Nbiom8-11
8
52,8
6,2
50,8-57,8
bnlg1863-PZB00865.2
-0,38 17,3
Eun1-09
1
30,8
2,8
21,4-31,8
bnlg1484-umc1479
1,98
5,9
Eun9-09
9
64,8
4,8
58,5-68,8
bnlg127-bnlg1209
2,57
10
Asi1-09
1
19,4
3,1
16,4-26,4
bnlg1429-bnlg1484
-0,42
6,3
Asi2-09
2
129
2,9
109,0-131,6
umc1185-bnlg1018
0,43
6,3
Asi1-11
1
29,1
3,0
28,4-31,7
bnlg1484-umc1479
-0,54
6,0
Asi5-11
5
19,0
2,7
14,6-23,0
bnlg1892-PZB01331.2
0,54
6,0
N/BiomMF
EUN
2011
2009
2009
ASI
2011
Cr: Cromosoma; LODmax: máximo valor de LOD para el QTL; MM= Marcadores Moleculares
A: efecto aditivo del alelo de parental LP2; R2: Variancia fenotípica explicada por el QTL
a
Sólo aquellos con dato; b Posición del valor de LODmax en cM; c Intervalo de confianza calculado ± 1 LOD
de LODmax;
Bibliografía
Arellano J.L.; Castillo F.; Alcantar G.; Martinez A. 1996. Parámetros genéticos de la eficiencia en el uso de nitrógeno
en líneas de maíz de Valles Altos. En ‘ Developing drought and soil nitrogen tolerance in maize’. CIMMYT. El Batan
México. (Ed Edmedes G.O.; Bänzinger M.; Mickelson H.R. y Peña-Valdivia C.B.) pp. 320-325.
Cárdenas-Navarro R.; Sánchez-Yánez J.M.; Farías-Rodríguez R.; Peña-Cabriales, J.J., 2004, Los Aportes de
Nitrógeno en la Agricultura. Revista Chapingo Serie Horticultura 10(2): 173-178.
Cruz C.D y Schuster I., 2008. GQMol V2008 6.1. Genética Quantitative e Molecular. Universidade Federal de Viçosa.
Laboratório de Bioinformática. www.ufv.br/dbg/gmol.htm.
Coque M.; Martin A.; Veyrieras B.; Hirel B. y Gallais A., 2008. Genetic variation for N-remobilization and postsilking
N-uptake in a set of maize recombinant inbred lines. 3. QTL detection and coincidences Theor Appl Genet,
117:729–747.
D`Andrea K.E.; Otegui M.E; Cirilo A.G. and Eyhérabide G., 2006. Genotypic Variability in Morphological and
Physiological Traits among Maize Inbred Lines—Nitrogen Responses. Crop Science. 46: 1266-1276.
Di Rienzo J.A.; Casanoves F.; Balzarini M.G.; Gonzalez L.; Tablada M.y Robledo C.W. InfoStat versión 2011, Grupo
InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina, URL http://www.infostat.com.ar
Gallais A. y Hirel B, 2004. An approach to the genetics of nitrogen use eficiency in maize. Journal of Experimental
Botany. 55:295-306.
Hirel B.; Bertin P.; Quilleré I.; Bourdoncle W.; Attagnant C.; Dellay C.; Gouy A.; Cadiou S.; Retailliau C.; Falque M.
and Gallais A. 2001. Towards a better understanding of the genetic and physiological basis for nitrogen use
efficiency in maize. Plant Physiology 125: 1258-70.
IGC International Grains Council www.igc.int
Kleinhofs A.; Kilian A.; Saghai-Maroof M.A.; Biyashev R.M.; Hayes P.; Chen F.Q.; Lapitan N.; Fenwick A.; Blake
T.K.; Kanazin V.; Ananiev E.; Dahleen L.; Kudnra D.; Bollinger J.; Knapp S.J.; Liu B.; Sorrells M.; Heun M.;
Franckowiak J.D.; Hoffman D.; Skadsen R. and Steffenson B.J. 1993. A molecular; isozyme and morphological
map of the barley (Hordeum vulgare) genome. Theor. Appl. Genet. 86: 705–712.
Olmos S.; Schlatter A.R.; Delucchi C.; Ravera M.; Negri M.E.; Mandolino C.; Mroginski E.; Eyherabide G. 2010.
Estimación de la estructura genética en las líneas de maíz de INTA Pergamino mediante el programa STRUCTURE
V. 2.3.3. IX Congreso Nacional de maíz simposio nacional de sorgo. Rosario 2010.
Wang S.; Basten C. J y, Zeng Z-B. 2012. Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina
State University, Raleigh. NC. http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm