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Adsorción de biocatalizadores de Bromelia athiacanta Bertol sobre
alúmina y nanopartículas magnéticas.
Shirley Furtadoa,b, Diego Vallésb, Santiago Botassinic, Ana M.B. Canteraa,b*
a
Cátedra de Bioquímica /Dpto. de Biociencias/Facultad de Química/Universidad de la República, Montevideo, Uruguay
Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas/ Instituto de Química Biológica/Facultad de Ciencias/Universidad de la Republica,
Montevideo, Uruguay.
c
Laboratorio de Biomateriales/ Instituto de Química Biológica/Facultad de Ciencias/Universidad de la Republica,
Montevideo, Uruguay.
*[email protected]
b
RESUMEN
El constante avance de la tecnología enzimática a potenciado el desarrollo de procesos biotecnológicos en
la industria. La obtención de sistemas biocatalizador-soporte (sistemas B-S) ha ampliado las posibilidades
de aplicación de los biocatalizadores, generando ventajas económicas y de proceso respecto al uso de los
mismos en solución. Los sistemas se recuperan de los medios de reacción en forma rápida y sencilla y
pueden volverse a usar.
En este trabajo se adsorbieron nuevas enzimas proteolíticas provenientes de un extracto de frutos maduros
de Bromelia AntiacanthaBertol (Bromeliaceae) sobre alúmina (sistema B-A) y nanopartículas magnéticas
(sistema B- MNPs) .
Se evaluó el rendimiento del proceso de adsorción combinando dos factores que inciden en el mismo,
temperatura y pH. Se estudió el efecto de 2 temperaturas (25°C y 37°C) y 3 valores de pH (pH:5, pH7, pH8).
Se realizaron isotermas de adsorción y se ajustó los resultados al modelo propuesto por Langmuir y al
modelo propuesto por Freundlich (modelo de mejor ajuste).
Se compararon parámetros cinéticos km, Vmax, Kcat de los biocatalizadores adsorbidos con
biocatalizadores en solución.
Se caracterizó estructuralmente los sistemas formados (micrografías electrónicas(SEM) , espectrosFTIR)
Se caracterizó funcionalmente los sistemas hidrolizando azocaseína, los sistemas mantienen la actividad
después de 4 ciclos de uso.
Palabras clave : adsorción, enzimas, nanopartículas, alúmina
ABSTRACT
The constant progress of enzyme technology promous the development of biotechnological processes in
the industry. The biocatalyst-support (B-S systems) systems has expanded the possibilities the application
of biocatalysts, generating economic and advantages process over the use of them in solution.. Systems
are recovered from the reaction media in quickly and easily way and can be reused.
In this paper new proteolytic enzymes from an extract of ripe fruits of Bromelia Antiacantha Bertol
(Bromeliaceae) were adsorbed onto alumina (System B-A) and magnetic nanoparticles (system B- MNPs).
Performance of the adsorption process by combining two factors affecting the same, temperature and pH
were evaluated. The effect of two temperatures (25 ° C and 37 ° C) and three pH values (5, pH7, pH8 pH)
were studied.
Adsorption isotherms were performed and the results adjusted to model proposed by Langmuir and
proposed by Freundlich (best fit model) .
The kinetic parametres , Vmax, Km, Kcat of biocatalysts in solution and biocatalysts adsorbed were
compared.The systems were structurally characterized (electron micrographs(SEM),FTIR spectra)
The systems were functionally characterized hydrolyzing azocasein , the systems retain activity after 5
cycles of use
Keywords: adsorption, enzymes, nanoparticles, alúmina,
1
1. Introducción
La obtención de sistemas heterogéneos
biocatalizador-soporte para su aplicación en
procesos industriales y farmacéuticos es un área
de investigación muy activa. Los bioprocesos
donde los catalizadores están fijados al soporte
son más fácilmente controlados, son muy
precisos en tiempos de reacción[1] y tienen
mayor productividad (kg de producto formado
por kg de enzima) que aquellos que utilizan
biocatalizadores libres[2].
Los productos obtenidos en procesos con
las enzimas inmovilizadas se ven menos
afectados por los parámetros de reacción dado
que no se utilizan cambios de temperatura o pH
ni se necesita el agregado de inhibidores
específicos para detener las reacciones
catalizadas. Para procesos biotecnológicos que
emplean
biocatalizadores
de
actividad
proteolítica hay una ventaja extra con la
inmovilización, la velocidad de procesos de
autolisis puede ser reducida.
En el presente trabajo se estudió la unión
de los biocatalizadores a dos soportes por
adsorción. Método muy económico fácil de
implementar, que generalmente no produce
perturbaciones en la estructura nativa del
biocatalizador y no provoca cambios en la
especificidad de la enzima.
La característica del soporte es una parte
determinante del performance de los sistemas, la
interacción soporte-biocatalizador le dará al
sistema propiedades mecánicas, bioquímicas y
cinéticas específicas.
El soporte fué seleccionado para ofrecer
una alta superficie interna accesible y
químicamente adecuado para las enzimas.[3]
El material debe presentar densidad alta
de sitios de unión para el catalizador y una
superficie compatible con la conformación de las
enzimas, para lograr un máximo de uniones
efectivas. Materiales porosos pueden ofrecer una
alta superficie de union a las enzimas pero
tienen una gran limitación de difusión, disminuir
el tamaño del material de soporte es una
estrategia comúnmente usada para incrementar
la superficie de adsorción. Por esta razón ha
crecido el interés en las Nanopartículas como
material de soporte para la inmovilización de
enzimas [4]
En este trabajo se utilizaran sólidos
inorgánicos Alúmina y nanopartículas magnéticas
de óxido de hierro (magnetita)
La alúmina es un sólido ampliamente
utilizado en catálisis ya sea como catalizador en si
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mismo o como soporte de catalizadores. Es un
soporte inorgánico durable y se puede obtener
fácilmente en el mercado a bajo costo (variable
importante a tener en cuenta); ya sea en grado
analítico o industrial. Puede ser empleada en un
amplio rango de pHs y ser recuperado
incinerando a 550°C.
Es un óxido resistente al ataque
microbiológico [5], importante condición dado
que los sistemas biocatalizador-soporte se usaran
en el tratamiento de sustancias de índole
alimenticio o farmacéutico.
De los materiales empleados a nanoescala
se seleccionó la magnetita
por su fuerte
propiedad magnética, alta área superficial y baja
toxicidad.[6] Las nanopartículas de óxido de
hierro cambian las propiedades magnéticas
respecto al material del que se originan, la
partícula se vuelve superparamagnetica, esta
propiedad permite que las partículas individuales
puedan ser magnetizadas solo al ser expuestas a
un campo magnético externo y no exhiben
magnetización remanente cuando el campo
externo es removido.
Los sistemas biocatalizador-Nanopartículas
magnéticas (B-MNPs) pueden extraerse del
sistema de reacción aplicando un campo
magnético externo[7].
Para la síntesis de nanopartículas
magnéticas se utiliza método de precipitación y
oxidación dado que son económicos, simples de
controlar y de fácil escalado.
Sintetizar MNPs un procedimiento de
estequiometria definida , se necesita una sal de
hierro en medio acuoso básico y un agente
oxidante.
Ecuaciones de obtención de magnetita
(óxido ferroso diférrico) [8]
Ecuación 1.
3Fe+2 + NO3- + 3H2O
Fe3O4+ NO2- + 6H+
Ecuación 2.
3Fe+2 + 2NO2- + 2H2O
Fe3O4+ 2NO + 4H+
Ecuación 3.
15Fe+2 + 2NO + 18H2O
5 Fe3O4+ 2NH3 + 30H +
2. Experimental
2.1 Extracto crudo de Frutos maduros de
Bromelia antiacantha (banana do mato).
El extracto (EC) se obtuvo por trituración
del fruto maduro en baño de hielo con un mixer
durante 2 minutos, se centrifugó a 6654 x g a 4°C
2
durante 15 min y filtró por gasa. La muestra se
almacenó a -20°C hasta su utilización.
Se
realizó
una
purificación
por
precipitación con
acetona permitiendo
enriquecer el extracto en proteína activa. A un
volumen de extracto crudo se agregó cuatro
volúmenes de acetona a -20°C bajo agitación
suave
a una velocidad de 2ml/min, (la
temperatura se mantuvo entre 0-4°C, a los
efectos de reducir al mínimo la desnaturalización
de las proteínas). Se dejó reposar durante 30 min
a -20°C y finalmente se centrifugó a 6.654 x g
durante 15 min. Se descartó el sobrenadante de
acetona y se secó el precipitado al aire
eliminando el resto del solvente. [9]
Al momento del uso se resuspendió el
precipitado acetónico en agua o buffer adecuado
según el caso, RAP (redissolved acetone
precipitated)
2.3.
Obtención de sistema biocatalizadoralúmina (B-A) y biocatalizador-nanopartículas
magnética (B-MNPs)
Se puso en contacto
el soporte
nanopartículas magnéticas (MNPs) o alúmina( A)
previamente humectado y la solución acuosa
del RAP en la relación 25mg de soporte/ml de
solución. Se Agitó a 200 rev/min, durante el
tiempo necesario para que el sistema establezca
el equilibrio de adsorción (4hs).
Se prepararon sistemas
a dos
temperaturas 25°C y 37°C en tres condiciones de
pH: pH8 (precipitado acétonico redisuelto en
buffer Tris- HCl, 0,1M ), pH 5 (precipitado
acetónico redisuelto en buffer acetato de sodio ácido acético 0,1M) y pH 7 (dilución del
preparado enzimático en agua destilada).
Se realizó seguimiento del proceso de
adsorción determinando proteína (ver 2.4) a las
soluciones de biocatalizadores al inicio y final del
proceso y determinando actividad enzimática
por método directo e indirecto (ver2.5)
2.4. Determinación de proteínas
Figura1. a .Frutos de Bromelia Antiacantha Bertol
b.Precipitado acetónico seco.
2.2. Soportes
Alúmina: Se utiliza alúmina comercial
Clase: Brockmann neutra, pH 7 en dispersión en
agua al 5%
Nanopartículas magnéticas (MNPs)
Se sintetizaron en el Laboratorio de
Biomateriales Instituto de Química Biológica
Facultad de Ciencias UdelaR bajo la dirección de
Lic. Santiago Botassini.[10]
Solución de Fe (II): 0,278g de FeSO4.7H20 se
disuelven en 40mL de agua a 80°C
Solución A : 0,01mol NaOH de y 0,001mol de
NaNO3en 10 mL de agua
Para sintetizar MNPs se agregó solución A
a una velocidad de 3ml/min a la solución de
Fe(II)bajo agitación vigorosa. La reacción continúa
bajo agitación y temperatura controlada a 80°C
durante 2horas luego de la formación de una
dispersión negra.
Las nanopartículas magnéticas se
separaron de la dispersión con ayuda de un
magneto permanente, se lavaron con agua y
secaron al aire.
XXV Congreso Iberoamericano de Catálisis
Se utilizó método de Bradford que es
adecuado en extractos vegetales con presencia
de sustancia de naturaleza fenólica
Reactivo de bradford: 100mg de Comasie brillant
blue G se disuleven en 50ml de etanol y 100ml
de ácido fosfórico 85%p/v, se lleva a 1litro con
agua destilada.
Las curvas de calibración se realizan
utilizando seroalbúmina bovina en el rango de
0,1-1,0 mg/ml
Se puso en contacto muestra, solución de
calibración o blanco y el reactivo de Bradford en
la relación 1/14 v/v. Se agitó 10 minutos en
agitador orbital. Se lee absorbancia a 595nm.
2.5. Determinación de actividad enzimática:
La actividad enzimática se determinó por
método directo y método indirecto.
Método indirecto: Se determinó la
actividad hidrolítica en la solución inicial de
biocatalizadores que se puso en contacto con las
MNPs o alúmina y en la solución final luego de
realizado el proceso de adsorción. La diferencia
del biocatalizador indica la actividad enzimática
total adsorbida (actividad teórica)
Método directo: Se determinó la actividad
hidrolítica del biocatalizador adsorbido en
alúmina y MNPs en forma directa (actividad
real).
3
Se incubaron 340µl de de una dilución
adecuada del RAP o
5mg del sistema
biocatalizador-soporte con 340µl de solución de
azocaseína (Sigma)(1% m/v) y 340µl de buffer de
actividad (0.2 M fosfato, pH 7.5), a 37 °C durante
10 minutos. Se detuvo la reacción agregando
340µl de ácido tricloroacético 10% m/v . Se
centrifugó 20 minutos a 2600g y se midió la
absorbancia a  =337 nm. Método modificado de
Asenjo.[11]
Se define unidad de enzima (UE) a la
cantidad requerida para incrementar en una
unidad el valor de adsorbancia a 337nm.
2.6 Isotermas de Adsorción
Una isoterma de adsorción indica la
relación entre la cantidad de proteína por gramo
de soporte y la cantidad de proteína en solución
cuando el soporte y la solución están en
equilibrio. Es decir indica la distribución de las
moléculas de biocatalizador en el punto de
equilibrio.
El modelo de adsorción de Langmuir
propone la relación entre el grado de ocupación
de la superficie y la concentración de
biocatalizador libre en el punto de equilibrio
(CBs).Se define grado de ocupación (Ecuación 1)
al cociente entre cantidad de biocatalizador
adsorbido por unidad de masa de soporte(Ba) y la
máxima cantidad de biocatalizador que se puede
adsorber por unidad de masa de soporte.(Bamax)
(mg.g-1)
Ecuación 1
Ba
= KLCBs
Bamax
1+KLCBs
En la ecuación 2 se plantea un modelo de
regresión.
Ecuación 2 CBs _= _ 1____ + CBs __
Ba
KL*Bamax
Bamax
La constante de Langmuir KL (ml.mg-1) se
relaciona con la afinidad a los los sitios de unión
al soporte.
El modelo de adsorción de isoterma de
Freundlich se expresa según:
Ecuación 3. Ba = KF (CBs)1/n
Ecuación 4. Ln(Ba)=ln KF +1/n ln(CBs)
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Donde Ba es la masa de bocatalizador
adsorbido por unidad de masa de soporte, KF es
la constante de Freundlich (mg.g-1) que indica la
capacidad de adsorción del soporte y n es un
indicativo de la intensidad de adsorción.
2.7 Determinación de parámetros cinéticos
Los parámetros cinéticos Vmáx, Km y kcat
fueron determinados por medidas de la actividad
amidásica de las enzimas con PFLNA (sustrato
específico de las cisteínproteinasas ).
A partir de la medición de las velocidades
iniciales (V0) de la reacción de hidrólisis para
diferentes
concentraciones
de
PFLNA
(piroglutamyl-phenyalanyl –paranitroaniline) de
regresión no lineal, de acuerdo a los modelos de
Michaellis-Menten, obteniéndose las constantes
cinéticas de los sistemas B-A y B-MNPs y
biocatalizadores en solución.
2.7 Caracterización funcional.Ciclos de uso
Se puso en contacto el sistema B-A o BMNPs con una solución de azocaseína 1% m/v en
la relación 15mg de soporte/ml de solución,
durante 10 minutos. Se repitió el proceso 5
veces consecutivas. Se determina la actividad
enzimática por método indirecto al finalizar cada
ciclo de uso.
3. Resultados y discusión
En este trabajo se adsorben
biocatalizadores presentes en una mezcla
natural, que es solo parcialmente purificada por
lo que contiene una gran variedad de
componentes no proteicos. Estos componentes
pueden afectar el delicado balance entre las
fuerzas atractivas y repulsivas del biocatalizador y
el soporte.
El método de adsorción como técnica de
fijación de biocatalizadores al soporte depende
de varios factores físicos y químicos.
3.1 Factores que afectan la adsorción
Humectación del soporte.
En el fenómeno de adsorción se dan
interacciones entre la proteína y la superficie del
soporte. Al estar los biocatalizadores en solución
hay competencia entre las moléculas de
biocatalizador y las moléculas de agua por un
sitio en la superficie del soporte, si se humecta
previamente el soporte, la competencia se da en
aquellos sitios donde las moléculas proteicas
4
pueden acceder dejando la superficie en igual
condición para los diferentes ensayos realizados.
Si se parte de soportes secos el aire retenido en
sus cavidades deben difundir a la superficie al
agregar la solución enzimática lo cual interfiere
con el fenómeno de adsorción, generando una
variable no cuantificable que puede afectar la
comparación de otras variables en estudio.
Tiempo de adsorción.
Al poner en contacto el biocatalizador con
soporte (alúmina o MNPs) se establece un
equilibrio con biocatalizadores remanentes en
solución. Se determina el tiempo en que se
obtiene la máxima cantidad de biocatalizador
adsorbido en las distintas condiciones de pH y
temperatura estudiadas. Para sistemas B-A el
tiempo en alcanzar el equilibrio es entre 2-4hs ,
para sistemas B- MNPs entre 3 y 4hs.
Se establece en el protocolo de adsorción tiempo
de proceso de adsorción 4hs.
Factor pH
En las Tablas 1 y 2 se observan resultados
del rendimiento del proceso de adsorción a
diferentes pH y temperaturas. Se informa
porcentaje de enzimas adsorbidas determinadas
por método indirecto de medida de
actividad(%Ba) y la cantidad de enzima activa
determinada por método directo(%Ba act)
La alúmina comercial presenta pzc(point
of zero charge) entre 8.6 y 9.2 [12] y el pcz de
magnetita es cercana a 6.5. Los biocatalizadores
presentes en el RAP tienen puntos isoeléctricos
entre 7,6 y 9,0[9]
En las condiciones de nuestro estudio el
soporte alúmina tiene carga superficial positiva.A
a pH 5 y pH 7 los biocatalizadores presenta una
carga superficial positiva y a pH 8 una carga
superfcial cerca al neutro.
Tabla 1. SISTEMAS Biocatalizador-alúmina
Proceso de Adsorción: efecto de temperatura y pH
alúmina
pH5
pH7
pH8
T
25°C 37°C 25°C 37°C 25°C 37°C
%Ba
93%(*1) 87%(*1) 85%(*1) 77%(*1) 43%(*1) 39%(*1)
%Ba act. 40%(*2) 41%(*2) 77%(*1) 74%(*2) 22%(*2) 22%(*2)
(*1)
Valores promedio (n:6 ,rsd :1),
(*2)
Valores promedio (n:4 ,rsd :1),
En sistemas B-A (tabla 1) a pH5 el
porcentaje de adsorción es del orden de 90% , a
pH7 es del orden de 80% y a pH 8 decae al 40%.
El porcentaje de biocatalizador activo frente al
adsorbido es del orden de 45% a pH 5, 95% a
pH7 y del 50% a pH 8.
XXV Congreso Iberoamericano de Catálisis
Aunque a pH 5 la repulsión debería ser
mayor entre los componentes del sistema B-A,
la conformación estructural de las enzimas deja
libre zonas que presentan más afinidad al
soporte. La cantidad de biocatalizador adsorbido,
a este pH, que presenta actividad es la mitad del
total adsorbido indicando que los
biocatalizadores se adsorben dejando inaccesible
al sustrato el sitio activo.
A pH superiores otros componentes del
extracto estarían interfiriendo con la adsorción
disminuyendo la afinidad del biocatalizador por
el soporte. Una de las ventajas de adsorber la
enzima es lograr separarlas de esos componentes
del extracto, para que su uso a pH alcalinos tenga
menos interferencias. Una vez adsorbidos, los
biocatalizadores pueden reacomodarse
ocupando una superficie mayor y/o
aumentando las interacciones laterales de
repulsión, por lo que disminuye el porcentaje de
adsorción.
Tabla 2. SISTEMAS Biocatalizador- MNPs
Proceso de Adsorción: efecto de temperatura y pH
MNPs
T
pH5
pH7
pH8
25°C 37°C 25°C 37°C 25°C
37°C
%Ba
55% 62% 54% 55% 54% 45%
Ba act. 51% 57% 50% 46% 50% 41%
Valores promedio (n:3 ,rsd :2),
En sistemas B-MNPs el porcentaje de
adsorción es similar a los distintos pHs en
estudio. El RAP esta compuesto por enzimas de
similar peso molecular y actividad hidrolítica que
presentan puntos isoeléctricos diferentes[9],.Por
lo tanto es posible que los diferentes
componentes hidrolíticos del RAP se adsorben en
cada caso en proporciones diferentes al variar el
pH manteniendo el valor neto de actividad
adsorbida (%Ba) .La orientación del
biocatalizador adsorbido deja accesible el sitio
activo al sustrato, el 90% del biocatalizador
adsorbido presenta actividad.
Factor temperatura.
Para los biocatalizadores de Bromelia
athiacanta bertol en solución, no se observa
perdida
de
actividad
en
soluciones
termostatizadas a 55°C en 60 minutos y
soluciones incubadas a 37°C han demostrado
mantener la actividad aún después de 3hs.[14].
Para el estudio del efecto de la temperatura en el
proceso de adsorción se trabajó a 25°C (T
ambiente) y 37°C
5
Los procesos de adsorción usando alúmina
o nanopartículas magnéticas como soporte no
presenta más de un 10% de diferencia en los
porcentajes de adsorción en ambas temperaturas
en las 3 condiciones de pH ensayadas.
3.2 Caracterización de los sistemas.
Actividad especifica
La
actividad
específica
de
los
biocatalizadores adsorbidos es mayor en
comparación con la actividad específica de los
biocatalizadores en solución ,(Tabla 3)
Podemos inferir que se adsorben
preferentemente moléculas de biocatalizador
con respecto al total de proteínas presentes en el
RAP
Tabla3. Relación actividad especifica de los sistemas
biocatalizador-soporte vs actividad específica de los
biocatalizadores en solución, a 25°C y pH:7.
UE del sistema
Método Indirecto
Método directo
(*1)
(*2)
Sistema
B-A
1,4(*1)
1,2(*1)
Sistema
B-MNPs
1,5(*2)
1,4(*2)
valores promedio (n:4 ,rsd :2),
valores promedio (n:3 ,rsd :2),
Isotermas de adsorción
Se utilizaron los modelos de Langmuir y
Freundlich para el ajuste de datos obtenidos con
isotermas de adsorción en condiciones de
temperatura 25°C y pH7. Los valores de las
constantes características se observan en Tabla 4.
El modelo de Adsorción de Langmuir
supone que la superficie es homogénea tiene un
numero especifico de sitios donde se puede
adsorber la molécula de biocatalizador (se llega a
saturación cuando todos los sitios son ocupados)
, todos los sitios son equivalentes y la energía de
las moléculas adsorbidas es independiente de la
presencia de otras moléculas ( las moléculas
adsorbidas no interaccionan entre si ni se
intercambian de posición)[. Este modelo asume la
formación de monocapas.[13]
El modelo de Freundlich supone superficies
heterogéneas donde existen múltiples sitios
disponibles para la adsorción, es decir, el calor de
adsorción varía entre un sitio y otro, por lo que
no son equivalentes entre si. La intensidad de
inmovilización (n) es mayor a 1 lo que indican
caracteristicas favorables de adsorción[14]
El modelo de Freundlich ajusta mejor a los
dos sistemas estudiados
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Tabla4.Parametros obtenidos de las isotermas de
Adsorción Condiciones de adsorción 25°C, pH 7
parámetro
Isoterma Langmuir
R2
KL
Bamax
-1
-1
(mg mL )
mg.g-1
0,91
1.9
10
0,96
1,3
17
Isoterma Freundlich
R2
KF
n
Sistema B-A
Sistema B-MNPs
0,99
0,99
parámetro
Sistema B-A
Sistema B-MNPs
8
16
1,4
1,1
Caracterización bioquímica de los sistemas
biocatalizador- soporte
En La tabla 5 se ven los parámetros
cinéticos de enzimas en solución y sistemas B-A y
B-MNPs
El valor de Km mayor en los biocatalizadres
en solución respecto a los adsorbidos, se debe a
que en solución se encuentran no solo las
enzimas también otros componentes que
interfieren en el acercamiento del sustrato al sitio
del biocatalizador.
Tabla5 .Parametros cinéticos de los sistemas
biocatalizador soporte
Vmax
KM
kcat
kcat/KM
-1
-1
-1 -1
mMs
mM
s
mM s
Biocat.
solución
Sistema
B-A
Sistema
B-MNPs
2.7E-5
0.16
0.03
460
4.3E-5
0.013
0.024
1831
2.4E-5
0.028
0.013
464
Caracterización estructural
Espectros IR
Se realizaron espectros IR a temperatura
ambiente usando método de discos de KBr para
el control de preparación de sistemas. Los
espectros se realizan en Espectrofotómetro
Shimadzu modelo IR-Prestige 21)
Los sistemas B-A y B-MNPs presentan
señales características a 1650cm-1 originada por
grupos amida, indicativo de la unión de las
proteínas a la superficie del soporte
Por ejemplo en la Figura 2 se observa
espectro FTIR de magnetita y sistemas MNPs.
A 550cm-1 se observa señal atribuida a las
vibraciones estrechas de los enlaces Fe-O.
6
Figura 6.Imagen SEM Sistemas Biocatalizador-MNPs
Caracterización funcional de los sistemas
biocatalizador biocatalizador- soporte
Figura2 Espectro IR MNPs, y sistemas B- MNPs a
Micrografías electrónicas
Se estudió la capacidad de reúso de los
sistemas hidrolizando azocaseína en procesos en
batch seguidos y determinando la actividad
remanente en los sistemas. Se observa que en el
primer ciclo de uso hay perdida de actividad
debido a aquellas moléculas de biocatalizador
que
no están fuertemente adsorbidas. Se
mantiene la actividad en los siguientes cuatro
ciclos de uso.
Tabla6. Ciclos de reuso de sistemas B-A y B-MNPs
Preparados a pH7 y 25°C. Sustrato Azocaseina,
Condiciones de reacción pH:7.5, Temperatura 37°C
Sistema
Figura 3.Imagen SEM de soporte Alúmina previo a la
adsorción
%UE remanente
Al finalizar 4 ciclos de uso
B-A
88
B-MNPs
95
4. Conclusiones
Figura 4.Imagen SEM Sistemas Biocatalizador-Alúmina
Figura 5.Imagen SEM de soporte MNPs previo
a la adsorción
XXV Congreso Iberoamericano de Catálisis
Se prepararon sistemas biocatalizadorsoporte adsorbiendo enzimas proteolíticos de un
extracto de frutos maduros de Bromelia
anthiacanta Bertol en dos soportes, alúmina y
nanoparticulas magnéticas. Las MNPs son
sintetizadas a escala laboratorio por método de
precipitación y oxidación.
Se confirmó la unión del biocatalizador al
soporte por medio de SEM Y FTIR.
Se estudió el efecto de la temperatura y
pH en el rendimiento de los proceso de
adsorción del biocatalizador sobre alúmina y
nanopartículas magnéticas
En los sistemas B-A el pH es el factor que
afecta en mayor medida la adsorción de los
biocatalizadores al soporte. De los tres pH
ensayados en a pH 7 la relación biocatalizador
adsorbido /biocatalizador activo es el mayor
(85% ).
7
En sistemas B-MNPs el pH no afecta
marcadamente el porcentaje
como se
comprueba por cvalores obtenidos
Del total de proteínas presentes en el
extracto los biocatalizadores presentan mayor
afinidad por el soporte (alúmina o MNPs)
Hay un incremento del 40% en actividad
específica en los sistemas B-Ay del 50% en BMNPs.
Los sistemas B-A y B-MNPs no presentan
perdida de actividad durante 4 ciclos de uso
consecutivos.
4.Agradecimientos
Este trabajo se realizó con el apoyo de
Pedeciba Área Biología
5. Referencias
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proteolíticas de vegetales superiores Aplicaciones
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