1. No category

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
AC
IÓ
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
N
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
TESIS
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
Efecto de la temperatura y pH en la
producción de amilasas por Bacillus
licheniformis FGM-A15 en un biorreactor
agitado
BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
N
DE
PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL
CC
IO
Autor: Br. Carlos Jimmy Pérez Plasencia
DI
RE
Asesor: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz
TRUJILLO --PERU
2015
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
UN
IC
AC
IÓ
N
TRUJILLO
M
Dr. Orlando Gonzáles Nieves
IC
A
Y
CO
RECTOR
RM
ÁT
Dr. Rubén Vera Véliz
EM
AS
DE
IN
FO
VICERECTOR ACADÉMICO
SI
ST
Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas
Dr. Esteban Ilich Zerpa
DI
RE
CC
IO
N
DE
VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN
SECRETARIO GENERAL
ii
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
UN
IC
AC
IÓ
N
BIOLÓGICAS
CO
M
Dr. José Mostacero León
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
DECANO
DE
Dr. William Zelada Estraver
Dra. Bertha Soriano Bernilla
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
SECRETARIO
DI
RE
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.
iii
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
PRESENTACIÓN
AC
IÓ
N
Señores Miembros del Jurado:
UN
IC
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y
Títulos de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la
CO
M
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra
consideración y criterio el presente trabajo de tesis titulado:
IC
A
Y
“Efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus
DE
RM
IN
FO
Título Profesional de Biólogo Microbiólogo.
ÁT
licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado” con el cual pretendo obtener el
DE
SI
ST
EM
AS
Trujillo, Octubre de 2015
DI
RE
CC
IO
N
Br. Carlos Jimmy Pérez Plasencia
iv
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
MIEMBROS DEL JURADO
Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en
AC
IÓ
N
concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y
Y
CO
M
UN
IC
Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.
IC
A
_________________________________
ÁT
Ms. C. Anibal Quintana Díaz
AS
DE
IN
FO
RM
PRESIDENTE
EM
_________________________________
SECRETARIO
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz
_________________________________
Ms. C. Jaime Agreda Gaitán
VOCAL
v
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el
Tesis
titulado: “Efecto de la temperatura y pH en la
N
de
AC
IÓ
presente Informe
UN
IC
producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor
agitado”, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo
IC
A
Y
CO
M
APROBADO por UNANIMIDAD.
ÁT
_________________________________
RM
Ms. C. Anibal Quintana Díaz
EM
AS
DE
IN
FO
PRESIDENTE
SI
ST
_________________________________
SECRETARIO
DI
RE
CC
IO
N
DE
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz
_________________________________
Ms. C. Jaime Agreda Gaitán
VOCAL
vi
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
CERTIFICACION DEL ASESOR
AC
IÓ
N
El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:
UN
IC
“Efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus
Y
CO
M
licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado”
IC
A
Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de
ÁT
Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con
RM
su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las
DE
IN
FO
observaciones y sugerencias alcanzadas.
AS
Por lo tanto, autorizo a Carlos Jimmy Pérez Plasencia continuar con el trámite
SI
ST
EM
del reglamento correspondiente.
CC
IO
N
DE
Trujillo, Octubre de 2015
RE
_________________________________
DI
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz
ASESOR
vii
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
DEDICATORIAS
AC
IÓ
N
A Dios
Por estar conmigo en cada paso que doy, cuidándome y dándome fuerzas
UN
IC
para seguir adelante y no desalentarme en el intento, por haberme dado salud para
M
lograr mis objetivos y permitido llegar a este momento tan importante de mi vida
RM
ÁT
A mi madre Nélida
IC
A
Y
CO
profesional.
IN
FO
Por ser el pilar más fundamental en mi vida, por sus consejos,
comprensión, amor, valores y apoyo incondicional en todo momento, por inculcar
DE
en mí el sabio don de la responsabilidad ¡Gracias por estar siempre conmigo
A mi padre Carlos
DE
SI
ST
EM
AS
mamita!
IO
N
A quien admiro porque es un ejemplo de esfuerzo y sacrificio, a no darse por
CC
vencido ante cualquier dificultad, a pesar de la distancia siempre te tengo presente,
DI
RE
gracias por tus consejos y apoyo incondicional para ser un hombre de bien.
viii
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
AC
IÓ
N
AGRADECIMIENTO
UN
IC
A mi asesor, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por brindarme su tiempo, apoyo y
dedicación, así como las sugerencias constructivas durante el desarrollo de la presente
CO
M
investigación, además por brindarme su amistad y conocimientos académicos durante
IC
A
Y
mi formación profesional.
ÁT
A mis compañeros y amigos Arturo, Cristóbal, Héctor y Omar por brindarme su
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
apoyo en parte del desarrollo de mi tesis.
ix
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
INDICE
Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………….……...….ii
AC
IÓ
N
Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………………….…………... iii
UN
IC
Presentación…………………………………………………….………….…………....iv
M
Miembros del jurado………………………………………………………..…………...v
Y
CO
Aprobación………………………………………………...……………….…………...vi
IC
A
Certificación del Asesor…………………………………...…….………….………….vii
RM
ÁT
Dedicatoria………………………………………………………...……….………….viii
IN
FO
Agradecimiento………………..………………………….….………………………....ix
DE
Indice…...…………………………………………………….………………………….x
EM
AS
Resumen…………………………………………………………………………......... xii
SI
ST
INTRODUCCION…………………….………………………………………………....1
DE
Justificación…………………………………………………………………………….13
N
Objetivos…………………………………………………………………………..……14
IO
MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………15
RE
CC
1. Material biológico……………………………………………………..………..15
DI
2. Metodología..……………………………………………….……….…….........15
2.1. Reactivación del cultivo………………………………………………………15
2.2. Construcción de biorreactores agitados……………………………………….16
x
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
2.3. Preparación del inóculo…….…………………..……..……...……………….16
2.4. Evaluación de la producción de amilasas……………………………………..17
N
2.5. Determinación de la actividad catalítica……………………………………....17
AC
IÓ
2.6. Medición del almidón residual………………………………………………..18
UN
IC
2.7. Elaboración de la curva estándar de almidón………………………………....18
2.8. Determinación de la producción de amilasas ………………………………...19
CO
M
2.9. Análisis de resultados………………………………………………………....19
Y
RESULTADOS…………………………………………………………………….......20
IC
A
DISCUSIÓN…………………………………………………………………..……..…29
RM
ÁT
CONCLUSIONES………….……………………………………………………...…...34
IN
FO
RECOMENDACIONES……………………………………………………….…........35
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….....……...36
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
ANEXOS………………………………………………………………………...……..40
xi
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
RESUMEN
El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo determinar el
AC
IÓ
N
efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por Bacillus
licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado hasta las 72h de incubación.
UN
IC
El cultivo bacteriano fue reactivado mediante siembra en placas conteniendo
M
agar almidón 0.1% e incubadas a 37°C por 24h, a partir del cultivo joven se
CO
preparó una suspensión con solución salina fisiológica estéril, equivalente al
A
Y
tubo N° 3 del nefelómetro de Mc Farland (9.0 x 108 UFC/mL). En cada
ÁT
IC
biorreactor se colocó 180mL de caldo almidón 0.6% - buffer fosfato al pH de
RM
ensayo (6.0, 7.0 y 8.0), suplementado con sales: (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4,
IN
FO
luego se agregó 20mL del inoculo estandarizado (9.0 x 108 UFC/mL), y se puso
DE
en funcionamiento e incubo a cada una de las temperaturas de ensayo (25, 40 y
AS
55°C). Se determinó la producción de amilasas presentes a los tiempos 0, 12, 24,
EM
36 y 72h extrayendo 10mL de muestra de cada biorreactor y se centrifugó. Al
SI
ST
sobrenadante (extracto enzimático) separado se cuantificó la cantidad de
amilasas producidas en relación al tiempo de incubación, midiendo el almidón
DE
residual en un espectrofotómetro y se determinó las unidades enzimáticas de
IO
N
amilasas (UA/mL) y fueron analizados mediante las Pruebas de Tukey y
CC
Duncan. Se determinó que hay diferencia significativa entre las 24 y 36h de
DI
RE
incubación y se encontró mayor producción de amilasas (UA/mL) a 55°C a pH
neutro.
xii
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
INTRODUCCION
El almidón es un polímero de glucosa unido por enlaces glucósidos y que
AC
IÓ
N
estructuralmente presenta un grupo aldehído en el extremo de la cadena polimérica
conocido como grupo reductor. Está constituido por dos tipos de polímeros: la
UN
IC
amilosa y la amilopectina; la primera, es un polímero lineal de aproximadamente
M
6000 unidades de glucosa con enlace α-1,4 glucósido; mientras que la amilopectina
CO
posee cadenas lineales cortas α-1,4 de 10 - 60 unidades de glucosa y de cadenas
A
Y
laterales α-1,6 con 15 - 45 unidades de glucosa. El número promedio de puntos de
ÁT
IC
ramificación es del 5%. La molécula completa de amilopectina contiene
RM
aproximadamente 2 000 000 unidades de glucosa, por lo que es considerada una de
IN
FO
las moléculas más grandes de la naturaleza1. La hidrólisis ácida del almidón a
DE
glucosa es una técnica que tiene muchas desventajas; formación de productos no
AS
deseables y flexibilidad muy pobre (el producto final sólo se puede modificar
EM
cambiando el grado de hidrólisis), por último es necesaria que el equipo resista el
SI
ST
ácido y las temperaturas requeridas durante este proceso. La hidrólisis enzimática en
los últimos 30 años ha desplazado la hidrólisis ácida, debido a que se dispone de
DE
nuevas enzimas, por lo tanto, la hidrólisis de almidón se realiza usando enzimas, ya
IO
N
que esta técnica presenta ventajas como: control de la formación de productos no
CC
deseables y mayor flexibilidad del producto. La α-amilasa hidroliza los enlaces
RE
glucosídicos α-1,4 de los polisacáridos que poseen 3 o más unidades de D-glucosa en
DI
unión α-1,4. El ataque se hace en forma no selectiva (tipo endoenzima) sobre varios
puntos de la cadena simultáneamente, aunque los primeros productos de la hidrólisis
son siempre oligosacáridos de 5.0 - 7.0 unidades de glucosa o un número múltiplo.
1
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
La amiloglucosidasa es una exohidrolasa también conocida como glucosamilasa, que
hidroliza los enlaces glucosídicos α-1,4 y α-1,6 de la amilasa y la amilopectina
AC
IÓ
N
separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena2.
UN
IC
El proceso enzimático consta de dos etapas consecutivas, denominadas
licuefacción y sacarificación, en donde intervienen las enzimas amilasas y
CO
M
glucosamilasas, respectivamente. Recientes avances en el desarrollo de amilasas
Y
termoestables han permitido mejorar la eficiencia del proceso de licuefacción,
A
entendiendo éste como el proceso de hidrólisis del almidón a maltodextrinas
ÁT
IC
mediante el rompimiento de los enlaces glucosídicos α-D 1,4 internos de la molécula
RM
del almidón, produciendo moléculas de diferentes número de unidades de glucosa.
IN
FO
La principal ventaja del proceso enzimático, comparado con la hidrólisis ácida,
DE
radica en la no formación de subproductos y la reducción en la demanda energética
AS
del proceso ya que no requiere el uso de grandes presiones ni elevadas
SI
ST
EM
temperaturas3,4.
Las α-amilasas presentan una gran utilidad tanto para la industria textil como
DE
para la de alimentos, pues rompen la molécula de almidón en fracciones más cortas
IO
N
(dextrinas). Las amilasas son enzimas extracelulares que catalizan las reacciones
CC
hidrolíticas del almidón, dando origen a diversos productos como oligosacáridos en
DI
RE
pequeñas cantidades y otros que poseen una gran relevancia para algunos
operaciones y procesos industriales. Son comúnmente halladas en animales y en
plantas; sin embargo, para fines industriales, las más utilizadas son aquellas de
origen bacteriano o fúngico. Poseen una gran importancia en la producción de
2
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
alimentos y de biocombustibles5,6. Las amilasas se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza, se pueden dividir en tres grupos: α-amilasas, las cuales
rompen al azar los enlaces en el interior del sustrato; β-amilasas las cuales hidrolizan
AC
IÓ
N
ordenadamente unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores del
UN
IC
sustrato (exoamilasas) y glucosamilasas que liberan unidades de glucosa a partir de
los extremos no reductores del sustrato. El principal producto final de la acción de la
CO
M
glucosamilasa sobre el almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de la α y β
Y
amilasas. La acción de la amilasa causa inversión de la configuración, produciendo β
IC
A
glucosa. En el comercio se encuentran diversas preparaciones derivadas de hongos
ÁT
Aspergillus sp y Rhizopus sp, excepto por la enzima de Aspergillus awamori, las
RM
glucosamilasas son inactivas sobre almidón nativo. Su actividad es máxima entre pH
DE
IN
FO
4.0 - 5.5, y temperatura alrededor de 55 - 65 °C7.
AS
En cuanto al pH óptimo para las α-amilasas de Bacillus subtilis o B.
EM
amyloliquefaciens es variable, pero se encuentra generalmente en el rango 6.0 - 7.0.
SI
ST
Existen pocos reportes de α-amilasas con un pH óptimo por debajo de 5.0. Algunos
casos excepcionales incluyen la α-amilasa producida por Alicyclobacillus
DE
acidocaldarius con un pH óptimo de 3.0 y la producida por Pyrococcus furiosus
IO
N
activa a un pH de 3.5. Debido a que la mayoría de las amilasas utilizadas en la
CC
sacarificación del almidón no son estables a pH ácido, este proceso debe ser ajustado
DI
RE
a un pH cercano a 6.0. Se ha planteado que los costos de procesamiento del almidón
pueden ser reducidos de manera significativa si se utilizan amilasas estables a la
acidez en el paso de sacarificación ya que esto permitiría realizar la hidrólisis de
almidón en un solo paso. La industria del almidón es una de las principales usuarias
3
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
de amilasas para la hidrólisis y modificación de esta materia prima con el fin de
obtener glucosa, maltosa y oligosacáridos, que pueden ser convertidos en jarabes de
fructosa y dextrosa. La glucosa obtenida, también puede ser fermentada para
AC
IÓ
N
producir etanol, aminoácidos y ácidos orgánicos. Sin embargo, para la conversión
UN
IC
enzimática de almidones es necesario utilizar amilasas termoestables, ya que estas
son adicionadas luego de un paso de gelatinización que requiere temperaturas entre
CO
M
70 °C - 110 °C. La mayoría de α-amilasas producidas por Bacillus amyloliquefaciens
Y
y Bacillus subtilis presentan una temperatura óptima cercana a los 70ºC, pero se han
A
encontrado enzimas con temperaturas óptimas superiores aisladas a partir de Bacillus
RM
ÁT
IC
licheniformis y Bacillus stearothermophilus8.
IN
FO
Son enzimas que catalizan al azar la hidrólisis de enlaces glucosídicos α-1,4
DE
de polisacáridos como el almidón y el glicógeno, para producir maltosa,
AS
oligosacáridos de diferentes tamaños y cadenas más o menos ramificadas llamadas
EM
dextrinas límite. Son de gran importancia en la industria alimenticia, textil, papelera
SI
ST
y farmacológica, aunque las fuentes productoras de α-amilasas incluyen plantas,
animales y microorganismos, son las enzimas microbianas las que encuentran mayor
N
DE
demanda en aplicaciones industriales. Tradicionalmente la producción de α-amilasas
IO
se ha llevado a cabo mediante procesos de fermentación líquida sumergida (FLS)
RE
CC
debido al mayor control de factores ambientales como temperatura y pH, sin
DI
embargo; la fermentación en fase sólida (FFS) constituye una alternativa interesante
puesto que los metabolitos se concentran y los procesos de purificación son menos
costosos. Los medios empleados en FFS son semejantes en textura al hábitat natural
4
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
de hongos filamentosos como Penicillium commune, lo que genera mayores
rendimientos en la producción de enzimas y la mínima degradación por acción de
proteasas. La amilasa mostró máxima actividad de hidrólisis de almidón soluble con
AC
IÓ
N
pH 6.0 y estabilidad en un intervalo de pH de 5.0 - 7.09.
UN
IC
Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a
M
cabo en un recipiente llamado fermentador o en general biorreactor, mediante el cual
CO
determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por
A
Y
acción microbiana en metabolitos y biomasa. Resumiendo, un proceso fermentativo
ÁT
IC
consiste en unir un medio de cultivo que contiene nutrientes con un microorganismo
RM
dado, en un ambiente óptimo (fermentador), donde se establecen condiciones
IN
FO
experimentales adecuadas (pH, temperatura, agitación, etc.) para obtener finalmente
el producto deseado: biomasa, metabolitos, enzimas con el mayor rendimiento. El
DE
diseño de un fermentador, aparte de asegurar que la operación se desempeñe en
EM
AS
forma aséptica, debe responder a tres requisitos principales: Mezcla adecuada, buena
SI
ST
transferencia del oxígeno del aire al microorganismo y remoción del calor. Este
último imperativo, explica que a pesar de las bajas temperaturas a que operan los
DE
procesos biológicos con respecto a la catálisis química; sea necesario considerar
IO
N
superficies importantes de intercambio térmico dentro del fermentador para mantener
CC
la temperatura de crecimiento. El fermentador agitado consiste en un cilindro vertical
RE
que posee varios deflectores para prevenir la formación de un torbellino durante la
DI
agitación. El aire estéril penetra por la base del reservorio, a través de un distribuidor
circular. El eje vertical lleva una o varias hélices en función de la relación
altura/diámetro10.
5
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Las amilasas hidrolizan el enlace glucosídico α-1.4 o α-1.6 del almidón,
glucógeno y otros polisacáridos. Se obtiene principalmente de fuentes microbianas y
tiene múltiples aplicaciones en la industria, principalmente en la alimentaria. Las
AC
IÓ
N
mejores fuentes productoras de amilasas son bacterias y hongos, no solo porque sus
UN
IC
amilasas son generalmente extracelulares, sino que además presentan altos niveles de
expresión. En este sentido, los principales microorganismos productores de amilasas
CO
M
son Bacillus subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis y Aspergillus sp.
Bacillus amyloliquefaciens produce una α-amilasa termoestable que es ampliamente
IC
A
Y
utilizada en las industrias que usan almidón. Las α-amilasas, son enzimas
ÁT
extracelulares denominadas endoenzimas porque catalizan la hidrolisis de enlaces
RM
glucosídicos internos α-1.4 presentes en el almidón, glucógeno y otros polisacáridos,
IN
FO
asimismo hidrolizan enlaces glucosídicos α-1.6 en un menor porcentaje11.
DE
Las principales aplicaciones de las enzimas extracelulares que degradan el
EM
AS
almidón consisten en la conversión del almidón de jarabes que contienen glucosa,
SI
ST
maltosa y oligosacáridos en la producción de azucares fermentables en cervecería y
en la obtención de bebidas alcohólicas y en la modificación de la harina de
DE
panadería. Entre las enzimas comercialmente utilizadas se destacan las α-amilasas de
IO
N
Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens y Aspergillus oryzae. Se han obtenido
CC
enzimas termoestables a partir de B. subtilis y B. licheniformis, permitiendo llevar a
RE
cabo la sacarificación a altas temperaturas, acelerando el proceso. Por otro lado la β-
DI
amilasas son exoenzimas que atacan los enlaces α-1.4 glucosídicos en la parte
externa de la cadena de almidón, separa unidades de maltosa a partir de los extremos
no reductores de esta por hidrólisis alterna de enlaces glucosídicos. Las β-amilasas
6
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
contienen un grupo sulfidrilo esencial para la actividad enzimática, que se lleva
acabo de forma óptima en un rango de pH entre 4.0 y 5.012.
AC
IÓ
N
La enzima α-amilasa es la enzima que favorece la hidrólisis de la cadena
lineal (amilasa) y ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo los enlaces α-
UN
IC
1,4 que se encuentran en su interior, para así formar una mezcla de dextrinas, está
M
conformada por amilodextrinas, eritrodextrinas, acrodextrinas y maltodextrinas.
CO
Producto que se desea ampliamente en la industria con su aplicación. Para su
A
Y
favorable acción catalítica sobre el almidón, esta enzima requiere un activador como
ÁT
IC
el cloruro de sodio y un pH óptimo que se encuentra entre 5.0 y 7.0, siendo éste
RM
valor, para la enzima α-amilasa bacteriana de 6.5. Por otro lado cabe mencionar que
IN
FO
es una enzima resistente al calor, ya que a 70ºC conserva aún su actividad amilolítica
en un 70%. La α-amilasa es una enzima altamente sensible a una acidez elevada y se
DE
inactiva a pH ≤ 3.3 en un tiempo aproximado de 15 minutos. Actúa sobre el almidón
AS
en estado sólido y granulado (almidón crudo o nativo), y sobre preparaciones en las
SI
ST
EM
cuales el almidón ya se encuentra gelatinizado13.
DE
Las α-amilasas provenientes de hongos y bacterias son las más utilizadas en
N
el sector industrial por sus múltiples ventajas: fácil disponibilidad, volumen de
CC
IO
producción, estabilidad de operación, modificación y optimización del proceso. Las
RE
α-amilasas bacterianas del género Bacillus como B. subtilis, B. stearothermophilus,
DI
B. licheniformis y B. amyloliquefaciens, han encontrado una extensa aplicación en
diversos procesos industriales debido a sus amplios rangos de operación de
temperatura (25 - 90°C), resistencia a pH extremos (1.0 - 11.5) y altos niveles de
7
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
expresión. Debido al amplio intervalo de operación (temperatura y pH) de las
amilasas microbianas, estas son altamente demandadas por la industria del almidón14.
AC
IÓ
N
El proceso de hidrólisis enzimática del almidón hasta glucosa, se ha llevado a
cabo en dos etapas, licuefacción y sacarificación, esta última puede alcanzar hasta
UN
IC
96% de dextrosa, por lo que ha sido necesario cultivar y manipular dos
M
microorganismos productores de enzimas amilolíticas separadamente, conllevando a
CO
un alto consumo de energía y de equipos para el proceso además de las diferencias
A
Y
existentes entre el pH y la temperatura que necesitan las dos enzimas, es difícil que
ÁT
IC
ambos actúen simultáneamente con el almidón. Las perspectivas futuras con respecto
RM
a la hidrólisis del almidón es acortar las etapas del proceso a una sola etapa, ya sea
IN
FO
con dos cepas microbianas juntas con sus respectivas enzimas, con una sola cepa con
las dos enzimas amilolíticas o con una enzima que tenga capacidad de romper todo
DE
tipo de enlace de las moléculas de almidón como lo hace la glucosamilasa. La
AS
amiloglucosidasa se utiliza a gran escala en la industria del procesado del almidón en
EM
tanques discontinuos a 55 - 60ºC y pH de 4.5 y con períodos de incubación de 48 -
SI
ST
92 h. para transformar las dextrinas formadas por la α-amilasa en glucosa. El calcio
IO
N
DE
la estabiliza frente a la desnaturalización por el calor o el pH15.
CC
Las β-amilasas hidrolizan el almidón atacándolo únicamente por su extremo
RE
no reductor y produce moléculas de maltosa y dextrinas básicamente; debido a que
DI
no hay una inmediata destrucción de la estructura polimérica del almidón, la βamilasa reduce la viscosidad de las dispersiones de almidón en forma muy lenta, a las
α-amilasa se la designa como enzima licuante ya que al hidrolizar los enlaces
8
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
químicos del almidón en una forma al azar, reduce rápidamente la viscosidad de las
dispersiones de este polímero, el producto de esta hidrólisis son dextrinas, maltosa y
glucosa, por lo que el poder reductor de las dispersiones de almidón aumenta
AC
IÓ
N
considerablemente. La glucosa obtenida, también puede ser fermentada para producir
UN
IC
etanol, aminoácidos y ácidos orgánicos. Por otro lado la α-amilasa procedente de
Aspergillus oryzae fue la primera enzima microbiana producida a escala industrial y
CO
M
comercializada. En la actualidad el A. oryzae es el microorganismo más ampliamente
utilizado como fuente productora de α-amilasa de origen fúngico y bacterias del
IC
A
Y
genero Bacillus como Bacillus subtilis principalmente. Las α-amilasas bacterianas y
ÁT
en especial aquellas provenientes de bacterias del género Bacillus como B. subtilis,
RM
B. stearothermophilus, B. licheniformis y B. amyloliquefaciens, han encontrado una
IN
FO
amplia aplicación en los procesos industriales gracias a sus rangos de temperatura
DE
óptima (25 - 90ºC), resistencia a pH extremos (1.0 - 11.5) y altos niveles de
AS
expresión en comparación con las procedentes de hongos filamentosos como
EM
aquellos del genero Aspergillus, por lo que ocupan un lugar importante en la
SI
ST
industria16.
DE
Las amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidón y que
IO
N
pueden ser producidos por diferentes microorganismos, entre ellos las bacterias y
CC
hongos. Actualmente en nuestro medio, no se han profundizado estudios de
RE
producción de amilasa, utilizando bacterias silvestres y sustratos de origen agrícola
DI
con alto contenido de almidón, este polisacárido es ideal para la inducción de las
permeasas que hidrolizan el almidón en productos como dextrinas, maltosa y
glucosa, que luego de hidrolizarlos hasta monosacáridos, son aprovechados por las
9
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
bacterias para su metabolismo, la expresión de la enzima amilasa excedente, queda
en el medio fermentado que puede ser recuperada posteriormente. Las α-amilasas son
generalmente estable a pH 5.5 – 8.0 en presencia de un complemento de calcio, la
AC
IÓ
N
actividad óptima de las α-amilasas normalmente ocurre entre pH 4.8 - 6.5, pero hay
UN
IC
diferencias en las formas de las curvas de actividad de pH de las diferentes enzimas
de amilasas y también en los valores de pH óptimo. Según la temperatura a la que
CO
M
actúan, las amilasas se pueden clasificar en amilasas termoestables y termolábiles;
Y
las enzimas termoestables son aquellas que actúan sin perder su actividad en un
IC
A
rango de 60 - 110 °C y la mayoría de ellas son de origen bacteriano; mientras que las
ÁT
enzimas termolábiles, son aquellas que actúan hasta 55 °C sin perder su actividad,
IN
FO
RM
generalmente varían entre los 20 - 55 °C y son de origen fúngico principalmente17.
La hidrólisis del almidón es el resultado de la actividad de diversas amilasas
DE
produciendo oligosacáridos, maltotriosas, maltosas, maltohexosas, maltopentosas,
EM
AS
maltotetrosas, dextrinas y pequeñas cantidades de glucosa. La α-amilasa exógena
SI
ST
proveniente de Bacillus licheniformis es una de las enzimas más estudiadas por sus
efectos en la degradabilidad del almidón. Sin embargo, en los experimentos
DE
realizados se ha prestado poca atención a la temperatura de la solución de la enzima,
IO
N
al proceso físico del grano, así como a los cambios de tamaño de partícula del
DI
RE
CC
almidón por sus propiedades fisicoquímicas18.
10
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
En la literatura se encuentran múltiples modelos cinéticos que describen la
hidrólisis del almidón. Uno de estos modelos describe la cinética de la hidrólisis de
almidón soluble con glucosamilasa como una modificación de la ecuación de
AC
IÓ
N
Michaelis - Menten que tiene en cuenta algunos factores que afectan la velocidad de
UN
IC
reacción (inhibición por productos, desnaturalización de la enzima, cambios del pH y
de la fuerza iónica, reversibilidad de la reacción, etc). Pero este modelo presenta una
CO
M
desventaja respecto a las conversiones pues no es aplicable a conversiones mayores
Y
al 40%, lo que se convierte en una limitante para el estudio de cinéticas que estén
IC
A
relacionadas con conversiones superiores. Modelos cinéticos para la fermentación de
ÁT
azúcares han sido ampliamente estudiados, desarrollaron y validaron un modelo
RM
considerando los efectos de temperatura e inhibición de sustrato, producto y biomasa,
IN
FO
en el cual los parámetros cinéticos son descritos como función de la temperatura.
DE
Este modelo fue desarrollado a partir del estudio de las cinéticas de fermentación
AS
bajo condiciones de alto estrés para el microrganismo permitiendo determinar los
EM
efectos de inhibición; y se extiende al uso industrial pues también consideró un
SI
ST
proceso continuo y utilizó como sustrato azúcar recuperada19.
DE
La hidrólisis consiste en la doble descomposición de la molécula de agua (H+
IO
N
y OH-) con otro compuesto, en la cual sus átomos forman otra especie química. Por
CC
la naturaleza disolvente del agua, también puede efectuarse la hidrólisis mediante
RE
adición de un ácido o una enzima. Al comparar los dos tipos de hidrólisis se
DI
encuentra la gran ventaja de la hidrólisis enzimática sobre la ácida. Esto se debe,
primordialmente, a que las enzimas son específicas para un tipo de enlace
(selectividad), por lo cual, no es usual la aparición de productos de degradación; caso
11
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
contrario sucede con la hidrólisis ácida, en la cual, el poco control y la selectividad
pobre ocasionan la aparición de productos de degradación, inclusive tóxicos. Otra
ventaja son los rangos moderados de condiciones como temperatura y pH en las que
AC
IÓ
N
transcurre la hidrólisis enzimática (pH = 4.0 - 8.0; T = 40 - 60°C). Además, no se
presentan sustancias extrañas añadidas como en el caso de la hidrólisis acida para la
M
UN
IC
neutralización en presencia de sales20.
CO
Durante las últimas dos décadas, la tecnología de producción de enzimas y en
A
Y
el especial las de origen microbiano, ha permitido que estas sean actualmente
ÁT
IC
comercializadas para diversos usos industriales. Actualmente, el género Bacillus
RM
destaca entre los distintos microorganismos estudiados y modificados genéticamente
IN
FO
para la producción de amilasas de uso industrial. Las condiciones de temperatura,
pH, entre otros factores, condicionan la efectividad del accionar de las enzimas
DE
amilolíticas. El uso de las enzimas amilolíticas termoestables, también tienen
EM
AS
características potenciales para usarse como aditivo en rumiantes21. Las amilasas del
SI
ST
Bacillus licheniformis actúan por difusión en los gránulos de almidón y presentan
una gran actividad en un intervalo de pH entre 4.0 - 9.0 y de temperatura entre 30 -
DE
90°C con un óptimo de 76°C, ha sido modificado mediante ingeniería genética, y se
DI
RE
CC
IO
N
usa para producir amilasas industriales22.
12
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
JUSTIFICACION
Existen distintas bacterias que producen una variedad de enzimas extracelulares que
son segregadas al medio para degradar los sustratos existentes, es el caso de Bacillus
AC
IÓ
N
licheniformis que destaca por hidrolizar almidón presente en diferentes ambientes
UN
IC
haciendo uso de las amilasas excretadas al medio, a una concentración de almidón,
pH, temperatura y tiempo de exposición. Por otro lado, no se tiene información
CO
M
científica sobre el tiempo necesario para producir amilasas por B. licheniformis,
Y
disponible en el laboratorio en un biorreactor agitado, en este sentido se pretende dar
IC
A
inicio a una investigación para optimizar el proceso de producción de amilasas a
ÁT
escala de laboratorio. Por tanto, se pretende optimizar la producción de amilasas por
RM
B. licheniformis en cultivo sumergido de un biorreactor agitado, determinando el
IN
FO
proceso de hidrólisis de almidón bacteriana para obtener jarabes glucosados que
DE
posteriormente pueden ser utilizados en la industria de producción de etanol, como
AS
una alternativa en la obtención de biocombustibles. Del mismo modo, las
EM
condiciones ambientales que se pueda lograr en los sistemas de ensayo nos
SI
ST
permitirán mejorar los sistemas de producción, constituyendo comercialmente una
propuesta para la industria a gran escala utilizando residuos de almidón y B.
DE
licheniformis nativo. En este sentido la investigación estará orientada a la evaluación
IO
N
del efecto de la temperatura y el pH en la producción de amilasas por B.
CC
licheniformis en condiciones de laboratorio para lograr hidrolizar un alto porcentaje
DI
RE
de almidón en el menor tiempo. Teniendo como problema científico: ¿Cuál es el
efecto de la temperatura 25, 40 y 55ºC y pH 6, 7 y 8 en la producción de amilasas por
Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado?
13
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
OBJETIVO(S)
General:
AC
IÓ
N
1. Determinar el efecto de la temperatura y pH en la producción de amilasas por
UN
IC
Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado hasta las 72h de
CO
M
incubación.
Y
Específicos:
IC
A
1. Monitorear la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-
RM
ÁT
A15 a pH 6, 7 y 8 en un biorreactor agitado a 25, 40 y 55°C hasta las 72h de
IN
FO
incubación.
2. Comparar la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-
DE
A15 a pH óptimo a las temperaturas de ensayo en un biorreactor agitado hasta las
AS
72h de incubación.
EM
3. Determinar si existe o no diferencias significativa en la producción de amilasas a
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
condiciones de ensayo con relación al tiempo de incubación.
14
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
MATERIAL Y METODOS
MATERIAL BIOLOGICO
N
1.
AC
IÓ
Cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15, proporcionado por el Laboratorio de
UN
IC
Fisiología y Genética Microbiana de la Universidad Nacional de Trujillo, con
Y
METODOLOGIA
ÁT
IC
A
2.
CO
M
capacidad amilolítica aislado de residuos de efluente de curtiembre23. (ANEXO 1)
RM
2.1. REACTIVACION DEL CULTIVO Bacillus licheniformis FGM-A15
IN
FO
El cultivo bacteriano conservado en refrigeración fue sembrado en placas
conteniendo agar almidón 0.1% (ANEXO 2) por estría, luego se procedió
EM
AS
DE
a incubar a 37ºC por 24h. (ANEXO 3)
SI
ST
2.1.1 VERIFICACION CUALITATIVA DE LA CAPACIDAD
DE
DEGRADATIVA DE Bacillus licheniformis FGM-A15 E
DI
RE
CC
IO
N
IDENTIFICACION MICROSCOPICA
Luego de la reactivación del cultivo puro se procedió a verificar la
capacidad degradativa de Bacillus licheniformis FGM-A15
mediante la técnica del lugol24. Se sembró en placa conteniendo
agar almidón 0.1% mediante la siembra por puntura, luego se
procedió a incubar a 37ºC por 48h. Posteriormente de agrego lugol
15
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
y se observó el halo de hidrolisis del almidón alrededor de las
colonias amilolíticas. Posteriormente se procedió a la identificación
CONSTRUCCION DE BIORREACTORES AGITADOS
UN
IC
2.2
AC
IÓ
N
microscópica mediante una coloración Gram. (ANEXO 4)
CO
M
Se construyeron 03 biorreactores con frascos de vidrio con un volumen de
Y
operación de 300 mL, con 04 “bafles”, se acondiciono un motor de 6V y
IC
A
un agitador tipo Roushton a cada uno25. (ANEXO 5). Los frascos y
ÁT
agitadores fueron esterilizados haciendo uso de hipoclorito de sodio (lejía)
RM
al 2.5 % por 30 minutos, luego fueron llevados para ser irradiados con luz
EM
AS
DE
minutos. (ANEXO 6)
IN
FO
ultravioleta de una lámpara de 300 Watt, a una distancia de 30 cm, por 60
PREPARACION DEL INOCULO
SI
ST
2.3
El cultivo se sembró en agar almidón 0.5% y se incubo a 37°C por 12h. A
DE
partir del cultivo joven y utilizando solución salina fisiológica estéril se
nefelómetro de Mc Farland (9.0x108 UFC/mL). (ANEXO 7)
DI
RE
CC
IO
N
preparó una suspensión microbiana equivalente al tubo Nº 3 del
16
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
2.4
EVALUACION DE LA PRODUCCION DE AMILASAS POR
Bacillus licheniformis FGM-A15 EN EL BIORREACTOR AGITADO
A LAS CONDICIONES DE ENSAYO.
AC
IÓ
N
Se colocó 180 mL de una solución de caldo almidón 0.6% - buffer fosfato
UN
IC
al pH de ensayo (6.0, 7.0 y 8.0), suplementado con (NH4)2SO4, CaCl2 y
CuSO4 (ANEXO 8), luego se agregó 20mL de inoculo estandarizado en
CO
M
cada uno de los biorreactores (ANEXO 9), seguidamente, se puso en
Y
funcionamiento a los biorreactores, con una agitación de 200 rpm
IC
A
aproximadamente en cada biorreactor, y se incubó a las temperaturas de
ÁT
ensayo (25, 40 y 55°C), de acuerdo al protocolo de los sistemas de ensayo.
IN
FO
RM
(ANEXO 10)
DE
A los tiempos 0, 12, 24, 36 y 72h, se extrajo 10 mL de muestra del
AS
biorreactor (ANEXO 11), se centrifugo a 2500 rpm por 10 minutos
EM
(ANEXO 12). En el sobrenadante (extracto de enzimas) se cuantificó la
SI
ST
cantidad de amilasas producidas en relación al tiempo de incubación
IO
N
DE
(ANEXO 13), midiendo la cantidad de almidón residual.
DI
RE
CC
2.5
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD CATALITICA
En un tubo de ensayo, se colocó 1.0mL de disolución de almidón 0.1% buffer fosfato al pH de ensayo (6.0, 7.0 y 8.0) y 1.0mL de extracto de
enzimas, se mezcló e incubo a 50 °C por 1h (ANEXO 14).
17
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Posteriormente se procedió a inactivar las enzimas presentes, calentando a
80°C por 5 minutos.
N
Se trabajó con un tubo Control, colocando 1.0 mL de buffer fosfato y 1.0
AC
IÓ
mL de extracto de enzima, calentado a 80 °C, y se incubó en las mismas
UN
IC
condiciones, para cuantificar la cantidad de almidón residual presente en el
Y
MEDICION DEL ALMIDON RESIDUAL
A
2.6
CO
M
extracto de enzimas.
ÁT
IC
En otro tubo de ensayo, se colocó 0.5mL del inactivado con 0.1mL de
RM
solución yodada (ANEXO 15), y 0.4 mL de agua destilada. Las lecturas de
IN
FO
las absorbancias (Problema), se realizaron en el espectrofotómetro
(Spectronic 20) a una longitud de onda de 580nm. (ANEXO 16)
DE
Para determinar los miligramos (mg) de almidón residual, se multiplicó la
AS
absorbancia Problema corregida por el factor de conversión, y por la
SI
ST
EM
dilución realizada, antes de realizar la lectura de la absorbancia en el
DE
espectrofotómetro.
ELABORACION DE LA CURVA ESTANDAR DE ALMIDON
IO
N
2.7
DI
RE
CC
Se trabajó con solución de almidón a una concentración de 0.1mg/mL. Se
colocó 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 y 0.6mL, en tubos de ensayo,
respectivamente; se aforó a 1.0mL con agua destilada; luego se agregó a
cada tubo, 0.5mL de HCl 0.01M y 0.1mL de solución yodada (I2/KI). Para
el blanco de reactivo, se trabajó con 1.0mL de agua destilada. Por último
18
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
se procedió a realizar las lecturas en el espectrofotómetro. (ANEXO 17).
Finalmente, se determinó el factor de conversión para cuantificar almidón
AC
IÓ
N
por espectrofotometría.
DETERMINACION DE LA PRODUCCION DE AMILASAS
UN
IC
2.8
(UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA)
CO
M
Una unidad de actividad amilolítica (UA) se definió como la cantidad de
Y
amilasas necesarias para hidrolizar 10mg de almidón en 30 minutos, a
RM
ÁT
IC
A
50°C, a pH de ensayo, expresados como UA/mL (ANEXO 18 - 22)
IN
FO
La cantidad de almidón hidrolizado, se calculó a partir de la diferencia
entre el almidón inicial incubado y el almidón residual, después de la
AS
DE
actividad catalítica.
EM
Para calcular las UA/mL, se dividió la cantidad de almidon hidrolizado
DE
SI
ST
calculado entre 10 y luego multiplicado por 2
DI
RE
CC
IO
N
2.9 ANALISIS DE RESULTADOS
La producción de amilasas (UA/mL), fueron analizados mediante las
pruebas estadísticas de Tukey y Duncan para verificar si existe o no
diferencia significativa entre los resultados obtenidos en cada sistema de
ensayo. (Tabla 1 - 3) (ANEXO 23 - 25)
19
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
RESULTADOS
En la Fig. 1, se muestra la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis
AC
IÓ
N
FGM-A15 en el biorreactor agitado a los pH de ensayo a 25°C, en relación al tiempo de
M
UN
IC
incubación, donde se observa una mayor producción a pH 7 entre las 24 y 36h.
CO
En la Tabla 1, se muestra el análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la
A
Y
producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor
ÁT
IC
agitado a condiciones de ensayo donde se observa que existe diferencia significativa
IN
FO
RM
entre las 12h y 36h a 25°C.
DE
En la Fig. 2, se muestran la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis
AS
FGM-A15 en el biorreactor agitado a los pH de ensayo a 40°C, en relación al tiempo de
SI
ST
EM
incubación, donde se observa mayor producción a pH 7 entre las 24 y 36h.
DE
En la Tabla 2, se muestra el análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la
IO
N
producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis en el biorreactor agitado a
RE
CC
condiciones de ensayo donde se observa que existe diferencia significativa a las 12, 36 y
DI
72h a 40°C.
20
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
En la Fig. 3, se muestra la producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis
FGM-A15 en el biorreactor agitado a los pH de ensayo a 55°C, en relación al tiempo de
AC
IÓ
N
incubación, donde se observa mayor producción a pH 7.
UN
IC
En la Tabla 3, se muestra el análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la
M
producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis en el biorreactor agitado a
CO
condiciones de ensayo donde se observa que existe diferencia significativa a las 12, 36 y
ÁT
IC
A
Y
72h a 55°C.
RM
En la Fig. 4, se muestran la producción de amilasas (UA/mL) a pH 7 a las diferentes
IN
FO
temperaturas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en relación al tiempo de incubación,
DE
donde la mayor producción corresponde a 55°C, con tendencia a seguir
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
incrementándose.
21
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
0.12
AC
IÓ
N
0.1
UN
IC
pH 6
0.06
M
pH 7
CO
UA/mL
0.08
A
Y
0.04
pH 8
0
20
40
IN
FO
0
RM
ÁT
IC
0.02
60
80
AS
DE
Tiempo (h)
EM
Figura 1. Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
biorreactor agitado a los pH de ensayo (6, 7 y 8) a 25°C.
22
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Tabla 1. Análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la producción de amilasas
(UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor agitado a
Unidades Amiloliticas/mL
Subconjunto
N (pH)
0.0000
12
3
0.0434
24
3
0.0545
36
3
0.0688
72
3
3
24
3
36
3
72
0.0545
0.0545
0.0688
0.0688
0.0000
DE
3
0.0777
3
0.0434
3
0.0545
0.0545
AS
24
Duncana,b
0.0434
3
0
12
ÁT
12
0.055
0.0000
RM
3
IN
FO
Tukey B
a,b
1,000
A
0.0777
Sig.
0
UN
IC
3
CO
0
3
IC
DHS de Tukeya,b
2
Y
1
M
Tiempo (h)
AC
IÓ
N
25°C, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan. (ANEXO 20)
3
0.0688
72
3
0.0777
EM
36
1.000
SI
ST
Sig.
0.303
0.059
DE
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
IO
N
Basadas en las medias observadas.
DI
RE
CC
El término de error es la media cuadrática (Error) = 15431.133
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000
b. Alfa = 0.05
23
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
0.16
N
0.14
AC
IÓ
0.12
UN
IC
M
0.08
pH 8
A
Y
0.06
pH 6
pH 7
CO
UA/mL
0.1
ÁT
IC
0.04
IN
FO
RM
0.02
0
0
20
40
60
80
EM
AS
DE
Tiempo (h)
SI
ST
Figura 2. Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en
DI
RE
CC
IO
N
DE
biorreactor agitado a los pH de ensayo (6, 7 y 8) a 40°C.
24
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Tabla 2. Análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la producción de amilasas
(UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor agitado a
Unidades Amiloliticas/mL
Subconjunto
N
0.0000
12
3
0.0844
24
3
0.0916
36
3
0.1028
72
3
A
IC
0
3
12
3
24
3
36
3
72
3
0
3
12
3
0.0844
3
0.0916
EM
36
72
0.0916
0.1028
0.1108
0.167
IN
FO
RM
0.0844
0.0916
0.0916
0.1028
0.1028
0.1108
0.0000
DE
24
Duncana,b
0.0000
0.195
AS
Tukey B
1,000
3
0.0916
0.1028
3
SI
ST
Sig.
4
M
3
Y
0
Sig.
a,b
3
ÁT
DHS de Tukeya,b
2
UN
IC
1
CO
Tiempo (h)
AC
IÓ
N
40°C, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan. (ANEXO 21)
0.1028
0.1108
1.000
0.366
0.174
0.314
DE
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
IO
N
Basadas en las medias observadas.
CC
El término de error es la media cuadrática (Error) = 8381.867
DI
RE
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000
b. Alfa = 0.05
25
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
0.2
0.18
AC
IÓ
N
0.16
0.14
UN
IC
UA/mL
0.12
pH 6
pH 7
CO
M
0.1
pH 8
Y
0.08
IC
A
0.06
ÁT
0.04
RM
0.02
0
IN
FO
0
20
40
60
80
EM
AS
DE
Tiempo (h)
Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15
SI
ST
FIGURA 3.
DI
RE
CC
IO
N
DE
en biorreactor agitado a los pH de ensayo (6, 7 y 8) a 55°C.
26
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Tabla 3. Análisis de varianza unidireccional (ANAVA) para la producción de amilasas
(UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 en el biorreactor agitado a
AC
IÓ
N
55°C, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan. (ANEXO 22)
Subconjunto
N
1
0.0000
12
3
0.1202
24
3
0.1309
36
3
72
3
12
3
24
3
36
3
72
3
0
3
24
SI
ST
72
0.1492
IC
0.222
0.191
0.1202
0.1309
0.1309
0.1492
0.1492
0.1684
0.1202
3
0.1309
3
0.1492
3
0.1684
1.000
0.206
1.000
1.000
DE
Sig.
0.1492
0.1684
A
3
EM
36
0.1309
0.0000
AS
12
Duncana,b
0.0000
0.658
RM
3
IN
FO
0
DE
Tukey B
1.000
4
M
3
Y
0
Sig.
a,b
3
ÁT
DHS de Tukeya,b
2
CO
Tiempo (h)
UN
IC
Unidades Amiloliticas/mL
N
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
CC
IO
Basadas en las medias observadas.
RE
El término de error es la media cuadrática (Error) = 9078.650
DI
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000
b. Alfa = 0.05
27
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
0.2
0.18
AC
IÓ
N
0.16
UN
IC
0.14
UA/mL
0.12
M
0.1
CO
40°C
55°C
Y
0.08
25°C
IC
A
0.06
RM
ÁT
0.04
IN
FO
0.02
0
0
20
40
60
80
SI
ST
EM
AS
DE
Tiempo (h)
FIGURA 4. Producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15 a
DE
pH 7 a las temperaturas de ensayo (25, 40 y 55°C), en relación al tiempo
DI
RE
CC
IO
N
de incubación.
28
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
DISCUSION
La producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 a condiciones
AC
IÓ
N
de pH 6.0, 7.0 y 8.0 y a las temperaturas de 25, 40 y 55°C; fue determinado durante las
72h de incubación mediante la cuantificación de la actividad enzimática midiendo
UN
IC
almidón residual para lograr determinar las condiciones óptimas de pH y temperatura.
M
Por otro lado según lo reportado por Fernández y col, para caracterizar el pH y la
CO
temperatura óptimos de la actividad amilásica utilizó un rango de pH entre 2.0 - 12.0 y
A
Y
un rango de temperatura entre 25 y 70°C, donde la actividad enzimática a diferentes pH
ÁT
IC
mostró que las amilasas son poco estables en medio ácido, reduciéndo su actividad en
RM
más de un 70%, con la existencia de más de un óptimo en la mayoría de las especies
IN
FO
consideradas, apuntando a la posible existencia de isoformas de la α-amilasa con valores
de pH óptimo más alcalinos (8.0 y 9.0), hecho que se corresponde con la alta
EM
AS
DE
sensibilidad a valores de pH ácidos 26.
SI
ST
Calvo y Zúñiga, evaluaron diferentes cepas de Bacillus spp. a pH 4.0 y 5.5
quienes mostraron diferentes tasas de crecimiento, a pesar de ser un género bacteriano
DE
asociado a pH neutros27; es así que el estudio de Bacillus licheniformis FGM-A15 dió
IO
N
un efecto positivo de crecimiento a pH neutro (7.0), debido a que se determinó mayor
CC
producción de amilasas en comparación con pH 6.0 y 8.0 en los biorreactores agitados,
RE
con una velocidad de agitación aproximada de 200 rpm y el medio enriquecido que
DI
posiblemente permitió mantener un medio equilibrado y óptimo.
29
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
La temperatura, pH y el tiempo de incubación son factores determinantes en la
producción de amilasas, así como en la actividad y estabilidad de una enzima; donde la
actividad amilásica verifica el proceso de hidrólisis del almidón de Bacillus
AC
IÓ
N
licheniformes FGM-A15, siendo a 40 y 55°C donde presentó la mayor actividad
UN
IC
enzimática, debido a que hubo mayor producción de amilasas con pH 6.0 y 7.0, hasta
las 72h de incubación (FIGURA 2 y 3); a diferencia de lo reportado por Guadarrama y
CO
M
col. sobre la actividad enzimática ya que trabajo con temperaturas entre 28 a 37°C,
Y
siendo esta última donde la actividad fue mayor, con rango de pH 4.0 a 6.0, suponiendo
A
que la producción de la enzima es directamente proporcional en relación al tiempo de
RM
ÁT
IC
incubación del sistema de producción 28.
IN
FO
Según lo reportado por Llenque que monitoreo la presencia de almidón residual,
DE
registrando el tiempo total necesario para que la bacteria hidrolice completamente la
AS
cantidad de almidón presente en cada uno de los sistemas. Logró seleccionar un bacteria
EM
con mayor capacidad hidrolítica sobre el almidón de papa en medio acuoso identificado
SI
ST
como Bacillus subtilis, el mismo que alcanzó una velocidad de hidrolisis experimental
DE
de 0.166 g almidón/h con 40ºC a pH 7.5 y 1.0 % de almidón, encontrándose un mayor
N
efecto positivo de la temperatura (40ºC) y el pH (7.5) sobre la velocidad de hidrólisis;
CC
IO
por el contrario, este trabajo realizado con Bacillus licheniformis FGM-A15 demostró
RE
que en los 3 ensayos realizados, el que se trabajó a pH 7 tuvo un efecto positivo sobre la
DI
hidrolisis del almidón a 55°C, ya que se produjo 0.1876 UA/mL hasta las 72h de
incubacion, con una concentración de almidón de 0.6 % 29.
30
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Bacillus licheniformis FGM-A15 presentó mayor producción de amilasas a pH 7
a las temperaturas de 25, 40 Y 55°C (FIGURA 4), pero de estas temperaturas, fue a
55°C donde se encontró la mayor producción, siendo de 0.1876 UA/mL hasta las 72h de
AC
IÓ
N
incubacion; a diferencia del estudio realizado por Ochoa, que trabajo con diferentes
UN
IC
cepas de Bacillus sp; y observó que ninguna de las cepas nativas que estudió se
desarrollaron a temperaturas superiores de 55°C. La cepa B-8 produjo mayor actividad a
Y
CO
M
35°C siendo de 3.970 U/mL, igualmente la cepa B-30 con 4.000 U/mL30.
IC
A
Según lo reportado por Pérez y col, que trabajó con diferentes cepas de Bacillus
ÁT
spp. determinó la temperatura óptima para la producción enzimática fue de 40°C con un
RM
valor de actividad de 97.34 U, pero se obtuvo una razón mayor en la síntesis enzimática
IN
FO
de Bacillus megaterium a una temperatura de 28°C a pH 8.0; es de destacar que el
DE
crecimiento de las células bacterianas está muy influenciado por el pH, a diferencia de
AS
la cepa de Bacillus licheniformis se obtuvo un valor óptimo de actividad enzimática a
EM
pH de 8.5. Por el contrario en este estudio, se encontró que la producción enzimática
SI
ST
óptima por Bacillus licheniformis FGM-A15 fue a pH 7.0 y a la temperatura de 55°C
DI
RE
CC
IO
N
amilasas31.
DE
con un valor de 0.1876 UA/mL, ya que el ensayo a pH 8.0 produjo la menor cantidad de
31
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Al observar la curva de producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGMA15 a través del tiempo, se aprecia que aumenta entre las 24 y 36h, siendo más
significante a 40 y 55°C y a pH 6 y 7 (FIGURA 2 y 3), hasta alcanzar un valor máximo.
AC
IÓ
N
Según lo reportado por Gonsalez, el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los
UN
IC
factores que intervienen en la expresión de la actividad enzimática es proporcional a la
concentración de la proteína enzimática activa en la zona de linealidad de la reacción
CO
M
producto - tiempo32. Por lo tanto, de acuerdo a los resultados obtenidos se establece que
Y
existe una relación correlacional entre la temperatura de 55°C y el pH 7 como factores
IC
A
óptimos hasta las 72h, debido a que permitió la mayor producción de amilasas en el
RM
ÁT
biorreactor agitado.
IN
FO
Según lo reportado por Cabeza y Morata la máxima producción en fermentación
DE
en sustrato sólido y sumergida de α-amilasa se alcanzó a las 72h de incubación, dicha
AS
producción se alcanzó cuando la incubación se realizó a 30ºC, siendo de 0.407 UE/mL,
EM
pero que al optimizar la producción en fermentación en sustrato sumergido, aumentando
SI
ST
al medio la cantidad de carbohidratos disponibles para el microorganismo (almidón,
pectina y glucosa), el valor máximo de α-amilasa fue de 1.157 UE/mL. Estas
DE
actividades superan las logradas en fermentación en sustrato sólido, donde no se ha
IO
N
optimizado el medio de cultivo33. Por otro lado la máxima producción por Bacillus
CC
licheniformis FGM-A15 fue a 55°C hasta las 72h de incubación, pero hubiera sido muy
DI
RE
conveniente realizar una optimización al medio utilizado (caldo almidon 0.6%) a fin de
obtener actividades enzimáticas mayores en el sistema de cultivo. Entonces resultaría
conveniente continuar con los ensayos para estandarizar el medio de fermentación para
lograr incrementar la producción de amilasas en el biorreactor.
32
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Mediante la prueba de Tukey y Duncan (Tabla 1 - 3) se analizaron las
diferencias de las curvas de producción de las unidades amilolíticas de los pH de ensayo
a cada temperatura (25, 40 y 55°C), en relación al tiempo de incubación por Bacillus
AC
IÓ
N
licheniformis FGM-A15, y se encontró diferencias significativas, ya que en cada pH se
UN
IC
presenta diferente producción de enzimas a partir del sustrato (almidon 0.6%). Así
mismo, en la Tabla 1 se observa el análisis unidireccional para la producción de
CO
M
amilasas promedio a 25°C donde la diferencia significativa se muestra a partir de las 24
Y
y luego a las 72h de incubación; mientras que, en las Tablas 2 y 3 se observan el análisis
IC
A
unidireccional para la producción de amilasas promedio a 40 y 55°C respectivamente
RM
ÁT
donde la diferencia significativa se encontró a las 24, 36 y 72h de incubacion.
IN
FO
En los tiempos mencionados hubo diferencia significativa debido a que se presentó un
aumento en la producción de amilasas en comparación con los no mencionados. Por lo
DE
tanto las temperaturas para la producción óptima de amilasas oscilan entre 40 y 55°C,
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
obteniendo una mayor producción a 55°C hasta las 72h de incubacion.
33
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
CONCLUSIONES
 La temperatura y el pH en general tuvieron efecto positivo sobre la producción
AC
IÓ
N
de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado hasta
La producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15, siempre fue
M

UN
IC
las 72h de incubación.
CO
mayor a pH 7 a las temperaturas de ensayo (25, 40 y 55°C) en el biorreactor
A
Y
agitado hasta las 72h de incubación en comparación con las que se produjeron a
RM
ÁT
IC
pH 6 y 8.
IN
FO
 La mayor producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en forma
óptima fue a pH 7 a 55°C hasta las 72h de incubación en el biorreactor agitado,
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
con tendencia a incrementarse.
34
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
RECOMENDACIONES
 Al construir los biorreactores, estos deben ser probados con el tiempo
UN
IC
AC
IÓ
N
estandarizado para poder encontrar fallas.
 Al momento de preparar la solución de caldo almidón, los reactivos deben ser
CO
M
preparados y esterilizados por separado, ya que algunas sales reaccionan al ser
IC
A
Y
mezcladas precipitando posteriormente.
ÁT
 Se debe monitorear y controlar el pH de la solución de caldo almidón durante
IN
FO
RM
todo el funcionamiento de los biorreactores.
DE
 Aplicar los parámetros óptimos para producir amilasas por Bacillus
EM
AS
licheniformis FGM-A15 a escala piloto y gran escala.
SI
ST
 Evaluar a pH 7 a temperaturas de incubacion superiores de 55°C, ya que las
DE
enzimas producidas son termoestables y es posible que se encuentre mayor
DI
RE
CC
IO
N
producción de enzimas.
35
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Peña A, Molina D, Torres R. Hidrolisis de almidón de yuca mediante la utilización
AC
IÓ
N
de preparaciones solubles e insolubilizadas de α-amilasa. (Aspergillus niger)
UN
IC
SIQUIA 2009.
2. Mera I, Carrera J. Obtención de glucosa a partir de almidón de yuca Manihot
CO
M
sculenta. Facultad de Ciencias Agropecuarias 2005; 3(01).
3. Mielenz J. Ethanol production from biomass: technology and commercialization
A
Y
status. Curr. Opin. Microbiol. 2001; 4:324-329.
ÁT
IC
4. Rutz D, Janssen R. Biofuel technology handbook. Munich: WIP Renewable
RM
Energies 2007.
IN
FO
5. Fennema O. Química de los alimentos. Edit. Acribia S.A. 2000. 1258
DE
6. Whiteburst R. Enzymes in food technology. Edit. Sheffield Academic Press 2002.
AS
7. Eliecer J. Producción y aplicación de enzimas industriales. Facultad de Ciencias
EM
Agropecuarias 2003; 01(01): 10-11.
SI
ST
8. Quinteros M, Montoya O, Gutiérrez P. Purificación y caracterización de una αamilasa producida por la cepa nativa Bacillus sp. BBM.ISSN 2010; (162): 31-38.
DE
9. Espinel E, López E. Purificación y caracterización de α-amilasa de Penicillium
IO
N
commune producida mediante fermentación en fase sólida. Rev. Colomb. Quim
CC
2009; 38(2): 191-208.
RE
10. Cuellas A. Biorreactores. Ingeniería de alimentos. 2007; 5-12.
DI
11. Montor J. Caracterización de amilasas producidas por bacterias de suelos cultivados
con caña de azúcar. Campus Tuxtepec, Universidad del Papaloapan. 2013.
36
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
12. Espitia L. Determinación de la concentración de alfa y beta amilasas comerciales
en la producción de etanol a partir de almidón de cebada empleando
Saccharomyces cerevisiae. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad
AC
IÓ
N
Javeriana. 2009.
13. Cala C, Martínez J. Modificación hidrolítica de almidón de yuca nativo con
UN
IC
enzima α-amilasa bacteriana aislada de Bacillus subtilis para elaboración de
CO
M
salsas. [Tesis]. Universidad de la Salle. 2008.
bioquímica
de
AmiJ33,
una
amilasa
de
Bacillus
IC
A
Caracterización
Y
14. Montor J, Olvera C, Reyes D, Sachman B, Ramírez L, Del Moral S.
ÁT
amyloliquefaciens aislada de suelos cultivados con caña de azúcar en la región de
RM
Papaloapan. Rev. Electrónica Nova Scientia 2013.
IN
FO
15. Sánchez P, Mejía C, Figueroa C, Esquivia M, Agudelo L, Zapata N, et al. Estudio
DE
de cepas nativas amilolíticas. Vitae 2005; 12(2). 21-28.
AS
16. Varela L. Amilasas. [Tesis para obtener el grado de maestro en Biotecnología].
EM
Universidad Autónoma de Chihuahua. 2010.
SI
ST
17. Vargas S. Selección y evolución de bacterias del genero Bacillus productoras de
amilasa en cultivo sumergido. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. 2002.
DE
18. Plata F, Ricalde R, Melgoza L, Mendoza G, Franco F. Efecto de la dosis de α-
IO
N
amilasa (Bacillus licheniformis), temperatura de solución y molido del grano de
CC
sorgo en la aglutinación del almidón y digestibilidad ruminal in vitro. Interciencia
DI
RE
2004; 29(12): 687.
19. Atala D, Costa A, Maciel R, Maugeri F. Kinetics of ethanol fermentation with
high biomass concentration considering the effect of temperature. Applied
Biochemistry and Biotechnology 2001. 353-365.
37
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
20. Guadix A, Guadix E, Páez M, González P. Procesos tecnológicos y métodos de
control en la hidrólisis de proteínas. Ars Pharmaceutica 2009; 41(1). 79-89.
21. Rojo R, Mendoza G, Montañez O, Rebollar S, Cardoso D, Hernández J, et al.
AC
IÓ
N
Enzimas amilolíticas exógenas en la alimentación de rumiantes. Universidad y
UN
IC
Ciencia. 2007; 23(02): 173-182.
22. Rojo R, Mendoza G, Crosby M. Uso de la amilasa termoestable de Bacillus
CO
M
licheniformis en la digestibilidad in vitro del almidón de sorgo y maíz.
Y
Redalyc.org. 2001; 35(4): 423-427.
IC
A
23. Mendoza G. Biorreducción y biosorción de cromo por Pseudomonas aeruginosa y
ÁT
Bacillus licheniformis en cultivo sucesivo utilizando efluente de curtiembre.
RM
[Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias]. Universidad Nacional de
IN
FO
Trujillo. 2014.
DE
24. Reyna L, Robles R, Reyes M, Mendoza Y, Romero J. Hidrólisis Enzimática del
AS
Almidón. Rev. Per. Quim. 2004; 01(7): 40-44.
EM
25. Paz I. Diseño integral de biorreactores continuos de tanque agitado aplicados a
SI
ST
procesos de fermentación. Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales.
2010.
DE
26. Fernández I, Mayano F, Díaz M, Martínez T. Caracterización de la actividad α-
IO
N
amilasa en algunos Espáridos Mediterráneos. Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 2002;
CC
18(1-4): 109-114.
DI
RE
27. Calvo P, Zúñiga D. Caracterización Fisiológica de Cepas de Bacillus spp Aisladas
de la Rizósfera de papa (Solanum tuberosum). Ecol. Apl. 2010; 9(1): 31-39.
38
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
28. Guadarrama A, Orozco J, Morales M. Obtención de α-amilasas a partir de
Aspergillus oryzae. XII Congreso Nacional de Biotecnología y Bioenergía.
Universidad Autónoma del Estado de México. 2007.
AC
IÓ
N
29. Llenque L. Efecto de la Temperatura, pH y Concentración de sustrato sobre la
UN
IC
Velocidad de Hidrólisis del Almidón de papa por Bacillus subtilis Nativo en un
Biorreactor Cilíndrico Agitado. Universidad Nacional de Trujillo. 2011.
CO
M
30. Ochoa M. Producción de α-amilasa por una cepa nativa de Bacillus y su
Y
Aplicación al Tratamiento del Almidon Residual en Granos de Malta Asociados.
IC
A
[Tesis para obtener el grado de Maestro en Microbiología Industrial]. Universidad
ÁT
Autónoma de Nueva León. 1994.
RM
31. Pérez M, Milián G, Alfonso G, González R, Piad R, Ascunce del Sol G.
IN
FO
Aislamiento y Caracterización de cepas de Bacillus spp productoras de enzimas
AS
Científica. 1998; 3(1): 1-7.
DE
proteolíticas para la producción de hidrolizados de proteínas. Rev. Avanzada
EM
32. González C. Evaluación de la actividad amilásica como indicador del grado de
SI
ST
Biotransformación de residuos orgánicos procedentes de la Industrialización de
papa congelada. Universidad de la Sabana. 2004.
DE
33. Cabeza M, Morata V. Producción de pectinasas y amilasas de Bacillus SC-H en
IO
N
Fermentación en Sustrato Sólido y Sumergida. Rev. Avanzada Científica.
DI
RE
CC
CONICET. 2006: 1-6.
39
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
ANEXOS
40
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Agar almidón
AS
DE
ANEXO 2.
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
ANEXO 1. Cultivo puro de Bacillus licheniformis FGM-A15.
g/L
1.00
Peptona
2.50
CaCl2
0.25
Agar
15.0
pH 6.5
DI
RE
CC
IO
N
DE
Almidón
SI
ST
EM
Composición
41
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 3.
Colonias del cultivo puro de Bacillus licheniformis FGM-A15 durante la
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
reactivación en agar almidón 0.1% mediante siembra por estría.
Observación microscópicca de Bacillus licheniformis FGM-A15
DE
ANEXO 4.
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
mediante colaración Gram
42
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Sistema de biorreactores utilizados en los ensayos
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
ANEXO 5.
43
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Cámara UV para la esterilización de los biorreactores
ANEXO 7.
Inóculo equivalente al tubo N° 3 del nefelómetro de Mc Farland que se
DE
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
ANEXO 6.
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
obtuvo a partir de cultivo joven de Bacillus licheniformis FGM-A15.
44
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
0.50
CaCl2
0.50
KH2PO4
1.497
Na2HPO4.12H2O
3.22
CuSO4
0.8
AC
IÓ
(NH4)2SO4
UN
IC
1.00
M
Almidón
CO
g/L
Y
Composición
N
Composición química del Caldo Almidón
RM
ÁT
IC
A
ANEXO 8.
IN
FO
ANEXO 9. Biorreactores con caldo almidón 0.6% - buffer fosfato al pH de ensayo en
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
funcionamiento
45
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
ANEXO 10 Biorreactores en la estufa, a temperaturas de ensayo
46
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 11. Toma de muestra de los biorreactores en cada uno de los tiempos de
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
ensayo.
DE
ANEXO 12. Obtención del sobrenadante (Extracto enzimático), mediante
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
centrifugando en cada tiempo de ensayo.
47
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
RM
ÁT
ANEXO 13. Sobrenadante (extracto enzimático) obtenido de las muestras a las
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
diferentes condiciones de ensayo.
48
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
ANEXO 14. Incubación del extracto enzimático en baño maria
49
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
ANEXO 15. Determinación del almidón residual a condiciones de ensayo.
50
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
IN
FO
ANEXO 16. Medición de la absorbancia de luz, para determinar de cantidad de
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
almidón residual por espectrofotometría.
51
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 17. Set de tubos de ensayo con las diferentes concentraciones de almidón para
determinar la curva de calibración de almidón por el método
S1
0.05
0.14
S2
S3
S4
S5
S6
S7
0.24
0.31
0.45
0.64
0.75
0.9
RE
CC
IO
N
DE
B
SI
ST
EM
AS
DE
IN
FO
RM
ÁT
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
AC
IÓ
N
espectrofotométrico
F=
F = 0.067 mg/mL
DI
B = Blanco
S = Standart
F = Factor
52
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 18. Absorbancias de cada uno de los sistemas de evaluación de almidón
N
residual.
1.50
UN
IC
CO
M
36
1.10
0.85
0.40
0.75
0.52
0.21
1.20
0.80
0.46
72
1.00
0.80
0.20
0.70
0.46
0.08
1.10
0.70
0.38
DE
IN
FO
8
1.50
Y
7
1.50
A
6
12
1.30
0.95
0.75
0.90
0.66
0.40
1.40
1.00
0.64
IC
25
40
55
25
40
55
25
40
55
0
TIEMPO (h)
24
1.20
0.90
0.60
0.85
0.60
0.35
1.30
0.95
0.58
ÁT
T (°C)
RM
pH
AC
IÓ
ENSAYO N°1
T (°C)
SI
ST
pH
EM
AS
ENSAYO N° 2
1.40
RE
IO
CC
7
N
DE
6
25
40
55
25
40
55
25
40
55
0
DI
8
1.40
1.50
12
1.20
0.90
0.70
0.85
0.64
0.40
1.30
0.90
0.54
TIEMPO (h)
24
1.10
0.85
0.64
0.80
0.60
0.35
1.20
0.85
0.50
36
1.00
0.80
0.50
0.70
0.52
0.19
1.00
0.75
0.43
72
0.95
0.75
0.25
0.64
0.46
0.06
0.95
0.68
0.35
53
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
7
1.50
1.40
72
0.90
0.64
0.21
0.75
0.50
0.06
1,00
0.80
0.33
RM
ÁT
IC
A
Y
8
1.50
36
0.95
0.70
0.44
0.80
0.54
0.17
1.10
0.85
0.41
AC
IÓ
6
12
1.20
0.85
0.60
0.90
0.70
0.44
1.30
0.95
0.70
UN
IC
25
40
55
25
40
55
25
40
55
0
TIEMPO (h)
24
1.10
0.80
0.52
0.85
0.62
0.38
1.20
0.90
0.52
M
T (°C)
CO
pH
N
ENSAYO N° 3
IN
FO
ANEXO 19. Absorbancias promedio de acuerdo a los ensayos realizados, ya que se
36
72
1.23
1.13
1.02
0.95
0.90
0.85
0.78
0.73
55
0.68
0.59
0.45
0.22
0.88
0.83
0.75
0.70
0.67
0.61
0.53
0.47
55
0.41
0.36
0.19
0.07
25
40
1.33
1.23
1.10
1.02
0.95
0.90
0.80
0.73
0.63
0.53
0.43
0.35
6
25
40
DI
RE
N
IO
CC
7
8
0
EM
T (°C)
SI
ST
pH
AS
12
TIEMPO (h)
24
DE
DE
realizaron por triplicado.
25
40
55
1.47
1.47
1.47
54
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 20. Cantidad de almidón residual en mg/mL
36
72
0.824
0.757
0.683
0.637
0.603
0.570
0.523
55
0.456
0.395
0.302
25
40
0.590
0.556
0.503
0.469
0.449
0.409
0.355
0.315
55
0.275
0.241
0.127
0.047
25
40
0.891
0.824
0.737
0.683
0.637
0.603
0.536
0.489
0.422
0.355
0.288
0.235
8
0.985
M
AC
IÓ
UN
IC
0.489
0.147
IN
FO
RM
ÁT
55
CO
0.985
Y
7
0.985
A
6
25
40
0
IC
T (°C)
N
12
TIEMPO (h)
24
pH
6
25
40
AS
T (°C)
0
EM
pH
DE
ANEXO 21. Almidón hidrolisado (degradado), siendo el almidón inicial: 0.985 mg/mL
72
0.228
0.302
0.349
0.382
0.416
0.462
0.496
0.529
0.590
0.684
0.838
0.395
0.429
0.483
0.516
0.536
0.576
0.630
0.670
55
0.710
0.744
0.858
0.938
25
40
0.094
0.161
0.248
0.302
0.349
0.382
0.449
0.496
0.563
0.630
0.697
0.751
0.00
SI
ST
DE
N
IO
CC
RE
DI
8
36
0.161
55
7
12
TIEMPO (h)
24
25
40
55
0.00
0.00
55
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 22. Unidad enzimática amilolítica (UA/mL).
T (°C)
6
25
40
36
72
0.0697
0.0456
0.0603
0.0764
0.0831
0.0925
55
0.1059
0.1179
0.1367
25
40
0.0791
0.0858
0.0965
0.1032
0.1072
0.1153
0.1260
55
0.1421
0.1488
25
40
0.0188
0.0322
0.0697
0.0764
0.1126
0.1260
UN
IC
0.1715
0.1876
0.0496
0.0603
0.0898
0.0992
0.1394
0.1501
IN
FO
RM
ÁT
55
0.1673
M
0.00
0.0992
0.1340
CO
0.00
Y
0.00
AC
IÓ
0.0322
A
8
12
IC
7
0
TIEMPO (h)
24
N
pH
ANEXO 23. Análisis de varianza unidireccional de la producción de las unidades
DE
amilolíticas de los pH de ensayo a 25°C, en relación al tiempo de
EM
AS
incubación, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan.
Factores inter-sujetos
N
pH
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
Análisis de varianza univariable
Tiempo
(h)
6.0
5
7.0
5
8,0
5
0
3
12
3
24
3
36
3
72
3
56
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Pruebas de los efectos inter-sujetos
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
cuadrados
gl
F
Sig.
0,000
tipo III
N
Origen
Media cuadrática
AC
IÓ
Suma de
1559476,667a
6
259912,778
16,843
Intersección
3584859,267
1
3584859,267
232,313
0,000
pH
455196,933
2
227598,467
14,749
0,002
Tiempo
1104279,733
4
276069,933
17,890
0,000
Error
123449,067
8
15431,133
Total
5267785,000
15
Total corregida
1682925,733
14
IC
A
Y
CO
M
UN
IC
Modelo corregido
RM
ÁT
a. R cuadrado = 0,927 (R cuadrado corregida = 0,872)
IN
FO
Pruebas post hoc
DE
pH de ensayo
(J)pH
Diferencia de
SI
ST
(I)pH
EM
AS
Comparaciones múltiples
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
7.0
Error típ.
Sig.
medias (I-J)
-313,6000
*
Intervalo de confianza 95%
Límite inferior
Límite superior
78,56496
0,010
-538,0950
-89,1050
78,56496
0,489
-130,6950
318,2950
93,8000
6.0
313,6000*
78,56496
0,010
89,1050
538,0950
8.0
407,4000
*
78,56496
0,002
182,9050
631,8950
6.0
-93,8000
78,56496
0,489
-318,2950
130,6950
7.0
-407,4000*
78,56496
0,002
-631,8950
-182,9050
8.0
DI
RE
CC
Tukey
8.0
7.0
IO
DHS de
N
DE
6.0
Basadas en las medias observadas.
El término de error es la media cuadrática (Error) = 15431,133.
57
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
* La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.
Subconjuntos homogéneos
N
Subconjunto
8.0
5
321,8000
6.0
5
415,6000
7.0
5
321,8000
6.0
5
415,6000
7.0
5
8.0
5
6.0
5
7.0
5
Sig.
729,2000
IC
A
5
1,000
ÁT
321,8000
415,6000
RM
Duncana,b
8.0
IN
FO
Tukey B
a,b
0,489
CO
Sig.
M
729,2000
Y
DHS de Tukeya,b
2
UN
IC
1
AC
IÓ
pH
N
Unidades Amilolíticas/mL
0,267
729,2000
1,000
DE
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
AS
Basadas en las medias observadas.
SI
ST
EM
El término de error es la media cuadrática (Error) = 15431,133.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 5,000
DI
RE
CC
IO
N
DE
b. Alfa = 0,05.
58
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Tiempos de ensayo
N
Comparaciones múltiples
(I)Tiempo
(J)Tiempo Diferencia de
Error típ.
AC
IÓ
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
Sig.
Intervalo de confianza 95%
medias (I-J)
-784,0714
-83,2620
24
-545,3333
101,42693
0,004
-895,7380
-194,9286
36
-688,0000*
101,42693
0,001
72
-777,3333
*
101,42693
0,000
0
433,6667*
101,42693
0,017
24
-111,6667
101,42693
0,802
36
-254,3333
101,42693
72
-343,6667
101,42693
M
0,017
-337,5953
-1127,7380
-426,9286
83,2620
784,0714
A
101,42693
*
-462,0714
238,7380
0,181
-604,7380
96,0714
0,055
-694,0714
6,7380
101,42693
194,9286
895,7380
CO
545,3333
12
111,6667
RM
0,004
101,42693
0,802
-238,7380
462,0714
36
-142,6667
101,42693
0,641
-493,0714
207,7380
72
-232,0000
101,42693
0,242
-582,4047
118,4047
0
DE
ÁT
0
688,0000
*
101,42693
0,001
337,5953
1038,4047
12
254,3333
101,42693
0,181
-96,0714
604,7380
142,6667
101,42693
0,641
-207,7380
493,0714
-89,3333
36
IN
FO
EM
24
101,42693
0,896
-439,7380
261,0714
0
777,3333
*
101,42693
0,000
426,9286
1127,7380
12
343,6667
101,42693
0,055
-6,7380
694,0714
24
232,0000
101,42693
0,242
-118,4047
582,4047
36
89,3333
101,42693
0,896
-261,0714
439,7380
SI
ST
72
*
AS
24
CC
IO
N
DE
IC
12
-1038,4047
Y
0
72
Límite superior
-433,6667
12
DHS de Tukey
UN
IC
Límite inferior
*
RE
Basadas en las medias observadas.
DI
El término de error es la media cuadrática (Error) = 15431,133.
* La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.
59
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Subconjuntos homogéneos
Unidades Amilolíticas/mL
(h)
0,0000
12
3
433,6667
24
3
545,3333
36
3
688,0000
72
3
777,3333
1,000
24
3
36
3
72
3
0
3
545,3333
688,0000
688,0000
777,3333
0,0000
3
433,6667
3
545,3333
545,3333
3
688,0000
3
777,3333
AS
72
545,3333
DE
24
36
433,6667
A
3
IC
12
0,0000
ÁT
3
0,055
RM
0
12
Duncana,b
CO
M
3
IN
FO
Tukey B
3
0
Sig.
a,b
2
Y
DHS de Tukeya,b
1
N
Subconjunto
AC
IÓ
N
UN
IC
Tiempo
1,000
0,303
0,059
EM
Sig.
SI
ST
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
DE
Basadas en las medias observadas.
N
El término de error es la media cuadrática (Error) = 15431,133.
CC
IO
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3,000
DI
RE
b. Alfa = 0.05.
60
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 24.
Análisis de varianza unidireccional de la producción de las unidades
amilolíticas de los pH de ensayo a 40°C, en relación al tiempo de
N
incubación, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan.
UN
IC
AC
IÓ
Análisis de varianza univariable
Factores inter-sujetos
0
3
12
3
24
36
3
3
3
AS
DE
IN
FO
72
CO
5
Y
8.0
A
5
IC
7.0
ÁT
Tiempos
5
RM
pH
6.0
M
N
EM
Pruebas de los efectos inter-sujetos
SI
ST
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
gl
cuadrática
F
Sig.
2661367,467a
6
443561,244
52,919
0,000
9107289,600
1
9107289,600
1086,547
0,000
pH
261504,400
2
130752,200
15,599
0,002
Tiempo
2399863,067
4
599965,767
71,579
0,000
Error
67054,933
8
8381,867
Total
11835712,000
15
Total corregida
2728422,400
14
DE
Origen
IO
N
Modelo corregido
DI
RE
Intersección
cuadrados tipo
Media
CC
Suma de
III
a. R cuadrado = 0,975 (R cuadrado corregida = 0,957)
61
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Pruebas post hoc
pH de ensayo
AC
IÓ
N
Comparaciones múltiples
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
(I)pH
(J)pH
Diferencia de
Error típ.
Sig.
Intervalo de confianza 95%
7.0
-262,6000
8.0
32,2000
*
UN
IC
medias (I-J)
Límite inferior
Límite superior
57,90291
0,005
-428,0543
-97,1457
6.0
0,846
-133,2543
197,6543
262,6000
57,90291
0,005
97,1457
428,0543
8.0
294,8000
*
57,90291
0,002
129,3457
460,2543
6.0
-32,2000
57,90291
0,846
-197,6543
133,2543
57,90291
0,002
-460,2543
-129,3457
8.0
-294,8000
CO
Y
RM
ÁT
7.0
*
A
7.0
IC
6.0
DHS de Tukey
M
57,90291
*
IN
FO
Basadas en las medias observadas.
El término de error es la media cuadrática (Error) = 8381,867.
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
* La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.
62
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Subconjunto homogeneos
Unidades Amilolíticas/mL
Subconjunto
1
8.0
5
670,2000
6.0
5
702,4000
7.0
5
670,2000
6.0
5
702,4000
7.0
5
8.0
5
670,2000
6.0
5
702,4000
7.0
5
M
5
1,000
965,0000
A
IC
Duncana,b
8.0
ÁT
Tukey B
a,b
0,846
CO
Sig.
UN
IC
965,0000
Y
DHS de Tukeya,b
2
N
N
AC
IÓ
pH
0,593
1,000
RM
Sig.
965,0000
IN
FO
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos
DE
homogéneos.
AS
Basadas en las medias observadas.
EM
El término de error es la media cuadrática (Error) = 8381,867.
SI
ST
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 5,000
DI
RE
CC
IO
N
DE
b. Alfa = 0,05.
63
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Tiempos de ensayo
AC
IÓ
N
Comparaciones múltiples
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
Error típ.
(h)
medias (I-J)
12
-844,3333
*
74,75233
24
-916,0000*
Límite superior
0,000
-1102,5839
-586,0827
-1174,2506
-657,7494
-1285,9173
-769,4161
-1366,2506
-849,7494
586,0827
1102,5839
-1027,6667
74,75233
0,000
72
-1108,0000
*
74,75233
0,000
0
844,3333*
74,75233
0,000
24
-71,6667
74,75233
0,866
-329,9173
186,5839
36
-183,3333
74,75233
0,195
-441,5839
74,9173
72
-263,6667
*
74,75233
0,045
-521,9173
-5,4161
0
916,0000*
74,75233
0,000
657,7494
1174,2506
12
71,6667
74,75233
0,866
-186,5839
329,9173
36
-111,6667
74,75233
0,593
-369,9173
146,5839
72
-192,0000
74,75233
0,167
-450,2506
66,2506
74,75233
0,000
769,4161
1285,9173
183,3333
74,75233
0,195
-74,9173
441,5839
24
111,6667
74,75233
0,593
-146,5839
369,9173
72
-80,3333
74,75233
0,815
-338,5839
177,9173
74,75233
0,000
849,7494
1366,2506
EM
SI
ST
CO
A
1027,6667
*
AS
0
12
ÁT
RM
IN
FO
DE
24
*
M
0,000
12
DE
Límite inferior
74,75233
36
36
Intervalo de confianza 95%
*
0
DHS de Tukey
Sig.
Y
(h)
Diferencia de
UN
IC
(J)Tiempo
IC
(I)Tiempo
0
1108,0000
12
263,6667*
74,75233
0,045
5,4161
521,9173
24
192,0000
74,75233
0,167
-66,2506
450,2506
36
80,3333
74,75233
0,815
-177,9173
338,5839
CC
IO
N
72
RE
Basadas en las medias observadas.
DI
El término de error es la media cuadrática (Error) = 8381,867.
* La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.
64
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Subconjuntos homogeneos
Unidades Amilolíticas/mL
Subconjunto
(h)
12
3
844,3333
24
3
916,0000
916,0000
36
3
1027,6667
1027,6667
72
3
UN
IC
0,0000
0,167
CO
0,195
3
0,0000
12
3
844,3333
24
3
916,0000
916,0000
36
3
1027,6667
1027,6667
72
3
0
3
12
3
24
3
36
3
72
3
A
Y
0
IC
1,000
M
1108,0000
844,3333
916,0000
916,0000
1027,6667
1027,6667
1108,0000
1,000
0,366
0,174
0,314
EM
AS
Sig.
1108,0000
RM
0,0000
IN
FO
Duncana,b
4
3
DE
Tukey B
3
0
Sig.
a,b
2
ÁT
DHS de Tukeya,b
1
N
N
AC
IÓ
Tiempo
SI
ST
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
Basadas en las medias observadas.
DE
El término de error es la media cuadrática (Error) = 8381,867.
IO
N
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3,000
DI
RE
CC
b. Alfa = 0,05.
65
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
ANEXO 25. Análisis de varianza unidireccional de la producción de las unidades
amilolíticas de los tres pH de ensayo a 55°C, en relación al tiempo de
N
incubación, mediante las Pruebas de Tukey y Duncan.
UN
IC
AC
IÓ
Análisis de varianza univariable
Factores inter-sujetos
0
3
12
3
24
36
3
3
3
DE
IN
FO
72
CO
5
Y
8.0
A
5
IC
7.0
ÁT
Tiempos
5
RM
pH
6.0
M
N
AS
Pruebas de los efectos inter-sujetos
EM
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
Origen
SI
ST
Suma de
cuadrados tipo
Media
gl
cuadrática
F
Sig.
5453724,400a
6
908954,067
100,120
0,000
Intersección
19405181,400
1
19405181,400
2137,452
0,000
198290,800
2
99145,400
10,921
0,005
Tiempo
5255433,600
4
1313858,400
144,720
0,000
Error
72629,200
8
9078,650
Total
24931535,000
15
Total corregida
5526353,600
14
N
DE
Modelo corregido
CC
III
DI
RE
IO
pH
a. R cuadrado = 0,987 (R cuadrado corregida = 0,977)
66
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Pruebas post hoc
pH de ensayo
AC
IÓ
N
Comparaciones múltiples
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
Error típ.
Sig.
Límite superior
-172,3942
171,9942
0,009
71,8058
416,1942
71,6058
415,9942
1,000
-171,9942
172,3942
0,009
-415,9942
-71,6058
medias (I-J)
*
7.0
-244,0000
8.0
-,2000
60,26160
0,009
60,26160
1,000
6.0
244,0000*
60,26160
*
8.0
243,8000
60,26160
6.0
,2000
60,26160
7.0
-243,8000*
60,26160
IC
A
0,009
ÁT
8.0
-416,1942
-71,8058
RM
7.0
Límite inferior
CO
6.0
DHS de Tukey
Intervalo de confianza 95%
UN
IC
Diferencia de
M
(J)pH
Y
(I)pH
IN
FO
Basadas en las medias observadas.
El término de error es la media cuadrática (Error) = 9078,650.
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
EM
AS
DE
* La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.
67
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Subconjuntos homogeneos
Unidades Amilolíticas/mL
Subconjunto
6.0
5
1056,0000
8.0
5
1056,2000
7.0
5
1300,0000
5
1056,0000
8.0
5
1056,2000
7.0
5
6.0
5
1056,0000
8.0
5
1056,2000
7.0
5
M
6.0
1300,0000
A
IC
Duncana,b
1,000
ÁT
Tukey B
a,b
1,000
CO
Sig.
Y
DHS de Tukeya,b
2
UN
IC
1
N
N
AC
IÓ
pH
0,997
1,000
IN
FO
RM
Sig.
1300,0000
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
DE
Basadas en las medias observadas.
AS
El término de error es la media cuadrática (Error) = 9078,650.
DI
RE
CC
IO
N
DE
SI
ST
b. Alfa = 0,05.
EM
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 5,000
68
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Tiempos de ensayo
N
Comparaciones múltiples
(I)Tiempo
(J)Tiempo
Diferencia de
(h)
(h)
medias (I-J)
12
-1202,0000
*
77,79739 0,000
-1470,7705
-933,2295
24
-1309,0000
*
77,79739 0,000
-1577,7705
-1040,2295
36
-1492,0000*
77,79739 0,000
-1760,7705
M
-1223,2295
72
-1684,0000
*
77,79739 0,000
-1952,7705
-1415,2295
0
1202,0000*
77,79739 0,000
933,2295
1470,7705
24
-107,0000
77,79739 0,658
-375,7705
161,7705
36
-290,0000*
77,79739 0,035
-558,7705
-21,2295
72
-482,0000
*
77,79739 0,002
-750,7705
-213,2295
0
1309,0000*
77,79739 0,000
1040,2295
1577,7705
12
107,0000
77,79739 0,658
-161,7705
375,7705
36
-183,0000
77,79739 0,222
-451,7705
85,7705
72
-375,0000
*
77,79739 0,008
-643,7705
-106,2295
0
1492,0000*
UN
IC
CO
Y
A
IC
77,79739 0,000
1223,2295
1760,7705
77,79739 0,035
21,2295
558,7705
183,0000
77,79739 0,222
-85,7705
451,7705
72
-192,0000
77,79739 0,191
-460,7705
76,7705
0
1684,0000*
12
290,0000
AS
EM
24
1415,2295
1952,7705
12
482,0000
77,79739 0,002
213,2295
750,7705
24
375,0000*
77,79739 0,008
106,2295
643,7705
36
192,0000
77,79739 0,191
-76,7705
460,7705
SI
ST
77,79739 0,000
*
IO
N
DE
Límite superior
*
36
72
Límite inferior
IN
FO
24
DE
DHS de Tukey
Intervalo de confianza 95%
ÁT
12
Sig.
RM
0
Error típ.
AC
IÓ
Variable dependiente: Unidades Amilolíticas
CC
Basadas en las medias observadas.
RE
El término de error es la media cuadrática (Error) = 9078,650.
DI
* La diferencia de medias es significativa al nivel 0,05.
69
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Subconjuntos homogéneos
Unidades Amilolíticas/mL
(h)
0,0000
12
3
1202,0000
24
3
1309,0000
36
3
72
3
0,658
1492,0000
1492,0000
1684,0000
0,0000
12
3
1202,0000
24
3
1309,0000
36
3
72
3
0
3
12
3
24
3
36
3
A
IC
1492,0000
1492,0000
1684,0000
RM
ÁT
1309,0000
0,0000
1202,0000
1309,0000
1492,0000
3
1684,0000
1,000
0,206
1,000
1,000
EM
AS
72
0,191
Y
3
Sig.
1309,0000
0,222
0
IN
FO
Duncana,b
1,000
UN
IC
3
4
DE
Tukey B
3
0
Sig.
a,b
2
CO
DHS de Tukeya,b
1
N
Subconjunto
AC
IÓ
N
M
Tiempo
SI
ST
Se muestran las medias de los grupos de subconjuntos homogéneos.
DE
Basadas en las medias observadas.
N
El término de error es la media cuadrática (Error) = 9078,650.
CC
IO
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3,000
DI
RE
b. Alfa = 0,05.
70
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.