1. Ciencia

Conservación ex situ de germoplasma
vegetal usando biotecnología'
Vlctor M. Villalobos Arámbula 2 y
Florent Engelmann
RESUMEN
la conservación de los recursos fitogenéticos atrae más y más el interés del publico, como el único camino para
garantizar las adecuadas reservas alimenticias para las futuras generaciones humanas. Sin embargo, éstas no son
tareas simples debido a que se encuentran relacionadas con factores culturales, económicos, técnicos y políticos. En
los últimos treinta años ha habido un incremento significativo en el número de colecciones de plantas y accesiones en
los centros de oonservaci6n ex s;tu alrededor del mundo. El presente artIculo es una revisión sobre esas colecciones
ex situ y la contribución de la biotecnologia a la conservación de germoplasma vegetal. Se discuten las aplicaciones y
limitaciones de las metodologías moleculares a la caracterización de germoplasma. El crecimiento retardado, in vitro es
•
usado en forma rutinaria en la conservación de germoplasma de especies como banano, plátano, yuca, papa y otras.
Más recientemente, los procedimientos de crioconservación han vuelto más accesible el almacenamiento a largo plazo.
las nuevas técnicas de crioconservación -como la encapsulación-deshidratación, vitrificación y desecación- han
incrementado la lista de especies vegetales que pueden no sólo tolerar bajas temperattJras sino también recobrar
posteriormente su crecimiento nonoa!. Sin embargo, se necesita todavla una investigación extensiva para una aplicación
total de esas técnicas?
P ALABRAS CLAVE ADICIONALES: semillas artificiales, crioconservación, colecciones existentes, caracterización
de gennoplasma. almacenamiento in vitro.
de material valioso que ha sido escasamente explorado.
la erosión genética afecta el uso potencial de especies
silvestres en la agricultura.
La diversidad genética vegetal es un recurso natural
limitado que aporta los genes para el mejoramiento de
variedades. los genes que han sido seleccionados por
la naturaleza, por el hombre a través de prácticas empiricas de campo o por técnicas de mejoramiento genético
se encuentran dispersos en las poblaciones domesticadas y silvestres. Sin la diversidad genética, el mejoramiento de los cultivos y de la agricultura no hubieran
existido.
Por la constante necesidad de incrementar la producción de alimentos, a menudo se ha descuidado el
valor de las medidas de protección, y se ha fallado en
hacer un uso eficiente de los recursos fitogenéticos
existentes, lo cual requiere una buena colecta, su conservación, evaluación, documentación e intercambio. Si
bien la conservación de germoplasma está atrayendo
más y más la preocupación pública como la única garantia para proporciooar alimentos a las futuras generaciones humanas , ésta y el acceso a los recursos
fitogenéticos no es simple debido a que involucra aspectos culturales, económicos, técnicos y polfticos. Este
En al"ios recientes, varios factores como la sustitución de genotipos locales por variedades mejoradas e
híbridos, la apertura de nuevas tierras al cullivo, la tala
de árboles, los cambios en técnicas agrícolas y el abuso
de agroquimicos han causado una rápida y profunda
erosión de recursos naturales lo que provoca la extinción
Traducci6n, con autorizaa6n del primer autor. del bom!dor del articulo: Ex si/u Con5efV81ion 01 Planl Gefmplasm Using BiotedmoIogy, que con ligeras
modificaciones apareció publicado en Wor1d Joumal ofMicrobioIogy and BioIedInoIogy 11 (1995):375-382 .
2
DWedor del CINVESTAV-IRAPUATO. Km . 9.8 libfamierlto Norte. Cam!lera Irapuatl).le6n. Apdo. PQstal629. 36500 lrapuato. Gto. México. Fax
(52--462) 045S-46. E. ma~: vilIa4:!lira .cil'\estav. mx.
3
Traduc:d6n del inglés de Juan Guillem10 Cruz castillo '1 Juan Ramón Pérez Pérez . Profesores-lnvestigadores del Centro Regional Unillersitario Ofiente
de la Universidad Autónoma Chapingo en HuaL/l!.co, Ver. Se agradece la opiniOn de la Dra. Lourdes G. Iglesias. Universidad VOOIClUzana. sobfe la
traducción de algunos télminos.
295
Revista de Geografla Agricota
articulo analiza la conservación y el acceso a los recur·
sos fitogenéticos desde una perspectiva té<:flica, evaluando las ventajas y limitaciones de las biotecnologias
modemas en los pasos mas importantes para la conservación del germoplasma.
Cuadro 2. Colecciones 8X-sitU: por región y por el CGIAR
Reg ión o CGIAR
Africa '
,
Número de
accesiones
Porciento del total
205000
6.0
971500
22.0
COLECCIONES EXISTENTES DE RECURSOS
FITOGENEnCOS
AsI.
1 344000
30.'
Desde los inicios de la década de los sesenta se
ha incrementado significativamente el numero de colecciones ex situ de material genético para el mejoramiento
de plantas y en consecuencia también se registra un
aumento en el número de muestras almacenadas en
bancos de semillas y colecciones de campo. La conservación ex situ es la preservación de material vegetal
fuera de su hábitat natural considerando un grado alto de
protección.
América Latina
,., 500
10.0
América del Norte
750700
17.0
Ceeanl.
132500
3.0
Europa ,
Subtotal (paIses y
regiones)2
Internacional
CGlAR1 3
TOTAL
50.4
En desarrollo
1678000
38.0
510500
11.6
4415700
100.0
CGIAR
TOTA L
4415700
100.0
les, debido a que sus periodos juveniles son muy largos
y no producen semillas por vatios afias. Por otro lado,
algunas especies propagadas vegetativamente son estériles o no presentan una reproducción sexual estable;
mudlas raices '1 tubérculos impor'.antes como fuente de
alimento, tales como los /'lames, la papa, la yuca, la
Xanthosoma y el camote, '1 frutas como la banana y los
plátanos se encuentran dentro de esta categorla.
% dellotal
2227200
11 .6
3. De la serie de estudios en Recursos Genéticos de!
Consultative Group on Inlemalíonal Agricultural Research
(CGIAR).
Cuadro 1. Colecciones ex-situ agrupados por estatus de
desarrollo de paIses donde las colecciones se han llevado a cabo y por el CGIAR.
Desarrollados
510500
2. De la base de datos del World Information y'Earty Warning
System on Plant Genetics (VVIEW$IPGR).
trializados, 38% en paises en desarrollo y el Grupo
Consultivo de los Centros Internacionales de Investigación Agrlcola preserva el 12% restante (cuadro 1).
Número de
accesiones
88.'
1. Se incluye. para las regiones especificas las colecciones del
Centro Agronómico Tropical de Investigación y Ensellanza (CAnE) y las del Nordlc Gene Bank (NGB), desde donde se brindan
servicios a los gobiernos de la reg ión.
De acuerdo a la Organización de Naciones Unidas
para la Agricultura y la Alimentación (FAO, 1994), existen
actualmente 4.41 millones de accesiones almacenadas
ex situ. De éstas , 50% son mantenidas en paises indus-
Grupos
econórmcos del
CGIAR
3905200
El éxito en la conservación de germoplasma esta
determinado por la longevidad inherente y por el comportamiento fisiológico bajo almacenaje de las especies
vegetales (i.e. ortodoxa , recalcitrante, o intermedia); por
la calidad inicial, tal como el contenido de humedad del
material almacenado; y por los métodos y condiciones
de almacenamiento (FAO, 1993).
El cuadro 2 muestra el número de aocas iones por
región. Como se indica en el cuadro 3, la mayor parte de
las colecciones ex s;'u son cereales (47%) y leguminosas
(16%).
Si bien la diversidad genética de un amplio número
de cultivos ha sido preservada ex situ, muchos cultivos
que son importantes a nivel nacional y local 'se encuentran pobremente representados en las colecciones existentes debido a diferentes problemas. Estos problemas
Los 4.41 millones de accesiones mantenidas ex
(FAO, 1994) , el tipo de almacenamiento, yel número
de aocasiones preservadas bajo cada uno de estos
reglmenes es dado en la figura 1. Más de 1 200 institu-
incluyen la conservaPón de semillas recalcitrantes-las
cuale s no son capaces de soportar la desecacióncomo es el caso de varios cultivos de importancia económica entre ellas el mango, hule, cacaotero, cocotero,
cafeto , palma de aceite, y muchos otros. Además, existen problemas prácticos para aplicar almacenaje a largo
plazo a semillas de plantas perennes, incluyendo árbo-
ciones alrededor del mundo tienen algún tipo de colección ex situ. De éstas, 308 institutos tienen la capacidad
para un almacenaje a mediano plazo, 175 para largo
plazo. y 119 tienen las facilidades para almacenar a
temperaturas abajo de -18"C. Tanto las colecciones in
vitro como las de campo están dentro de la categorla de
almacenaje a corto y mediano plazo.
~itu
296
Conservación ex situ de
~ rmoplas ma
vegetal
Cuadro 3. Colecciones ex-situ; por grupos de aJltivos.
Q~-'1I '
\. :
v
Cultivo
.•
Colecciones
nacionales
1 750 200
Cereales
•
Centros del
CGIAR
% del total
Total
317200 2067 400
46.82
leolJminosas
600 200
118150
718350
16.27
Forra'es
3744SO
50 900
425350
9.63
Hortalizas
336 600
336600
7.62
Frutos
174400
174 400
3.95
Raicesy
157400
1798SO
4.07
224SO
tubéraJlos
•
Figura 1. Representación esquemática del procedimiento de la
crioconservación clásica empleando ápices de clavel (Galerne,
1985).A-Plantitas in vitro [los ápices (m) son disectados y usados
para su congelamiento y (b) su posterior multiplicación]: B-Precrecimiento de los ápices (24 h en medio sólido suplementado con
sacarosa a O.5M); 'J o (concentración fínal de azúcar al 5%) {la
adición de OMSO se realiza al colocar los ápices en hielo (9):
E-Transferencia de ápices en un vaso de precipitados; F-Medio
de criopropagación usando pinzas (p) pre-enfriadas en nitrógeno
líquido: G-Enfriamienlo lento controlado por 5"C/minulo hasta
abajo de -4O"C; H-Inmersión del vial dentro de nitrógeno liquido;
I y J-Oescongelamiento rápido en Bailo Maria a 4O"C; K a M-Posttratamiento y recuperación eliminando los crioprotectores (H y l);
M-Cultivo sobre un medio standar.
e
LA CONTRIBUCiÓN DE LA BIOTECNOLOGíA A LA
CONSERVACiÓN DE GERMOPLASMA VEGETAL
En al\os recientes, las biotecnologías aplicadas a
las plantas han sido consideradas como un grupo de
herramientas con un gran potencial para beneficio de la
agricultura. Resultados recientes han mostrado importantes avances en la agricultura debido a las biotecnologías que han proporcionado nuevos enfoques para
solucionar los problemas que presentan las plantas en
ambientes marginados, estrés biótico, plagas y enfermedades, y también para alcanzar un desarrollo agrícola vla
la producción de combinaciones genéticas inexistentes
en la naturaleza, mediante ingenierla genética, la producción de genotipos resístentes a plagas y para la
conservación de germoplasma vegetal.
Oleaainosas
89 750
897SO
2.03
Fibras
70 300
70300
1.59
Bebidas
42 900
42900
0.97
Caucho
30 500
30500
0.69
Varios
17 350
17 350
0.39
Cana de azú·
16700
-.
16700
0.38
""
Narcóticos
y
14650
-
14650
0.33
Condimentos,
especias y saborizantes
10 OSO
-
10 OSO
0.23
Culti vos proledores
9600
9600
0.22
dr
as
Cacao
8750
8750
0.20
Ornamentales
4550
4550
0.10
Plantas medicinales
2950
2950
0.07
Tintóreos
1023
1 023
0.02
Aromatizantes
550
550
0.01
Maleriales de
Construcción
400
400
0.01
17
0.00
10
0 .00
Arvenses
Maderables
Oesconoddos
10
191 900
4.34
1500
1 500
0.03
300
300
0.01
510500 4415700
100.0
191 900
Plálano
Árboles de uso
múl\i le
T 01 a I
3905200
últimos 15 años, las técnicas de cultivo in vitro han sido
desarrolladas para más de 1 000 especies ind uyendo
anuales y perennes. El uso de esas técnicas es cada vez
más importante para la conservadón y multiplicación de
plantas que producen semillas recalcitrantes y también
de especies de propagación vegetativa.
La posibilidad de desarrollar plantas completas a
partir de cétulas aisladas, tejidOS u órganos ha permitido
el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando
metodologías de cultivo de tejidos vegetales. Durante los
Asi , el almacenamiento in vitro ha sido propuesto
como un medio para resolver algunos de los problemas
297
Revista de Geografía Agrfcola
de conservación ya mencionados. La tecnología in vitro
en realidad ha tenido una gran motivación para la planeación , investigación y desarrollo de fuentes altemativas de conservación. En principio, las técnicas de cultivo
de tejidos son apropiadas para la conservación, el resultado esperado en todos los casos es el desarrollo de una
planta completa. Por esta razón , es lógico mantener un
elevado nivel de organización de tejidos durante el almacenamiento. Uno de los principales objetivos de la conservación de germoplasma es mantener la diversidad
genética de una especie en una condición estable; por
lo tanto, las técnicas de almacenamiento usadas no
deben poner en peligro la estabilidad genética de las
plantas. Por esta razón, siempre será más apropiado
usar el cultivo de tejidos de ápices del tallo o embriones
zigólicos ya que minimizan el riesgo de variación en
comparación con otros sistemas de cultivo.
de plantas de los tejidos almacenados in vitro, y éstos
deben tener un aceptable grado de eficiencia. Los factores que determinan una bu~na respuesta en la regeneración de plantas son tanto ambientales como físicos.
Además, el grado de variaci ón genotipica también incide
en la obtención de diferentes resultad os.
La conservación de germoplasma usando técnicas de cuHivo de tejidos puede ser visualizada en dos
maneras: (1) conservación a corto Y mediano plazo, y (2)
conservación a largo plazo o crioconservaciÓn. Ambas
técnicas tienen sus propias caracteristicas, asi como sus
ventajas y desventajas.
Conservación a corto y mediano plazo
La conservación a corto y mediano plazo se refiere
a los periodos de almacenamiento del germoplasma in
vitro con diferentes intervalos de subcuHivo. En el actual
estado de conocimiento, algunos reportes se refieren
como lapsos cortos a : tres , seis. o nueve meses, básicamente porque las frecuentes transferencias a un medio
de cultivo fresco son costosas y también' porque se
incrementan las posibilidades de pérdidas por contami·
nación , otros errores técnicos y cambios en el genotipo
debidos a inestabilidad genética. Se usan dos métodos
para la conservación de germoplasma a corto y mediano
plazo: (1) cuHivo in vitro bajo condiciones normales de
crecimiento, (2) cultivo bajo condiciones limitadas de
crecimiento.
Aunque las técnicas de cultivo de te.iidos han sido
usadas para la conservación in vílro, actualmente solo
37 600 accesiones son almacenadas usando este sistema (FAO, 1994). Las colecciones in vitro se encuentran
sujetas a discusión debido a que deben ser mantenidas
bajo un cuidadoso ambiente controlado. Los problemas
prácticos para su mantenimiento, asociados al ·riesgo
de contaminación microbiana y estabilidad genética tendrán que ser considerados para mejorar este sistema.
Las técnicas in vitro implican la sustitución de
condiciones naturales por artificiales con la ventaja de
que la luz y la temperatura son controladas en un reducido espacio, y en muchos casos, para plantas de ciclos
reproductivos cortos , como algunas raíces, tubérculos y
otras anuales, los intervalos de transferencia in vitro son
menos frecuentes que los ciclos de cosecha en el campo.
Otra ventaja importante es la posibilidad de producir
plantas libres de virus con una alta tasa de multiplicación ,
independientemente de las condiciones climáticas . Bajo
un contexto moderno de conservación y con un uso
racional de diversidad genética, la conservación in vítro
debe incluir la eliminación de virus del material almacenado y la habilidad para micropropagar el germoplasma
Se conoce que durante el cultivo in vitro ocurren
mutaciones y selecciones, lo cual puede llevar a una
progenie atípica o a perder la totipotencialidad. El logro
más importante durante el almacenamiento de germoplasma a corto y largo plazo es definir las condiciones
experimentales que favorecen el crecimiento mínimo sin
la alteración en la estabilidad genética y con un numero
posible minimo de subcultivos.
Los requisitos de cultivo se reducen cuando se
limita la tasa de crecimiento y de esta manera se extienden los intervalos de transferencia. Esto puede tener un
efecto benéfico sobre la estabilidad del cultivo, ya que
disminuyendo la tasa de división celular se puede reducir
la frecuencia de mutaciones que podrían ocurrir durante
la duplicación de DNA en la fase mitótica del ciclo celular
(Henshaw, 1982). Sin embargo, el riesgo no puede ser
totalmente eliminado, ya que la misma técnica podría
introducir nuevos peligros de selección debido al inevitable estrés fisiológico impuesto por el método de almacenaje in vitro.
en grandes cantidades cuando sea necesario (Villalobos
ela/.,1991).
Cualquier sistema de cuHivo de tejidos usado para
la conservación in vítro debe cubrir dos requisitos:
a) La estabilidad "genética del material a ser preservado debe garantizarse. La estrategia se basa generalmente en el cultivo de meristemos apicales como un
tejido ideal para el almacenamiento, esto debido a su
estabilidad genética y potencial morfogénico, en comparación con otros tejidos y células aisladas.
Es importante que los procedimientos aplicados
para minimizar el crecimiento también sean capaces de
mantener una maxima viabilidad en los cultivos; la obtención de plantas debe ser posible cuando sea necesaria. En teoría, podría ser suficiente obtener una planta en
b) Se deben implementar protocolos bien definidos, a fin de garantizar un alto porcentaje de obtención
298
ConservitCión ex situ de gennoplurna vegetat
cada cultivo; sin embargo, se requiere una alta habilidad
de regeneración a través de los sistemas de micropropagaci6n debido a las necesidades prácticas de propaga,
ción para iniciar otro ciclo de conservación, asi como
también para reducir la posibilidad de selección impuesta
por condiciones de almacenamiento sub-óptimas, y para
facilitar el intercambio y utilización de germoplasma
(Roca, 1983).
puesto a un periodo transitorio en condiciones de reco·
peraci6n que son diferentes al de las condiciones estandar de cultivo, para estimular el crecimiento.
2) Nuevas técnicas de crioconservación
Durante los aflos recientes, las modificaciones a
las técnicas clasicas para la crioconservación de plantas
provenientes de las diferentes condiciones ecológicas y
el desarrollo de nuevos métodos, como el uso de semillas artificiales. han incrementando las técnicas disponibles para la conservación a largo plazo. Una revisión de
las técnicas més exitosas se presenta a coritinuación:
El crecimiento in vitre puede reducirse durante el
periodo de conservación por varios factores fisicos y
químicos tales como: reducción de la temperatura y de
la intensidad de la luz, la dilución de los elementos
nutritivos del medio de cultivo y el uso de agentes osmóticos e inhibidores del crecimiento.
Encapsu/ación-deshidralación. Esta técnica ha
sido desarrollada inicialmente para ápices de algunas
especies de dima templado y embriones somáticos ele
zanahoria (Dereuddre, 1992). Més recientemente se ha
trabajado con épices de tres cultivos tropicales: yuca
(Benson etal., 1992) caña de azúcar (Paulet el al., 1993;
Gonzalez-Arnao. el al .. 1993) y café (Mari el al., 1993).
.
Esta técmca se basa en la metodologla desarrollada para
la producción de semillas artificiales, donde el embrión
se introduce en una cápsula peletizada de alginina. Para
la crioconservación, usando la encapsulación-deshidra·
tación. los épices son desecados y cultivados en un
medio estándar durante una noche para inducir su recuperación del estrés producido por la desecación. Postericrmente son introducidos a las cápsulas de alginina y
precultivados en un,medio liquido con una concentración
alta de sacarosa. los tratamientos de precultivo tienen
que ser determinados experimentalmente. Los épices
encapsulados son as; deshidratados por exposición a
aire seco filtrado y luego congelados rápidamente.
Conservación a largo plazo o crioconservación
La cñoconservación se basa en la reducción y la
subsecuente detención de las funciones metabólicas,
incluyendo la división celular en los explantes. Esta es
completada cuando el material es llevado a temperaturas
ultra bajas, como la del Nitrógeno I1quido H96 oC) . Asl,
las estructuras vegetales pueden ser almacenadas y
mantenidas por periodos de tiempo virtualmente indefinidos. y de esta forma su estabilidad genética es garantizada (Ashwood-Smilh and Friedmann, 1979).
.
Varias técnicas de crioconservación han sido desarrolladas para la suspensión de células, callo. ápices
de tallo. embriones somáticos y zigóticos. ¡;stas pueden
ser divididas en dos grandes categorías: (1) técnicas
clásícas de crioconservación y (2) nuevas técnicas de
crioconservación.
1) Técnicas clasicas de crioconservación
Algunos trabajos de revisión describen los procesos clásicos de crioconservación (lN'lIhers, 1985, 1992;
Dereuddre y Engelmann. 1987). en resumen, el procedimiento clésico implica los siguientes pasos sucesivos:
pretratamiento. enfriado lento. descongelamiento, almacenamiento y postratamiento. El pretratamiento implica
el cultivo del material biológico en presencia de substancias crioprotectoras como sacarosa, sorbitol, manitol,
dimetilsulf6xido, polietilenglicol, etc. Estas substancias
pueden tener s610 una acción osmótica (agentes no
penetrantes) o también pueden proteger membranas,
proteínas, y puntos de unión de las enzimas del estrés
ocasionado por el congelamiento (agentes penetrantes).
El congelamiento se lleva a cabo lentamente (de -0.1 a
varios · C min" ) usando un aparato de congelamiento
controlado. El ajuste de dos parámetros, la tasa de
congelamiento y la temperatura de preoongelamiento.
permiten modificar la cantidad de agua intracelular residual y as! limitar el daño causado por la cristalización
durante el congelamiento. Después de almacenar a 196"C, el material es descongelado rápidamente y dis-
La técnica que se acaba de mencionar presenta
algunas ventajas para la crioconservación de épices en
comparación con las técnicas désicas. Las tasas de
sobrevivencia de épices crioconservados son altas (casi
100% en el caso de la caña de azúcar) . Su recuperación
es muy rápida y el reinicio del crecimiento generalmente
toma lugar directamente sin pasar por la fase transitoria
de callo. Esto es debido al hecho de que la mayorla de
las células de los ápices permanecen vivas después del
oongelamiento usando estos métodos (Gonzalez-Amao
el al., 1993). Desde un punto de 'lIsIa práctico. las
condiciones de regeneración y congelamiento se simplifican, ya que la sacarosa es el único crioprotector empleado y el uso · de un aparato programable de
congelamiento no es necesario. Ademés, la manipulación de los ápices es muy fécil cuando están encapsula-dos. La encapsulación-deshidratación es por lo tanto de
gran interés para la conservación de ápices y se espera
que se aplique a un gran número de especies vegetales.
Otro aspecto importante a tomarse en consideración es
299
Revista de Geografla Agricola
la enorme reducci6n del riesgo de inestabilidad debido a
que usan ápices en comparación a otros explantes.
contenido de agua inicial de 64 Y 100% de viabilidad sin
ningún tratamiento, pero no toleraron el congelamiento
en nitrógeno liquido. Después de 30 min de desecación,
el contenido de agua se redujo a 21 %, Y la viabilidad de
los conltoles desecados sin congelamiento bajó a 80%
pero 50% de los embriones resistieron la crioconservaciOn. Después de 1.5 hrs de desecación, la sobrevivencia de los controles desecados bajó 25%, debido a la
excesiva deshidratación y sólo 14% de los embriones
sobrevivió después de congelarlos a _196°C.
Vitrificación. Este proceso consiste en depositar
las muestras para el pretratamlento en soluciones crioprotectoras extremadamenle concentradas y congelarlas ultra-rápidamente. En esas condiciones el agua
intracelular se vitrifica. fonnando un crislal amorfo que
evita la formación de cristales de hielo intracelulares que
sean detrimentales a la sobrevivencia de la célula. Los
procesos de vitrificación han sido desarrollados en suspendones de células, embriones somáticos y ápices de
varias especies (Sakal. 1993), los procesos de vitrificación evitan el uso de aparatos de congelación controlada.
Sin embargo. las mezclas crioprotectoras son muchas
veces tóxicas debido a sus altas concentraciones. La
duraci6n del pretratamiento y la dilución progresiva de
los crioprotectores después de descongelar deben ser
meticulosamente controladas, asila elaboración de esta
técnica está lejos de ser usada en un amplio número de
materiales, partiwlarmente si son sensibles a los crioprotectores.
Pre-crecimienfo Desecación. Procesos de crioconservaci6n combinando el precrecimiento sobre un
medio con crioprotectores y la desecaci6n han sido
desarrollados para varias especies. destacando el caso
de embriones zig6ticos de coco (Assy-Bah y Engelmann,
1992). Embriones maduros de cuatro variedades comerciales fueron desecados por 4 horas con aire filtrado, y
puestos de 11 a 20 hrs sobre un medio conteniendo 600
g.r' de glucosa y 150 g.r' de glicerol. El congelado y
descongelado se llevaron a cabo rápidamente. Las lasas
de recuperación de embriones Congelados variaron entre 33 y 93% dependiendo de la variedad.
Proceso simplificado de congelamiento. Este proceso consiste en reemplazar los aparatos de congelación controlada por un refrigerador comercial para enfriar
las muestras abajo de -20· C o -40· C. Cuando se alcanza la temperatura de preenfriamiento, las muestras se
introducen rápidamente en nitrógeno liquido. Esta técnica se ha utilizado para el congelamiento de: embriones
somáticos de café y zanahoria (Lecouteux el al., 1991 ;
Abdelnour et al., 1992a); embriones zigóticos de banano
y plátano (Abdelnour el al., 1992b, Villalobos y Abdelnour, 1993) y células embriogénicas en suspensión y
callos de varias variedades de Citrus (Engelmann el al.,
1993). Esta técnica puede ser de gran interés para
simplificar los procedimientos de congelamiento con materiales que no requieren tasas de congelación muy
precisas.
ESTABIUOAO GEN~TICA DEL MATERIAL
CONSERVADO
Conservación a corto y mediano plazo
Se han publicada con anterioridad resultados de
estudios cuantitativos de la estabilidad genética de las
colecciones en los bancos de semillas, sobre todo en lo
que se refiere a las predicciones de pérdida ·de alelas
durante la conservación (Breese 1989; Gale y Lauwrence. 1984). Sin embargo, es muy poco lo que se sabe de
este tema en las colecciones almacenadas in vitro. Durante la propagación in vitro se han observado cambios
heredables. la cantidad de variación depende de la
interacción entre el proceso de cultivo de tejidos, el
genotipo y el OIigen del explante.
Desecación. Esta técnica se emplea especialmente para embriones zig6ticos o ejes embriónicos. Los
embriones se aislan de las semillas, para después deshidratarios por medio de aire filtrado y congelarlos rápidamente por inmersión directa en nitrógeno liquido. La
duración de los periodos de desecación varian dependiendo principalmente del contenido de agua inicial y del
tamaño de los embriones. Usualmente, el contenido de
agua que asegura la sobrevivencia máxima de los embriones después del congelamiento es de 15 a 20% (de
peso fresco). La deshidratadón debe ser suficiente para
asegurar la sobrevivencia después del congelamiento
pero no tan intensa como para inducir un dal"io causado
por la desecación. Un ejemplo de esta técnica fue reportado por Abdelnour el al. (1992b) trabajando con embriones zig6ticos de Coffea arabica. los cuales tuvieron un
La atta estabilidad genética está asociada con el
cultivo de tejidos de plántulas, embriones o tallos, mientras que el material desorganizado como los protoplastos, células y callos está generalmente asociado con alta
inestabilidad. Los Indices altos de variación somaclonal
pudieran ser atribuidos a varios tipos de cambios en el
genoma. En partlwlar los ejemplos de variaciones morfológicas pueden estar relacionados a la impresión de
cromosomas o mutaciones en genes con efectos pleiotrópicos en el desarrollo (Walhot y Cullis, 1985).
Orton (1984) estim6 las frecuencias de mutación
somaclonal sobre la base de la progenie de semillas.
obteniendo sorpresivamente cifras altas. Los rangos de
frecuencia de mutación (%) fueron de 17 a 75 en Driza
300
Conservación ex situ de germoplasma vegetal
sativa, de 2.1 a 45.1 en Triticum aestivum, de 0.4 a 2.3
en Zea mays, de 0.4 a 1.7 en Ucopersicon escu/entum,
de 1.4 a 5.6 en Lactuca saliva, y de 1.8 en Apium
graveolens (Scrowcroft el al. 1985). Estimaciones similares no están disponibles para la mayoria de los cultivos
tropicales. Sin embargo, han sido observados altos Indices de variación somaclonal fuera de tipo (offtype) o de
plantas mutantes (Villalobos, el al. 1991).
suspensiones celulares de cana de azúcar (Chowdury y
Vasil, 1993) después de la crloconservación no permitieron detectar ninguna modificación.
Con respecto al efecto de la duración de almacenaje sobre la recuperación del material crioconservado,
la experiencia es limitada en comparación con la existente en células animales. Sin embargo, ningún cambio en
la sobrevivencia fue notado en periodos extendidos de
almacenaje (Engelmann, 1991). Apices de papa y yuca
fueron almacenados hasta por 4 años sin ninguna
modificación en sus tasas de recuperación (Bajaj, 1985).
S6Io un número limitado de reportes bien documentados está disponible en lo que se refiere al efecto
del almacenaje en la modalidad de crecimiento lento in
vitro sobre la estabilidad genética del material conservado. Existe evidencia de inestabilidad genética en cultivo
de callos conservados bajo crecimiento lento, aún después de periodos cortos (Mannonen el al. 1990). En el
caso de estructuras organizadas, un estudio detallado
ha sido realizado recientemenle en el marco de un
proyecto de colaboración entre el Centro Internacional
de Agricultura Tropical y el Inslituto Internacional de
Recursos Fitogenéticos (CIAlT-IPGRI), donde se han
investigado varios aspectos del establecimiento y operación de un banco activo piloto de genes de yuca in vitro
(CIAT-IPGRJ, 1994). Basado en descriptores morfológicos, bioquimicos (perfiles isoenzimáticos) y moleculares
no se observaron cambios en 'el material de campo
recuperado a partir de cultivos de tallo in vitro después
de tres cieJos sucesivos de aecimiento lento. Sin embargo, es posible que un almacenamiento extendido del
malerial vegetal bajo crecimiento lento pueda oonducir a
una selección progresiva de genotipos mejor ada piados
a esas condiciones subóptimas.
CARACTERIZACiÓN DE GERMOPLASMA POR
TÉECNICAS MOLECULARES
Durante las úHimas dos décadas las tecnicas moleculares han tenido un desarrollo que ha permitido la
caracterización del material genético. Hardon el al.,
(1994) divide estas témicas en tres categorías: (1) técnicas que describen un genotipo sin observar ningún
rasgo (generalmente genera una complejo patrón en el
bandeo): (2) técnicas que detectan el DNA vinaJlado a
un rasgo de interés (freaJet1temente genera una configuración simple de bandeo y usualmente no detecta el
DNA que genera esa caracterlstica por si misma; y (3)
técnicas que caraderizan el gene de interés.
Todos los métodos descritos son capaces de detectar diferencias entre los genotipos, haciéndolos disponibles para una variedad de caracterizaciones.
Las técnicas usadas para la caracterización genética , se basan en tres diferentes principios (Handen el al.
1994)'
Conservación a largo plazo usando crioconservaclón
-Hi~ridación
Southern.
-Reacción de polimerización en cadena
(Polymerase Chain Reaction (PCR».
las posibles modificaciones inducidas en el material vegetal mediante téalicas de crioconservación han
sido estudiadas a varios niveles. Hasta ahora llO se
reportan modificaciones que puedan ser atribuidas a la
crioconservación . La regeneración de plantas de ápices
crioconservados de fresa y yuca fueron fenotipicamenle
normales (Bajaj, 1983). Varios cientos de palmas de
aceite regeneradas a partir de embriones somáticos
crioconservados han sido plantados en el campo. No se
encontraron diferencias en el desarrollo vegetativo y
floral en contraste con los totes testigos de plantas de
palma no congeladas (Engelmann el a/., 1993). Ninguna
modificación fue observada en los perfiles eledroforéticos de dos sistemas isoenzimáticos en plantas regeneradas del control y de ápices crioconservados de cana
de azÜCélr (Paulet el al., 1993) . los análisis de citometria
de flujo revelaron que la crioconservación no parece
inducir cambios en la sensible dihaploidia de la papa
(Word el al., 1993). Finalmente, los análisis de PlFR
realizados en puntas de tallo de papa (Harding , 1990) y
-Secuenciaci6n del AON.
Hibridación Southem. Indica las diferencias en la
longitud de los fragmentos de reslriccioo: Por lo tanto, el
polimorfismo detectado por esta técnica es llamado polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
(RFlP) (re striction fragment length polymorphism) o
fragmentación restricta de polimorfismo longitudinal
(RFlP) (restricted fragment length polymorphism
[RFlP)). Ensayos usados para mostrar los RFlPs son
tanto para un solo locus como para ensayos mulliloci.
la técnica de RFlP para 9)(plorar un solo locus es
amptiamente usada en el mejoramiento genético de
ptanlas. En este momento la principal aplicación es ja
construcción de mapas moleculares, los cuales ahora
están disponibles para la mayoría de los cultivos. los
RFLPs pueden estar asociados a características de interés, por ejemplo, genes que confieren resistencia a
301
Revista de Geografia Agricola
plagas. Una vez que la coneión es establecida, los
RFLPs pueden ser usados como un marcador indirecto
de selección para ese gene.
sin afectar la función o la composición de los aminoácidos de las proteínas codificadas por los genes ( Herrera-Estrella, 1995).
Los ensayos de multilocus detectan varios fragmentos de restricción los cuales pueden estar dispersos
a través del genoma completo. Un diagrama de RFLPde
multilocus es frecuentemente llamado huella digital de
ADN (fingerprint de DNA) . Tal tipo de 'fingerprint' puede
ser obtenido por el uso de ensayos de secuencias de mini
CONCLUSIONES
A nivel general, el uso de técnicas in vitro es
todavía marginal para la conservación de las colecciones
de recursos genéticos vegetales existentes. Estas técnicas pudieran ser explotadas más ampliamente. Una
aplicación adicional importante del cultivo de tejidos es
en el intercambio internacional de germoplasma, dado
que después de la inoculación in vitro seguida por tratamientos apropiados, el material vegetal a intercambiarse
puede estar libre de virus y en tamai'io miniaturizado.
o micro satélites .
Reacción de polimerización en cadena (RPC)
(Polymerase chain reaction (PCR» . Los métodos basados en la RPC muestran diferencias en polimorfismo de
longitud de fragmentos amplificados de ADN (AFLPs:
amplified fragment leng1h polymorphism). Los fragmentos amplificados estan determinados por los cebadores
(primer(s» usados para los procesos de amplificación.
Un diagrama de multilocus AFLP puede ser obtenido sin
la necesidad de secuenciar información para designar
cebadores. t:stos se designan al azar. Un sólo cebador
es usado Ylos métodos que generan tales diagramas son
conocidos con los acrónimos PFAD (Polimorfismo de
fragmentos amplificados de DNA al azar) (random amplified polymorphic ONA), AP-PCR (Reacción de polimerización en cadena usando cebadores arbitrarios)
(arbitrarily primer-polymerase chain reaction) y AHD
(Amplificación de huella digital de ADN) (DNA amplificalian fingerprint). Los cebadores que muestran polimorfismo entre genotipos son seleccionados. También con
este método es posible que esos polimorfismos sean
ligados a una característica de interés. En ese caso
pueden ser usados similarmente para un locus único de
PLFR, pero difieren en el hecho de que las bandas
generadas por PFAD, RPC-CA y AHD son dominantes.
La preservación de material vegetal bajo crecimiento lento in vffro es ya una práctica rutinaria en
algunas especies (banana, plátano, papa. y yuca). Con
respedo a la estabilidad genética, ésta puede considerarse adecuada en el caso de estructuras organizadas y
almacenadas en condiciones subóptimas ¡¡ara periodos
intermedios. Sin embargo, es necesario monitorear los
efectos relativos a largo plazo sobre la limitación del
crecimiento más allá de la estabilidad genética y fisiológica.
La criopreservación se encuentra en un estado de
avance significativo. Una investigación extensiva es todavia necesaria para desarrollar nuevas técnicas de
congelamiento, para aplicar las existentes a otras especies vegetales y para experimentar con ellas a mayor
escala.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su enonne agradecimiento
a J. Suttie., J. Serwinski, K. Ringlund y H. Silva por
proporcionar sugerencias e información para este manuscrito.
Secuenciación del ADN. El secuenciamiento es
una técnica segura bien establecida. Una vez que la
secuencia es conocida, es fácil cambiar esta secuencia
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