1. No category

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NÚMERO
6 •
V.
VOLUMEN
NOVIEMBRE-DICIEMBRE
Estudios iniciales para el desarrollo
XXIII.
DE
1981
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1"
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I
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de procesos en la producción de
vacunas bacterianas por cultivo agitado
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ADRIÁN MEDINA GARcíA
IRMA GÓMEZ REYES
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Gómez Reyes, 1.; MedIDa Garda, A.: Estudios iniciales para el desarrollo de procesos en
la producción de vacunas bacterianas POI' cultivo agitado. Sal. Púb. Méx., XXIU, 5SS.
561, 1981.
Resumen: En el presente trabajo se hacen estudios
preliminares para establecer el cultivo agitado de Corvnebacterium diphteriae y Bordetella pertussis, usando
las cepas que se emplean en cultivo estacionario y algunas ya adaptadas a este tipo de cultivo o para aumentar la producción de DPT en el Instituto Nacional de
Higiene.
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se
estableeieron las condiciones generales de propagación en el matraz y en el fermentador de 14 litros.
En el caso de C. diphteriu se logr6 obtener en el matraz de SOOmi hasta 142 Lf/ml yen el de B. pertussls
se obtuvieron rendimientos de 30.4 UO/ml en el fermentador de 14 litros. Los resultados se cbtuvíeron en
48 horas de proceso.
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INTRODUCClON
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n nuestro país en años recientes se ha visE
to la necesidad de incrementar la producción de biológicos debido a la expansión demográfica. A principios de los años setenta en
el Instituto Nacional de Higiene la producción
de vacunas bacterianas se basaba en el cultivo
estacionario de microorganismos.
Este método de producción tiene varias
Sección Experimental. Instituto Nacional de Higiene.
Gerencia General de Biológicos y Reactivos, SSA.
NOVIEMBRE-DICIEMBRE
1981
desventajas: los tiempos de proceso son largos, hay cierta heterogenicidad por la cantidad de recipientes de cultivo y el control de
condiciones son menos estrictas que en
técnicas de cultivo sumergido.
Los recipientes que se usan para fermentación permiten una producción mayor de vacunas.
Un ejemplo de esta situación se presentaba
en la vacuna pertussis, en donde la demanda
del producto era mayor a la producción (años
1973 a 1975) ya futuro se tenía contemplada
mayor producción, la cual con el método men555
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Gómez Reyes. 1. y Medina García. A.
cionado no se alcanzaba aunque se trabajaba
a la máxima capacidad del laboratorio, con
dos turnos de producción; por ello se decidió
cambiar el método de producción a cultivo
agitado, usando al principio garrafones de cuatro litros y luego reactores biológicos. Por
cultivo sumergido se esperaba reducir los tiempos de proceso de 72 a sólo 48 horas, en el
caso de Bordetella pertussis; y para la producción de toxina diftérica, de 168 horas que es
el tiempo normal de propagación en cultivo
estacionario, a 48 horas o menos, con lo que
la productividad se incrementaría en forma
notable.
En el Laboratorio Experimental se realizaron estudios tentativos para la producción de
toxoide diftérico y Bordetella pertussis a nivel
de matraz de 500 mi, garrafón de cuatro litros, fermentador de 14 litros e' intentos en
un fermentador de 300 litros, obteniéndose
resultados muy satisfactori~
MATERIAL Y METODOS
se realizaron estudios en forma simultánea
para la producción de Borde/ella pertussis y
toxina diftérica usando los medios de cultivo
propuestos por Stainer 1970' Y Linggood en
1947,' respectivamente.
En el desarrollo de ambos trabajos se utilizaron matraces de 500 mi para la adaptación
de las cepas a cultivo agitado y un agitador
giratorio marca New Brunswick Scientific Ca.
(NBS) Modelo G-25, así como un agitador
de mayor capacidad Modelo G-53 de la misma marca. A nivel de fermentador los estudios
se efectuaron en dos fermentadores marca
Labro-Ferm de 14 litros, uno con dos plazas
Modelo CFS-314, así como un equipo de control de pH marca NBS, Modelo pH 161. Para
el escalamiento a nivel industrial se empleó un
fermentador japonés marca Marubishi Modelo
MF-300.
Los fermentadores utilizados tuvieron que
ser modificados con respecto al sistema de
aereación y agitación, ya que originalmente
produjeron mucha espuma y el uso de antiespumantes no es muy recomendable en la producción de vacunas. Los cambios consistieron
en remover los deflectores y propelas, dejando
556
sólo una de ellas al extremo de la flecha, con
lo que se produjo un vórtice alto. La aereación se cambió del fondo a la superficie.
TOXINA DIFrERICA
Las cepas empleadas en la producción de
toxina por agitación fueron la PW-8 (Park
Williams 8), procedente de Massachusetts, la
cual es usada para la producción por cultivo
estacionario en el Instituto Nacional de Higiene y la cepa CN-2000 procedente
del Rijks Instituut Voor de Volksgezondheid
de Holanda, usada para la producción en cultivo agitado.
La toxina producida en los diferentes niveles del proceso se evaluó según la técnica de
floculación de Ramón.'
El contenido de fierro en los medios de cultivo preparados, así como en muestras del desarrollo microbiano en etapas diferentes del
cultivo, se determinó por el método de Peters
1956.'
VACUNA PERTUSSIS
Ma/eriales y métodos específicos.
se emplearon 5 cepas de Borde/ella pertussis. Las
tres designadas 10536, 18334 Y 18904 procedentes del Michigan State Department of
Health y las cepas 134 y 509 procedentes del
Instituto Nacional de Salud de Holanda.
La opacidad microbiana se determinó usando un fotocolorímetro Klett Summerson con
filtro verde de 540 nanómetros, utilizando
como referencia un tubo con partículas de vidrio equivalente a 10 unidades de opacidad
facilitado por los National Institutes of Health
de Bethesda, Maryland, EUA.
La toxicidad y antigenicidad del paquete
celular de B. pertussis se determinó según los
requerimientos mínimos que exige la OMS
para este biológico.'
Para la propagación masiva de B. pertussis
a partir de liofilizado se empleó el medio Bordet-Gengou;' para la producción los medios
Verwey y B-2 propuestos por Van Hemert;'
así como el de Stainer,!
El control de la pureza se efectuó usando
gelosa sangre, infusión cerebro-corazón, agar
soya tripticasa y tioglicolato.
SALUD. PÚBLICA DE MÉXICO
Desarrollo de procesos en la producción de vacunas
Cuadro I
RENDIMIENTO
DE LOTES DE B. PERTUSSIS EN FERMENTADORES
DESPUES DE 48 HORAS DE INCU8ACION
Lote
CEPA
1
18334
18834
18834
10536
18904
18904
10536
10536
\34
509
2
3
4
5
6
7
8
9
10
EDAD
DEL INOCUl.O
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
EN HORAS
F-14'
UO/ml
6.0
2.8
3.3
8.8
5.6
10.0
11.6
14.4
9.7
11.0
VOI mI unidades de opacidad por mililitro .
• El equipo empleado fue de acuerdo al diseño del fabricante.
RESULTADOS
TOXINA DIFTERICA
La cepa PW8 de Corynebacterium diphtheriae adaptada a cultivo estacionario fue denominada (A-EINH); esta cepa produjo a nivel
de matraz hasta 142 Lf/ml de toxina, en
comparación con la cepa CN-2000 que sólo
produjo 62.5 Lf/ml. Con base en los resultados obtenidos se decidió continuar los estudios con la cepa adaptada en el laboratorio.
se estudiaron algunos parámetros, como volumen de trabajo, encontrándose que para
matraces de 500 mI el volumen óptimo fue de
\00 mI (142 Lf/ml) y la resiembra en la cual
se produjo la mayor cantidad de toxina fue el
cuarto (125 Lf/ml).
Para conocer cuál era la velocidad de producción de toxina con la cepa adaptada en
cultivo agitado se determinó la cinética de ésta
a nivel de matraz, encontrándose que el tiempo al cual se producía la máxima cantidad era
de 48 horas (gráfica 1).
Los rendimientos de toxina en fermentadores de 14 litros fueron muy pobres debido a
la gran cantidad de fierro que" liberaba el
equipo. se alcanzaron concentraciones de fierro hasta de I ,000 ppm, después de 48 horas
de agitación.
NOVIEMBRE-DICIEMBRE
1981
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-...
-......
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.......
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No se contínuaron los estudios por no contar con el equipo adecuado para este proceso .
COMPONENTE PERTUSSIS
Por conveniencia y tomando en cuenta el
origen y su composición antigénica, se trabajaron dos grupos de cepas; uno formado por
cultivos 10536, 18904 Y 18334, el otro
por los cultivos de la cepa 134 y 509.
Después de estudiar comparativamente los
medios de cultivo propuestos por Stainer y
Van Hemert con base en los rendimientos, se
optó continuar los estudios con el medio B-2.'
se estudiaron en matraz de 500 mI conteniendo 100 mI de medios las cinéticas de
crecimiento de cada cepa, encontrándose que
todas las cepas presentaron diversa velocidad
de crecimiento con excepción de las cepas 134
y 509, además que de acuerdo con sus rendimientos, calculados en opacidad a las 48 horas, algunas eran promisorias y otras no
(cuadro 1). En el caso de la cepa 10536, aun
cuando los resultados fueron buenos, se tuvieron que desechar porque esto implicaba desarrollar tres procesos diferentes. Con las cepas
134 y 509 las cinéticas de crecimiento así
como de rendimientos fueron similares.
Los fermentadores F-14 se emplearon en
un principio con el diseño del fabricante, pero
557
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1:1
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Gómez
Gráfica
CURVA
DE PRODUCCION
DE TOXINA
oo
Reyes, 1. y Medina García, A.
1
DIFfERICA
Y VARIACION
o
DE pH
60
8
45
6
pH
Lf/ml
(o)
(<l)
30
4
15
2
20
CEPA: A-EINH
CONDICIONES:
40
80
100
TJEMPOhs
C. diphtheriae.
35°C; 250 rpm, lOO mi en matraz de 500 mI.
debido a la gran formación de espuma se
arrastraba el inóculo a la superficie y había
formación de grumos, obteniéndose un escaso
desarrollo (8-12 VO/ml). Fue necesario modificar los fermentadores de 14 litros como se
ha indicado previamente, para evitar la formación de' espuma e incrementar los rendimientos y a la vez proporcionar datos más
repetitivos.
Sabiendo que la edad óptima del in6culo a
nivel de matraz era de 20 a 24 horas se estudiaron diversos parámetros, como velocidad
de agitación, aereación, volumen de trabajo y
por ciento de inóculo, lográndose establecer
558
60
EDAD INOCULO
24 HS AL 5% (v/v).
las siguientes condiciones de operación:
Agitación
Volumen de trabajo
Volumen de aire
Concentración de in6culo
550 rpm
7 litros
0.2 (vvm)
3-5% (v/v)
Establecidas las condiciones de cultivo, se
corrió la cinética de crecimiento microbiano
encontrándose que el desarrollo máximo se alcanza a las 48-50 horas (gráfica 2).
Con el propósito de saber la consistencia
de datos y a la vez para obtener suficiente
paquete celular para los estudios de atoxiciSALUD PÚBLICA DE MÉXICO
Desarrollo de procesos en la producci6n de vacunas
Gráfica 2
DE B. pertussís CEPAS 509 Y 134 EN FERMENTADOR
DE 14 LITROS
CINETICA DE CRECIMIENTO
18
9
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16
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8
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14
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I
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UO/ml
10
I
I
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I
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5
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X
8
pH
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4
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6
4
,
3
X
,
,,
I
r
,,
X
(x)----CEPA
(ó)-CEPA
(o)--pH
509.
134.
MUY SIMILAR PARA AMBAS CEPAS.
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2
O
2
10
20
Condiciones de proceso: 550 rpm, 3SoC.
--....
....--ca
I
I
40
30
SO
EDAD DE CULTIVO (HORAS)
60
ca
7.1 volumen de trabajo y 0.2 vvm.
~
dad y potencia. se produjeron siete lotes con
la cepa 134 ycinco con la cepa 509 (cuadro2).
Estos lotes se mezclaron con otros obtenidos
en agitador G-53 y se les determinó pruebas
de atoxicidad y potencia (cuadro 3).
A nivel de fermentador de 300 litros se realizaron modificaciones similares a las efectu adas en los F-14 para la eliminación de espuma
y se determinó la cinética de crecimiento para
las cepas 134 y 509 (gráfica 3).
Para la producción de vacuna pertussis fue
necesario modificar el equipo existente a fin
de reducir las turbulencias y así la excesiva
NOVIEMBRE-DICIEMBRE
1981
formación de espuma. evitándose el uso de
antiespumantes. Los rendimientos logrados por
dichas modificaciones incrementaron de dos a
tres veces las unidades de opacidad por mililitro.
Para fermentadores de 14 litros se determinó que el volumen óptimo de operación
fuera de 17 litros bajo las siguientes condiciones: velocidad de agitación 550 rpm, aereación sobre el vórtice de 0.2 vvm y temperatura de 35°C.
se estableció que la cinética de desarrollo
para las cepas 134 y 509 de B. pertussis era
559
ca
Gómez
Reyes. 1. y Medina García. A.
Cuadro 2
RENDIMIENTOS
FERMENTADOR
I
2
3
4
S
6
7
8
9
10
11
12
DE B. PERTUSSIS OBTENIDOS
CON ADAPTACIONES
EN FERMENTADOR
F·14
CEPA
UOlml
134
S09
134
S09
S09
134
134
134
S09
S09
134
134
28.0
28.0
23.26
30.0
27.S
29.0
28S
27.7
28.3
30.0
28.S
24.9
Condiciones de proceso: edad del inóculo: 24 horas: volumen de trabajo: 7 litros.
Velocidad de agitación: SSO rpm, aereación: 0.2 vvm.
Cuadro
POTENCIA
DE B. PERTUSSIS
Y ATOXICIDAD
DE MEZCLAS DE LOTES EXPERIMENTALES
OBTENIDOS EN AGITADOR G·S3 Y FERMENTADOR
DE 14 LITROS
LOTE
CEPAS
01
10S36
18904
134
S09
134
509
134
10536
18904
10536
10536
134
509
134
509
134
S09
134
134
134
509
134
509
02
03
04
05
06
07
08
09
010
011
012
013
014
015
3
ATOXICIDAD
TOXICO
TOXICO
UII mI
Il.
Il.
SATISFACTORIO
8.0
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
10.28
10.0
8.0
6.8
5.6
SATISFACTORIO
Il.
SATISFACTORIO
3.9
SATISFACTORIO
SATISFACTORIO
SA TISF ACTORIO
S.6
5.6
6.8
SATISFACTORIO
10.95
SATISFACTORIO
7.2
• Los resultados de potencia son variables debido a que estos lotes se sometieron
rentes tratamientos químicos para su concentración.
a No determinado.
560
POTENCIA'
a dift-
SALUD PÚBLICA DE MÉXICO
Desarrollo
de procesos en la producción
de vacunas
Gráfica 3
CURVA
DE CRECIMIENTO
DE B. pertussis CEPAS 509 Y 134 EN FERMENTADOR
MARUBISHI DE 300 UTROS
30-r----------------------------------------------,
10
20
1
,
•
pH
UO/ml
e, .1
C-~
g.
fe. .J
5
10
_
Cepa509
o---c Cepa
134
(1.,,,,
~pH
-
~
a;¡¡
~
O
75
50
Condiciones de operación. Edad de inoculo 20 H. 260 rpm, volumen de trabajo 250 L. temp.
ine. 35 "C, aereación 0.2 vvm.
muy similar, por lo que las condiciones de
propagación para ambas cepas fueron las mismas.
En fermentador de 300 litros las condiciones de propagación estudiadas fueron: 260
rpm, 250 litros volumen de trabajo, y aereación de 0.2 vv a través del vórtice formado.
se establecieron para el Instituto Nacional
de Higiene las bases para la producción de
biológicos de uso humano por procedimientos
de cultivo agitado. se considera que es neceNOVIEMBRE-DICIEMBRE
1981
EDAD
IHORAS,
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sario continuar con los estudios a fin de optimizar condiciones de operación de acuerdo a
los recursos existentes y disponibilidad de materia prima.
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logró adaptar la cepa PW-8 (J\-EINH)
a cultivo agitado. se obtuvieron hasta 142
Uf mI en matraces de 500 mI después de 48
561
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Gómez
horas de incubación.
Debido a la liberación cada vez más elevada de fierro causada por la oxidación del
equipo se suspendieron los estudios para la
producción de toxina diftérica ya que no se
contaba con otro tipo de equipos.
11. PERTUSSIS
se probaron en cultivo agitado las cepas
B. pertussis usadas comúnmente en cultivo
Reyes. I. y Medina García,
A.
estacionario; algunas de ellas dieron rendimientos prometedores. se seleccionaron para
trabajar las que según los datos históricos presentaban contenido adecuado de aglutininas,
simplificando esto la selección.
Se logró establecer en lotes experimentales
de cada cepa las condiciones generales de cultivo a nivel de matraz de 500 mI y de garrafón
de cuatro litros.
Gómez Reyes, 1.; Medina Garcla, A.: loltlal studles to develop a process ID tbe prodUctiOD
of bacterial vaccfnes by means of agitated culture. Sal. Púb. Méx•• XXIII, 555·561. 1981.
Summary: Preliminary submerged culture studies for
Corvnebacternnn
diptttheriae and Bordetelta pertussis
were done with available strains generally used for superficial and agttated culture. TIte objective was lo increase the production of DPT in the Instituto Nacional
de Higiene {National Institute of Hygiene).
General conditions for prcpagation al f1ask and 14
Jiters fermentar were established. [o diphtheria .500 mi
f1ask production reaelied 142 Lilml and In pertussis a
yield of 30.4 OU/ml was obtained ín 14 liters fermentorso lnboth
cases results were attained in 48 hoúrs.
REFERENCIAS
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as a unit
procese" tesis doctoral Rijks Instituut Voor de vctkegzondheid.
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Netherlands.
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Ramón. G .. 1922: "Ploculation
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SALUD PÚBLICA
DE MÉXICO